يوفر بروتوكول زراعة الكبد الإضافي غير المتجانس الموصوف هنا أداة استقصائية عملية لاستكشاف آليات رفض الطعم الخيفي الكبدي. يساعد هذا النموذج في تخفيف العقبات الجراحية والإجهاد الحيواني لزراعة الكبد في الفئران.
مقالة منهجية
نموذج زرع فئران الكبد الكامل المساعد غير المتجانس باستخدام فغر الكبد الخيفي لدراسات رفض الطعم الخيفي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لا غنى عن نماذج زرع الصغيرة لدراسات تحمل الأعضاء التي تبحث في التدخلات العلاجية الممكنة في الدراسات قبل السريرية. عادة ما تستخدم بروتوكولات زراعة كبد الفئران (LTx) نموذجا تقويميا حيث تتم إزالة الكبد الأصلي للمتلقين واستبداله بكبد متبرع. يتطلب هذا الإجراء الجراحي المتطلب تقنيا مهارات جراحية متقدمة ويزداد تعقيدا بسبب أوقات نقص تروية الكبد والجزء السفلي من الجسم. أدى ذلك إلى تطوير طريقة غير متجانسة أقل تعقيدا يمكن إجراؤها بشكل أسرع بدون وقت نقص تروية منزوع الكبد أو الجزء السفلي من الجسم ، مما يقلل من إجهاد ما بعد الجراحة للحيوان المتلقي.
يتضمن بروتوكول LTx غير المتجانس خطوتين رئيسيتين: استئصال الكبد من الجرذ المتبرع وزرع الكبد بالكامل في الجرذ المتلقي. أثناء استئصال الكبد المتبرع ، يقوم الجراح بربط الوريد الأجوف فوق الكبدي (SHVC) والشريان الكبدي (HA). على الجانب المتلقي ، يزيل الجراح الكلية اليسرى ويضع كبد المتبرع مع الوريد البابي (PV) ، والوريد الأجوف تحت الكبدي (IHVC) ، والقناة الصفراوية التي تواجه الأوعية الكلوية. علاوة على ذلك ، يقوم الجراح بمفاغرة الوريد الكلوي للمتلقي من النهاية إلى النهاية باستخدام IHVC للكبد وشريانية PV بالشريان الكلوي باستخدام دعامة. يتم استخدام فغر الكبد والوعيرات لتصريف القناة الصفراوية عن طريق مفاغرة القناة الصفراوية إلى حالب المتلقي ، مما يسمح بتصريف الصفراء عبر المثانة.
كان متوسط مدة الزرع 130 دقيقة ، ومدة نقص التروية الباردة حوالي 35 دقيقة ، وكانت مدة نقص التروية الدافئة أقل من 25 دقيقة. أظهر الهيماتوكسيلين واليوزين في أنسجة الكبد المساعد من عمليات الزرع الزاوية: بنية طبيعية لخلايا الكبد مع عدم وجود تغييرات متني كبيرة بعد 30 يوما من الزرع. في المقابل ، أظهرت عينات الكسب غير المشروع الخيفي بعد الزرع لمدة 8 أيام تسلل واسع النطاق للخلايا الليمفاوية مع درجة مؤشر نشاط رفض مخطط بانف 9. لذلك ، تسهل طريقة LTx هذه نموذج رفض المراضة المنخفضة البديل ل LTx تقويم العظام.
