مقالة منهجية

توصيف معدلات المستقبلات المنشطة بالبروتياز باستخدام مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام قارئ الألواح

DOI:

10.3791/66507

⸱

مايو 24, 2024

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول محسن لمقايسة تعبئة الكالسيوم مع الخلايا البطانية ، وتستخدم لتحديد روابط المستقبلات المنشطة للبروتياز (PARs). يقلل البروتوكول الجديد من إجمالي وقت الفحص بمقدار 90-120 دقيقة وينتج منحنيات استجابة تركيز قابلة للتكرار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الخلايا بسرعة بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام الأصباغ داخل الخلايا والفلورسنت وملزمة الكالسيوم وأدوات التصوير التي يمكنها قياس انبعاثات الفلورسنت من ما يصل إلى 1536 بئرا في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوات أغلى بكثير ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ عليها مقارنة بقارئات اللوحات المتاحة على نطاق واسع والتي تمسح الآبار بشكل فردي. الموصوف هنا هو اختبار محسن لقارئ الألواح للاستخدام مع خط الخلايا البطانية (EA.hy926) لقياس التنشيط المدفوع بمستقبلات تنشيط البروتياز (PAR) لإشارات Gαq وتعبئة الكالسيوم اللاحقة باستخدام صبغة ربط الكالسيوم Fluo-4. تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف مجموعة من روابط PAR ، بما في ذلك روابط "البارمودولين" المضادة للالتهابات التي تستهدف PAR1 والتي تم تحديدها في مختبر Dockendorff. يغني هذا البروتوكول عن الحاجة إلى معالج سوائل آلي ويسمح بفحص متوسط الإنتاجية لروابط PAR في لوحات 96 بئرا ويجب أن يكون قابلا للتطبيق على دراسة المستقبلات الأخرى التي تبدأ تعبئة الكالسيوم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المستقبلات المنشطة بالبروتياز (PARs)1،2،3 هي فصيلة فرعية من مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين من الفئة A G (GPCRs) التي يتم التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الصفائح الدموية والخلايا البطانية4،5،6،7. على عكس غالبية GPCRs ، فإن PARs لها طريقة تنشيط فريدة داخل الجزيئات. يتم تنشيط معظم GPCRs عن طريق الروابط القابلة للذوبان التي تتفاعل مع جيب ربط مميز ، ولكن يتم تنشيط PARs عن طريق الانقسام المحلل للبروتين في N-terminus ، مما ينتج عنه رابط مربوط جديد يمكن أن يتفاعل مع مجال الحلقة 2 خارج الخلية على سطح الخلية6،8،9. ينشط هذا التفاعل المستقبل ويمكنه بدء العديد من مسارات الإشارات ، مما يعزز التأثيرات مثل الالتهاب وتنشيط الصفائح الدموية4،10،11،12. يمكن للبروتياز المختلفة تنشيط PARs من خلال الانقسام في مواقع فريدة على N-terminus ، مما يكشف عن روابط مربوطة مختلفة (TL) تعمل على استقرار توافقات المستقبلات ، والتي تبدأ مسارات إشارات مختلفة9،13،14،15. على سبيل المثال ، في العضو الأكثر دراسة جيدا في الفصيلة الفرعية ، PAR1 ، يتم استخدام الانقسام بواسطة الثرومبين لدعم العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تنشيط الصفائح الدموية وتجنيد الكريات البيض إلى البطانة ، ولكن يمكن أن يؤدي إلى آثار ضارة عندما يتم التعبير عن المستقبل بشكل مفرط أو مفرطالنشاط 4،16،17،18،19،20،21. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي الانقسام بواسطة البروتين المنشط C (aPC) إلى تعزيز التأثيرات المضادة للالتهابات والحفاظ على الحواجز البطانية15،22،23،24،25،26،27،28،29. يمكن أيضا تنشيط PARs عن طريق نظائر الببتيد في TLs بطريقة بين الجزيئات13،30،31. تستخدم هذه الببتيدات بشكل روتيني لقياس تثبيط (تعديل) PAR بدلا من البروتياز الذي يستهدف PAR ، ويتم استخدامها في هذا البروتوكول.

ترتبط العديد من الاضطرابات بإشارات PAR1 المرضية ، بما في ذلك الإنتان22،32 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية33،34،35،36،37،38 ، وأمراض الكلى39،40،41،42 ، ومرض فقر الدم المنجلي43 ، والتليف44 ، وهشاشة العظام وهشاشة العظام45، 46 ، التنكس العصبي47،48،49،50،51 ، والسرطان52،53،54،55،56،57،58،59. تمت دراسة مضادات PAR1 منذ تسعينيات القرن العشرين كعوامل مضادة للصفيحات لأمراض القلب والأوعية الدموية ، والقائمة المتزايدة من الأمراض المرتبطة بالمستقبل تستلزم تحديد روابط جديدة لاستخدامها كتحقيقات بيولوجية (مركبات أداة) أو كعلاجات محتملة. حاليا ، لا يوجد سوى مضاد PAR1 واحد معتمد من إدارة الغذاء والدواء ، vorapaxar ، والذي يستخدم لعلاج مرض الشريان التاجي في المرضى المعرضين لمخاطر عالية34،36،37،60. أكمل مضاد بديل ل PAR1 ، pepducin PZ-128 ، دراسة المرحلة الثانية الناجحة لمنع تجلط الدم في مرضى قسطرة القلب38. ركزت مجموعة Dockendorff على الكيمياء الطبية وعلم الأدوية لفئة منفصلة من الجزيئات الصغيرة ، روابط PAR1 المعروفة باسم parmodulins61,62. على عكس مضادات PAR1 المبلغ عنها مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين عبارة عن معدلات متحيزة ومتحيزة ل PAR1 تمنع بشكل انتقائي مسار Gαq مع تعزيز التأثيرات الواقية للخلايا المشابهة ل aPC. على عكس مضادات PAR1 التقويمية القوية مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين المنشور يمكن عكسه أيضا63،64،65.

في البداية ، تم تحديد البارمودولين من قبل Flaumenhaft وزملائه في العمل لقدرتهم على تثبيط تعبير P-selectin أو إفراز الحبيبات في الصفائح الدموية61,66. ومع ذلك ، كانت هناك حاجة إلى طريقة بديلة لدراسة آثار البارمودولين على الخلايا البطانية. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لمراقبة الإشارات المتعلقة ب GPCR في قياس تعبئة Ca2+ داخل الخلايا ، وهو رسول ثانوي مهم يمكن قياسه باستخدام صبغة مناسبة ملزمة للكالسيوم داخل الخلايا67,68. تم تقديم أدلة جوهرية تبين أن تعبئة الكالسيوم التي يسببها PAR1 تتم من خلال تنشيط Gαq69,70. بمجرد تنشيطه بواسطة ليجند مربوط (أو ليجند خارجي مناسب) ، يخضع PAR1 لتغيير توافقي يؤدي إلى استبدال ثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP) المرتبط بالوحدة الفرعية Gαq بثلاثي فوسفات جوانوزين (GTP)68. تقوم الوحدة الفرعية Gαq بعد ذلك بتنشيط فوسفوليباز Cβ (PLC-β) ، والذي يحفز التحلل المائي للفوسفاتيديلينوسيتول 4,5 ثنائي الفوسفات (PIP2) ، مكونا 1,4,5-إينوسيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) ودياسيلجليسرول (DAG). أخيرا ، يرتبط IP3 بقنوات Ca2+ الحساسة ل IP3 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية ، مما يسمح بإطلاق Ca2+ في السيتوبلازم ، حيث يمكن أن يرتبط بالأصباغ الفلورية المعتمدة على Ca2+ ، مثل Fluo-4 ، التي تضاف إلى الخلايا71. تحدث هذه العملية في غضون ثوان ويمكن أن تزيد من تركيز الكالسيوم2+ 100 ضعف ، مما يؤدي إلى تغيير جذري في كمية الصبغة المرتبطة بالكالسيوم وإشارة مضان قوية.

