يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

مايو 10, 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، يتم توفير بروتوكول لثقافة عضويات المريء البشري وثقافة واجهة الهواء السائل. يمكن استخدام ثقافة واجهة الهواء السائل لعضويات المريء لدراسة تأثير السيتوكينات على الحاجز الظهاري المريئي.

الملخص

تتعرض ظهارة المريء الحرشفية مباشرة للبيئة ، وتواجه باستمرار المستضدات الأجنبية ، بما في ذلك مستضدات الطعام والميكروبات. يعد الحفاظ على سلامة الحاجز الظهاري أمرا بالغ الأهمية للوقاية من العدوى وتجنب الالتهاب الناجم عن المستضدات المشتقة من الغذاء غير الضارة. توفر هذه المقالة بروتوكولات مبسطة لتوليد عضويات المريء البشرية وثقافات واجهة الهواء السائل من خزعات المريض لدراسة المقصورة الظهارية للمريء في سياق توازن الأنسجة والمرض. كانت هذه البروتوكولات معالم علمية مهمة في العقد الماضي ، حيث وصفت الهياكل الشبيهة بالأعضاء ثلاثية الأبعاد من الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، والمواد العضوية ، وثقافات واجهة الهواء والسائل. إنها توفر إمكانية التحقيق في وظيفة السيتوكينات المحددة وعوامل النمو ومسارات الإشارات في ظهارة المريء في إطار ثلاثي الأبعاد مع الحفاظ على الخصائص الظاهرية والجينية للمتبرع. توفر المواد العضوية معلومات عن العمارة المجهرية للأنسجة من خلال تقييم النسخ والبروتين بعد تحفيز السيتوكين. في المقابل ، تسمح ثقافات واجهة الهواء السائل بتقييم سلامة الحاجز الظهاري من خلال المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو قياسات تدفق الجزيئات. يعد الجمع بين هذه الكائنات العضوية وثقافات واجهة الهواء السائل أداة قوية لتطوير البحث في ظروف الحاجز الظهاري المريئي الضعيف.

المقدمة

يضر التهاب المريء بسلامة الحاجز الظهاري1،2،3،4،5 ، كما لوحظ في التهاب المريء اليوزيني (EoE) ، وهو مرض التهابي مزمن يهيمن عليه Th2 في المريء6. تم وصف EoE لأول مرة في تسعينيات القرن العشرين7،8 ويتم تحريضه في الغالب بواسطة مستضدات الغذاء9،10،11،12،13. الأعراض الأكثر شيوعا ل EoE في السكان البالغين هي عسر البلع وانحشار الطعام14. في الأطفال ، يظهر EoE عادة مع الفشل في النمو ، ورفض الطعام ، والقيء ، وآلام البطن15. حددت دراسات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS) جينات خطر EoE المشاركة في سلامة الحاجز الظهاري ، مما أدى إلى نقل الظهارة إلى بؤرة أبحاث EoE16،17،18. كشفت EoE transcriptomics كذلك أن عملية التمايز الضعيفة وتضخم المنطقة القاعدية التفاعلية يتسببان في وظيفة الحاجز للخطر لظهارة المريء3،5،19،20،21،22. أدى الفهم المبكر لكون EoE مرضا بوساطة Th26 إلى اكتشاف IL-13 كوسيط قيادة عن طريق الإخلال بسلامة الظهارة3،4،21،23. توفر الأنظمة التجريبية التي تسمح بتشريح التأثيرات بوساطة السيتوكين على السلامة الظهارية من ضعف الحاجز الداخلي من خلال الاستعداد الوراثي إمكانية دراسة التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والظهارة في EoE. تم اقتراح عضويات المريء البشرية ومزارع واجهة الهواء السائل (ALI) كأدوات قيمة لتحليل عواقب تحفيز السيتوكين على سلامة الظهارة5.

