Method Article

مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية لدراسة وظيفة المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70

DOI:

10.3791/66515

⸱

March 8th, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Microbiology, University of Venda

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول نشاط المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70). تعمل خلايا E. coli dnaK756 كنموذج للفحص لأنها تؤوي Hsp70 الأصلي ، مما يجعلها عرضة للإجهاد الحراري. الإدخال غير المتجانس ل Hsp70 الوظيفي ينقذ نقص نمو الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو بروتين محفوظ يسهل طي البروتينات الأخرى داخل الخلية ، مما يجعله مرافقا جزيئيا. في حين أن Hsp70 ليس ضروريا لخلايا الإشريكية القولونية التي تنمو في ظل الظروف العادية ، يصبح هذا المرافق لا غنى عنه للنمو في درجات حرارة مرتفعة. نظرا لأن Hsp70 محفوظ بشكل كبير ، فإن إحدى طرق دراسة وظيفة المرافقة لجينات Hsp70 من الأنواع المختلفة هي التعبير عنها بشكل غير متجانس في سلالات E. coli التي إما ناقصة في Hsp70 أو تعبر عن Hsp70 الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. خلايا E. coli dnaK756 غير قادرة على دعم الحمض النووي للبكتيريا. علاوة على ذلك ، يظهر Hsp70 (DnaK) الأصلي نشاط ATPase مرتفعا مع إظهار تقارب منخفض ل GrpE (عامل تبادل النوكليوتيدات Hsp70). نتيجة لذلك ، تنمو خلايا E. coli dnaK756 بشكل كاف في درجات حرارة تتراوح من 30 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية ، لكنها تموت في درجات حرارة مرتفعة (>40 درجة مئوية). لهذا السبب ، تعمل هذه الخلايا كنموذج لدراسة نشاط مرافقة Hsp70. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتطبيق هذه الخلايا لإجراء فحص مكمل ، مما يتيح دراسة وظيفة مرافقة السليلو في Hsp70.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب بروتينات الصدمة الحرارية دورا مهما كمرافقين جزيئيين من خلال تسهيل طي البروتين ، ومنع تراكم البروتين ، وعكس اختلال البروتين 1,2. بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو واحد من أبرز المرافقين الجزيئيين ، ويلعب دورا مركزيا في توازن البروتين 3,4. DnaK هو نظير E. coli Hsp705.

تم تطوير العديد من المقايسات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والخلوية لاستكشاف نشاط المرافق ل Hsp70 وفحص مثبطات تستهدف هذا المرافق6،7،8. Hsp70 هو بروتين محفوظ للغاية. لهذا السبب ، تم الإبلاغ عن العديد من Hsp70s من الكائنات حقيقية النواة ، مثل Plasmodium falciparum (العامل الرئيسي للملاريا) ، لتحل محل وظيفة DnaK في E. coli 6,9. وبهذه الطريقة ، تم تطوير مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية تتضمن التعبير غير المتجانس ل Hsp70s في الإشريكية القولونية لاستكشاف وظيفتها الواقية للخلايا. عادة ، يتضمن هذا الفحص استخدام خلايا الإشريكية القولونية التي تعاني من نقص في DnaK أو التي تعبر عن DnaK الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. في حين أن DnaK ليس ضروريا لنمو الإشريكية القولونية في ظل الظروف العادية ، إلا أنه يصبح ضروريا عندما تنمو الخلايا في ظل ظروف مرهقة مثل درجات الحرارة المرتفعة أو أشكال أخرى من الإجهاد10,11.

تشمل سلالات الإشريكية القولونية التي تم تطويرها لدراسة وظيفة Hsp70 باستخدام مقايسة تكميلية E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr::Tn10]) و E. coli dnaK756. تنتج خلايا E. coli dnaK103 DNA مقطوعا غير وظيفي ، وعلى هذا النحو ، تنمو الخلايا بشكل كاف عند 30 درجة مئوية ، في حين أن السلالة حساسة للبرودة والإجهاد الحراري12,13. وبالمثل ، فإن سلالة E. coli dnaK756 / BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) لا تنمو فوق 40 درجة مئوية14,15. تعبر سلالة E. coli dnaK756 عن DnaK الأصلي الطافر (DnaK756) الذي يتميز بثلاثة بدائل من الجلايسين إلى الأسبارتات في المواضع 32 و 455 و 468 ، مما يؤدي إلى نتائج بروتينية معرضة للخطر. وبالتالي ، فإن هذه السلالة مقاومة للبكتيريا λ DNA14. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر E. coli dnaK756 نشاطا مرتفعا ل ATPase ، بينما يتم تقليل تقاربها لعامل تبادل النوكليوتيدات ، GrpE ،16. الإشريكية القولونية تعمل سلالات DnaK الطافرة كنماذج مثالية للتحقيق في نشاط مرافقة Hsp70 من خلال نهج التكامل. نظرا لأن DnaK ضروري فقط في ظل الظروف العصيبة ، يتم إجراء اختبار التكملة عادة في درجات حرارة مرتفعة (الشكل 1). تشمل بعض مزايا استخدام الإشريكية القولونية في هذه الدراسة الجينوم المميز جيدا والنمو السريع والتكلفة المنخفضة للزراعة والصيانة17.

