تم تطوير بروتوكول محسن لمقايسة تعبئة الكالسيوم مع الخلايا البطانية ، وتستخدم لتحديد روابط المستقبلات المنشطة للبروتياز (PARs). يقلل البروتوكول الجديد من إجمالي وقت الفحص بمقدار 90-120 دقيقة وينتج منحنيات استجابة تركيز قابلة للتكرار.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توصيف معدلات المستقبلات المنشطة بالبروتياز باستخدام مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام قارئ الألواح
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تتم مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الخلايا بسرعة بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام الأصباغ داخل الخلايا والفلورسنت وملزمة الكالسيوم وأدوات التصوير التي يمكنها قياس انبعاثات الفلورسنت من ما يصل إلى 1536 بئرا في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوات أغلى بكثير ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ عليها مقارنة بقارئات اللوحات المتاحة على نطاق واسع والتي تمسح الآبار بشكل فردي. الموصوف هنا هو اختبار محسن لقارئ الألواح للاستخدام مع خط الخلايا البطانية (EA.hy926) لقياس التنشيط المدفوع بمستقبلات تنشيط البروتياز (PAR) لإشارات Gαq وتعبئة الكالسيوم اللاحقة باستخدام صبغة ربط الكالسيوم Fluo-4. تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف مجموعة من روابط PAR ، بما في ذلك روابط "البارمودولين" المضادة للالتهابات التي تستهدف PAR1 والتي تم تحديدها في مختبر Dockendorff. يغني هذا البروتوكول عن الحاجة إلى معالج سوائل آلي ويسمح بفحص متوسط الإنتاجية لروابط PAR في لوحات 96 بئرا ويجب أن يكون قابلا للتطبيق على دراسة المستقبلات الأخرى التي تبدأ تعبئة الكالسيوم.
المقدمة
المستقبلات المنشطة بالبروتياز (PARs)1،2،3 هي فصيلة فرعية من مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين من الفئة A G (GPCRs) التي يتم التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الصفائح الدموية والخلايا البطانية4،5،6،7. على عكس غالبية GPCRs ، فإن PARs لها طريقة تنشيط فريدة داخل الجزيئات. يتم تنشيط معظم GPCRs عن طريق الروابط القابلة للذوبان التي تتفاعل مع جيب ربط مميز ، ولكن يتم تنشيط PARs عن طريق الانقسام ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم إجراء جميع عمليات التبادل / الإضافات الإعلامية التي تتم في الخطوتين 1 و 2 من البروتوكول التالي في غطاء معقم. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يجب شراء جميع الأواني البلاستيكية المستخدمة في غطاء المحرك المعقم معقمة ومختومة أو معقمة بشكل مناسب عبر الأوتوكلاف.
1. بدء خط الخلية EA.hy926
- الحصول على خلايا EA.hy926.
- قم بتخزين قارورة (قوارير) الخلايا في مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
- قم بإعداد وسط DMEM الكامل عن طريق تسخين DMEM و FBS والقلم / البكتيريا (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. أضف 50 مل من FBS....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الغرض من هذا الفحص بشكل عام هو إنتاج منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) لثلاثة إلى أربعة بارمودولين جديد. في كل لوحة فحص ، غالبا ما يتم إنشاء CRC إضافي لمركب معروف ، مثل NRD-21 ، والذي يعمل كفحص جودة للتجربة بسبب IC50 المعروف. لإنشاء CRCs ، يجب تخطيط خريطة لوحة مثل تلك الموضحة في الجدول 1 . إذا كانت استجابات التركيز أحادية النقطة مرغوبة بدلا من ذلك ، فيجب إضافة المركبات عند تركيزات نهائية 10 ميكرومتر (أو تركيزات مفضلة أخرى) إلى ثلاثة آبار على الأقل.
عند إجراء الفحص ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في حين أن البروتوكول72 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا كان موثوقا به بشكل عام وسمح لنا بتحديد بارمودولين رئيسي جديد ، NRD-21,62 كان مطلوبا بروتوكول أكثر كفاءة. تم اختراق الفحص بشكل أكبر خلال نقص العرض الناجم عن جائحة COVID-19. أصبح الحصول على نصائح لمعالج السوائل الآلي أمرا صعبا ، ومحاولة غسل النصائح وتعقيمها وإعادة استخدامها أنتجت CRCs مع تباين كبير. وقد سهل ذلك سلسلة عاجلة من التجارب المصممة لتبسيط مقايسة تعبئة الكالسيوم المحسنة التي يحركها PAR.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
C.D. هو مخترع براءات الاختراع التي تنطوي على البرومودولين وهو مؤسس ومساهم في شركة Function Therapeutics، Inc. ، التي تقوم بتطوير البارمودولين للاستخدام السريري.