تم إنشاء البروتوكول الأول لتوليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة البالغة (ASC) بعد خمس سنوات من التقارير المنشورة الأولى عن العضويات المعوية في عام 2009 باستخدام Lgr5 + ASCs المعوية التي تلخص المقصورة الظهارية للأمعاءالدقيقة 24. كان DeWard et al. رائدا في توليد المواد العضوية من الخلايا الظهارية المريئيةللفئران 25. في عام 2018 ، قام Kasagi et al. بتوليد عضويات المريء البشري من خط خلايا ظهارة المريء الحرشفية البشرية الخالدة EPC2-hTERT والخلايا الأولية المشتقة من المريض26. في نفس العام ، نجح Zhang et al. في توليد عضويات المريء المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). لقد حددوا أهمية تثبيط TGFβ والبروتين المورفولوجي العظمي (BMP) لتطوير الخلايا السلفية المريئية (EPC) والدور الحاسم لإشارات Notch في تمايز الظهارة الحرشفية الطبقية26,27. استكمل تريسنو وزملاؤه هذه النتائج من خلال تحديد Sox2 كمثبط Wnt يوجه مصير النمو نحو تمايز المريء28. أدت التحسينات اللاحقة للبروتوكولات والتركيب المتوسط وظروف الاستزراع إلى زيادة معدل تكوين الأعضاء وجعلت الاستزراع الفرعي واستعادة المواد العضوية بعد الحفظ بالتبريد ممكنا26،29،30،31،32. على الرغم من أن هذه الكائنات العضوية هي أدوات قوية لدراسة بنية الأنسجة والتعبير عن الجينات المستهدفة المحتملة بعد التحفيز بالسيتوكينات ، إلا أن عضويات المريء لن توفر إمكانية قياس المقاومة عبر الظهارة (TEER) أو تدفق الجزيئات الكبيرة كمقاييس مباشرة لسلامة الحاجز. كما وصفه شيريل وزملاؤهسابقا 22 ، تسمح ثقافات ALI التي تنمذجة التمايز الظهاري4 بإجراء تقييمات مباشرة للسلامة الظهارية. يعد الجمع بين المواد العضوية المشتقة من المريض ومزارع ALI أداة قوية للتحقيق في بنية الأنسجة وسلامة الحاجز الظهاري في EoE.

فيما يلي إجراءات مع تعليمات لعزل الخلايا القابلة للحياة من خزعات المريء وإنشاء مزارع عضوية المريء و ALI التي يمكن استخدامها بشكل أكبر لدراسة آثار السيتوكينات على سلامة الحاجز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في شمال غرب ووسط سويسرا (EKNZ; معرف المشروع 2019-00273). قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة على الاستخدام التجريبي للخزعات قبل الفحص بالمنظار. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. عزل الخلايا لعضويات المريء المشتقة من المريض

ملاحظة: ترد في الجدول 1 قائمة بالمكونات المتوسطة لزراعة عضويات المريء البشري.

  1. الحصول على الخزعات.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم الحصول على خزعتين من جزء واحد من المريء أثناء تنظير المريء والمعدة والاثني عشر باستخدام ملقط خزعة باستخدام منظار المعدة مع قناة عمل 2.8 مم.
  2. نقل الخزعات إلى وسط خال من الخلايا الكيراتينية المتاحة تجاريا (KSFM; الكالسيوم2+ 0.09 ملليمتر ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE).
    ملاحظة: يمكن تخزين الخزعات على الثلج لعدة ساعات حتى الاستخدام.
  3. استبدل وسط KSFM ب 1 مل من Dispase I (10 U / mL) واحتضان الخزعات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.
  5. نضح Dispase باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر دون لمس الخزعات وحبيبات حطام الخلية.
  6. اشطف الخزعات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) سعة 1 مل من Dulbecco.
  7. أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.
  8. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
  9. احتضان الخزعات ب 500 ميكرولتر من Trypsin-EDTA (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أثناء رجها عند 800 دورة في الدقيقة.
  10. قم بإجراء تعطيل ميكانيكي عن طريق السحب المتكرر لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق أحادي الخلية.
  11. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام رأس المكبس المطاطي لحقنة السل.
  12. اغسل المصفاة ب 2-4 مل من مثبطات تربسين فول الصويا (250 ميكروغرام / مل).
  13. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 35 ميكرومتر مع غطاء إضافي على أنبوب بوليسترين مستدير القاع سعة 5 مل.
  14. انقل المحلول أحادي الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  15. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  16. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
  17. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط KSFM.
  18. امزج 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
  19. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي.