في هذه المقالة ، وصفنا بالتفصيل بروتوكولا يتضمن استخدام خلايا E. coli dnaK756 لدراسة وظيفة Hsp70. Hsp70s التي استخدمناها في الفحص هي DnaK من النوع البري ومشتقه الخيمري ، KPf (يتكون من مجال ATPase ل DnaK المنصهر في مجال ربط الركيزة C-terminal من Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). تم التعبير عن KPf-V436F بشكل غير متجانس كعنصر تحكم سلبي لأن الطفرة تمنعه بشكل أساسي من ربط الركائز ، وبالتالي إلغاء نشاط مرافقه9.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحول

ملاحظة: استخدم الأواني الزجاجية المعقمة للثقافة ، وأطراف الماصة ، والوسائط الطازجة والتعقيم المعقم. تحضير ثقافات خلايا الإشريكية القولونية في 2x خميرة التربتون (YT) [1.6٪ تريبتون (وزن / حجم) ، 1٪ مستخلص الخميرة (وزن / حجم) ، 0.5٪ كلوريد الصوديوم (وزن / حجم) ، 1.5٪ أجار (وزن / ت)] أجار. يتم توفير الكواشف العامة المستخدمة في البروتوكول ومصادرها في جدول المواد.

  1. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل و aliquot 50 μL من خلايا E. coli dnaK756المختصة ، مع الحفاظ على الخلايا على الجليد.
  2. إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2.0 مل مع الخلايا المختصة ، القسمة 10-50 نانوغرام من pQE60 / DnaK ، pQE60 / KPf ، و pQE60 / KPf-V436F الحمض النوويالبلازميد 9 في أنابيب منفصلة.
  3. احتفظ بأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2.0 مل التي تحتوي على الخلايا المختصة والحمض النووي البلازميد على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بصدمة الحرارة لمزيج الخلايا المختصة والحمض النووي لمدة 60 ثانية عند 42 درجة مئوية وإعادة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مرة أخرى على الجليد لمدة 10 دقائق.
  5. أضف 950 ميكرولتر من مرق 2x YT الطازج (المحتضن مسبقا عند 37 درجة مئوية) واحتضانه عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 150 دورة / دقيقة لمدة 1 ساعة. اترك الخلايا تنمو لفترة أطول لتشجيع تعافيها إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: تجنب هز الخلايا بقوة.
  6. ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا ونشرها على 2x ألواح أجار YT تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين للسلالة المعنية ، و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (انظر جدول المواد) لاختيار البلازميد.
  7. أجهزة الطرد المركزي بقية الخلايا (التي يبلغ حجمها الآن حوالي 900 ميكرولتر) لمدة 1 دقيقة عند 5000 × جم (عند 4 درجات مئوية) باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة.
  8. صب حوالي 800 ميكرولتر من المرق واستخدم الوسط المتبقي لإعادة تعليق الخلايا المحببة.
  9. لوحة الخلايا المستردة على لوحة أجار 2x YT.
  10. احتضان كلا الصفيحتين من الآجار طوال الليل (أو حوالي 17 ساعة) عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تنمو هذه الخلايا ببطء شديد وقد تحتاج إلى الحضانة لفترة أطول. كن حذرا لتحديد المستعمرات التي قد تبدأ صغيرة جدا. تعمل اللوحة التي تحتوي على خلايا أعيد تعليقها بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.7) كنسخة احتياطية في حالة ضعف كفاءة تحويل الخلايا ، وفي هذه الحالة قد تحسن الخلايا المحببة استعادة أي خلايا محولة. ومع ذلك ، إذا كانت كفاءة التحويل ممتازة ، فإن صفيحة الآجار التي تم طلاء الخلايا المركزة عليها قد تتميز بثقافة متضخمة عند الحضانة ، مما يجعل من الصعب تحديد المستعمرات الفردية. في هذه الحالة ، قد تكون صفيحة الآجار الأخرى هي التي تنمو عليها المستعمرات المتباعدة جيدا.

