Method Article

القياس الكمي للعمود الفقري التغصني باستخدام برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية ثلاثي الأبعاد التلقائي

DOI:

10.3791/66493

⸱

September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمود الفقري التغصني عبارة عن مقصورات ما بعد المشبكي لمعظم المشابك المثيرة. تحدث تغيرات في مورفولوجيا العمود الفقري التغصني أثناء النمو العصبي والشيخوخة والتعلم والعديد من الاضطرابات العصبية والنفسية ، مما يؤكد أهمية تحليل العمود الفقري التغصني الموثوق. يصف هذا البروتوكول القياس الكمي لمورفولوجيا العمود الفقري التغصني بدقة وقابلية للتكرار باستخدام برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية ثلاثي الأبعاد التلقائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح الاتصالات المتشابكة بتبادل ومعالجة المعلومات بين الخلايا العصبية. غالبا ما يتم تشكيل موقع ما بعد المشبكي للمشابك العصبية المثيرة على العمود الفقري التغصني. العمود الفقري التغصني هي هياكل ذات أهمية كبيرة في الأبحاث التي تتمحور حول اللدونة المشبكية ، والنمو العصبي ، والاضطرابات العصبية والنفسية. تخضع الأشواك المتغصنة لتعديلات هيكلية خلال عمرها ، مع خصائص مثل إجمالي عدد العمود الفقري ، وحجم العمود الفقري التغصني ، وتغيير النوع الفرعي المحدد شكليا استجابة لعمليات مختلفة. يعتمد تحديد الآليات الجزيئية التي تنظم هذه التغيرات الهيكلية للأشواك المتغصنة على القياس المورفولوجي. هذا يفرض تحليلا دقيقا وقابلا للتكرار للعمود الفقري الشجيري لتقديم أدلة تجريبية. تحدد الدراسة الحالية بروتوكولا مفصلا لقياس وتصنيف العمود الفقري التغصني باستخدام Neurolucida 360 (برنامج إعادة بناء الخلايا العصبية ثلاثي الأبعاد التلقائي). يسمح هذا البروتوكول بتحديد خصائص العمود الفقري التغصني الرئيسية مثل الكثافة الكلية للعمود الفقري وحجم رأس العمود الفقري والتصنيف إلى أنواع فرعية للعمود الفقري وبالتالي تمكين التحليل الفعال للأنماط الظاهرية الهيكلية للعمود الفقري التغصني.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأشواك المتغصنة هي نتوءات من التشعبات غالبا ما تتكون من موقع ما بعد المشبكي للمشابك العصبية الجلوتاماتية 1,2. تعتبر الأشواك المتغصنة ذات أهمية خاصة في مجال اللدونة المشبكية. غالبا ما يتم تغيير العمود الفقري عندما تتغير القوة المشبكية ، وتصبح أكبر وأقوى في التقوية المشبكية طويلة المدى أو أصغر وأضعف في الاكتئاب المشبكي طويل المدى3،4،5،6،7. ما وراء اللدونة المشبكية ، يتغير ملف تعريف العمود الفقري التغصني طوال العمر. في التطور المبكر ، هناك فترة من تكوين العمود الفقري الشجيري ونموه ، يليه تقليم العمود الفقري التغصني حتى الوصول إلى حالة مستقرة8،9،10. في شيخوخة الدماغ ، يصاحب فقدان العمود الفقري انكماش الدماغ والتدهور المعرفي11. بالإضافة إلى ذلك ، تتميز العديد من الاضطرابات العصبية والتنكسية العصبية والنفسية بأشواك شجيرية شاذة. تحتوي مناطق الدماغ المتعددة لدى الأفراد المصابين بالفصام على عدد أقل من الأشواك المتغصنة ، ومن المحتمل أن تكون ناتجة عن التقليم المشبكيالمتشابكي المتغير 12. تتميز اضطرابات طيف التوحد أيضا بأمراض العمود الفقري التغصني13. فقدان العمود الفقري التغصني هو السمة المميزة لكل من مرض الزهايمر ومرض باركنسون14,15. بالنظر إلى المجموعة الواسعة من الموضوعات البحثية التي تشمل التحقيقات في خصائص العمود الفقري التغصني ، فإن تقنيات القياس الكمي الدقيق للعمود الفقري لها أهمية قصوى.

يعد التلوين ، أي طريقة جولجي ، أو تسمية الخلايا العصبية عن طريق ملء الصبغة أو التعبير عن البروتينات الفلورية طرقا شائعة لتصور العمود الفقري التغصني16،17،18. بمجرد تصورها ، يمكن تحليل العمود الفقري مع مجموعة متنوعة من عملاء البرامج المجانية والمتاحة تجاريا. يعد الناتج المطلوب من التحليل عاملا مهما في تحديد البرنامج الأكثر استخداما. فيجي هي خيار برمجي قابل للتطبيق للأسئلة التي تتمحور حول كثافة العمود الفقري التغصني. ومع ذلك ، تعتمد هذه التقنية إلى حد كبير على العد اليدوي الذي يستغرق وقتا طويلا والذي يمكن أن يؤدي إلى إمكانية التحيز. تسمح المكونات الإضافية الجديدة مثل SpineJ بالقياس الكمي التلقائي ، بالإضافة إلى السماح بتحليل أكثر دقة لرقبةالعمود الفقري 19. عيب هذه الأساليب هو فقدان تحليل ثلاثي الأبعاد لتحديد حجم العمود الفقري ، حيث يقتصر SpineJ على مكدسات الصور ثنائية الأبعاد. بالإضافة إلى ذلك ، يصبح الحصول على معلومات النوع الفرعي للعمود الفقري أمرا صعبا عبر هذه العمليات. الأنواع الفرعية الأربعة السائدة في العمود الفقري ، رقيقة ، فطر ، قصير ، وفيلوبوديا ، كلها تشير إلى وظائف فردية وتصنف إلى حد كبير عبر التشكل20. تتميز الأشواك الرفيعة برقبة ممدودة ورأس محدد21. أشواك الفطر لها رأس عمود فقري أكبر بكثيروواضح 22. العمود الفقري القصير قصير وله تباين ضئيل بين الرأس والرقبة23. Filopodia هي أشواك غير ناضجة ذات رقبة طويلة ورفيعة ولا يمكن ملاحظتها بشكل واضح24. بينما يوفر التصنيف معلومات قيمة ، توجد الأشواك على سلسلة متصلة من الأبعاد. يعتمد التصنيف إلى فئات على نطاقات القياسات المورفولوجية25,26. إن قياس العمود الفقري يدويا للتصنيف يضاعف العبء اللوجستي للباحثين في هذا النهج.