2. ثقافة العضوية المشتقة من المريض

  1. أضف 1-2 مل من KSFM إلى تعليق الخلية بعد العد.
  2. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. نضح الطافع مع ماصة 1000 ميكرولتر دون إزعاج بيليه الخلية.
  4. أعد تعليق حبيبات الخلية في مصفوفة هيدروجيل مستخلص الغشاء القاعدي (BME) (40 ميكرولتر من BME لكل 20000 خلية).
    ملاحظة: بعد إضافة BME ، احتفظ بالخلايا على الجليد لمنع التصلب المبكر ل BME.
  5. اقطع طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لشفط خليط تعليق خلايا BME اللزج.
  6. قم بتكوين قطرات 40 ميكرولتر في لوحة زراعة الخلايا المعلقة الدافئة مسبقا (37 درجة مئوية).
  7. احتضان اللوحة بدون وسط لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لضمان تصلب قطرات BME.
  8. أضف وسط KSFM-C الذي تم تسخينه مسبقا مع 10 ميكرومتر من Y27632 (مثبط ROCK) لأول يومين من الثقافة.
  9. استبدل الوسيط بوسيط KSFM-C جديد (بدون Y27632 و +/- سيتوكين مهم) كل يوم.
  10. قم بنضح الوسط وخدش القطرات باستخدام طرف الماصة مع إضافة 1 مل من Dispase II (1.5 وحدة / مل) باستمرار إلى البئر.
  11. انقل خليط BME-dispase إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واحتضانه لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مهتز لهضم BME.
  12. أجهزة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية ونضح Dispase II.
  13. تابع وفقا لبروتوكول قراءات الفائدة (على سبيل المثال ، عزل الحمض النووي الريبي أو عزل البروتين أو التثبيت بنسبة 4٪ PFA للأنسجة).

3. عزل الخلايا لثقافات واجهة الهواء السائل المشتقة من المريض (ALI)

  1. الحصول على الخزعات. أثناء تنظير المريء والمعدة والأمعاء باستخدام منظار المعدة مع قناة عمل 2.8 مم ، يتم أخذ خزعتين من جزء مريء واحد مع ملقط خزعة.
  2. ضع الخزعات في وسط خال من مصل الخلايا الكيراتينية متاح تجاريا (KSFM; Ca2+ 0.09 mM، 1 ng/mL EGF، 50 μg/mL BPE) ويخزن على الثلج لعدة ساعات حتى الاستخدام.
  3. تبادل KSFM مع 1 مل من ديسباز (10 وحدة / مل). بعد ذلك ، احتضان الخزعات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. أجهزة الطرد المركزي الخزعات في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.
  5. قم بإزالة Dispase باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر دون لمس الخزعات وحبيبات حطام الخلية.
  6. اغسل الخزعات ب 1 مل من DPBS.
  7. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتدوير الخزعات عند 300 × جم لمدة 2 دقيقة.
  8. نضح الطاف مع ماصة 1000 ميكرولتر.
  9. احتضان الخزعات في 500 ميكرولتر من Trypsin-EDTA (0.05٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق واخلطها باستمرار عند 800 دورة في الدقيقة أثناء الحضانة.
  10. قم بتعطيل الخزعات ميكانيكيا باستخدام السحب المتكرر لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق أحادي الخلية.
  11. مرر الخلايا المنفصلة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر برأس مكبس مطاطي من حقنة السلين واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  12. اغسل المصفاة ب 2-4 مل من مثبطات التربسين لفول الصويا (250 ميكروغرام / مل) لإزالة الخلايا المتبقية من المصفاة.
  13. قم بتصفية الخلايا باستخدام غطاء مصفاة خلية 35 ميكرومتر في أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل.
  14. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 mL.
  15. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  16. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر.
  17. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من وسط KSFM (Ca2+ 0.09 mM) ، بما في ذلك 10 μM Y27632.
  18. نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الخلايا T25.
  19. لتوسيع الخلايا الكيراتينية الأولية ، قم بزراعة الخلايا حتى التقاء 60٪ -80٪ لمدة 1 أسبوع تقريبا.
    ملاحظة: يشكل الممر (P) 0 تكتلات خلايا تشبه الجزيرة وليس طبقة أحادية. تشكل الخلايا الكيراتينية الأولية طبقة أحادية من P1 فصاعدا.
  20. المرور عند التقاء 60٪ -80٪ وإعادة زرع P1 في 2-3 T25 أو 1-2 T75 قوارير زراعة الخلايا.
  21. المرور P1 مرة أخرى عندما تشكل الخلايا الكيراتينية طبقة أحادية مع التقاء 60٪ -80٪.