2. طلاء الخلية

  1. التقط مستعمرة واحدة من المحولات وقم بتلقيحها في 10 مل من مرق 2x YT المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الكانامايسين ، و 10 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين لاختيار خلايا E. coli dnaK756 ، و 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسيلين لاختيار البلازميد.
    ملاحظة: استخدم قوارير (≥50 مل) لضمان التهوية عند تحريك الثقافة. احتضان اللقاح طوال الليل (17 ساعة) عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 150 دورة / دقيقة.
  2. خذ قراءة امتصاص في OD600 في صباح اليوم التالي.
  3. نظف سطح طاولة العمل باستخدام 75٪ إيثانول لمسح السطح استعدادا لاكتشاف الخلايا.
  4. باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، قم بتوحيد الثقافة إلى قراءة OD600 ل 2.0 باستخدام مرق 2x YT.
    ملاحظة: تأكد من أخذ قراءات OD بشكل صحيح لأن هذه الخطوة مهمة لتوحيد كثافة الخلايا عبر العينات المختلفة.
  5. باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل ، قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للخلايا من 100 إلى 10-5.
  6. احتضن ألواح الآجار لاستخدامها في تحديد الخلايا في فرن على حرارة 40 درجة مئوية للسماح للألواح بالجفاف مع فتح الأغطية جزئيا لضمان تسرب بخار الماء.
    ملاحظة: للتأكد من رصد الخلايا على مسافات منفصلة بشكل موحد ، ارسم خطوطا على قطعة من الورق يطبع عليها قالب لمواقع الإكتشاف.
  7. بقعة 2 ميكرولتر من الخلايا المخففة متسلسلا على ألواح أجار مكملة ب 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين ، 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين ، و 0.5 مليمتر IPTG (لتحريض التعبير عن البروتينات المؤتلفة) (انظر جدول المواد).
  8. حدد كل عينة على طبقين منفصلين (أحدهما يتم تحضينه عند 37 درجة مئوية والآخر عند 43.5 درجة مئوية).
    ملاحظة: تجنب ثقب لوحة أجار.
  9. عينات التحكم الموضعي على نفس اللوحة مثل العينات التجريبية لتقليل الآثار البيئية.
  10. قم بإجراء عملية الإكتشاف بسرعة لضمان اكتمال العملية قبل أن تبدأ الخلايا في النمو ، لأن هذا قد يولد أنماط نمو منحرفة.
    ملاحظة: من المهم تجنب الهباء الجوي عند اكتشافه ، لأنه قد يلوث الألواح. من المهم أيضا إبقاء الألواح مغلقة بين البقع لتجنب التلوث.
  11. احتضان صفيحة واحدة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة نمو متساهلة) والأخرى عند درجة حرارة نمو غير متساهلة تبلغ 43.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: احتضان الألواح رأسا على عقب لتجنب تجمع البخار على الغطاء ، لأن الماء المكثف سيغسل المستعمرات المرقطة من مواقعها.
  12. ضع جميع الأطباق في الحاضنات في نفس الوقت وتجنب فتح الحاضنة حتى صباح اليوم التالي.
    ملاحظة: لا ينصح بفتح باب الحاضنة عدة مرات أثناء حضانة الألواح. وذلك لأن وصول الهواء إلى الحاضنة قد يؤدي إلى تقلبات في درجات الحرارة تؤثر سلبا على نمو الخلايا.