تعد خيارات البرامج الأخرى التي تركز بشكل خاص على تحليل العمود الفقري التغصني ثلاثي الأبعاد أكثر ملاءمة للتحقيقات في حجم العمود الفقري وخصائص النوع الفرعي27،28،29،30،31. على الرغم من الصعوبة التي يمثلها التحليل ثلاثي الأبعاد ، مثل ضعف دقة المستوى z والتشويه ، فإن خيارات البرامج هذه تسمح بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد موثوقة للزوائد الشجيرية والعمود الفقري التغصني بطريقة شبه آلية موجهة من المستخدم. يعد التصنيف التلقائي للأشواك المحددة في أنواعها الفرعية أيضا ميزة موجودة في بعض حزم برامج تحليل العمود الفقري هذه. هذا يمكن أن يخفف من المخاوف من عبء العمل المحتمل والتحيز التجريبي. Neurolucida 360 هو أحد البرامج المتاحة تجاريا مما يسمح بتحديد وتصنيف العمود الفقري الشجيري ثلاثي الأبعاد الموثوق به والقابل للتكرار32. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لإعداد الأنسجة الثابتة بشكل فعال ، والحصول على الصور ، وفي النهاية تحديد وتصنيف العمود الفقري التغصني باستخدام هذا البرنامج.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية إرشادات المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة باستخدام في الأبحاث الداخلية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام التابعة للمعهد الوطني للصحة العقلية.

1. إعداد شرائح الحصين الثابتة

  1. تخدير الفئران بحقن الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق (الكيتامين: 100 مغ / كغ; زيلازين: 8 ملغ/كغ). تحقق من صحة التخدير عن طريق قرصة الذيل ولصق الماوس على لوحة التروية.
  2. باستخدام مقص جراحي كبير ، قم بإزالة الجلد والفراء من الصدر ، مما يسمح بتصور أسهل للقفص الصدري الأساسي.
  3. قم بعمل قطع أفقي أسفل عرض القفص الصدري ، وتجنب الكبد والحجاب الحاجز. باستخدام ملقط دقيق ، اسحب عملية الخنجري لأعلى واقطع كل جانب جانبي من القفص الصدري. اقلب القفص الصدري إلى منطقة الرقبة وقم بتثبيته في مكانه باستخدام ملقط مرقئ.
  4. أدخل إبرة فراشة 21 جم في البطين الأيسر للقلب وابدأ في التسرب بدرجة حرارة الغرفة 1x PBS عند حوالي 5 مل / دقيقة. قم بعمل قطع صغير في الأذين الأيمن بمقص جراحي صغير. استخدم برنامج تلفزيوني حتى يصبح المحلول الذي يغادر الأذين واضحا.
  5. قم بإيقاف تشغيل مضخة التروية لضمان عدم دخول الفقاعات إلى الأنبوب. ضع الأنبوب من PBS في الثلج البارد 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS. يتفاعل مع PFA بمعدل 5 مل / دقيقة حتى يتماسك بالكامل ، حوالي 25 مل.
    ملاحظة: تأكد من أن PFA طازج (لا يزيد عمره عن 1 أسبوع إذا تم تخزين المخزون عند 4 درجات مئوية) للتثبيت الأمثل.
  6. إزالة الجلد من سطح الجمجمة بمقص جراحي صغير. قم بعمل قطع منتصف سهمي بمقص جراحي صغير على طول الشق المركزي للجمجمة. جعل الجروح الجانبية منضدة إلى البصلة الشمية وفوق المخيخ.
  7. افتح الجمجمة بالملقط الدقيق لفضح الدماغ. باستخدام ملعقة ، استخرج الدماغ برفق من المصابيح الشمية وضعها في 4٪ PFA في PBS طوال الليل.
    ملاحظة: للحصول على بروتوكول أكثر شمولا لنضح القوارض ، يرجى الرجوع إلى Gage et al.33.
  8. Cryoprotect الدماغ الثابت عن طريق استبدال 4٪ PFA مع 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني لمدة 1 يوم. بعد ذلك ، استبدل السكروز 15٪ بالسكروز 30٪ في محلول PBS لمدة يوم واحد حتى يغرق الدماغ في المحلول.
  9. أخرج الدماغ من محلول السكروز وضعه في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. قطع المخيخ والمصباح الشمي باستخدام شفرة مشرط.
  10. ضع كمية صغيرة ، قطرها 1-2 سم ، من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) على سطح حامل العينة. قم بتركيب الدماغ إكليليا على حامل العينة باستخدام السطح المقطوع الذيلي في OCT. قم بتجميد الدماغ بسرعة عن طريق وضع حامل العينة في الثلج الجاف المسحوق حتى يتم تجميده بشكل واضح ، حوالي 5-7 دقائق.
  11. تأكد من ضبط زاوية شفرة cryostat بين 0 درجة و 5 درجات لإنتاج أقسام موحدة. اضبط زاوية لوحة اللف للحصول على تسطيح مثالي للشريحة. يرجى الرجوع إلى دليل المعدات للحصول على تعليمات محددة.
  12. ضع حامل العينة في cryostat مع السطح البطني للدماغ الأقرب إلى النصل. قطع الدماغ إلى أقسام الحصين الظهرية 30 ميكرومتر ، وتجاهل جميع شرائح المنقار إلى الحصين.
    ملاحظة: يمكن تكييف هذا الجزء من البروتوكول مع أي منطقة مرغوبة في الدماغ من اختيارك. ستتغير الخطوات من 1.9 إلى 1.12 اعتمادا على منطقة الاهتمام.
  13. نقل شرائح الحصين الظهرية إلى برنامج تلفزيوني. باستخدام فرشاة الرسم ، قم بتركيب أقسام الحصين برفق على شريحة المجهر. قم بإزالة أي محلول زائد باستخدام مسحات القطن أو مناديل المهام الحساسة.
  14. ضع 100 ميكرولتر من وسط التثبيت الصلب على شريحة المجهر التي تغطي جميع شرائح الدماغ. لمنع الفقاعات ، اخفض غطاء الغطاء ببطء باستخدام ملقط على وسط التثبيت. إذا تشكلت فقاعات ، فاضغط برفق على غطاء الغطاء بالملقط للسماح لها بالهروب. دع الشرائح تضبط طوال الليل قبل التصوير.

2. تصوير متحد البؤر عالي الدقة

  1. استخدم عدسات منخفضة التكبير لتحديد الخلايا الفلورية. قم بالتبديل إلى هدف 63x (NA = 1.4) أو أعلى ، مع تطبيق وسيط الانغماس المناسب على الهدف.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، استخدم مجهرا متحد البؤر للمسح بالليزر بهدف 63x أو أعلى.
  2. حدد المقاطع الشجيرية ذات العلامات الجيدة ذات التداخل المحدود للحصول على الصور. اضبط طاقة الليزر وكأسه لضمان عدم تشبع التشعبات الفلورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يوفر تقليل سرعة المسح دقة صورة أفضل.
  3. احصل على مكدسات z التي تشمل الأجزاء المتغصنة الكاملة للتحليل المستقبلي. مداخن Z الأكبر من 10 ميكرومتر غير مرغوب فيها بسبب الاحتمال الإضافي للتداخل الشجيري في المستوى z.
    ملاحظة: استخدم أصغر حجم z-step متاح (0.2-0.7 ميكرومتر) وحجم ثقب وحدة تهوية واحدة. ينتج عن حجم الخطوة الأصغر المزيد من الصور في مكدس z ، مما يعوض عن دقة Z المحدودة للعديد من المجاهر.
  4. اختياري: إذا كان ذلك متاحا ، فاستخدم وظيفة برنامج فك الالتفاف الخاص بالمجهر لفك الصور الملتوية. سيسمح ذلك بالحصول على صور عالية الدقة.

