تقدم هذه الدراسة تقنيتين تجريبيتين حاسمتين: بناء نموذج جرح الفئران لتقييم إغلاق الجرح وإعداد معلقات أحادية الخلية من جلد الفئران للحفاظ على حيوية الخلية.
مقالة منهجية
نماذج جروح الفئران وتحضير معلقات الخلايا المفردة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = "jove_content" > تمثل إدارة إصابات الجلد الحادة ذات السماكة الكاملة تحديا كبيرا في الممارسة السريرية. إن تعقيد التئام الجروح ، الذي يشمل مجموعات الخلايا المتنوعة والبيئة الدقيقة المعقدة للجروح ، يعقد تقييم آثار العلاج وتفاعلاتها باستخدام الأساليب التجريبية التقليدية. أحدثت تقنية تسلسل النسخ أحادي الخلية ثورة في فهم الوظائف والآليات الخلوية أثناء التئام الجروح. ومع ذلك ، فإن التباين في منهجيات إنشاء نماذج جرح الفئران يقدم عوامل مربكة يمكن أن تؤثر على النتائج التجريبية. علاوة على ذلك ، تمثل عملية فصل أنسجة جلد الفئران عقبات فنية كبيرة ، مما يسلط الضوء على الحاجة الماسة إلى معلقات أحادية الخلية عالية الجودة لتسلسل النسخ الدقيق. لذلك ، تهدف هذه الدراسة إلى تحسين بناء نماذج جرح الفئران لتقييم التغييرات في إغلاق الجرح بدقة مع التخلص من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على نتيجة التسلسل اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تحضير المعلقات أحادية الخلية باستخدام كل من بروتوكولات تحضير الإنزيم وبروتوكولات مجموعة الاختبار لتحسين التكلفة والفعالية.
المقدمة
الفأر هو نموذج حيواني معترف به على نطاق واسع في البحث لتسلسله الجيني المتماثل للغاية للبشر ، والتكاثر السريع ، والفعالية من حيث التكلفة ، والحجم الذي يمكن التحكم فيه < فئة الدعم = "xref">1. ومع ذلك ، توجد اختلافات في بنية الجلد بين الفئران والبشر. تحتوي الفئران على طبقة غشاء جلدية مميزة تساهم في تقلص الجلد ، وتلعب دورا مهما في التئام الجروح في هذا النوع. في المقابل ، يتضمن التئام الجروح البشرية في المقام الأول إعادة تكوين الظهارة وتكوين الأنسجة الحبيبية < فئة الدعم = "xref" >1.
على الرغم من هذه الاختلافات بين الأنواع في بنية الجلد ، يظل نموذج الفأر هو الخيار المفضل في أبحاث إصلاح الجروح ويحتفظ بأهمية كبيرة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى< فئة الدعم = "xref" >2،< sup class = "xref">3. عند استخدام جلد الفأر لتقليد عمليات التئام الجروح البشرية ، من الضروري النظر بعناية في العوامل المؤثرة المختلفة. تشمل هذه العوامل اختيار المواقع المناسبة للعمليات الجراحية ، وحساب دورة بصيلات شعر الفأر ، وفهم آثار تقلص الغشاء الجلدي < فئة sup = "xref" >4 ، < sup class = "xref" >5. يعد تنفيذ التدابير المقابلة أمرا حيويا لتحسين الظروف التجريبية وتحسين دقة نتائج الملاحظة.
تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) يقوم بتسلسل الخلايا بمستوى أكثر دقة بكثير من تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدي وله متطلبات أعلى بكثير لجودة العينة مع الحد الأدنى من الاختلافات داخل المجموعة. أجريت تجارب متعددة لتحسين نموذج عيب جلدي حاد كامل السماكة للفأر المستقر استخدمت هذه التجارب مزيجا من الأساليب المعمول بها من الأدبيات والأساليب المبتكرة لتقييم التئام الجروح بشكل شامل< sup class = "xref" >2 ، < sup class = "xref" >5. لتطوير نموذج التئام الجروح ، تم استخدام استئصال الجلد بكامل السماكة للفأر لتكرار العملية الفسيولوجية لإصلاح الجروح وتجديدها. كان هدفها هو تقييم التغيرات المحتملة التي تسببها العلاجات المختلفة باستخدام scRNA-seq. يشكل تفكك أنسجة الجلد من الفئران تحديات ، بما في ذلك انخفاض قابلية الخلايا للحياة ومعدلات التجميع العالية ، أثناء تحضير المعلقات أحادية الخلية < فئة sup = "xref" >6. قد تؤدي هذه الصعوبات إلى مشكلات مثل انسداد الأجهزة والتقاط الخلايا الشاذة ، مما قد يضر بجودة البيانات. نظرا للتكلفة الكبيرة للتسلسل أحادي الخلية ، فإن إجراء تجارب أولية متعددة أمر بالغ الأهمية لضمان استقرار وموثوقية التعليق أحادي الخلية. قيمت هذه الدراسة فعالية تفكك الإنزيم المختلط وطريقة تفكك مجموعة الأنسجة لتحديد النهج الأمثل لتفكك الأنسجة< فئة الدعم = "xref">6 ، < sup class = "xref" >7. تضع هذه الدراسة أساسا قويا لمزيد من التحقيقات المتعمقة.
البروتوكول
< p class = "jove_content" >تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للمركز الطبي السابع لمستشفى جيش التحرير الشعبى الصيني العام ، الصين. تم استخدام ذكور الفئران C57 / BL6 التي تتراوح أعمارها بين 6 أسابيع.
< p class = "jove_title" >1. نموذج التئام الجروح في الفأر
- تجميع
-
قم
- بتعيين الفئران بشكل عشوائي لمجموعات التجربة والضابطة (6 لكل منهما). الفئران المنزلية في منشأة حيوانية محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 23-25 درجة مئوية ، والرطوبة عند 50٪ -60٪ ، ودورة الضوء والظلام لمدة 12 ساعة.
- تزويد الفئران بوصول غير مقيد إلى الطعام القياسي وماء الصنبور المعقم.
- التحضير قبل الجراحة
- قم بتقييد الماوس برفق باستخدام مصفاة أو عن طريق إمساك الماوس بإحكام في وضع الانبطاح. قم بتحميل المحقنة ب 1٪ من الصوديوم البنتوباربيتال الذي تم إعادته إلى درجة حرارة الغرفة ، ويتم إعطاؤه بجرعة 0.1 مل / 20 جم من وزن الجسم.
ملاحظة: يجب تخزين محلول البنتوباربيتال الصوديوم بنسبة 1٪ في بيئة مظلمة عند 4 درجات مئوية. - نظف بطن الفأر بمسحات قطنية كحولية. أدخل المحقنة بزاوية طفيفة في البطن. الشفط قبل الحقن لمنع الإعطاء غير المقصود في المثانة أو الأمعاء. انتظر لمدة 10 دقائق.
- بعد أن يتوقف الفأر عن الوخز ولم يعد يستجيب للمنبهات ، ضع الفازلين الأبيض على كلتا العينين لمنع الجفاف. استخدم ماكينة حلاقة لتقليم الفراء الظهري الأطول.
- ضعي كريم إزالة الشعر على الظهر ، وانتظري لمدة دقيقتين ، وامسحيه برفق بشاش مبلل لتجنب إتلاف جلد الفأر. تأكد من عدم ترك كريم إزالة الشعر لفترة طويلة.
- قم بتطهير الجلد المحيط بلطف بثلاث مسحات متناوبة من البيتادين و 70٪ كحول.
- الأوتوكلاف لكمة خزعة الجلد ، مقص ، ملقط ، وأدوات أخرى للتعقيم. حافظ على مساحة عمل معقمة. قم بإجراء الجراحة اللاحقة على قطعة قماش جراحية جديدة.
- قم بتقييد الماوس برفق باستخدام مصفاة أو عن طريق إمساك الماوس بإحكام في وضع الانبطاح. قم بتحميل المحقنة ب 1٪ من الصوديوم البنتوباربيتال الذي تم إعادته إلى درجة حرارة الغرفة ، ويتم إعطاؤه بجرعة 0.1 مل / 20 جم من وزن الجسم.
- استئصال الجلد بكامل السماكة
ملاحظة: تم استخدام نموذج جبيرة الجرح لتقييم فعالية العلاج في التئام الجروح.- باستخدام علامة دائمة ، قم بتمييز المنطقة المركزية العلوية للمنطقة الظهرية للفأر بدائرة واحدة قطرها 8 مم.