شكر وتقدير
نشكر إيرين هيرنانديز وترودي هوليست والدكتور هارتموت ويلر (معهد فيرسيتي لأبحاث الدم) والدكتور ليجي أرنولد (جامعة ويسكونسن - ميلووكي) على توفير المساحة والدعم غير المباشر لهذا المشروع ، والدكتور جون ماكورفي (كلية الطب في ويسكونسن) على المشورة ذات الصلة. نشكر المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R15HL127636) ، ووزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH22101) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (2223225) على دعم المنح.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية > كواشف ثقافة الخلية< / قوية > | |||
| ملتصقة خلايا EA.hy926 | ATCC | CRL-2922 | |
| CellStripper كاشف تفكك | الخلايا Corning | 25-056-CI | يمكن استخدامه اختياريا ، ولكن يجب بالتأكيد تجنبه باستخدام فحوصات PAR2. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع الفينول الأحمر | Corning | 10-013-CV | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Avantor | 97068-091 | |
| الجيلاتين من جلد الخنازير | MilliporeSigma | G2500 | استخدمه لصنع محلول مائي 0.4٪ (وزن / حجم) بالماء منزوع الأيونات. الأوتوكلاف قبل الاستخدام للتعقيم. |
| قلم / بكتيريا (100X) | Corning | 30-002-CI | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| أزرق تريبان (0.4٪ وزن / حجم) كواشف | تعبئة الكالسيوم | 25-900-CI | |
| قوية > كالسيوم < / قوية > | |||
| 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) | حراري 172571000 | ||
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | أفانتور | 97061-420 | |
| ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم | ثيرمو | 42352-0250 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | Thermo | J66650-AD | |
| Fluo-4 / AM | Invitrogen | F14201 | |
| محلول الملح المتوازن من هانك (خالي من الكالسيوم / المجم / الفينول الأحمر) | كورنينج | 21-022-CV | |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | MilliporeSigma | M2393 | |
| Pluronic F-127 (Poloxamer 407) | Spectrum Chemical | P1166 | |
| Probenecid | TCI America | P1975 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | VWR International | BDH9292 | |
| TFLLRN-NH2< / sub> (ملح TFA) | من إعداد Trudy Holyst في Versiti Blood معهد الأبحاث | ||
| <قوي>المواد< / قوي> | |||
| 96 بئر معالجة بالثقافة ، سوداء الجدران ، لوحة فحص قافلية | شفافة Corning | 3603 | مع أغطية شفافة |
| أنبوب الطرد المركزي ، 15 مل | Avantor | 89039-664 | |
| Avantor | 89039-656 | سعة 50 مل | |
| ، T-75 | Corning | 353136 | معالجة ثقافة الأنسجة |
| خزان الكاشف القابل للتصرف ، 50 مل | Corning | RES-V-50-S | |
| قارئ لوحة Enspire | Perkin Elmer | أنبوب | |
| الطرد المركزي الدقيق المتوقف ، 1.5 مل | Avantor | 20170-038 | |
| ماصة باستور ، 9 " | Fisher | 13-678-6B | يجب تعقيم |
| شريط أنبوب PCR مع شقة منفصلة شرائط غطاء | أفانتور | 76318-802 | |
| أطراف ماصة ، 20 & إل | بيوتكس | 63300042 | أطراف ماصة معقمة ومفلترة |
| ، 200 وميكرو ؛ إل | بيوتكس | 63300044 | ماصة معقمة ومفلترة |
| ، 1250 & ميكرو ؛ L | Biotix | 63300047 | معقمة ، نصائح مفلترة |
| Prism | GraphPad | حجم 6 تستخدم | |
| ماصة مصلية ، 5 مل | Tradewinds Direct | & nbsp ؛ 07-5005 | |
| ماصة مصلية ، 10 مل | Tradewinds Direct | ؛ 07-5010 | |
| ماصة مصلية ، 25 مل | Tradewinds Direct | ؛ 07-5025 |
المراجع
- Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
- Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