3. تكميم العمود الفقري التغصني

  1. افتح Neurolucida 360 (الإصدار 2022.1.1 أو أحدث). افتح ملف الصورة في برنامج تحليل العمود الفقري (ملف > Open > Image). تأكد من أن ملف الصورة مرئي في النافذة الرئيسية وبيئة 3D. إذا لم تظهر نافذة البيئة ثلاثية الأبعاد ، فانقر بزر الماوس الأيسر على 3D Environment في شريط الأدوات العلوي للنافذة الرئيسية في علامة التبويب تتبع (الشكل التكميلي 1)
    ملاحظة: يمكن تكييف هذا القسم من البروتوكول لأي صور شجيرية ، وليس حصريا التشعبات من أنسجة الفأر.
  2. أثناء وجودك في علامة التبويب تغيير عرض الصورة في نافذة بيئة ثلاثية الأبعاد ، تأكد من عرض الصورة كوحدة تخزين ثلاثية الأبعاد في مربع عرض الصورة باسم . في المربع إعدادات مكدس الصور من علامة التبويب صورة ، حدد الحد الأقصى للإسقاط في القائمة المنسدلة إظهار Surface ك . (الشكل التكميلي 2)
  3. حدد شريحة شجيرية مناسبة للتتبع.
    1. انقر بزر الماوس الأيسر فوق أداة نقل النقطة المحورية في شريط الأدوات العلوي لنافذة بيئة 3D . انقر بزر الماوس الأيسر على التغصنات المطلوبة لتعيين نقطة محورية جديدة. سيؤدي هذا إلى تغيير الاتجاه لتمكين التكبير الفعال.
    2. أعد إنشاء الاتجاه الأصلي بالنقر بزر الماوس الأيسر فوق أيقونة إعادة تعيين الاتجاه . بعد تعيين النقطة المحورية، انقر بزر الماوس الأيسر فوق أداة تحريك النقطة المحورية لبدء تتبع التغصنات. (الشكل التكميلي 2).
      ملاحظة: الزوائد الشجيرية المثالية هي تلك ذات التداخل المحدود مع الزوائد الشجيرية الأخرى في أي من مستويات الإحداثيات ولا تتقاطع مع زوائد شجيرية أخرى أو سطحية مع أخرى تحتها. يفضل أيضا استخدام التشعبات على مقربة منخفضة من الآخرين في المستوى XY لمنع التخصيص غير المناسب للأشواك المجاورة إلى التشعبات المتتبعة. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن التشعبات ذات السماكات والأوامر والمسافات المختلفة من سوما لها كثافات مختلفة للعمود الفقري التغصني 34,35. هذا يحتاج إلى أن يؤخذ في الاعتبار في التصميم التجريبي. تعتبر التشعبات الثانوية < سمك 1.5 ميكرومتر مرشحة مثالية للتتبع (الشكل 1).
  4. انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب شجرة في نافذة بيئة 3D . انقر بزر الماوس الأيسر فوق User-Guided لوضع التتبع و Directional Kernels كطريقة في خيارات التتبع الموجهة للمستخدم.
  5. انقر بزر الماوس الأيسر على التغصنات عندما تظهر نواة دائرية لبدء التتبع. حرك المؤشر على طول الجزء التغصني. سيؤدي هذا إلى ملء النواة تلقائيا. إذا لم يتم ملء النواة تلقائيا، فراجع الخطوة 3.51.
    1. حرك المؤشر برفق ذهابا وإيابا على الزوائد الشجيرية حتى تمتلئ الحبوب. انقر بزر الماوس الأيسر للحفاظ على النواة المكتشفة الموجودة. إذا توقفت النواة عن التعبئة، فانقر بزر الماوس الأيسر عندما تملأ النواة أسفل التغصنات لوضع واحدة يدويا. انقر بزر الماوس الأيمن لإنهاء التتبع. تأكد من أن طول الزوائد الشجيرية المتتبعة لا يقل عن 7 ميكرومتر (الشكل التكميلي 3).
  6. تحقق من دقة التتبع الشجيري باستخدام جميع الاتجاهات الثلاثة للبيئة ثلاثية الأبعاد ، ودرجة الصوت ، والانحراف ، واللف ، عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر وسحب نافذة البيئة ثلاثية الأبعاد . حدد النقاط التي يكون فيها التتبع الشجيري خارج الموقع المناسب على الزوائد الشجيرية. يمكن أن تكون هناك حالات يبدو فيها تتبعها بدقة من أعلى إلى أسفل ، ولكن في البعد z ، لا تكون النقاط على الزوائد الشجيرية (الشكل 2).
  7. لتصحيح المقاطع الشجيرية التي تم تتبعها بشكل غير صحيح، انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب تحرير ضمن قائمة الشجرة . انقر بزر الماوس الأيسر فوق التغصنات محل الاهتمام ، ثم انقر بزر الماوس الأيسر فوق النقاط.
  8. انقل النقاط الموضوعة بشكل غير صحيح مرة أخرى إلى مقطع التغصنات عن طريق النقر والسحب. احذف النقاط الدخيلة بالنقر بزر الماوس الأيسر فوق النقطة والنقر فوق الزر حذف . قم بتغيير حجم النقاط إذا لم يتم ملء التغصنات بشكل كاف. لتغيير حجم النقطة، انقر بزر الماوس الأيسر فوق نقطة واضبط شريط تمرير السمك لتغيير الحجم (الشكل التكميلي 4).
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي التشعبات المملوءة بشكل غير كاف إلى تحديد الأشواك الكاذبة التي تشكل مكونات الجزء التغصني. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي الإفراط في ملء التشعبات إلى حجب العمود الفقري الحقيقي.
  9. كرر الخطوات 3.3-3.8 للتشعبات المتعددة في الصورة قبل المتابعة إلى تعريف العمود الفقري في الخطوة 3.10.
  10. انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب العمود الفقري في نافذة بيئة 3D. اضبط إعدادات الكشف للنطاق الخارجي والحد الأدنى للارتفاع والحد الأدنى لعدد Voxel. اعتمادا على الإعداد ، قد يلزم تغيير القيم المحددة مسبقا في حالة وجود مبرر واضح ومحدد للتغييرات. الشروط المحددة مسبقا هي النطاق الخارجي: 2.5 ميكرومتر ، الحد الأدنى للارتفاع: 0.3 ميكرومتر ، الحد الأدنى لعدد الفوكسل: 10 فوكسل.
    ملاحظة: ستتطلب الاستعدادات المختلفة ، مثل مزارع الخلايا مقابل الأنسجة الحادة ، بالإضافة إلى النقاط الزمنية التنموية المختلفة معايير مختلفة يجب اشتقاقها من الأدبيات الموجودة. من الضروري أيضا ملاحظة أن تغيير إعدادات الكشف يمكن أن يغير النتائج بشكل كبير. على سبيل المثال ، يمكن أن يستبعد الحد الأدنى للارتفاع الأعلى العمود الفقري القصير. يجب أن تظل إعدادات الاكتشاف متسقة طوال فترة التجربة بأكملها.
  11. اضبط حساسية الكاشف على 70٪ وانقر بزر الماوس الأيسر فوق اكتشاف الكل. سيؤدي ذلك إلى ملء العمود الفقري الذي تم تحديده بواسطة حساسية الكاشف هذه على جميع الزوائد الشجيرية. إذا كان تحديد العمود الفقري بطريقة خاصة بالتغصنات مطلوبا ، فانقر بزر الماوس الأيسر فوق المربع انقر فوق صورة لاكتشاف الكل في أقرب فرع، وانقر بزر الماوس الأيسر على كل تغصنات يدويا بحساسيات كاشف مختلفة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الطبيعي ألا تمتلئ جميع الأشواك المتغصنة. وبالمثل ، قد يتم ملء غير العمود الفقري بشكل غير صحيح. الحساسية الأولية بنسبة 70٪ مرنة أيضا ؛ قد يتغير هذا اعتمادا على التحضير.
  12. افحص العمود الفقري المحدد بواسطة حساسية الكاشف هذه عن طريق النقر على التغصنات وسحبها في جميع الاتجاهات الثلاثة. إذا لم يتم ملء غالبية العمود الفقري المكتشف بالكامل ، فانتقل إلى الخطوة 3.12.1. إذا تم ملء العمود الفقري الذي تم اكتشافه بشكل زائد ، فانتقل إلى الخطوة 3.12.2. إذا بدا أن العمود الفقري المكتشف ممتلئ بشكل كاف ، فانتقل إلى الخطوة 3.13.
    1. قم بزيادة حساسية الكاشف بنسبة 5٪ -10٪ وانقر بزر الماوس الأيسر فوق اكتشاف الكل مرة أخرى. سيحل هذا محل جميع الأشواك المكتشفة مسبقا بأخرى جديدة بحساسية أعلى. كرر حسب الحاجة حتى يتم ملء العمود الفقري المكتشف بشكل كاف.
    2. قم بتقليل حساسية الكاشف بنسبة 5٪ -10٪ وانقر بزر الماوس الأيسر فوق اكتشاف الكل مرة أخرى. سيحل هذا محل جميع الأشواك المكتشفة سابقا بأخرى جديدة بحساسية أقل . كرر حسب الحاجة حتى يتم ملء العمود الفقري المكتشف بشكل كاف.
  13. انقر بزر الماوس الأيسر فوق الاحتفاظ بالعمود الفقري الموجود في علامة التبويب العمود الفقري في بيئة 3D. إذا تم تحديد انقر فوق صورة لاكتشاف الكل في أقرب فرع ، فقم بإلغاء تحديده.