- ارفع الجلد الظهري باستخدام ملقط نظيف وقم بعمل القطع الأول باستخدام مقص جراحي دقيق. بعد القطع الأول ، أمسك منطقة الجلد التي تمت إزالتها جزئيا باستخدام ملقط وقم بقص الدوائر المحددة بعناية.
- استخدم حلقة من الفولاذ المقاوم للصدأ مصممة خصيصا (القطر الداخلي 15 مم ، القطر الخارجي 18 مم). قم بخياطة الحلقة المعدنية على محيط موقع الشق باستخدام 5-0 خيوط غير قابلة للامتصاص ، مما يمنع تقلص جلد موقع الشق (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 أ). استخدم الفولاذ المقاوم للصدأ كمادة دائرية لمنع الصدأ والتشوه.
- يجب إعطاء حقنة واحدة تحت الجلد 0.1 مل من تخفيف هيدروكلوريد البوبرينورفين بنسبة 10٪ بالقرب من الجرح لعلاج ألم ما بعد الجراحة.
- أعد إدخال الماوس لتنظيف الأقفاص الفردية. ضع الماوس في وضع الانبطاح. لا تترك الماوس دون رقابة قبل أن يستعيد الفأر وعيه.
- مراقبة جرح الفأر وتصويره كل يومين لقياس حجم الجرح بعد التخدير كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- وضع علامات على ختم الجرح للحصول على أنسجة الخزعة
- استعد للتجربة كما هو موضح في الخطوتين 1.1 و 1.2.
- قم بإنشاء طوابع مخصصة لتعليم جرح الماوس بقطر دائرة 8 مم وطول جانب مربع يبلغ 10 مم (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1 ب).
- ضع الفأر في وضعية الانبطاح وقم بتطهير الجلد الظهري بمسحات قطنية كحولية. اغمس الختم في الحبر. ضع علامة على الجزء العلوي الأوسط من ظهر الماوس بالختم. قم
- باستئصال طبقة الجلد الكاملة من الظهر بعناية على طول العلامة الدائرية باستخدام مقص جراحي ، مع تعريض طبقة العضلات تماما. اترك الجرح مفتوحا بدون ضمادة لتجنب التدخل في حالة الجرح. حافظ على عقم الجرح عن طريق وضع الفأر في بيئة نظيفة ومعقمة والسماح للجرح بتكوين قشرة بشكل طبيعي.
- يجب إعطاء حقنة واحدة تحت الجلد 0.1 مل من تخفيف هيدروكلوريد البوبرينورفين بنسبة 10٪ بالقرب من الجرح لعلاج ألم ما بعد الجراحة.
- أعد إدخال الماوس لتنظيف الأقفاص الفردية. ضع الماوس في وضع الانبطاح. لا تترك الماوس دون رقابة قبل أن يستعيد الفأر وعيه.
- مراقبة جرح الفأر وتصويره كل يومين لقياس حجم الجرح بعد التخدير كما هو موضح في الخطوة 1.2.
- إجراء العلاج كما هو موضح في 1.4
- إدارة العلاج
- بعد 4 ساعات من استعادة الفأر للوعي، قم بإجراء التخدير كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.3.
- حقن العلاج المطلوب تحت الجلد ، هنا 100 ميكروغرام من الإكسوسوم المشتق من الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (hucMSC-Exo) مذاب في 200 ميكرولتر من PBS حول موقع الشق لمجموعة العلاج.
- حقن 200 ميكرولتر من PBS تحت الجلد حول موقع الشق للمجموعة الضابطة.
- كرر الخطوتين 1.5.2 و1.5.3 كل يومين لمدة تصل إلى 14 يوما. افحص موقع الحقن بحثا عن أي تورم أو احمرار أو علامات عدوى.
- جمع الأنسجة وتحضيرها
- إجراء التخدير كما هو موضح في الخطوات 1.2.2-1.2.3.
- ارفع الجلد الظهري باستخدام ملقط نظيف وقم بإزالة القشور. قم بقطع ما يقرب من 2 سم2 من الجلد بالقرب من الجرح ، وتقليم الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية الكبيرة.
- انقل خزعة الجلد باستخدام ملقط معقم إلى بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار مملوءة ب 4 مل من PBS المبردة مسبقا.