3. تأكيد التعبير عن البروتينات المؤتلفة

  1. باستخدام حلقة معقمة ، التقط جزءا من الخلايا المتبقية من نفس مستعمرة خلايا E. coli dnaK756 المحولة.
  2. تلقيح الخلايا في مرق 10 مل YT مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين ، 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين ، و 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان بين عشية وضحاها (17 ساعة) عند 37 درجة مئوية بينما تهتز عند 150 دورة / دقيقة.
  3. انقل المزرعة إلى 90 مل من مرق 2x YT المعقم الذي يحتوي على المضادات الحيوية اللازمة كما هو مذكور في الخطوة 3.2. دع الخلايا تنمو إلى مرحلة منتصف السجل (OD600 = 0.4-0.6).
  4. خذ 2 مل من مزرعة العينة قبل الحث (0 ساعة عينة تحريض).
  5. أضف IPTG إلى تركيز نهائي قدره 1 mM للحث على إنتاج البروتين وإعادة احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
  6. خذ عينة ثانية سعة 2 مل بعد 6 ساعات من الحث.
  7. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 10 دقائق. حافظ على درجة حرارة جهاز الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية.
  8. تخلص من المادة الطافية.
  9. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت PBS (137 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 27 مللي مول KCl ، 4.3 مللي متر Na2HPO4 ، 1.4 مللي متر KH2PO4) وتخزينها في -20 درجة مئوية.

4. SDS-PAGE وتحليلات اللطخة الغربية

  1. تحضير 2x 10٪ المواد الهلامية SDS كما هو موضح سابقا19.
  2. احتفظ بأحد المواد الهلامية SDS-PAGE للتلطيخ اللاحق باستخدام صبغة Coomassie لعرض أشرطة البروتين. استخدم جل SDS-PAGE الثاني لإجراء تحليل اللطخة الغربية.
  3. القسمة 80 ميكرولتر من العينات المعاد تعليقها وخلطها مع 20 ميكرولتر من 4x Laemmli SDS تحميل المخزن المؤقت.
  4. اغلي المعلق على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بتحميل 10 ميكرولتر من كل عينة على جل SDS مسبق الصب (انظر جدول المواد).
  5. قم بإجراء الرحلان الكهربائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة باستخدام جهد 120 فولت في محلول 1x من المخزن المؤقت لتشغيل SDS (25 مم Tris ، 250 مم جليكاين ، 0.1٪ (وزن / حجم) SDS).
  6. قم بتلطيخ الجل باستخدام صبغة كوماسي (انظر جدول المواد) لمدة 1 ساعة ، متبوعا بإزالة البقع باستخدام محلول إزالة البقع (50٪ (v / v) ميثانول ، 10٪ (v / v) حمض الخليك في الماء المقطر) لمدة 2 ساعة.
  7. تصور أشرطة البروتين الموجودة في الجل باستخدام نظام تصوير هلام (انظر جدول المواد). أعد تشغيل هلام SDS-PAGE آخر بنفس العينات باتباع البروتوكول المذكور أعلاه.
  8. عندما ينتهي تشغيل الكهربائي ، خذ المواد الهلامية SDS-PAGE لإجراء تحليل اللطخة الغربية كما هو موضح سابقا19.
  9. اغسل غشاء النيتروسليلوز الذي تم نقل البروتينات إليه ثلاث مرات في محلول الغسيل (TBS-Tween ، درجة الحموضة 7.4 [50 mM Tris ، 150 mM NaCl ، 1٪ (v / v) Tween]).
  10. استخدم α-DnaK (انظر جدول المواد) للكشف عن DnaK و α-PfHsp70-17 للكشف عن KPf ومتحوله ، KPf-V436F) ، على التوالي.
  11. استخدم الأجسام المضادة بتخفيف 1: 2000 في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪. احتضان عند 4 درجات مئوية أثناء الاهتزاز عند 60 دورة / دقيقة لمدة 1 ساعة.
  12. قم بإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة بشكل خاص عن طريق غسل غشاء النيتروسليلوز في TBS-Tween 3 مرات في 15 دقيقة.
  13. احتضان الغشاء في الجسم المضاد الثانوي (α-Rabbit ، انظر جدول المواد) في ظل نفس الظروف مثل الخطوة السابقة. ويتبع ذلك الغسيل اللاحق في ظل نفس ظروف الجسم المضاد الأساسي.
  14. حل العصابات باستخدام كاشف الكشف عن التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL).
  15. تصور العصابات باستخدام جهاز تصوير هلام.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم الشكل 2 صورة للأجار الممسوح ضوئيا الذي يحتوي على خلايا تم رصدها واستزراعها عند درجة حرارة نمو متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية و 43.5 درجة مئوية على التوالي. على الجانب الأيمن من الشكل 2 ، تمثل مكونات اللطخة الغربية المستأصلة تعبير DnaK و KPf و KPf-V436F في خلايا E. coli dnaK756. كما هو متوقع ، تمكنت جميع خلايا E. coli dnaK756 المزروعة عند درجة حرارة نمو متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية من النمو. ومع ذلك ، في ظل ظروف النمو غير المتساهلة البالغة 43.5 درجة مئوية ، تمكنت الخلايا التي تعبر بشكل غير متجانس عن DnaK و KPf من النمو ، كما ورد سابقا6،9،20 (الشكل 2). من ناحية أخرى ، نمت الخلايا التي تعبر عن KPf-V436F فقط عند 37 درجة مئوية ولكنها فشلت في النمو عند 43.5 درجة مئوية. هذا يدل على أن DnaK و KPf كانا قادرين على استعادة عيب نمو خلايا E. coli dnaK756 تحت ظروف الإجهاد الحراري. يوضح فشل الخلايا التي تعبر بشكل غير متجانس عن KPf-V436F لدعم نمو الخلايا عند 43.5 درجة مئوية عدم وجود وظيفة مرافقة لهذا البروتين. في هذا الصدد ، يعمل KPf-V436F كبروتين تحكم سلبي مثالي.