    ملاحظة: عن طريق تحديد الاحتفاظ بالعمود الفقري الموجود يضمن أن تحديد العمود الفقري التغصني حديثا يدويا لن يحل محل العمود الفقري المحدد مسبقا. تأكد من تحديد هذا المربع قبل المتابعة حتى لا تتم الكتابة فوق العمل السابق.
  14. انقر بزر الماوس الأيسر على Move Pivot Point وانقر بزر الماوس الأيسر على التغصنات التي تتطلب مزيدا من اكتشاف العمود الفقري لتعيين النقطة المحورية.
    1. قم بإلغاء تحديد نقل النقطة المحورية. تحديد العمود الفقري الشجيري غير المملوء. زيادة حساسية الكاشف 10٪ -20٪ بعد الكشف السابق وانقر بزر الماوس الأيسر على العمود الفقري. إذا كان العمود الفقري المكتشف أقل أو ممتلئا بشكل زائد ، فانتقل إلى الخطوة 3.14.3 أو 3.14.4. إذا لم تتم تعبئة العمود الفقري، فستظهر الرسالة تعذر اكتشاف عمود فقري في الموقع المحدد . في هذه الحالة ، انتقل إلى الخطوة 3.14.2.
    2. قم بزيادة حساسية الكاشف بشكل تدريجي ، ربما أعلى من 100٪ ، حتى يتم اكتشاف العمود الفقري وملئه بشكل كاف. إذا تم اكتشاف العمود الفقري ولكن لم يتم ملؤه بشكل كاف ، فانتقل إلى الخطوة 3.14.3. إذا كان العمود الفقري ممتلئا بشكل زائد ، فانتقل إلى الخطوة 3.14.4 (الشكل 3).
    3. انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب تحرير وانقر بزر الماوس الأيسر على العمود الفقري غير المملوء. انقر بزر الماوس الأيسر على إزالة. قم بإلغاء تحديد علامة التبويب تحرير . قم بزيادة الحساسية بنسبة 5٪ -10٪ وانقر بزر الماوس الأيسر على العمود الفقري. كرر هذه الخطوة إذا كان العمود الفقري لا يزال ممتلئا بأقل من اللازم.
    4. انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب تحرير وانقر بزر الماوس الأيسر على العمود الفقري المملوء. انقر بزر الماوس الأيسر على إزالة. قم بإلغاء تحديد علامة التبويب تحرير . قلل الحساسية بنسبة 5٪ -10٪ وانقر على العمود الفقري. كرر هذه الخطوة إذا كان العمود الفقري لا يزال ممتلئا.
  15. كرر الخطوات 3.14-3.14.4 حتى يتم اكتشاف جميع الأشواك التي تم تحديدها بواسطة التعريف البصري. تحقق مرة أخرى من الزوائد الشجيرية بحثا عن أي أشواك تنتمي إلى الزوائد الشجيرية المجاورة ، أو أشواك كاذبة لا تتوافق مع أي إشارة حقيقية ، أو أجزاء محتملة من الزوائد الشجيرية تم تصنيفها خطأ على أنها عمود فقري. احذف هذه الأشواك الخاطئة باستخدام وظيفة الإزالة .
  16. فحص العمود الفقري المحدد على التغصنات. في بعض الحالات ، قد تظهر أشواك متعددة كعمود فقري تكتل واحد. إذا ظهر أن العمود الفقري يشمل اثنين، فانقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب تحرير . انقر بزر الماوس الأيسر فوق العمود الفقري وانقر بزر الماوس الأيسر فوق إخفاء التحديد. بعد تأكيد العمود الفقري للتكتل ، في علامة التبويب تحرير ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق إظهار التحديد وحدد تقسيم. إذا كان هناك أكثر من عمودين فقودين في تكتل واحد ، فقد يلزم تكرار هذه الخطوة (الشكل 4).
    ملاحظة: إذا لم ينقسم العمود الفقري للتكتل بعد الخطوة 3.16 ، فقم بإزالة العمود الفقري. ثم حدد العمود الفقري الأكثر كثافة للتكتل بحساسية أقل. بمجرد ملء العمود الفقري الأكثر كثافة ، قم بزيادة الحساسية لتحديد العمود الفقري الآخر غير المملوء. بدلا من ذلك ، قد يسمح حذف العمود الفقري للتكتل ثم زيادة الحساسية بالتقسيم المناسب.
  17. مع اكتشاف جميع الأشواك التي يمكن التعرف عليها بصريا وتعبئتها بشكل مناسب ، في علامة التبويب العمود الفقري ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق تصنيف الكل لتصنيف العمود الفقري إلى أربعة أنواع فرعية: رقيقة ، فطر ، قصير ، وفيلوبوديا (الشكل 5).
    ملاحظة: قد يتم تغيير معلمات تصنيف العمود الفقري في الإطار إعدادات من المربع تصنيف في علامة التبويب العمود الفقري . كما هو الحال مع إعدادات الكاشف ، يتم تشجيع الأساس المنطقي الواضح لتغيير المعلمات الحالية. القيم المحددة مسبقا هي نسبة الرأس إلى الرقبة: 1.1 ، نسبة الطول إلى الرأس: 2.5 ، حجم رأس الفطر: 0.35 ميكرومتر ، طول Filopodium- 3 ميكرومتر.
  18. في شريط الأدوات العلوي لنافذة بيئة 3D ، حدد حفظ وعرض في مستكشف Neurolucida. مستكشف Neurolucida هو المكان الذي يتم فيه جمع البيانات من عمليات التتبع. سيتم حفظ العمل كملف .dat يحتوي على جميع عمليات التتبع والعمود الفقري.
  19. ضمن نافذة Explorer في علامة التبويب عرض ، انقر بزر الماوس الأيسر فوق تحديد الكل لتمييز جميع التشعبات والأشواك.
  20. انقر بزر الماوس الأيسر فوق علامة التبويب تحليل في شريط الأدوات العلوي. انقر بزر الماوس الأيسر فوق القائمة المنسدلة Structure. انقر بزر الماوس الأيسر فوق تحليل الهيكل المتفرع.
  21. اعتمادا على المتغيرات ذات الاهتمام ، يمكن اختيار أي من التحليلات. أكثر الأسئلة فائدة للأسئلة التي تتمحور حول كثافة العمود الفقري ومتوسط حجم العمود الفقري هما كل شجرة > كل تغصنات والعمود الفقري > تفاصيل العمود الفقري. حدد موافق ، وستظهر البيانات في نافذتين منفصلتين.
  22. انسخ البيانات إلى جدول بيانات لمزيد من التجميع والتحليل.
    ملاحظة: سيتم فصل الشجرة الفردية بواسطة التغصنات ، لكن حجم العمود الفقري لن يكون. باستخدام وظيفة الفرز في جدول البيانات ، يمكن تصفية تفاصيل العمود الفقري حسب الميزات.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدأ الاستخدام الفعال لطريقة التحليل هذه باختيار الأجزاء المتغصنة للتتبع. كما هو موضح في الشكل 1، لا تقع الزوائد الشجيرية المثالية للتتبع على مقربة من الزوائد الشجيرية الأخرى. يمكن أن تؤدي الزوائد الشجيرية التي تعمل على التوازي إلى تحديد الأشواك بشكل غير صحيح من الزوائد الشجيرية المجاورة. تضيف الزوائد الشجيرية التي تتقاطع مباشرة أو تعمل بشكل عمودي في مستوى z مختلف صعوبة كبيرة في التتبع الشجيري الدقيق أيضا. من المهم أيضا ملاحظة الاختلافات في سمك التغصنات. كما ذكر سابقا ، هناك اختلافات رئيسية في كثافة العمود الفقري مع الزوائد الشجيرية متفاوتة السماكة36. يمكن أن تكون هناك أيضا اختلافات في نفس الزوائد الشجيرية مع زيادة المسافة من نقطة الفرع37. يمكن لتتبع التشعبات من نفس الترتيب والسمك ، من الناحية المثالية مع أصول نقطة فرع مماثلة ، التحكم في عدم التجانس الحالي لكثافة العمود الفقري التغصني. قد يكون تحديد نقطة الفرع في بعض المستحضرات غير ممكن ، ولكن يجب أن يكون سمك الزوائد الشجيرية دائما عاملا يمكن التحكم فيه في تتبع الزوائد الشجيرية. يعد التتبع الدقيق للقطاعات المتغصنة أمرا حيويا للحصول على نتائج دقيقة من هذا التحليل. من الضروري التأكد من أن جميع نقاط الزوائد الشجيرية المتتبعة هي حقا داخل الزوائد الشجيرية. يمكن أن يساعد عرض الزوائد الشجيرية ثلاثية الأبعاد من اتجاهات مختلفة في هذه العملية. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، ب ، يوضح العرض من أعلى إلى أسفل ما يبدو أنه تغصنات تم تتبعها بشكل صحيح. في المنظر الجانبي ومع ذلك ، لا توجد العديد من النقاط على التغصنات نفسها. هذه المشكلات غير موجودة في العرض الجانبي للشكل 2C. من الضروري أيضا ضمان ملء الزوائد الشجيرية بشكل صحيح أثناء التتبع. يمكن أن تؤدي الزوائد الشجيرية غير المملوءة جيدا إلى تحديد قطع من الزوائد الشجيرية بشكل غير مناسب على أنها أشواك. يمكن أن تمنع التغصنات المملوءة بشكل مفرط التعرف على العمود الفقري الحقيقي بسبب الحد الأدنى للارتفاع. يعد هذا التقييم اليدوي للتتبع الموجه للمستخدم أمرا بالغ الأهمية للسماح بتحليل دقيق للعمود الفقري المتغصن.