- اغسل باستخدام PBS عن طريق نقل الخزعة بالتتابع إلى آبار جديدة (صفيحة 6 آبار) مملوءة ب 4 مل من PBS حتى لا يكون هناك دم مرئي.
- قم بقص الجلد بمشرط إلى قطع بحجم 2 مم تقريبا ، وغسلها مرة أخرى في DPBS تحتوي على 0.04٪ BSA وإزالة أي حطام.
- التفكك الأنزيمي (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2)
- امزج 1 مل من الكولاجيناز الأول (10 مجم / مل) ، 1 مل من الكولاجيناز الرابع (5 مجم / مل) ، 1 مل من الكولاجيناز D + Dispase II (15 مجم / مل) ، 1 مل من DNase I (5 مجم / مل) ، و 6 مل من DPBS في أنبوب مخروطي معقم لتحضير محلول الهضم. امزج المكونات جيدا لضمان التجانس.
- ضع الأنبوب المخروطي في حمام مائي على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتسخين محلول الهضم مسبقا.
- أضف 2.5 مل من محلول الهضم إلى الأنسجة وهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة 70 دقيقة ، مع قلب أنبوب الاختبار كل 10 دقائق للخلط الشامل.
- قم ببللة مصفاة 70 ميكرومتر مسبقا مع عازلة غسيل (0.2٪ BSA في PBS). انقل مزيج التفاعل ، بما في ذلك الخلايا المنفصلة وشظايا الأنسجة المتبقية ، باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1 مل على المصفاة.
- قم بتصفية هذا الخليط من خلال مصفاة الخلية المبللة مسبقا 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- جهاز الطرد المركزي لخليط التفاعل مع الأنسجة المهضومة عند 300 × جم ، درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تحلل خلايا الدم الحمراء
- تمييع محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (10x) بنسبة 1:10 بالماء المقطر المزدوج. خفف الخلايا بمحلول تحلل خلايا الدم الحمراء 1x بنسبة 1:10 في أنبوب مخروطي الشكل.
- دوامة الخليط لمدة 5 ثوان ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ثم الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
- الترشيح
- استرجع معلق الخلية وقم بتصفيته من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد.
- اشطف الأنبوب 2x ب 4.5 مل من RPMI (10٪ FCS) لضمان جمع أي خلايا متبقية.
- تابع الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية ، وقم بنفض الغبار برفق عن الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا بأطراف واسعة التجويف في 50 ميكرولتر من 0.04٪ BSA PBS. حافظ على الخلايا على الجليد طوال هذه العملية.
- إزالة الخلايا الميتة
- امزج مجموعة إزالة الخلايا الميتة 20x مع الماء الخالي من النوكلياز بنسبة 1:20 للحصول على مخزن مؤقت ملزم 1x.
- قم بالطرد المركزي للعينة عند 300 × جم ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 10 ميكرولتر من حبيبات إزالة الخلايا الميتة ل 60 مجم من عينة الجلد.
- احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف المخزن المؤقت للمخزون حتى يصل إلى 500 ميكرولتر. قم بتحميل العينة في العمود المعد في المجموعة وقم بإرفاقها بالمفقسم.
- قم بتشغيل برنامج الفصل لفصل الخلايا الحية. بعد انتهاء البرنامج ، قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 30 ميكرومتر وقم بتخفيفه بحجم متساو D-PBS.
ملاحظة: إذا تباطأت سرعة التنقيط بشكل ملحوظ ، فاستبدل العمود على الفور لمنع الشوائب من سد المسام والتأثير على استعادة الخلايا. - قم بإجراء تلطيخ Acridine Orange / Propidium Iodide (AO / PI) وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي. استخدم معايير القبول التالية: قابلية للخلية ≥ 85٪ ، ومعدل تراكم الخلايا < 20٪ ، وعدم وجود خلايا دم حمراء مرئية أو شظايا خلايا.
- إجراء التفكك لمجموعة التفكك متعدد الأنسجة (بديل)
- امزج 2.5 مل من RPMI 1640 ، و 100 ميكرولتر من الإنزيم D ، و 50 ميكرولتر من إنزيم R ، و 12.5 ميكرولتر من الإنزيم A1 في أنبوب MACS C لطيف (مكونات من مجموعة تفكك الأنسجة المتعددة).