في عام 2018 ، كشفت مجموعة Dockendorff عن اختبار تعبئة Ca2+ متوسط الإنتاجية يمكن استخدامه لتحديد خصوم مسار Gαq ل PAR172. استخدم الفحص EA.hy92673 ، وهو خط خلية بطانية بشرية هجينة ، والذي يمكن استخدامه لمقاطع متعددة دون تغيير ملحوظ في تعبير PAR1 ، ويتم إنشاؤه للقياسات المختبرية للتأثيرات الواقية للخلايا.

استخدم البروتوكول الأصلي خلايا EA.hy926 في 96 لوحة بئر ومحملة بصبغة Fluo-4 / AM ، والتي تم اختيارها بسبب مضانها الشديد عند 488 نانومتر ونفاذية الخلايا العالية. بمجرد تحميل الصبغة في الخلايا ، تم إجراء خطوات غسيل طويلة باستخدام معالج سائل آلي من 8 قنوات (لم يكن من الممكن الوصول إلى طرق أسرع للتعامل مع السوائل ، مثل غسالة 96 قناة). كانت قابلية استنساخ هذا الفحص متفوقة على ذلك دون تغييرات الوسائط الروبوتية الآلية الدقيقة. ثم تم تحضين المضادات بالخلايا ، وتم تنشيط PAR1 من خلال الإضافة المتسلسلة لناهض انتقائي (16 بئرا في المرة الواحدة) ، وتم قياس التغيرات في التألق الناتجة عن تعبئة الكالسيوم وربط الصبغة لتحديد النشاط.

في حين أن هذا البروتوكول يسمح بقياس تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR1 ، إلا أنه محدود بالوقت اللازم لفحص كل لوحة 96 بئرا. تعتبر أوقات التجربة الطويلة مشكلة ليس فقط لأن عدد المركبات التي يمكن فحصها كل يوم محدود ، ولكن أيضا لأن تدفق الصبغة يحدث بمرور الوقت ، مما يضيق نافذة الفحص عن طريق زيادة التألق القاعدي. أحد المساهمين في وقت التجربة الطويل هو استخدام معالج سائل من 8 قنوات لغسل الألواح ، مما يضيف أكثر من 30 دقيقة لكل تجربة. كما أصبح من الصعب الحصول على النصائح المطلوبة بسبب مشاكل سلسلة التوريد. هنا تم الإبلاغ عن بروتوكول محدث لمقايسة تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR والتي لا تتطلب معالج سائل ، وبالتالي يمكن تشغيلها في إنتاجية أعلى. يجب أن يكون هذا البروتوكول مناسبا أيضا لقياس الإشارات مع GPCRs الأخرى التي تؤدي إلى تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا. يعد بروتوكول قارئ الألواح المحدث هذا مثاليا للمختبرات الأكاديمية والصناعية الصغيرة التي لا تملك الموارد اللازمة لأدوات تصوير الخلايا باهظة الثمن ولكنها تحتاج إلى فحص العديد من المركبات بسرعة. للحصول على مثال على مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام جهاز تصوير اللوحة ، انظر Caers et al.74.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء جميع عمليات التبادل / الإضافات الإعلامية التي تتم في الخطوتين 1 و 2 من البروتوكول التالي في غطاء معقم. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يجب شراء جميع الأواني البلاستيكية المستخدمة في غطاء المحرك المعقم معقمة ومختومة أو معقمة بشكل مناسب عبر الأوتوكلاف.

1. بدء خط الخلية EA.hy926

  1. الحصول على خلايا EA.hy926.
  2. قم بتخزين قارورة (قوارير) الخلايا في مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
  3. قم بإعداد وسط DMEM الكامل عن طريق تسخين DMEM و FBS والقلم / البكتيريا (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. أضف 50 مل من FBS و 1 مل من القلم / البكتيريا إلى 500 مل من DMEM. امزج المحلول برفق عن طريق الانقلاب.
    ملاحظة: يؤدي الخلط بقوة شديدة إلى وجود كميات زائدة من الفقاعات.
  4. أخرج قارورة واحدة من الخلايا من النيتروجين السائل وقم بتسخينها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تعقيم قارورة الخلايا وزجاجة DMEM متوسطة كاملة عن طريق الرش بالكحول ، ثم الانتقال إلى غطاء محرك السيارة المعقم.
  6. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل الخلايا بعناية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. أضف 1 مل من DMEM إلى القارورة لشطفها وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي.
  7. اصنع كرية من الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي (150 × جم ، 5 دقائق ، 22 درجة مئوية). إزالة الوسيط من أنبوب الطرد المركزي عن طريق الشفط ؛ احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  8. أضف 3 مل من الوسط الكامل DMEM إلى أنبوب الطرد المركزي وقم بتفكيك الحبيبات برفق عن طريق خلط تعليق الخلية باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب تجنب التسبب في الفقاعات عن طريق الاختلاط بقوة شديدة لأن ذلك قد ينشط الخلايا أو يتلفها.
  9. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة مع أطراف 20 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية / التريبان الأزرق إلى مقياس الدم وعد الخلايا.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر إلى قص الخلايا. لا ينبغي استخدام نصائح بهذا الحجم أثناء التعامل مع تعليق الخلية.
  10. أضف وسط DMEM الكامل إلى تعليق الخلية لعمل كثافة 66000 خلية / مل باستخدام ماصة مصلية 10 أو 25 مل. ماصة 15 مل من تعليق الخلية في قارورة (قوارير) ثقافة T-75. تأكد من التشتت المتساوي لتعليق الخلية عن طريق تحريك القارورة من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب.
  11. احتضان الخلايا حتى تصل إلى نقطة التقاء (عادة بعد 4-6 أيام) ، كما هو مقدر عن طريق الفحص تحت المجهر. في هذه المرحلة ، استخدم الخلايا في التجربة (بدءا من القسم 2) أو قم بزرعها في قوارير جديدة للتوسع لإعداد المخزونات المجمدة (بكثافة بذر موصى بها تبلغ 1,000,000 خلية في 15 مل من الوسط الكامل لكل قارورة T-75).
    ملاحظة: يمكن زراعة الخلايا في قوارير الثقافة لمدة تصل إلى 3 أسابيع دون اختلاف ملحوظ في الشكل أو الصحة أو الأداء في الفحص. يجب استبدال الوسيط الكامل كل 3-4 أيام.

2. إضافة خلايا EA.hy926 إلى 96 لوحة بئر

ملاحظة: يمكن استخدام خلايا من قارورة ثقافة T-75 متقاربة واحدة لإعداد لوحين أو ثلاثة ألواح فحص أو توسيعها اختياريا إلى ما يصل إلى 15 قارورة T-75 جديدة. يمكن فحص خمس لوحات فحص على الأقل باستخدام البروتوكول في القسمين 4 و 5 في يوم العمل العادي. تصف التعليمات التالية إعداد واختبار لوحة فحص واحدة ، ولكن يمكن تحضير لوحات إضافية بتكرار الخطوات 2.2 و 2.7 و 2.12 و 3.2 لإعداد العدد المطلوب من لوحات الفحص. الأكثر شيوعا ، يتم إعداد أربع لوحات فحص يوميا لقياس استجابات التركيز مع ما يصل إلى 16 مركبا ، الأمر الذي يتطلب قارورتين من T-75 مع خلايا متقاربة.