يتطلب تحديد العمود الفقري التغصني أيضا نهجا موجها للمستخدم. استخدام وظيفة "كشف الكل" لتعيين عتبة حساسية الكاشف الموحدة غير كاف لأسباب عديدة. يعد استخدام ميزة "اكتشاف الكل" مفيدا لتحديد العمود الفقري الأكثر وضوحا بشكل صارخ ، ولكن يجب التحقق من ملء هذه الأشواك للتحقق. قد تكون الأشواك المحددة مع "اكتشاف الكل" الأولي ناقصة. لتصحيح ذلك ، يجب حذف العمود الفقري المحدد بشكل فردي ثم إعادة تحديده يدويا بحساسية كاشف أعلى (الشكل 3A-C). هذا يضمن ملء العمود الفقري بشكل كاف. هناك عدم تجانس كبير في حساسية الكاشف المطلوبة للأشواك التي يجب حسابها يدويا. قد تؤدي زيادة حساسية الكاشف للكشف عن كل شيء إلى امتلاء العمود الفقري بشكل مفرط ، الأمر الذي يتطلب تصحيحا يدويا أيضا (الشكل 3D). هناك مشكلة إضافية تتعلق بحساسية الكاشف غير الصحيحة وهي الإنشاء غير المناسب للعمود الفقري المتكتل ، وهو عمود فقري شجيري مملوء يشمل أشواك متعددة. يمكن دمج عمودين فقودين على مقربة من بعضهما البعض بشكل غير صحيح في عمود فقري تكتل واحد (الشكل 4 أ ، ب). يحتوي برنامج الكشف عن العمود الفقري على ميزة "Split" ، والتي يمكن استخدامها لفصل العمود الفقري الذي تم دمجه عن طريق الملء الزائد. تسمح ميزة "الانقسام" بتوليد العمود الفقري الفردي بسهولة من العمود الفقري التكتلي (الشكل 4C). يسمح التتبع الدقيق للتغصنات وملء العمود الفقري التغصني بالتصنيف الدقيق إلى أنواع فرعية من العمود الفقري. يعتمد تصنيف العمود الفقري على التشكل من الأشواك المملوءة والمسافة من التشعبات ، لذلك تلعب كل خطوة في العملية دورا في التصنيف المورفولوجي (الشكل 5).