figure-results-1
الشكل 1: مبدأ مقايسة التكملة باستخدام خلايا E. coli dnaK756 لدراسة وظيفة chaperone للبروتينات المعبر عنها بشكل غير متجانس. تعبر E. coli dnaK756 عن بروتين DnaK756 الأصلي غير القادر على حماية الخلايا من الإجهاد الحراري. إدخال Hsp70 غير المتجانسة الوظيفية ينقذ الخلايا من الموت عند التعرض للإجهاد الحراري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مقايسة لوحة تكميلية توضح قدرات DnaK و KPf لحماية خلايا E. coli dnaK756 من الإجهاد الحراري. تم استزراع الخلايا المحولة عند 37 درجة مئوية (درجة حرارة النمو المتساهلة) و 43.5 درجة مئوية (درجة حرارة النمو غير المسموح بها). تم توحيد الخلايا وطلائها على أنها تخفيفات تسلسلية. يرمز الحرف "N" إلى "أنيق" ، ويمثل البقعة الأولى المكونة من خلايا غير مخففة. في أقصى الجانب الأيمن توجد عمليات استئصال اللطخة الغربية التي تمثل التعبير عن البروتينات الثلاثة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح البروتوكول فائدة خلايا E. coli dnaK756في استكشاف وظيفة chaperone ل Hsp70 المعبر عنه بشكل غير متجانس. يمكن اعتماد هذا الفحص لفحص مثبطات استهداف وظيفة Hsp70 في السليلو. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن Hsp70s غير قادر على استبدال DnaK في الإشريكية القولونية غير متوافق مع هذا الفحص. قد يكون عدم وجود تعديل ما بعد الترجمة21 لبعض Hsp70s غير الأصلية مسؤولا عن افتقارها إلى الوظيفة داخل نظام الإشريكية القولونية . قد يعالج الفحص التكميلي القائم على الخميرة22 بعض أوجه القصور في الفحص القائم على الإشريكية القولونية.

هناك عدة خطوات رئيسية حاسمة لضمان نتائج قابلة للتكرار. وتشمل هذه التأكد من أن الخلايا التي تم تحويلها بواسطة بنية البلازميد المعنية فقط هي المستخدمة أثناء الطلاء. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تجنب تلوث الثقافة طوال الخطوات. علاوة على ذلك ، نظرا لأن خلايا E. coli DnaK المجهدة عرضة للخيوط المفرطة10 ، فمن المهم تجنب الاهتزاز القوي أثناء المزرعة ، لأن هذا الإجهاد البدني يعزز الخيوط المكثفة. تعطي الخلايا ذات الخيوط المفرطة قراءات نمو واضحة خاطئة أعلى عند OD600 ، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير نمو المزرعة والتأثير سلبا على توحيد الخلايا قبل الطلاء. على الرغم من أن Hsp70 ليس ضروريا لنمو الإشريكية القولونية في ظل الظروف العادية ، إلا أن الخلايا التي تفتقر إلى هذا البروتين تكون عرضة للإجهاد10. لهذا السبب ، تنمو خلايا E. coli dnaK756 بشكل أبطأ بكثير بعد تحولها أو أثناء تعافيها من مخزون الجلسرين. بالإضافة إلى ذلك ، فهي حساسة للغاية لتقلبات درجات الحرارة. لذلك ، من المهم تجنب فتح باب الحاضنة بمجرد وضع ألواح الآجار المطلية بالداخل حتى يحين وقت عرض الألواح.