  1. دافئ DMEM وسط كامل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. تعقيم زجاجة DMEM وسط كامل عن طريق رشها بالكحول ، ثم نقلها إلى غطاء معقم.
  2. أضف 100 ميكرولتر من محلول جيلاتين معقم بنسبة 0.4٪ إلى جميع آبار صفيحة ذات جدران سوداء و 96 بئرا وذات قاع شفاف مع غطاء. احتضان اللوحة بمحلول الجيلاتين في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة.
  3. تأكد من أن الخلايا الموجودة في قارورة ثقافة T-75 متقاربة بنسبة 80-100٪ باستخدام مجهر مقلوب. قم بإزالة الوسط الكامل DMEM من قارورة T-75 عن طريق الشفط.
  4. اغسل الخلايا في القارورة باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني وحرك القارورة برفق من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب. قم بإزالة PBS من القارورة عن طريق الشفط.
  5. أضف 5 مل من محلول تفكك الخلايا إلى القارورة واحتضان القارورة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة ~ 12 دقيقة. اضغط على القارورة بعد 6 دقائق للمساعدة في تسهيل الانفصال.
    ملاحظة: يؤدي احتضان الخلايا لمدة تزيد عن 15 دقيقة باستخدام عامل تفكك الخلايا المشار إليه إلى بدء الخلايا في التكتل معا ، مما يجعل الحصول على عدد دقيق للخلايا أكثر صعوبة وقد يتداخل مع الفحص.
  6. أضف 5 مل من وسط DMEM الكامل المسخن مسبقا إلى القارورة واخلطه برفق في محلول تفكك الخلية / تعليق الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. اصنع كرية من الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي (150 × جم ، 5 دقائق ، 22 درجة مئوية).
  7. أثناء تشكيل الحبيبات ، قم بإزالة محلول الجيلاتين من لوحة 96 بئرا عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور متصلة بالفراغ. قم بإزالة غطاء اللوحة من وقت إزالة الجيلاتين حتى يصبح المحلول جاهزا للطلاء.
    ملاحظة: يمكن اختياريا استخدام ماصة متعددة القنوات أو مشعب معقم متصل بالفراغ.
  8. قم بإزالة الوسط من أنبوب الطرد المركزي عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور متصلة بفراغ أو ماصة مصلية ؛ احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  9. أضف وسط DMEM الكامل الطازج إلى أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة مصلية سعة 5 أو 10 مل. قم بتفتيت حبيبات الخلية برفق عن طريق خلط الوسط الكامل DMEM مع ماصة 1,000 ميكرولتر أو ماصة مصلية سعة 5 مل.
    ملاحظة: عادة ما يتم استخدام ثمانية ملليلتر من DMEM ، ولكن يمكن إضافة كميات أكبر لتسهيل عد الخلايا.
  10. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة مع أطراف 20 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية / التريبان الأزرق إلى مقياس الدم وعد الخلايا.
  11. أضف وسائط DMEM الكاملة إلى تعليق الخلية لعمل كثافة 600000 خلية / مل باستخدام ماصة مصلية 10 أو 25 مل. سيعطي هذا كثافة نهائية تبلغ 60000 خلية / بئر في صفيحة 96 بئرا (يتم تحديدها لتكون الكثافة المثلى عن طريق التجربة).
    ملاحظة: ستنتج زراعة الخلايا الناجحة الطبيعية ما بين 12,000,000 و 15,000,000 خلية ، والتي يمكن أن تزرع صفيحتين إلى ثلاث صفيحتين من 96 بئرا.
  12. امزج تعليق الخلية عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي برفق وإضافته إلى خزان ماصة متعدد القنوات سعة 50 مل. خلط التعليق في الخزان كل 30 ثانية عن طريق هز الخزان برفق من جانب إلى آخر ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. استبدل غطاء اللوحة الشفاف وهز اللوحة برفق عن طريق تحريكها على سطح الغطاء المعقم من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لضمان التوزيع المتساوي للخلايا. احتضان اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 16-24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام تعليق خلية إضافي لإعداد لوحات إضافية ، أو يمكن تكرار الخطوات 1.10-1.11 لمواصلة خط الخلية.