- انقل الأنسجة إلى أنبوب MACS C اللطيف الذي يحتوي على مزيج الإنزيم وأغلقه بإحكام.
- ضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 90 دقيقة مع انعكاس لطيف كل 10 دقائق لضمان تعرض الأنسجة بشكل كاف لمحلول التفكك.
- تخلص من محلول التفكك واغسل المناديل باستخدام DPBS.
- قم بتمرير المعلقات أحادية الخلية عبر مصافي الخلايا 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر بالتتابع وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 300 × جم.
- ليز خلايا الدم الحمراء باستخدام كاشف تحلل خلايا الدم الحمراء باتباع نفس الإجراء المتبع للخطوة 2.3.
- قم بإزالة الخلايا الميتة باستخدام مجموعة إزالة الخلايا الميتة باتباع نفس الإجراء كما في الخطوة 2.58.
- قم بإجراء تلطيخ AO / PI وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي. استخدم معايير القبول التالية: قابلية للخلية ≥ 85٪ ، ومعدل تراكم الخلايا < 20٪ ، وعدم وجود خلايا دم حمراء مرئية أو شظايا خلايا.
النتائج
تم استكشاف عدة تنويعات للإجراء. وقد فُضِّل استخدام بروتوكولات الختم (Stamp protocols) لأنها تسبب حداً أدنى من التداخل مع عملية التئام الجروح وتحافظ على سلامة الجرح من تأثيرات مثل الخدش والغرز الجراحية؛ وذلك لتجنب إدخال ضجيج على مستوى الخلية الواحدة في عملية التسلسل اللاحقة. وقد أدى إحداث جروح على كلا جانبي الفأر إلى فروق ملحوظة في مساحة الجرح بسبب المرونة المتأصلة في جلد الفأر (الشكل 3-أ،بأدت الثقوب الثنائية إلى وضع الجروح في مكان أقرب إلى الحواف، وهي منطقة عرضة لسلوك الخدش الذاتي لدى الفئران. واعتُبرت الفئران التي تبلغ من العمر 7 أسابيع أو أكثر غير مناسبة للدراسة، حيث أظهرت مجموعة فرعية منها اسوداداً غير منتظم في الجلد الظهري حول الـ 10th اليوم التالي للجراحة، مما يشير إلى بدء إعادة نمو الشعر (الشكل 4أ). وقد أدى ذلك إلى إدخال متغير إضافي غير مرغوب فيه.
عند استخدام الحلقات المطاطية، وبغض النظر عما إذا كان المطاط المستخدم ليناً أو صلباً، كانت هذه الحلقات تميل إلى الانفصال وغالباً ما كانت تزيح عن موقع الجرح في غضون 12 h تقريباً بسبب حركات الفئران المتكررة وخصائص الالتصاق المحدودة للحلقات. وكانت الحلقات المطاطية المثبتة بالغرز عرضة للتمزق، مما تطلب إجراء غرز متكررة لتحقيق الاستقرار. وبدوره، أدى إجراء الخياطة التكراري هذا إلى إلحاق صدمات إضافية بالفئران (الشكل 4B،C). وفي المقابل، أظهرت الحلقات المعدنية استقراراً فائقاً وخصائص تثبيت محسنة، مما أتاح تقييم تأثيرات إعادة التظهير دون تداخل من انكماش الجرح.
نظرًا لاحتمالية أن تتسبب الجبيرة المثبتة بحلقات معدنية مخيطة في إحداث تلف جلدي إضافي خارج منطقة الجرح، وتطبيق إجهادات ميكانيكية غير منتظمة عبر الجرح، تم استخدام ختم معياري بأبعاد ثابتة لتسهيل التحليلات اللاحقة.
كشف الاستقصاء أن مجموعة العلاج النموذجي (hucMSC-Exo) أظهرت وتيرة شفاء أسرع مقارنة بمجموعة الضبط (الشكل 5A). وبينما حدث الشفاء الكامل بسرعة أكبر في نموذج الختم مقارنة بمجموعة الحلقة المعدنية المخيطة، التي تحد من انكماش الجرح، لم يُلاحظ أي فرق ذو دلالة إحصائية في معدلات الشفاء خلال فترة الـ 7 أيام الأولى (الشكل 5B). وتتفق هذه النتائج مع بحث سابق أجراه Lin وزملاؤه، مما يشير إلى أن الأيام العشرة الأولى من شفاء الجلد لدى الفئران تتضمن في المقام الأول عملية إعادة التظهير بدلاً من الانكماش9.