بيانات اللطخة الغربية مهمة لتأكيد التعبير عن بروتينات Hsp70 المؤتلفة في خلايا E. coli dnaK756. يؤدي الفشل في التعبير عن البروتين المعني إلى نتيجة سلبية كاذبة للخلايا التي تنمو تحت درجة حرارة نمو غير متساهلة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل بتمويل منحة تم الحصول عليها من رقم منحة المركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (ICGEB) ، HDI / CRP / 012 ، مديرية البحوث بجامعة فيندا ، المنحة I595 ، قسم العلوم والابتكار (DSI) والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) في جنوب إفريقيا (أرقام المنح ، 75464 و 92598) الممنوحة ل AS.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-& بيتا ميركابتو إيثانولسيجما ألدريتش8،05،740مكون لصبغة تحميل العينة
حمضالخليك Labchem101005125مكون من مزيل الإيثيان
أكريلاميدسيجما ألدريتشمكون 8008300100من SDS
AgarMerckHG000BX1.500مكون مقايسة النمو المتوسط والسائل
Agaroseذكي علمي14131031معتمد من البيولوجيا الجزيئية الاغاروز
بيرسولفات الأمونيومسيجما ألدريتش101875295مكون لجل SDS-PAGE
AmpicillinVWR International0339 &mdash ؛ الاتحاد الأوروبي & [مدش] ؛ 25Gمضاد حيوي انتقائي
مكررسيجما ألدريتش1015460100مكون من SDS
بروموفينولسيجما-ألدريتش0449-25Gمكون لصبغة تحميل العينة
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich10043-52-4لتحضير الخلايا المختصة
Coomassie الأزرق اللامعVWR International443293XSDS-PAGE صبغة
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشRB10368مكون من PBS عازلة
ECLThermofischer Scientific32109كاشف الكشف عن اللطخة الغربية
Ethidium BromideThermofischer Scientific17898صبغة إقحام الحمض
النووي GlycerolMerck SAAR2676520Lمكون لصبغة تحميل
العينة GlycineVWR International10119CUمكون SDS
IPTGGlentham life Sciences162ILمحفز
KanamycinMelfordK0126مضاد حيوي انتقائي
كلوريد المغنيسيومMerck SAAR4123000EMمكون لمقايسة النمو المتوسط والسائل
الميثانولLabchem113140129مكون من مزيل التعطيل
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةميرك1،04،87،30،250مكون من PBS عازلة
بيبتونميركHG000BX4.250مكون من مقايسة النمو المتوسط والسائل
كلوريد البوتاسيومميركSAAR5042020EMمكون PBS عازلة
غشاء PVDFThermofischer العلميPB7320غشاء اللطخة الغربية
كلوريد الصوديومSAAR5822320EM ميركمكون لمقايسة النمو المتوسط والسائل
كبريتات دوديسيل الصوديومVWR الدولية108073لحل البروتينات المعبر
عنها فواصل Spectramax iD3373705019قارئ الألواح الآلي
TEMEDVWR ACRO420580500الدولي مكون من هلام
SDS TetracyclineDuchefa BiochemiesT0150.0025مضاد حيوي انتقائي
TrisVWR International19A094101مكون من جل SDS
Tween20MerckSAAR3164500XFمكون للغسيل الغربي
مخزن التخزين المؤقت الغربيThermofisher ScientificPB0112نقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز
مستخلص الخميرةMerckHG000BX6.500مكون لمقايسة النمو المتوسط والسائل
& alpha;-DnaK الجسم المضادInqabaBK CAC09317الجسم المضاد الأولي
& alpha & -rabbitThermofischer Scientific31460الجسم المضاد الثانوي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).">Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
  2. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).">Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
  3. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).">Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
  4. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).">Edkins, A. L., Boshoff, A. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. , Springer. (2021).
  5. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).">Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
  6. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).">Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
  7. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).">Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
  8. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).">Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
  9. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626(2016).">Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626(2016).
  10. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).">Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
  11. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243(2015).">Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243(2015).
  12. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).">Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
  13. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).">Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
  14. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).">Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
  15. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).">Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
  16. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).">Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
  17. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).">Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
  18. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).">Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
  19. https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).">Shonhai, A. Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University. , Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007).
  20. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226(2021).">Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226(2021).
  21. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).">Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
  22. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389(2019).">Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389(2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Heat Shock Protein 70Chaperone FunctionEscherichia Coli AssayProtein FoldingDnaK756 CellsComplementation AssayHeterologous ExpressionSDS PAGEWestern BlotSmall Molecule Screening

Related Articles