3. إعداد مقايسة تعبئة الكالسيوم

  1. إعداد الكواشف فحص.
    1. تحضير محلول البروبينسيد (250 مللي متر ، مائي) عن طريق إضافة 36 ملغ من البروبينسيد إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإذابته في 0.6 M NaOH (500 ميكرولتر). دوامة الحل.
      ملاحظة: يحسن Probenecid الاحتفاظ بالصبغة في الخلية عن طريق تثبيط ناقلات الأيونات العضوية75،76،77.
    2. لعمل مخزن مؤقت لمقايسة HBSS-HEPES ، أضف HEPES (1.19 جم) إلى زجاجة سعة 500 مل من HBSS الخالي من الكالسيوم / المغنيسيوم / الفينول الأحمر (صنع محلول 10 مللي متر من HEPES). استكمل المخزن المؤقت ب MgCl2 (محلول مائي 1 متر ، 500 ميكرولتر) و CaCl2 (محلول مائي 1 متر ، 500 ميكرولتر). امزج المحلول واحفظه في الثلاجة على حرارة 5 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستعمال.
      1. لكل لوحة 96 بئرا ، أضف 50 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، واستكمل ب 500 ميكرولتر من محلول البروبينسيد ، واخلطه جيدا. قم بتسخين المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. اصنع محلول Pluronic F-127 بنسبة 10٪ في DMSO عن طريق إضافة Pluronic F-127 (20 مجم) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق أو قارورة HPLC وحلها باستخدام 200 ميكرولتر من DMSO.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة وهو كاف لحوالي 30 لوحة. يذوب Pluronic F-127 ببطء شديد في درجة حرارة الغرفة ويجب تسخينه برفق لتسهيل الذوبان.
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل الصبغة عن طريق إضافة 24 ميكرولتر من DMSO أولا إلى قنينة من Fluo-4 / AM (50 ميكروغرام) لإذابة الصبغة. في أنبوب طرد مركزي ملفوف بورق الألمنيوم سعة 15 مل ، أضف 6 مل من محلول فحص HBSS-HEPES وتكملة مع 6 ميكرولتر من 10٪ Pluronic F-127 و 6 ميكرولتر من محلول Fluo-4 / AM. دوامة الحل لفترة وجيزة والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة ، بعيدا عن الضوء ، لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: لمنع التبييض الضوئي ل Fluo-4 ، احتفظ بالصبغة بعيدا عن الضوء عن طريق لف رقائق الألومنيوم حول أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول الصبغة وغطاء لوحة الفحص.
  2. تحضير لوحات الفحص.
    1. قم بإزالة لوحة الفحص من الحاضنة وتأكيد الالتقاء باستخدام مجهر مقلوب. قم بإزالة وسائط DMEM الكاملة يدويا عن طريق تحريكها في الحوض وتنشيف الجزء العلوي من اللوحة بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: تتم إزالة الوسط بشكل كاف عن طريق إمساك اللوحة أفقيا وتحريكها ، متبوعا بتدوير اللوحة 180 درجة والتكرار.
    2. أضف محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد إلى خزان مذيب ماصة متعدد القنوات سعة 50 مل.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذا المحلول لخطوات الغسيل اللاحقة ويجب وضعه جانبا وتغطيته بورق الألمنيوم لحين الحاجة.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات واترك الخلايا تجلس في وجود البروبينسيد لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت لمقايسة HBSS-HEPES عن طريق النقر في الحوض بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.2.1.
    4. أضف مخزن مؤقت لتحميل الصبغة إلى خزان مذيب ماصة منفصل متعدد القنوات سعة 50 مل. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الصبغة إلى كل بئر من لوحة الفحص باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان الطبق لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
    5. أثناء وجود اللوحة في الحاضنة ، قم بإعداد المحاليل الناهضة / المضادة.
      1. يتم تخزين حلول الخصوم كحلول 31.6 mM في DMSO. في أنبوب PCR ، قم بتخفيف 2 ميكرولتر من محلول المخزون ب 38 ميكرولتر من 0.1٪ BSA / ماء للحصول على محلول 1.58 mM. 2 ميكرولتر من هذا المحلول سيعطي تركيزا نهائيا يبلغ 31.6 ميكرومتر في لوحة الفحص. قم بتخفيف 4 ميكرولتر من محلول مضاد 1.58 mM مع 36 ميكرولتر من 5٪ DMSO / ماء (بدون إضافة BSA) ، وقم بإعداد التركيزات المتبقية من خلال التخفيفات التسلسلية.
      2. قم بإعداد محلول 108.3 ميكرومتر (16.7x) من TFLLRN-NH2 في مخزن مقايسة HBSS-HEPES ، والذي سيعطي تركيزا نهائيا يبلغ 6.5 ميكرومتر عند إضافة 6 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة الفحص. على سبيل المثال ، قم بإذابة حصة 2 ملغ من TFLLRN-NH2 مع 5.244 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES لإعطاء محلول مخزون 0.5 مللي متر. امزج 1.083 مل من هذا المحلول مع 3.917 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES لإعطاء محلول 108.3 ميكرومتر.
        ملاحظة: يجب تخزين محاليل TFLLRN-NH2 في مجمد -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام.
    6. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وتأكد من امتصاص الصبغة باستخدام مجهر مضان في مكان مناسب (عادة لبروتين الفلورسنت الأخضر ، انظر الشكل 1 للحصول على مثال على Fluo-4 الذي تم تحميله بنجاح في الخلايا). قم بإزالة المخزن المؤقت لتحميل الصبغة عن طريق تحريك اللوحة بنفس طريقة الخطوة 3.2.1.
    7. اغسل الخلايا 2x ب 50 ميكرولتر من محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد (من الخطوة 3.2.3) في كل بئر (قم بإزالته عن طريق تحريك الوسط في الحوض).
    8. أضف 92 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمقايسة HBSS-HEPES إلى كل بئر واعرض الخلايا مرة أخرى باستخدام مجهر مضان لضمان إزالة الصبغة الزائدة بالكامل ، وأن الخلايا تظل ملتصقة.
    9. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 2 ميكرولتر من المحاليل المضادة والمركبة إلى الآبار المناسبة (انظر الجدول 1 للحصول على خريطة لوحة تمثيلية).

4. إجراء مقايسة تعبئة الكالسيوم

  1. اضبط قارئ اللوحة على النحو التالي: درجة الحرارة: 37 درجة مئوية ؛ الطول الموجي للإثارة: 485 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاث: 525 نانومتر ؛ ارتفاع القياس: 7.8 مم (محسن) ؛ عدد الومضات: 100 ؛ عدد التكرارات: 20.
  2. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في قارئ الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية. قم بقياس مضان الخلفية في العمودين 1 و 2 (خمس عمليات مسح لكل بئر).
  3. أخرج اللوحة من قارئ اللوحة وأضف بسرعة 6 ميكرولتر من محلول ناهض إلى كل بئر في العمودين 1 و 2 من شريط PCR مكون من 8 أنابيب باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، نستخدم ماصة إلكترونية ذات 8 قنوات مع أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر.
  4. قم بقياس التغير في التألق حيث يحدث تحرك الكالسيوم في الخلايا. قم بإجراء 20 عملية مسح لكل بئر وفقا للإعدادات أعلاه.
    ملاحظة: يستغرق مسح كل بئر في عمودين 20x لكل منهما حوالي 5 دقائق (أي ~ 15 ثانية بين عمليات المسح لكل بئر).
  5. كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.4 للأعمدة من 3 إلى 12 بزيادات عمودين.

5. تحليل البيانات

  1. تصدير البيانات من الفحص كجداول بيانات منفصلة لكل مجموعة من عمودين.
  2. أوجد متوسط قراءات التألق القاعدي باستخدام الدالة AVG (المسح الأول: المسح الأخير). افعل ذلك لكل بئر في كلا العمودين.
  3. أوجد الحد الأقصى للتألق بعد إضافة ناهض باستخدام الدالة MAX (الفحص الأول: المسح الأخير).
  4. احسب التغير في التألق عن طريق طرح التألق القاعدي من الحد الأقصى للتألق.
  5. اطرح التغير في التألق المحسوب للتحكم السلبي (إضافة مركبة بدون ناهض) من كل بئر في نفس العمود.
  6. أوجد التغير النسبي (الطبيعي) في التألق بقسمة التغير في التألق في كل بئر على التغير في التألق في السيارة (0.1٪ DMSO / ماء) + 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 بئر.
  7. انسخ القيم غير التحكم، كنسب مئوية، إلى برنامج الإحصاء والرسوم البيانية. إذا كنت تستخدم البرنامج المشار إليه ، فاختر خيار الجدول XY ، مع اختيار الأرقام كمحور X وتكرار القيم في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب كمحور ص.
  8. استخدم البرنامج لرسم منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) من البيانات. في حالة استخدام البرنامج المشار إليه ، اختر خيار السجل (المانع) مقابل الاستجابة - المنحدر المتغير (أربعة معلمات).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغرض من هذا الفحص بشكل عام هو إنتاج منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) لثلاثة إلى أربعة بارمودولين جديد. في كل لوحة فحص ، غالبا ما يتم إنشاء CRC إضافي لمركب معروف ، مثل NRD-21 ، والذي يعمل كفحص جودة للتجربة بسبب IC50 المعروف. لإنشاء CRCs ، يجب تخطيط خريطة لوحة مثل تلك الموضحة في الجدول 1 . إذا كانت استجابات التركيز أحادية النقطة مرغوبة بدلا من ذلك ، فيجب إضافة المركبات عند تركيزات نهائية 10 ميكرومتر (أو تركيزات مفضلة أخرى) إلى ثلاثة آبار على الأقل.