مقارنة التفكيك
بعد إجراء تحسين واسع لتركيبة الإنزيم، أظهر الجمع بين Dispase II والـ collagenase أداءً فائقاً مقارنةً باستخدام إنزيم واحد (الجدول 1). والأهم من ذلك، كان وجود خلايا الدم الحمراء أو الحطام الخلوي في حدوده الدنيا، مما استوفى المعايير الأساسية للاستخدام الآلي، والتي تشمل حيوية خلوية تتجاوز 85% ومعدل تكتل أقل من 20%.
في المقابل، أظهر نهج استخدام طقم الاختبار نتائج واعدة، مع حيوية خلوية أعلى نسبياً ومعدل تجمع خلوي أقل (الجدول 1). علاوة على ذلك، لم يتم ملاحظة أي خلايا دم حمراء أو شظايا خلوية، مما يشير إلى جودة خلوية فائقة بشكل عام مقارنة بالطرق الأخرى.
الشكل 1نموذج جرح الفأر النهائي. (A) صورة تمثيلية للحلقة المعدنية المخصصة بعد خياطتها. (Bصورة تمثيلية لختم الجلد والجرح المستأصل. القطر: 8 مم. الحافة: 1 سم.كربون) معدل إغلاق الجرح. شريط الخطأ: الخطأ المعياري. اختبار T ذا ذيلين (n=6). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مخطط توضيحي لتحضير معلقات الخلايا المفردة. تشمل الخطوات جمع العينات، والتفكيك، وتحلل كريات الدم الحمراء، وإزالة الخلايا الميتة، والوصول إلى معلق الخلايا المفردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: نموذج جروح الفأر مع وجود جروح على كل جانب. (A) تظهر صورة تمثيلية لنموذج جروح الفأر مع وجود جروح على كل جانب. القطر المرجعي الدائري الأبيض: 8 mm. (B) صورة تمثيلية لالتئام الجروح في نقاط زمنية مختلفة للجروح الموجودة على كل جانب. التأم الجلد في ظهر الفأر بالقرب من الذيل بشكل أسرع من الجلد القريب من الرقبة. حافة الجسم المرجعي المربع الأبيض: 1 cm. قطر الجسم المرجعي الدائري الأبيض: 8 mm. الاختصارات: POD = أيام ما بعد العملية الجراحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: نموذج جرح الفأر مع جروح منفردة. (A) صورة تمثيلية لالتئام الجروح في مراحل نمو شعر مختلفة لفئران تبلغ من العمر 7 أسابيع. الفئران في مراحل نمو شعر مختلفة في POD 10. الجلد الأغمق التأم بشكل أسرع. (B) صورة تمثيلية لحلقات اللاصق المطاطي. حافة الجسم المرجعي المربع الأبيض: 1 cm. (C) صورة تمثيلية لخطوط الخياطة. قطر الجسم المرجعي الدائري الأبيض: 8 mm. الاختصارات: POD = أيام ما بعد الجراحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5معدل انغلاق الجرح. (Aمقارنة بين مجموعة الضابطة ومجموعات hucMSC-Exo. تمثل أشرطة الخطأ الأخطاء المعيارية. اختبار T ثنائي الذيل (n=6).Bمقارنة بين مجموعتي الختم والحلقة المعدنية. تمثل أشرطة الخطأ الأخطاء المعيارية. حُسبت الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذيل (n=6). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| معدل حيوية الخلايا | معدل تجميع الخلايا | |
| نهج داخلي | 86.90% | 18.50% |
| نهج استخدام طقم الاختبار | 90.65% | 13.73% |
الجدول 1: حيوية ومعدل تجمع نهجي تحضير الخلايا.
المناقشة
وهناك عدة خطوات حاسمة ضرورية لنجاح البروتوكول. تضمنت هذه الخطوات التحضير الدقيق لمنطقة الجرح عن طريق الحلاقة والتنظيف الشاملين ، وإنشاء جروح موحدة ذات حجم وعمق محددين ، ورعاية دؤوبة بعد الجرح لمراقبة العدوى وإدارة العلاجات المناسبة. يضمن توحيد هذه الإجراءات الاتساق عبر الظروف التجريبية ، وبالتالي تعزيز موثوقية النتائج وقابليتها للتكرار10.