4. ثقافة واجهة الهواء السائل المشتقة من المريض (ALI)

  1. بذرة الخلايا الكيراتينية الأولية P2 على إدخالات transwell لثقافة ALI.
    ملاحظة: زرع 400000 خلية في 12 بئرا (200000 خلية كيراتينية لكل 0.6 سم2) في 500 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE).
    1. بذر 150000 خلية في 24 بئر (155000 خلية كيراتينية لكل 0.5 سم2) في 100 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 نانوغرام / مل EGF ، 50 ميكروغرام / مل BPE).
    2. بدلا من ذلك ، قم بالتجميد في وسط KSFM (Ca2 + 0.09 mM + 10٪ DMSO) عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ثم انقل الخلايا المجمدة إلى النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا.
      ملاحظة: عند استخدام قوارير مجمدة ، قم بالمرور مرة أخرى بعد الذوبان قبل استخدام الخلايا لثقافة ALI.
  2. أضف وسيطا إلى البئر السفلي أسفل إدخال لوحة الاستزراع transwell.
    ملاحظة: ل 12 لوحة بئر: 1.5 مل من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE). ل 24 لوحة بئر: 600 ميكرولتر من KSFM (Ca2+ 0.09 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE).
  3. استبدل الكالسيوم المتوسط إلى العالي KSFM (Ca2+ 1.8 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE) بعد يومين.
  4. قم بتغيير وسط KSFM عالي الكالسيوم كل يومين حتى اليوم 7.
  5. قم بإجراء الجسر الجوي في اليوم السابع عن طريق شفط الوسط من الغرفة العلوية واستبدال الوسط في الغرفة السفلية ب KSFM عالي الكالسيوم (Ca2+ 1.8 mM ، 1 ng / mL EGF ، 50 μg / mL BPE) يحتوي على 10 نانوغرام / مل KGF (= FGF7) ، 75 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك (AA).
    1. اختياري: أضف السيتوكين محل الاهتمام بالتركيز المطلوب إلى الوسط.
  6. قم بتغيير الوسيط كل يومين حتى اليوم 14.

5. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER)

  1. تعقيم القطب الكهربائي لمقياس TEER عن طريق غمره في بئر من صفيحة 24 بئرا مع 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10-15 دقيقة.
  2. اغسل هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 5٪ عن طريق غمر القطب في 4 آبار فرعية مع ddH2O المعقم وترك القطب يجف في الهواء.
  3. اضبط الفراغ عن طريق وضع قطب كهربائي واحد في البئر والقطب الثاني في ملحق البئر ، وملئه ب PBS ، وقياس TEER.
    ملاحظة: الأحجام الموصى بها لقياسات TEER: ل 12 صفيحة بئر (1900 ميكرولتر في البئر و 900 ميكرولتر في الإدخال). ل 24 لوحة بئر (750-1000 ميكرولتر في البئر و 250 ميكرولتر في الإدخال).
  4. استبدل وسط ثقافات ALI ببرنامج تلفزيوني معقم بدرجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بإزالة الوسط من البئر السفلي ، وفي خطوة ثانية ، من ملحق البئر. وبالمثل ، أضف PBS أولا إلى الإدخال ثم إلى البئر السفلي لمنع انفصال ثقافة ALI عن غشاء البئر.
  5. ضع أقطاب مقياس TEER في الآبار التجريبية مع مزارع ALI وقم بإجراء قياس TEER1.
    ملاحظة: قم بإجراء قياسات TEER كل يومين قبل تغيير الوسيط.