نظرا لضرورة الاختيار اليدوي وتحديد الحدود ، من الأهمية بمكان اتباع معيار موحد لجميع التحليلات. هذا مهم بشكل خاص إذا ساهم العديد من المستخدمين في تحليل البيانات. للتأكد من أن جميع المحققين الذين يجرون التحليل يتبعون نفس المعيار ، يجب على الباحثين مقارنة البيانات من نفس الزوائد الشجيرية التي تم تتبعها. يمكن أن يقلل هذا من احتمالية تحيز المجرب من خلال التأكد من أن كل باحث يحدد العمود الفقري بناء على معايير مشتركة وموحدة بطريقة عمياء. هناك أيضا احتمال التحيز من باحث واحد بين الأيام أو حتى في نفس اليوم بسبب التعب. يجب مراقبة ذلك طوال عملية تحليل البيانات. لمزيد من ضمان صحة التحليل ، فإن مقارنة النتائج الأولية بتلك المنشورة في الأدبيات تضمن اتباع البروتوكول بشكل فعال. من الأهمية بمكان ملاحظة أن هذه المقارنة لن تكون فعالة إلا إذا تمت مشاركة الإعداد والمعلمات. يمكن أن تساهم الاختلافات في التلوين أو الحصول على إشارات الفلورسنت أو ترتيب وسمك التشعبات أو منطقة الدماغ في نتائج مختلفة 8,36. في حالة فقدان النتائج المنشورة ، فإن استخدام العديد من الباحثين للتحقق من صحة تحديد العمود الفقري يسمح بزيادة الثقة في موثوقية التحليل وإمكانية استنساخه. تم تضمين مجلد تحليل تكميلي في هذه المخطوطة. يحتوي هذا المجلد على ملفات لنماذج صور للمقاطع الشجيرية، والتشعبات المتتبعة، والتشعبات المتتبعة ذات الأشواك المحددة والمصنفة، ومخرجات البيانات (الجدول التكميلي 1، والملف التكميلي 1، والملف التكميلي 2، والملف التكميلي 3، والملف التكميلي 4). يمكن للمستخدمين الجدد التدريب على مجموعة البيانات هذه لممارسة الإجراءات الموضحة في هذه الورقة. تعتبر النتائج التي ينشئها المستخدم في حدود 10٪ من مجموعة بيانات العينة المقدمة مقبولة لإعادة إنتاج معيار التحليل. نظرا للمعايير الذاتية المحتملة للعمود الفقري المملوء بالكامل والحاجة إلى الفحص اليدوي للأشواك المكتشفة تلقائيا ، يعد التباين بين الباحثين وداخلهم جزءا طبيعيا من التحليل. إذا تجاوزت النتائج المتولدة تلك العتبة؛ ومع ذلك ، يجب إجراء مقارنة جنبا إلى جنب لتحديد حالات أحجام العمود الفقري المختلفة وكذلك العمود الفقري المدرج أو المستبعد بشكل غير صحيح. يمكن بعد ذلك إعادة تحليل مجموعة البيانات النموذجية حتى يتم الوصول إلى الحد المقبول.