استخدمنا وضع علامات على ختم الجرح للتسلسل ، حيث تقدم طرق أخرى متغيرات إضافية مثل خدش جرح الفأر وتمزق الخيط2،5. يعمل نموذج الطوابع على تحسين الاتساق الأولي للجروح في الفئران ويوفر معيارا موحدا لتقييم التئام الجروح ، مما يقلل من عدم الدقة المحتملة في تقدير معدل التئام الجروح في نماذج الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، تسهل علامة الطوابع استخدام برامج مثل ImageJ. ومع ذلك ، نظرا لعدم استخدام الضمادة لتغطية الجرح ، فإن طريقة الختم لها متطلبات تطهير أعلى بكثير للبيئة. يجب تكرار التجربة في حالة حدوث عدوى.
يمكن أن يؤدي التباين البيولوجي بين الفئران الفردية إلى التباين في النتائج التجريبية ، مما يستلزم أحجام عينات أكبر لإجراء تحليلات إحصائية قوية. يمكن توسيع هذا النموذج ليشمل تقنيات التسلسل الأخرى ، مثل التسلسل المكاني ، لتعزيز فائدته بشكل أكبر.
يعد تحسين ظروف تفكك scRNA-Seq واختيار طرق التفكك المناسبة خطوات حاسمة في سير العمل التجريبي. حاليا ، تشمل المنهجيات شائعة الاستخدام الهضم الأنزيمي جنبا إلى جنب مع النهج الموصى به 10x القائم على كاشفالجينوم 11. والجدير بالذكر أن الهضم الأنزيمي أكثر فعالية من حيث التكلفة بشكل ملحوظ من الطريقة القائمة على الكاشف. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تكرارات متعددة قبل التجربة لتحسين اختيار الإنزيم ومدة الهضم.
في هذه الدراسة ، أجريت تجارب أولية باستخدام مجموعات إنزيمية مختلفة. استوفت الطريقة المختارة المتطلبات الأساسية لمراقبة الجودة النهائية على الرغم من افتقارها إلى مجموعة كاشف الجينوم 10x المصممة خصيصا لتفكك الجلد كامل سمك الفئران. بدلا من ذلك ، تم استخدام مجموعة التفكك متعددة الأنسجة 1 للحصول على معلقات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة التكلفة المرتفعة نسبيا المرتبطة بهذه الطريقة ، على الرغم من أنها توفر ثباتا فائقا مقارنة بتقنيات هضم الإنزيم الداخلية. بالنسبة للعينات القيمة ، يوصى باستخدام طريقة التفكك القائمة على كاشف علم الجينوم 10x.
من الأهمية بمكان النظر في التأثير المحتمل للتباين بين الأفراد على بقاء الخلية ، حيث قد يؤدي ذلك إلى عدم استيفاء بعض العينات للمعايير المطلوبة وبالتالي التأثير على جودة البياناتالنهائية 12.
على الجانب الإيجابي ، توفر هذه الطريقة فرصا للتكامل مع النسخ المكاني أو غيرها من مناهج الطباعة المتعددة ، وبالتالي تقديم إطار تحليلي أكثر شمولا13. علاوة على ذلك ، تسلط تطبيقاته السريرية المحتملة الضوء على تعدد استخداماته وأهميته خارج سياقات البحث الأساسية.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ( # 82373494).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 75٪ Alcolchol | Liuhe | JIUJING500ML | |
| C57 / BL6J الفئران | Charles River Laboratories | ||
| Collagenase D + Dispase II | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase I | Roche | 5349907103 | |
| Collagenase IV | Roche | 5267439001 | |
| مسحات قطنية | Haishi | MIANQIAN | |
| طقم إزالة الخلايا الميتة | Miltenyi Biotec | 130-090-10 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| gentleMAC Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| خيط نايلون طبي | Jinlong | HM507 | |
| طقم تفكك الأنسجة المتعدد 1 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| لكمة إبرة خزعة | Integra Miltex | ||
| محلول تحلل خلايا الدم الحمراء | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| مقص جراحي | Jinglu | JIANDAO | |
| الفازلين الأبيض | Shangyuan | BAIFANSHILIN |
المراجع
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
- Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
- Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
- Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
- Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
- Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
- Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