عند إجراء الفحص ، يجب أن تكون هناك زيادة سريعة في التألق (يجب أن تبدأ الزيادة خلال أول 3-4 عمليات مسح) يعرضها قارئ اللوحة (انظر الشكل 2 أ للحصول على مثال للإخراج مقارنة بالإخراج الفاشل في الشكل 2 ب). من المهم ملاحظة أنه يجب إضافة الناهض بسرعة (في غضون 15 ثانية) حتى يتمكن قارئ اللوحة من التقاط الزيادة في التألق بدقة. في تجربة العمل ، يجب أن تظل الإشارة الفلورية لبئر السيارة مسطحة ، بينما يجب أن تبدأ إشارة التألق في آبار التحكم الإيجابية (السيارة + 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2) في الزيادة بعد ثلاث أو أربع عمليات مسح. بمجرد الوصول إلى القيمة القصوى (بعد ~ 10 عمليات مسح) ، يجب أن تبدأ إشارة التألق في الانخفاض ببطء. في التجارب مع الخصوم عالية الفعالية ، يجب أن يكون للآبار التي تحتوي على أعلى تركيزات من المضاد إشارة تظل مسطحة نسبيا ، على غرار التحكم السلبي. يجب أن يكون هناك أيضا اختلاف بسيط بين إشارة آبار التحكم الإيجابية وتلك ذات التركيزات المنخفضة من المضاد (الشكل 2C). إذا كانت أقل تركيزات المضاد لا تزال تمنع حركة الكالسيوم ، فيجب تعديل التركيزات التي تم فحصها لتشمل تركيزات أقل. يجب أن تحتوي CRCs التي تم إنشاؤها على نقطة بيانات واحدة على الأقل ~ 100٪ لإظهار الطبيعة السيني للمنحنى بشكل كامل.

العلامة الأكثر شيوعا على أن التجربة لم تنجح هي إذا كان بئر التحكم الإيجابي (السيارة + 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2) لا يظهر زيادة كبيرة في التألق (الشكل 2 ب). يمكن أن يحدث هذا لمجموعة متنوعة من الأسباب: يمكن أن يكون عدد الخلايا منخفضا (إذا لم يتم تأكيد التقاء) ، أو يمكن اختراق محلول الناهض ، أو يمكن أن تأخذ الخلايا كميات غير كافية من الصبغة. من الممكن أيضا عدم إضافة ناهض عن طريق الخطأ إلى بعض الآبار.

باستخدام طريقة مبرمجة ، يتم إخراج البيانات كستة جداول بيانات منفصلة ، يحتوي كل منها على بيانات لعمودين. توجد عمليات المسح الخمسة للتألق القاعدي في صفها الخاص ، مع إجراء 20 مسحا بعد إضافة ناهض في الصف أدناه مباشرة (انظر الشكل 3 للحصول على إخراج تمثيلي). كمثال على عملية حسابية، سيتم استخدام عمود من تجربة باستخدام NRD-21. في الملف المصدر (الشكل 3) ، يتم إخراج التألق القاعدي من كل بئر إلى الأعمدة من C إلى G ، ويتم إخراج البيانات من بعد إضافة الناهض (عمليات المسح العشرون التالية) إلى الأعمدة من C إلى V في الصف التالي. تحتوي الصفوف من 14 إلى 17 في الملف على عنصر تحكم إيجابي لعمودين منفصلين. تم حساب متوسط الصف القاعدي لأحد آبار التحكم الإيجابية باستخدام الأمر "= AVERAGE (C16: G16)" ، والذي أعطى قيمة 1,039.8. تم تكرار هذا الأمر للقياسات القاعدية الإضافية في كل بئر. تم حساب الحد الأقصى لعمليات المسح التجريبية باستخدام الأمر "= MAX (C16: V16)" ، والذي أعطى قيمة 2,629. مرة أخرى ، تم تكرار الأمر لجميع الآبار. ثم تم طرح التألق القاعدي لكل بئر من القيمة القصوى. في هذه التجربة ، تم تطبيع البيانات عن طريق طرح التغير في التألق في التحكم السلبي من كل بئر (والذي كان 142.6 في عمود المثال). ثم قسمت هذه القيم على القيمة المحسوبة بالمثل للتحكم الإيجابي. في هذا العمود ، كانت القيمة القصوى 2,629 ، وكان متوسط القياس الأساسي 1,039.8 ، والقيمة المطروحة للفراغ 142.6. وبالتالي فإن قيمة التحكم الموجبة المعدلة هي 1,446.6 (محسوبة من المعادلة). تتكرر هذه المعادلة لكل بئر في العمود ، ويتم تقسيم القيم المحسوبة على 1,446.6 لإعطاء تغييرها النسبي في التألق. ثم تم تحويل النسب إلى نسب مئوية وتم نسخها في البرنامج التحليلي. تكررت هذه العملية للأعمدة ال 11 الأخرى.

لمعالجة البيانات باستخدام البرنامج المشار إليه ، يجب تحديد جدول XY مع خيار الحصول على ثلاثة قياسات متكررة في أعمدة جنبا إلى جنب. يجب إدخال قيم -log لكل تركيز في قيم x ، وإضافة النسب المئوية المحسوبة إلى قيم y. يجب إجراء تحليل الانحدار غير الخطي على البيانات ، مما يؤدي إلى إنتاج أربعة منحنيات تركيز واستجابة. يقوم البرنامج أيضا بإخراج قيم IC50 ، وإحصاءات الأخطاء الكمية ، وإحصاءات الملاءمة الجيدة.