figure-results-1
الشكل 1: اختيار الزوائد الشجيرية لتحليل العمود الفقري التغصني. (أ) عرض بحجم 3D للصور البؤرية البؤرية z-stack المأخوذة من التشعبات القريبة CA1 في خط الماوس المعدل وراثيا THY1-YFP. لاحظ عدم تجانس ترتيب الزوائد الشجيرية مع الزوائد الشجيرية الأولية السميكة في الأشكال البيضاوية الزرقاء والتشعبات الأرق والثانوية والثالثية في الأشكال البيضاوية الوردية. (ب) يشار إلى المرشحين المثاليين لتتبع الزوائد الشجيرية بأشكال بيضاوية خضراء. لاحظ سمك التقاطعات والتداخلات المحدودة والقرب من الزوائد الشجيرية الأخرى. يشير الشكل البيضاوي الأحمر إلى الأجزاء المتغصنة التي يجب تجنبها لتتبع التغصنات بسبب التقاطعات العالية والتداخلات والقرب من الزوائد الشجيرية الأخرى. كما أن الزوائد الشجيرية الأولية الأكثر سمكا ليست مرشحة مناسبة للتعقب. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تتبع الأجزاء المتغصنة بدقة. (أ) عرض بحجم 3D لصور z-stack متحدة البؤر مأخوذة من التشعبات القريبة CA1 في خط الماوس المعدل وراثيا THY1-YFP ليتم تتبعها عبر طريقة النواة الاتجاهية الموجهة من قبل المستخدم. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (ب) مثال على ضعف تتبع الزوائد الشجيرية. يبدو أن الزوائد الشجيرية يتم تتبعها بشكل صحيح في العرض من أعلى إلى أسفل. يوضح المنظر الجانبي أن الزوائد الشجيرية مملوءة بشكل غير صحيح بنقاط تنحرف عن الزوائد الشجيرية. ج: مثال على تتبع الزوائد الشجيرية بشكل صحيح. يبدو العرض من أعلى لأسفل مشابها ل B ، لكن العرض الجانبي يختلف اختلافا كبيرا. يتم تتبع الزوائد الشجيرية في C بشكل صحيح كما هو موضح من خلال امتلائها بالكامل دون أي انحرافات عن الزوائد الشجيرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: ملء الأشواك المتغصنة بدقة باستخدام التحديد اليدوي. (أ) عرض بحجم 3D للصور متحدة البؤر z-stack المأخوذة من التشعبات القريبة CA1 في خط الماوس المعدل وراثيا THY1-YFP للعمود الفقري في انتظار الكشف اليدوي. شريط المقياس = 0.5 ميكرومتر. (ب) مثال على العمود الفقري الشجيري غير المملوء. هناك إشارة فلورسنت كبيرة لا تزال مرئية بسبب التعبئة غير المكتملة. ج: مثال على العمود الفقري التغصني المملوء بشكل صحيح. إن وجود "هالة" من الإشارة بالكاد مرئية حول الجزء الخارجي من الحشوة هو المعيار لملء الأشواك المتغصنة بدقة. د: مثال على العمود الفقري التغصني المملوء. حساسية الكاشف عالية جدا ، مما يؤدي إلى امتلاء العمود الفقري. لقد تجاوز الحشو حدود التألق وله هالة غير محسوسة تقريبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تقسيم الأشواك الشجيرية التكتلية. (أ) عرض بحجم 3D للصور متحدة البؤر z-stack المأخوذة من التشعبات القريبة CA1 في خط الماوس المعدل وراثيا THY1-YFP مع اثنين من العمود الفقري على مقربة. شريط المقياس = 0.15 ميكرومتر. (ب) مثال على عمودين مستقلين مملوءين بشكل غير صحيح كعمود فقري شجيري تكتل واحد. (ج) بعد استخدام ميزة "الانقسام" ، ينقسم العمود الفقري التكتلي إلى عمودين شجيريين متميزين مملوءين بشكل صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحديد العمود الفقري التغصني وتصنيفه إلى أنواع فرعية. (أ) عرض بحجم 3D للصور متحدة البؤر z-stack المأخوذة من التشعبات القريبة CA1 في خط الفأر المعدل وراثيا THY1-YFP لجزء شجيري متتبع معزول لتحديد كمية العمود الفقري التغصني وتصنيفه. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (ب) تتبع الجزء التغصني مع تحديد جميع الأشواك المتغصنة وفحصها لضمان الحشو والانقسام المناسبين. يقوم البرنامج بتعيين الألوان بشكل تعسفي للأشواك المحددة في هذه الخطوة. (ج) تصنيف جميع الأشواك المتغصنة المحددة إلى أنواع فرعية باستخدام معلمات محددة في البرنامج. الأزرق = الفطر ، الأصفر = رقيقة ، والأخضر = قصير. Filopodia غير موجودة بسبب عمر هذا النسيج. (د) صور تمثيلية للفطر والأشواك الرفيعة والقصيرة غير مملوءة (أعلى) ومملوءة (أسفل). شريط المقياس = 0.3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: الوصول إلى بيئة 3D. Z-stack من الصور متحدة البؤر التي يتم عرضها في واجهة البرنامج. تم تمييز التنقل في بيئة 3D من علامة التبويب "تتبع " في العارض الرئيسي باللون الأصفر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: معلمات الصورة وإعدادات الاتجاه لبيئة 3D. عارض بيئة 3D لصور z-stack متحدة البؤر. يتم تعيين المعلمات في علامة التبويب تغيير عرض الصورة المميزة المشار إليها بأسهم صفراء إلى عرض الصورة باسم: 3D Volume وإظهار Surface As: Max Projection. يتم تحديد تحريك النقطة المحورية وإعادة تعيين الاتجاه بواسطة الأسهم الصفراء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: تتبع مقطع الزوائد الشجيرية. (أ) حجم 3D من الصور متحدة البؤر z-stack لتتبع التغصنات. مع تحديد علامة تبويب الشجرة والنواة الموجهة للمستخدم والاتجاهية ، يبدأ التتبع بوضع النواة الأولية على التغصنات بنقرة يسرى. ب: انتشار حبات اتجاهية لأسفل الزوائد الشجيرية بعد حركة المؤشر. (ج) يؤدي النقر بزر الماوس الأيسر لأسفل الزوائد الشجيرية إلى ملء حبات الاتجاه. د: مثال على حبات اتجاهية لا تملأ الزوائد الشجيرية. بدلا من ذلك ، توجد نواة وحيدة أسفل المقطع. (ه) يؤدي النقر بزر الماوس الأيسر على النواة الحرة إلى ملء الزوائد الشجيرية بين النقطتين. يؤدي النقر بزر الماوس الأيمن إلى إنهاء عملية التتبع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: ضبط النقاط في الزوائد الشجيرية المتتبعة. (أ) تتبع مقطع الزوائد الشجيرية في انتظار تعديل النقطة. يتطلب تحرير التغصنات تحديد علامة التبويب "شجرة" وعلامة التبويب "تحرير". كلاهما مظلل باللون الأصفر. تم اختيار Dendrite للتحرير بنقرة يسرى. (ب) يتيح تحديد علامة تبويب النقاط، المميزة باللون الأصفر، اختيار نقاط منفردة على قطعة الزوائد الشجيرية. النقطة الخضراء سمكها 1.2 ميكرومتر. (ج) نقطة معدلة لملء الزوائد الشجيرية بدقة أكبر. قيمة السماكة الجديدة للنقطة الخضراء هي 0.6 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: نتائج تحليل الصور النموذجية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: عينة من تتبع الصور باستخدام التشعبات spines.dat الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تتبع العينات مع dendrites.dat الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: نموذج صورة التغصنات file.czi الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: نموذج صورة تغصنات file.jpx الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يفصل هذا البروتوكول الخطوات المحددة لإعداد العينات والتصوير وعملية تقدير وتصنيف العمود الفقري التغصني باستخدام برنامج إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. هذا البرنامج هو أداة قوية قادرة على إنتاج بيانات هيكلية قوية تساهم في مجموعة متنوعة من التحقيقات. طوال العملية ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تجعل هذا البروتوكول أقل عبئا منهجيا وتعزز الناتج الإجمالي للبيانات. تعد طريقة تسمية العمود الفقري التغصني واحدة من أول الأشياء التي يجب على الباحثين مراعاتها قبل الشروع في هذا البروتوكول. يمكن أن تنشأ مشكلات القياس الكمي للعمود الفقري من طرق وضع العلامات غير الكافية. يمكن أن يؤدي تلطيخ بعض البروتينات المعبر عنها بمستويات منخفضة في العمود الفقري إلى إشارات منخفضة جدا بالنسبة للبرنامج. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه يمكن إدخال التحيز من خلال تتبع ألمع التشعبات الفلورية. في حين أنه من غير الواضح ما إذا كانت الزوائد الشجيرية الفلورية المختلفة لها خصائص فسيولوجية مختلفة ، إلا أنها لا تزال قيدا على البروتوكول يجب مراعاته. بالإضافة إلى ذلك ، في بعض الخطوط المعدلة وراثيا ، مثل خط THY1-YFP-H ، لا يظهر التألق في العمود الفقري التغصني حتى حوالي P21. هذا يجعل هذا الخط غير مناسب للتحقيقات في النقاط الزمنية التنموية الأصغر سنا. إن النظر في الطريقة المستخدمة لتسمية العمود الفقري لطريق التحقيق ليس جانبا تافها ، لأنه بدون مضان كاف ، فإن البرنامج قد قلل من قابلية الاستخدام. وبالمثل ، تتطلب أجهزة الحصول على الصور النظر. هناك بعض أنواع الملفات التي تثبت أنها أقل توافقا مع برنامج التحليل من غيرها. على وجه التحديد، تم تحديد ملفات ND2 كأنواع ملفات إشكالية للاستخدام الفعال للبرنامج. يوصي موفرو البرامج بالتحويل إلى أنواع ملفات مثل JPEG2000 في حالة حدوث مشكلات.

يعد تحضير الأنسجة والحصول على الصور أيضا خطوات مهمة لقياس العمود الفقري عالي الجودة. يضمن التثبيت السليم للأنسجة وتقطيعها وتركيبها عينة طويلة الأمد مع الحد الأدنى من القطع الأثرية التي يمكن أن تتداخل مع تحليل البيانات. كما أن تصوير الأنسجة ليس مجرد مسألة التقاط صور z-stack لشريحة الدماغ بأكملها. أثناء التصوير ، يجب أن يكون القصد دائما هو الحصول على مداخن تحتوي على التشعبات لتحديد كمية العمود الفقري. يجب التركيز على الحصول على مداخن z التي تتضمن التشعبات التي سيكون من السهل تتبعها. عادة ما ينتج عن مكدس z الأكثر سمكا المزيد من التشعبات الخلفية. هذا يجعل من الصعب تتبع التشعبات بشكل فعال مع البرنامج. إن أخذ وقت إضافي أثناء التصوير للعثور على مرشحين أفضل للتتبع سيوفر المزيد من الوقت أثناء التحليل الكمي للعمود الفقري. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن صور z-stack تتضمن التشعبات بالكامل المراد تتبعها. إذا كانت التشعبات قابلة للعرض جزئيا فقط في z-stack ، فإن تتبع التشعبات وتحديد العمود الفقري سيثبت أنه صعب وغير دقيق بسبب عرض 3D غير المكتمل.