6. التدفق الجزيئي

  1. قم بتخفيف محلول مخزون FITC-Dextran (3-5 كيلو دالتون) إلى تركيز 1 مجم / مل عامل.
    ملاحظة: قم دائما بحماية FITC-Dextran من التعرض للضوء.
  2. قم بإعداد صف تخفيف مع انخفاض تركيز FITC (1000 ميكروغرام / مل إلى 0.25 ميكروغرام / مل) كمعيار للقراءة.
  3. أضف 500 ميكرولتر من محلول FITC-dextran (1 مجم / مل) إلى الغرفة العلوية للترانسويل و 1.5 مل متوسط (+/- سيتوكين مهم) في الجزء السفلي وضع اللوحة في الحاضنة.
  4. اجمع 120 ميكرولتر من الوسط من المقصورة السفلية في النقاط الزمنية المعنية (على سبيل المثال ، 0 دقيقة ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة ، 60 دقيقة ، 90 دقيقة ، 120 دقيقة ، 150 دقيقة ، و 180 دقيقة).
  5. يتكرر ماصة (50 ميكرولتر / بئر) من كل نقطة زمنية في لوحة سفلية مسطحة شفافة سوداء 96 جيدا.
  6. قم بإثارة FITC-dextran عند 490 نانومتر وقراءة الانبعاث بطول موجي 520 نانومتر باستخدام قارئ لوحات.
  7. حساب كمية التدفق الجزيئي وفقا للمعيار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ستنمو عضويات المريء من الخلايا الأولية المستخرجة من خزعات المريض وفقا لتعليمات البروتوكول المقدم ، كما هو موثق باستخدام مجهر برايت فيلد المقلوب (الشكل 1). تبدأ ASCs الظهارية في تكوين مجموعات الخلايا بطريقة ذاتية التنظيم خلال اليومين الأولين من الثقافة بعد بذر الخلايا المعزولة في مستخلص الغشاء القاعدي ، لتكون بمثابة سقالة. يزداد حجم وعدد مجموعات الخلايا ، التي يمكن ملاحظتها باستخدام مجهر برايت فيلد المقلوب ، بشكل مستمر خلال الأسبوع الأول (الشكل 2). ومع ذلك ، في ه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسمح الإجراءات المقدمة بزراعة المواد العضوية المشتقة من المريض وثقافات ALI مع احتمالات عالية للنجاح. تم تكييف بروتوكول العضوي من أول بروتوكول منشور يبلغ عن توليد عضويات المريء البشري26 ومن بروتوكول32 المنشور مؤخرا. وصف شيريل وزملاؤه نموذج ALI22. تساعد الكائنات العضوية ونماذج زراعة ALI بعضها البعض في دراسة تأثير السيتوكينات والوسطاء الآخرين على الحاجز الظهاري المريئي في سياقات أمراض المريء ، مثل EoE 5,26

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

دعمت منحة SNSF 310030_219210 إلى J.H.N. نشر هذه المخطوطة دون قيود. تم إنشاء الشكل 1 بمساعدة BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1250 & ميكرو; L Griptip - فلترIntegra4445
300 & micro ؛ L Griptip - فلترIntegra4435
70 & micro ؛ مصفاة الخلايا MSarstedt83.3945.070
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتش (ميرك)A4544
مستخلص الغدة النخامية البقريGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش (ميرك)21115
ألواح ثقافة الخلايا متعددة الآبار CELLSTAR لثقافات التعليقGreiner Bio-One7.657 185
مستخلص الغشاء القاعدي Cultrex (BME) ، النوع 2 ، PathclearR & D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، >99,5٪ من الدرجة الحيويةCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline   ؛ (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE عداد الخلايا الآليNanoEntekEVE-MC
EVE شريحة عد الخلاياNanoEntekEVS-050
Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، مع مصفاة الخلية المفاجئة كابفالكون352235
فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) - ديكسترانسيجما-ألدريتش (ميرك)FD4متوسط مول الوزن 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R ثيرمو فيشر العلمي75004518
عامل نمو البشرة المؤتلفالبشري جيبكو (ثيرمو فيشر العلمي3700015
الكيراتينية - SFMجيبكو (ثيرمو فيشر العلمي)17005042
البنسلين - ستربتومايسينجيبكو (ثيرمو فيشر العلمي)15140122
بروتين KGF / FGF-7 البشري المؤتلفR & D Systems (Bio-Techne)251-KG-010 / CF
أنبوب غطاء لولبي ، 15 ملSarstedt62.554.502
قناة واحدة EVOLVE 100-1000 & micro ؛ L Integra3018
أحادي القناة EVOLVE 20-200 & L Integra3016
1 مل1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
مثبط التربسين من Glycine max (فول الصويا)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 ثنائي هيدروكلوريدتوكرس (Bio-Techne)1254
) الخلايا حقنة

المراجع

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عضوانيات المريءالواجهة بين الهواء والسائلالتمايز الظهاريزراعة الخلايا الكيراتينيةالمقاومة عبر الظهاريةالتحفيز بالسيتوكيناتمسار بروتين كيناز الموُجّه بالـ MAP
نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتحقيق في الحاجز الظهاري في التهاب المريء اليوزيني
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.