figure-results-1
الشكل 1: Fluo-4 / AM محمل في خلايا EA.hy926. يتم تحميل Fluo-4 بشكل انتقائي في خلايا EA.hy926 ، بعد خطوات حضانة الصبغة والغسيل. كل مضان داخل الخلايا ، مع عدم وجود تسرب للصبغة. تم الحصول على الصورة باستخدام إعداد GTP على جهاز تصوير خلية EVOS وتكبير 20x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الناتج المحتمل للمقايسة. (أ) ناتج قارئ اللوحة التمثيلية لمقايسة العمل. الصف A هو عنصر التحكم السلبي وليس له أي تغيير في التألق. الصف B هو عنصر التحكم الإيجابي ويظهر زيادة سريعة في التألق. الصفوف C-H هي الآبار التجريبية ، مع تركيزات أعلى من البارمودولين أقل في اللوحة. (ب) مثال على ناتج تجربة فاشلة. لا توجد زيادة في التألق في الصف B ، وهو التحكم الإيجابي. (ج) التغير في التألق بمرور الوقت الناجم عن ناهض PAR1 TFLLRN-NH2. يستغرق مسح عمودين من لوحة 96 بئرا باستخدام الإعدادات المتوفرة ~ 5 دقائق على قارئ لوحة PerkinElmer EnSpire (أي ~ 15 ثانية بين عمليات المسح لكل بئر). حلول NRD-21 المختلفة كما هو موضح ، "ناهض" هو 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 ، n = 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مثال على إخراج Excel لمقايسة العمل. يتم إخراج التألق القاعدي إلى صفوف ذات أرقام زوجية تبدأ من الصف 10 ، والنتيجة من أول 10 عمليات مسح بعد إضافة ناهض يتم إخراجها في الصفوف اللاحقة ذات الأرقام الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التعامل الروبوتي مع السوائل مقابل "النقر". الطلاء المسبق لألواح الفحص بالجيلاتين وإجراء عمليات تبادل الوسائط يدويا عن طريق تحريك اللوحة ونشافها جافة ينتج منحنيات استجابة التركيز مع تباين أقل. (أ) منحنيات التركيز والاستجابة للبارمودولين ML161 و NRD-21 و 5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 ، n = 3 (مناولة السوائل الآلية). (ب) منحنيات التركيز والاستجابة للبارمودولين ML161 و NRD-21 و 5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 ، n = 3 (ألواح مغلفة بالجيلاتين ، منفضوطة). البيانات هي وسائل ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: دراسات درجة الحرارة. يؤدي إجراء الفحص عند 37 درجة مئوية إلى توليد بيانات قابلة للتكرار أكثر من درجة حرارة الغرفة. (أ) منحنيات التركيز والاستجابة ل ML161 و 5 μM TFLLRN-NH2 ، n = 3 (درجة حرارة الغرفة). (ب) منحنيات التركيز والاستجابة ل ML161 و 5 μM TFLLRN-NH2 ، n = 3 (37 درجة مئوية). البيانات هي وسائل ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: دراسات كثافة الخلايا. كثافة الخلية المثلى هي 60000 خلية / بئر عند البذر 16-24 ساعة قبل بدء الفحص. (أ) منحنيات التركيز والاستجابة ل TFLLRN-NH2 عند كثافات خلايا مختلفة ، n = 3. (ب) منحنى التركيز والاستجابة ل TFLLRN-NH2 عند الكثافة المثلى للخلية البالغة 60000 خلية / بئر. البيانات هي وسائل ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: حجم الفحص. يؤدي استخدام حجم فحص يبلغ 100 ميكرولتر إلى توليد منحنيات استجابة تركيز قابلة للتكرار أكثر من المقايسات باستخدام حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر. (أ) منحنيات التركيز والاستجابة ل ML161 و 5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 ، n = 3 (الحجم النهائي 200 ميكرولتر). (ب) منحنيات التركيز والاستجابة ل ML161 و 5 μM TFLLRN-NH2 ، n = 3 (الحجم النهائي 100 ميكرولتر). البيانات هي وسائل ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 8: توليد عوامل Z لتحديد قدرة الفحص على اكتشاف مركب ضرب. استجابات تعبئة الكالسيوم مع 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 (العمود B) بالإضافة إلى مضادات PAR1 الاختيارية 10 ميكرومتر NRD-21 (العمود C) أو 0.316 ميكرومتر vorapaxar (العمود D). (أ) اكتمل الفحص بعد 16 ساعة من بذر الخلية. (ب) اكتمل الفحص بعد 24 ساعة من بذر الخلية. (ج) جدول عوامل Z'-المحسوبة باستخدام المعادلة التالية: figure-results-9، حيث σp هو الانحراف المعياري للتحكم الموجب ، و σn هو الانحراف المعياري للتحكم أو العينة السالبة ، و μp هو متوسط السيطرة الموجبة ، و μn هو متوسط التحكم أو العينة السالبة. يتم حساب كل قيمة عن طريق تعيين السيارة + 6.5 μM TFLLRN-NH2 كعنصر تحكم إيجابي ومقارنتها بالحالة المشار إليها كعنصر تحكم سلبي (مركبة) أو عينة (NRD-21 و vorapaxar). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10
الشكل 9: تعبئة الكالسيوم من ناهض PAR2. التغير في التألق بمرور الوقت الناجم عن 10 ميكرومتر SLIGKV-NH2 ، ن = 4. البيانات هي وسيلة ± التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مثال على خريطة لوحة 96 بئرا للغربلة المركبة. يتم قياس كل تركيز في ثلاث نسخ. يحتوي الصف A على عناصر تحكم سلبية (بدون خصم ؛ لا ناهض) ، ويحتوي الصف B على عناصر تحكم موجبة (بدون خصم ؛ ناهض). تحتوي الأعمدة من 1 إلى 3 على ستة تركيزات نصف لوغاريتمية من البارمودولين NRD-21 والتي يمكن استخدامها اختياريا لمراقبة الجودة. PM-A ، PM-B ، PM-C هي بارمودولين غير مسماة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مقارنة بين البروتوكول المنشور سابقا والبروتوكول الجديد المحسن. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن البروتوكول72 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا كان موثوقا به بشكل عام وسمح لنا بتحديد بارمودولين رئيسي جديد ، NRD-21,62 كان مطلوبا بروتوكول أكثر كفاءة. تم اختراق الفحص بشكل أكبر خلال نقص العرض الناجم عن جائحة COVID-19. أصبح الحصول على نصائح لمعالج السوائل الآلي أمرا صعبا ، ومحاولة غسل النصائح وتعقيمها وإعادة استخدامها أنتجت CRCs مع تباين كبير. وقد سهل ذلك سلسلة عاجلة من التجارب المصممة لتبسيط مقايسة تعبئة الكالسيوم المحسنة التي يحركها PAR.

كان تحديد بديل صالح لاستخدام معالج السوائل الآلي لخطوات الغسيل هو الأولوية الرئيسية في هذه الدراسة. أثناء تطوير الفحص السابق ، قلل استخدام معالج السائل الآلي من الأخطاء الناجمة عن تبادل الوسائط اليدوي. ومع ذلك ، أضاف هذا وقتا كبيرا للفحص ، حيث أدت التبادلات الإعلامية مع معالج السائل المكون من 8 قنوات إلى زيادة الوقت الإجمالي لكل لوحة فحص بمقدار 30-45 دقيقة. على الرغم من تجربة طريقة "النقر" لتبادل الوسائط سابقا ، فقد أجريت هذه التجارب دون طلاء ألواح الفحص بالجيلاتين قبل بذر الخلايا. من خلال المعالجة المسبقة للألواح بالجيلاتين ، تم ضمان بقاء الخلايا في مكانها بغض النظر عن القوة المستخدمة لإزالة الوسائط يدويا. كان لدى CRCs التي تم إنشاؤها في الفحص باستخدام الألواح المطلية بالجيلاتين والمنفضة درجات جودة أفضل وأشرطة خطأ أصغر عند نقاط بيانات متعددة من المنحنيات حيث تم استخدام معالج السائل الآلي (الشكل 4). كانت قيم خطأ جذر متوسط التربيعي (RMSE) للوحة باستخدام معالج السائل الآلي 9.687 لمنحنى ML161 و 10.690 لمنحنى NRD-21 ، بينما كانت قيم RMSE للوحة باستخدام الجيلاتين وتبادل الوسائط اليدوي 7.658 لمنحنى ML161 و 6.408 لمنحنى NRD-21. تشير قيم RMSE المنخفضة إلى منحنى يناسب البيانات المحددة بشكل أفضل. هذا التغيير يقلل أيضا بشكل كبير من إجمالي وقت الفحص. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام غسالة ألواح أوتوماتيكية متعددة القنوات.

كانت طريقة إضافة ناهض عامل إضافي تمت دراسته. وقد تم ذلك لتحديد ما إذا كان يمكن إضافة ناهض إلى جميع آبار الألواح في وقت واحد متبوعا بمسح اللوحة بأكملها مرة واحدة. هذا من شأنه أن يلغي حاجة الباحثين للبقاء بالقرب من قارئ اللوحة طوال مدة الفحص الحساس للوقت للعديد من الإضافات المنفصلة للناهضات ، والتي يمكن أن تزيد الإنتاجية بشكل كبير. لسوء الحظ ، كانت إضافة ناهض إلى جميع الآبار ومسح اللوحة بأكملها مشكلة ، لأن الاستجابة سريعة جدا لقياس تركيز الكالسيوم الأقصى العابر في كل بئر بشكل موثوق ، مما يعطي CRCs متغيرة للغاية. أدى تقليل عدد الأعمدة الممسوحة ضوئيا من 12 إلى 6 إلى تحسين النتائج بشكل طفيف ، ولكن تم إنشاء أفضل النتائج من مسح عمودين فقط (16 بئرا) في وقت واحد. يمكن للمرء أن يفترض أن خفض درجة حرارة الفحص من 37 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة يمكن أن يبطئ التغير في تركيز الكالسيوم بما يكفي للسماح بإجراء قياسات موثوقة. على الرغم من التحقق من صحة بروتوكولات تعبئة الكالسيوم المتعددة ذات الأصباغ أو خطوط الخلايا المختلفة في درجة حرارةالغرفة 78,79 ، في هذا الفحص المحدد ، لوحظت نتائج محسنة عند 37 درجة مئوية. لم تكن منحنيات استجابة تركيز الخصوم المقاسة في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) موحدة كما كانت عند 37 درجة مئوية (الشكل 5 أ مقابل الشكل 5 ب). بسبب هذه النتائج ، تم تحديد أن مسح عمودين في وقت واحد عند 37 درجة مئوية هو الأمثل.