يمكن أن تكون عملية تتبع التشعبات والحصول على ملف تعريف دقيق للأشواك المتغصنة المحددة عملية شاقة. هناك درجة من الفروق الدقيقة في ذلك. أثناء تتبع التغصنات ، لا يمكن أن تعمل الوظيفة الموجهة للمستخدم في بعض الأحيان على النحو المنشود. في بعض الأحيان ، لن تملأ النواة الاتجاهية على جزء معين أو تبدأ في ملء جزء غير مرغوب فيه. تتمثل إحدى طرق التحايل على ذلك في البدء بعرض عملية نموذجي أصغر. هذا يجعل التغصنات أكثر قابلية للكشف في البرنامج ، مما يسمح بتتبع أسهل. إذا فشلت النواة الاتجاهية في الملء بالكامل ، فإن النقر بزر الماوس الأيسر على التغصنات سيضع واحدة يدويا. سيصل إلى نقطة صغيرة جدا ولن يملأ التغصنات ، ولكن يمكن تصحيح ذلك بتعديل السماكة كما هو موضح في الخطوة 3.8 من البروتوكول. بينما يمكن تتبع التشعبات يدويا إذا ثبت أن البرنامج غير كاف ، فإن تتبع العمود الفقري يدويا ليس من قدرات البرنامج. ستكون هناك حالات يظهر فيها العمود الفقري الواضح مرئيا ، ولكن بغض النظر عن مدى ارتفاع حساسية الكاشف ، سيفشل البرنامج في اكتشافه. شيء واحد يجب التحقق منه هو ما إذا كان العمود الفقري المشتبه به خارج النطاق. إذا كان في النطاق ولكن لم يتم تحديده بواسطة البرنامج ، استبعاد هذا العمود الفقري من التحليل. في حين أن هذا قد يحدث نادرا ، إلا أنه قيد يجب مراعاته. كما هو الحال مع أي تحليل يتطلب عتبة ومكون تصنيف يدوي ، هناك إمكانية لإدخال التحيز. يمكن أن تتفاقم هذه المشكلة عند مقارنة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة عدة مستخدمين. تسعى الطبيعة شبه الآلية لهذا التحليل إلى تقليل إدخال هذا التحيز ، ولكن لم يتم القضاء عليه بالكامل. في مختبرنا ، كان التباين بنسبة 10٪ بين الباحثين في مجموعة بيانات قياسية معقولا مع الممارسة والتدريب الكافيين. بينما بذلت جهود لتقليل التحيز ، لا يزال من المهم مراعاة التحيز بين الباحثين عند تقييم البيانات التي تم إنشاؤها من خلال هذا البروتوكول.

مع الأخذ في الاعتبار العيوب الطفيفة للبرنامج ، فإن ناتج تحليل العمود الفقري التغصني باستخدام هذه التقنية قوي للغاية. كما هو موضح سابقا ، هناك عدد لا يحصى من المقاييس التي يمكن استقرائها من تتبع المقطع الشجيري الدقيق وتحديد العمود الفقري. توفر القدرة على الحصول على معلومات النوع الفرعي للعمود الفقري رؤية قيمة على مستوى أعمق من المقاييس الأساسية. هذه البيانات مهمة بسبب الترابط بين الهيكل والوظيفة. يشير كل نوع فرعي من العمود الفقري إلى وظيفة. العمود الفقري الرقيق هو النوع الفرعي السائد الذي يخضع لدوران وفير21. الأشواك الرقيقة لديها أيضا القدرة على التطور إلى أشواك الفطر38. هذا يتوافق مع أشواك الفطر المرتبطة بقوة بالتعلم والذاكرة38,39. بالإضافة إلى ذلك ، يعتقد أن العمود الفقري القصير هو أحد مكونات التعلم ، وربما يكون من بقايا أشواك الفطر40. Filopodia ، على الرغم من عدم انتشارها في العديد من الأنسجة البالغة ، هي سلائف العمود الفقري التي لها أهمية رئيسية في التنمية 41,42. يظل المجهر الإلكتروني 3D هو المعيار الذهبي للتصنيف الأكثر دقة للأنواع الفرعية للعمود الفقري. على الرغم من قيمة هذه التقنية ، إلا أنها محدودة بالفرز والتصنيف اليدوي الشاق المعرضين للأخطاء البشرية. يقلل التصميم شبه الآلي لهذا التحليل من الحالات التي يمكن فيها إدخال التحيز الذاتي. في حين أنه قد تكون هناك عيوب من حيث الدقة المطلقة وكثافة التألق المطلوبة لإجراء تصنيفات مثالية في هذا البروتوكول ، إلا أنه لا يزال يوفر بديلا أقل ضرائبا من الناحية المنهجية للمجهر الإلكتروني 3D والتصنيف اليدوي. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء تحليل تغصني كامل لفروع تغصنية متعددة من مجموعة أوسع من مناطق الدماغ باستخدام التحليل الموضح في هذا العمل. هذا ليس هو الحال مع المجهر الإلكتروني. من خلال استخدام هذا البروتوكول ، من الممكن معالجة الأسئلة التي تركز على الهيكل في تخصصات متعددة ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر اللدونة المشبكية ، والتنمية ، والاضطرابات العصبية والنفسية ، بطريقة موثوقة وقابلة للتكرار.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لكارولين سميث وسارة ويليامز أفرام وتيد أوسدين و NIMH SNIR للمساعدة الفنية. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لمجموعة دراسة أبحاث الطب الحيوي بجامعة كولجيت. يتم دعم هذا العمل من قبل برنامج NIMH الداخلي (1ZIAMH002881 إلى Z.L.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F زيت الغمرZeiss444960-0000-000
CryostatLeicaCM3050Sلتحضير الشريحة
ملقط ناعمFST11150-10
ملقط الإرقاءFST13020-12
مقص جراحي كبيرFST14002-16
LSM 880 مجهر متحد البؤرZeissLSM 880
غطاء مجهرزجاجي فيشربراند12-541-035
مضخة تمعجية صغيرة IIجهاز هارفارد70-2027للتروية
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1برنامج تحليل العمود الفقري
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1برنامج تحليل العمود الفقري
OCT Compoundساكورا فينيتيك4583لتقسيم ناظم البرد
بارافورمالدهيد (37٪)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x / 1.40 Oil DICZeiss440762-9904-000
شفرة مشرطFST10022-00
مقص جراحي صغيرFST14060-09
ملعقة  FST10091-12
السكروزFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus MicroslidesdiaggerES4951 +
Vectashield HardSet تصاعد مختبرات ناقلات متوسطةH-1400-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).">Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).">Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).">Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).">Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).">Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).">Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).">Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).">Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).">Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).">Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).">Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).">Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).">Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).">Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).">Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).">Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).">Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).">Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).">Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).">Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).">Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).">Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).">Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).">Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).">Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).">Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).">Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).">Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).">Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).">Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).">Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).">Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).">Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).">Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).">Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).">Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).">Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).">Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).">Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).">Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).">Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationThree Dimensional Neuron ReconstructionDendritic Spine AnalysisSpine DensitySpine Head VolumeSpine Subtype ClassificationSynaptic PlasticityNeurolucida 360Hippocampal DendritesSpine Morphology

Related Articles