متغير آخر تم فحصه لتقليل وقت الفحص هو وقت حضانة الخصوم. في البروتوكول السابق ، تم تحضين الخصوم لمدة 40 دقيقة قبل إضافة الناهض ، ولكن تم تحديد هنا أن 15 دقيقة هي وقت كاف لتفاعل البارمودولين مع PAR1. تم اختبار ذلك عن طريق إضافة محاليل بارمودولين إلى أعمدة متعددة في نفس الوقت متبوعة بإضافة ناهض في نقاط زمنية مختلفة (تمت إضافة ناهض عند t = 15 دقيقة و 30 دقيقة و 45 دقيقة). تم الاحتفاظ بنشاط البارمودولين ، ولكن لم يتحسن ، من خلال احتضان الخصوم لفترة أطول. نتيجة لهذا الاكتشاف ، في البروتوكول الجديد ، تتم إضافة حلول مضادة إلى اللوحة بأكملها في وقت واحد ، وتضاف حلول ناهض إلى الأعمدة الأولى بعد حضانة مدتها 15 دقيقة. يقلل هذا التغيير من إجمالي وقت التجربة بمقدار 30 دقيقة. تجدر الإشارة إلى أن الخصوم ذات حركية الارتباط البطيئة ، مثل vorapaxar ، قد تتطلب أوقات حضانة أطول80,81.

في حين أن تقليل وقت الفحص والقضاء على الاعتماد على معالج السائل كانا من العوامل الرئيسية التي تستلزم تحديث بروتوكول الفحص ، تم أيضا اختبار طريقة بديلة لزراعة الخلايا. في السابق ، تم زرع الألواح بخلايا مباشرة من المخزونات المجمدة وسمح لها بالنمو في الألواح لمدة 40-48 ساعة بعد البذر. ومع ذلك ، فإن الوقت الممتد بين لوحات البذر وإجراء المقايسات حد من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها كل أسبوع. استخدام الخلايا المزروعة في قوارير الثقافة يقلل بشكل كبير هذه المرة. نمت الخلايا في قوارير T-75 المعالجة بزراعة الأنسجة وتمت إزالتها من سطح القارورة باستخدام عامل تفكك الخلايا غير الأنزيمي. قد يكون هذا مهما لتجنب إتلاف بعض مستقبلات سطح الخلية ، وخاصة PAR2 ، مع التربسين. بمجرد إضافتها إلى لوحة الفحص ، تحتاج الخلايا إلى وقت كاف للاستقرار والالتصاق بالجيلاتين. نظرا لأن طريقة النقر لإزالة الوسائط يمكن أن تحل محل الخلايا أيضا ، فهناك حاجة إلى وقت كاف للسماح للخلايا بأن تصبح جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين. تسببت تجربة تسمح للخلايا بالاستقرار لمدة ساعتين في خسارة كبيرة للخلايا ، مما أدى إلى مقايسة غير صالحة للاستعمال (البيانات غير معروضة). أوقات التسوية بين 2 ساعة و 12 ساعة تحد من عدد اللوحات التي يمكن تحليلها في يوم واحد ، لذلك يفضل الحضانة الأطول بين عشية وضحاها. وقد وجد أن احتضان الخلايا المزروعة حديثا في أي مكان بين 16 ساعة و 24 ساعة سمح للخلايا بالالتصاق الكامل بالجيلاتين ، ويمكن الحصول على بيانات قابلة للتكرار.

كما أدى التغيير من الخلايا المجمدة إلى الخلايا المزروعة في قارورة إلى تغيير كثافة بذر الخلايا المثلى. وكما هو متوقع، فإن زرع الآبار بكثافة 25000 خلية / بئر التي كانت قياسية في البروتوكول السابق لم يسمح للخلايا بالوصول إلى نقطة التقاء مع وقت حضانة أقصر. تم إنشاء CRCs ناهض مع ثماني كثافات خلايا منفصلة لتحديد الظروف المثلى (الشكل 6). في السابق ، تم استخدام TFLLRN-NH2 كناهض PAR1 عند 5 ميكرومتر ، حيث سمح ذلك بالعداء المعقول مع بارمودولين أقل قابلية للذوبان. لا يوجد فرق كبير في الخلفية أو الإشارة القصوى عند البذر ب 45000-65000 خلية / بئر ، ولكن هناك انخفاض في التباين مع 5 μM TFLLRN-NH2 عند إضافة 60000 خلية / بئر. ومن المثير للاهتمام ، أنه لا توجد زيادة كبيرة في التألق الأقصى مع عدد أكبر من الخلايا ، لذلك تم اختيار 60000 خلية / بئر ككثافة مثالية بسبب انخفاض التباين. أنتجت ناهضات CRCs أيضا EC50 من 6.5 ميكرومتر ل TFLLRN-NH2 ، لذلك تم اختيار هذا كتركيز ناهض قياسي جديد.

عامل آخر تم تحليله هو الأحجام المستخدمة في الفحص. في البروتوكول السابق ، تمت إضافة 2 ميكرولتر من الناهض إلى كل بئر لإعطاء حجم فحص نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. تم افتراض أن إضافة كميات أكبر من محلول ناهض - مع الحفاظ على التركيز النهائي ثابتا - يمكن أن يساعد في الخلط ، مما يتسبب في إشارة أسرع وأكثر موثوقية. لاختبار هذه الفرضية ، تمت مقارنة إضافة 2 ميكرولتر و 6 ميكرولتر و 10 ميكرولتر TFLLRN-NH2 إلى 100 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر من HEPES-HBSS في لوحة فحص تحتوي على تركيزات مختلفة من NRD-21. تم إنشاء CRCs من NRD-21 من كل حالة لتحديد أي مزيج من حجم ناهض وحجم الفحص النهائي أعطى البيانات الأكثر اتساقا. في حين أن كل من الإضافات 2 ميكرولتر و 6 ميكرولتر أدت إلى توليد CRCs مع القليل من التباين ، لا يمكن قول الشيء نفسه عن المنحنيات الناتجة عن إضافة 10 ميكرولتر TFLLRN-NH2 (البيانات غير معروضة) ؛ لم تكن الزيادات في التألق متسقة في هذه الآبار من حيث الحجم أو التوقيت ، مما ينتج CRCs التي يجب أن تكون متطابقة ولكنها بدلا من ذلك مختلفة اختلافا جذريا. على الرغم من أن الإضافات 2 ميكرولتر و 6 ميكرولتر أنتجت نتائج مماثلة ، إلا أن التغيير في التألق حدث بشكل أسرع بكثير مع إضافة 6 ميكرولتر من TFLLRN-NH2 ، مما سمح بخفض العدد الإجمالي لعمليات المسح في كل بئر إلى النصف ، من 40 عملية مسح إلى 20 عملية مسح. كما تقرر أن استخدام حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر ينتج عنه CRCs أكثر اتساقا مقارنة بتلك المتولدة بحجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر (الشكل 7).

لتحديد ما إذا كان البروتوكول الجديد مناسبا لفحوصات الإنتاجية الأعلى ، تم حساب عوامل Z للفحص (الشكل 8). عامل Z هو طريقة إحصائية تقيس جودة فحص الفحص وتحدد ما إذا كان الفحص سيفرق بشكل موثوق بين المركبات النشطة وغير النشطة82. تم حساب عوامل Z للفحوصات التي أجريت بين 16 و 24 ساعة بعد ألواح البذر ، وفي ممرات خلايا مختلفة. في جميع الحالات - لكل من أوضاع الناهض فقط والناهض بالإضافة إلى المضاد - كانت عوامل Z المحسوبة أكبر من 0.5 ، مما يدل على مقايسة ممتازة82. كانت عوامل Z المحسوبة أيضا مماثلة لتلك المحسوبة للاختبار السابق ، مما يشير إلى أن التغييرات التي تم إجراؤها على البروتوكول لإنتاج اختبار أسرع لم تؤثر سلبا على الجودة.

تم تحديث بروتوكول تعبئة الكالسيوم المدفوعة ب PAR من خلال التجارب التي تولد قيم IC50 من CRCs ، ولكن يمكن أيضا استخدام الفحص لقياس فعالية مضادات PAR1 بتركيزات واحدة. يمكن أيضا استخدام الفحص لقياس نشاط روابط PAR2 ؛ على سبيل المثال ، يمكن أن يحل ناهض PAR2 SLIGKV-NH2 محل TFLLRN-NH2 في البروتوكول المحدث (الشكل 9) ؛ تم استخدام البروتوكول السابق أيضا مع ناهضات ومضادات PAR283. على الرغم من عدم اختباره صراحة هنا ، يجب أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق أيضا على الخلايا البطانية الوريدية للوريد السري البشري (HUVEC) ، والتي تم استخدامها مع البروتوكول السابق ، وربما خطوط الخلايا الملتصقة الأخرى. يتمثل أحد القيود المفروضة على استخدام قارئ لوحة المسح الضوئي مع بروتوكولات مثل هذا البروتوكولات في أنها غير مناسبة لدراسة الاستجابات السريعة (دون الثانية) ، على الأقل ليس بالتوازي كما هو ممكن مع جهاز تصوير اللوحة.

في الختام ، تم الإبلاغ هنا عن بروتوكول أسرع وأبسط لمقايسة تعبئة الكالسيوم البطانية التي يحركها PAR باستخدام قارئ اللوحة. من خلال القضاء على الحاجة إلى معالج سائل آلي ، وتقليل وقت حضانة المضاد ، وتقليل عدد عمليات المسح لكل بئر ، تم تخفيض إجمالي وقت الفحص بمقدار 90-120 دقيقة على الأقل ، وتم تقليل تكاليف الفحص (للمقارنة بين البروتوكولات المبلغ عنها سابقا والبروتوكولات الحالية ، انظر الجدول 2). لن يسمح هذا فقط بفحص المزيد من المركبات كل يوم ، ولكنه يزيل أيضا خطر انخفاض نافذة الفحص من تدفق الصبغة ، مما قد يؤدي إلى نتائج غير موثوقة. يسمح الفحص المحسن حديثا بالفحص الأسرع في الخلايا البطانية لروابط PAR1 أو PAR2 ، أو ربما روابط GPCR الأخرى التي تنشط تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا ، في المختبرات التي تقتصر على استخدام قارئات الألواح.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.D. هو مخترع براءات الاختراع التي تنطوي على البرومودولين وهو مؤسس ومساهم في شركة Function Therapeutics، Inc. ، التي تقوم بتطوير البارمودولين للاستخدام السريري.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر إيرين هيرنانديز وترودي هوليست والدكتور هارتموت ويلر (معهد فيرسيتي لأبحاث الدم) والدكتور ليجي أرنولد (جامعة ويسكونسن - ميلووكي) على توفير المساحة والدعم غير المباشر لهذا المشروع ، والدكتور جون ماكورفي (كلية الطب في ويسكونسن) على المشورة ذات الصلة. نشكر المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R15HL127636) ، ووزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH22101) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (2223225) على دعم المنح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية > كواشف ثقافة الخلية< / قوية >
ملتصقة خلايا EA.hy926ATCCCRL-2922
CellStripper كاشف تفككالخلايا Corning25-056-CIيمكن استخدامه اختياريا ، ولكن يجب بالتأكيد تجنبه باستخدام فحوصات PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع الفينول الأحمرCorning10-013-CV
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Avantor97068-091
الجيلاتين من جلد الخنازيرMilliporeSigmaG2500استخدمه لصنع محلول مائي 0.4٪ (وزن / حجم) بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف قبل الاستخدام للتعقيم.
قلم / بكتيريا (100X)Corning30-002-CI
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Corning21-040-CV
أزرق تريبان (0.4٪ وزن / حجم) كواشفتعبئة الكالسيوم25-900-CI
قوية > كالسيوم < / قوية >
4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES)حراري 172571000
ألبومين مصل الأبقار (BSA)أفانتور97061-420
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيومثيرمو42352-0250
ثنائي ميثيل سلفوكسيدThermoJ66650-AD
Fluo-4 / AMInvitrogenF14201
محلول الملح المتوازن من هانك (خالي من الكالسيوم / المجم / الفينول الأحمر)كورنينج21-022-CV
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
هيدروكسيد الصوديومVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2< / sub> (ملح TFA)من إعداد Trudy Holyst في Versiti Blood معهد الأبحاث
<قوي>المواد< / قوي>
96 بئر معالجة بالثقافة ، سوداء الجدران ، لوحة فحص قافليةشفافة Corning3603مع أغطية شفافة
أنبوب الطرد المركزي ، 15 ملAvantor89039-664
Avantor89039-656سعة 50 مل
، T-75Corning353136معالجة ثقافة الأنسجة
خزان الكاشف القابل للتصرف ، 50 ملCorningRES-V-50-S
قارئ لوحة EnspirePerkin Elmerأنبوب
الطرد المركزي الدقيق المتوقف ، 1.5 ملAvantor20170-038
ماصة باستور ، 9 "Fisher13-678-6Bيجب تعقيم
شريط أنبوب PCR مع شقة منفصلة شرائط غطاءأفانتور76318-802
أطراف ماصة ، 20 & إلبيوتكس63300042أطراف ماصة معقمة ومفلترة
، 200 وميكرو ؛ إلبيوتكس63300044ماصة معقمة ومفلترة
، 1250 & ميكرو ؛ LBiotix63300047معقمة ، نصائح مفلترة
PrismGraphPadحجم 6 تستخدم
ماصة مصلية ، 5 ملTradewinds Direct& nbsp ؛ 07-5005
ماصة مصلية ، 10 ملTradewinds Direct  ؛ 07-5010
ماصة مصلية ، 25 ملTradewinds Direct  ؛ 07-5025
< أنبوب الطرد المركزي ، قارورة ثقافة أطراف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PAR1 Fluo 4 Gq 96

مقالات ذات صلة