المقدمة
الصغير LTx هو نموذج لا يقدر بثمن للتحقيق في آليات رفض الكبد. تم تقديم زراعة الكبد المساعدة غير المتجانسة مع الشرايين الوريدية البابية (HALT-PVA) في الفئران في عام 1968 من قبل Lee و Edgington1عندما أبلغوا عن استخدام الوريد الكلوي والشريان المتلقي لإعادة إعادة الأوعية الدموية الكبد المساعد المطعم. بعد ذلك ، عزز Hess et al.2 البروتوكول مع التخفيف من المنافسة الوظيفية بين الكبد الأصلي والكبد المساعد عن طريق تقليل حجم الكبد الأصلي والمتبرع جنبا إلى جنب مع إعادة بناء اتصال القناة الصفراوية للمتبرع ، مما أدى إلى بقاء الكسب غير المشروع على المدى الطويل. تم إجراء مزيد من التحسينات مع إدخال مفاغرة الكفة3،4 ، وحدد Schleimer et al.5 قطر الدعامة الأمثل لتنظيم تدفق الدم للحصول على تدفق بوابة فسيولوجية وتجنب فرط أو نقص نضح الكسب غير المشروع. طور باحثون آخرون تعديلات كبيرة على الطريقة باستخدام الشريان الطحالي6 أو الشريان الحرقفيالمشترك 7 لإمداد الدم بالطعم ، بينما طور البعض نماذج تستخدم الدم الوريدي8 فقط أو الدم الشرياني فقط عبر الشريان الكبدي9 لتزويد طعم الكبد المساعد.
افترضت الدراسة الحالية أن المنافسة الوظيفية من الكبد الأصلي لن تتداخل مع رفض الطعم الخيفي ، لذلك قمنا بتطوير بروتوكول يعتمد على نموذج Schleimerالمنظم للتدفق 10 والذي لم يتضمن أي تخفيض في حجم الكبد الأصلي أو المساعد. تم اختيار الجانب الأيسر من المتلقي لتحديد موقع الكسب غير المشروع لأنه يوفر التوجيه الأمثل بين أوعية الكبد الكلوية والمتبرعة للمتلقي. في البداية ، حاولنا إعادة بناء القناة الصفراوية عن طريق فغر الكبد والاثني عشر ، لكن هذه التجارب أكدت ببساطة تأكيد شلايمر على أن "التصريف الصفراوي هو كعب أخيل لزراعة الكبد"10. أدى ذلك إلى تطوير تقنية جديدة حيث يتم مفاغرة القناة الصفراوية من طرف إلى طرف باستخدام دعامة مع حالب المتلقين ، مما يسمح بإفراز الصفراء عبر المثانة. من الفوائد الجديرة بالملاحظة لاستخدام فغر الكبد أنه يمكن مراقبة وظائف الكبد المطعمة يوميا من خلال مراقبة البول. طعم الكبد المنتج للصفراء يلون البول باللون الأصفر الفاتح. يمثل الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية لطريقة HALT-PVA.
تتعلق إحدى المزايا المهمة للفئران غير المتجانسة على LTx لتقويم العظام بعدم وجود أي وقت نقص تروية غير كبدي أو كلي في الجزء السفلي من الجسم ، مما يسمح بالتعافي بشكل أسرع وأسهل للمتلقين غير المتجانسين. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تعتمد الدراسات المناعية LTx التي تستخدم طرق تقويم العظام على الرفض الشديد أو موت المتلقي كنقطة نهاية تجريبية ، وهذا ليس هو الحال مع عمليات الزرع غير المتجانسة ، حيث يظل بصحة جيدة حتى لو توقف الطعم الخيفي عن العمل بسبب الرفض. تدعم كلتا السمتين هاتين السمتين للطريقة غير المتجانسة مبادئ مبادرة 3R الدولية (الاستبدال والاختزال والصقل)11 ، والتي تعزز إطارا لتقليل الألم والمعاناة والضيق الذي تعاني منه البحث وتحسين رفاهيتها.
نموذج HALT-PVA الذي تم الإبلاغ عنه هنا هو طريقة عملية وموثوقة للتحقيق في آليات رفض الطعم الخيفي الكبدي في الدراسات قبل السريرية. تساعد هذه التقنية التجريبية المفيدة في التغلب على المتطلبات الجراحية الكبيرة والإجهاد الحيواني لتقويم العظام LTx في الفئران. في المستقبل ، نعتزم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في آليات الرفض المناعي الحاد مع استكشاف أهداف جديدة واستراتيجيات علاجية لقمع رفض الطعم الخيفي الكبدي.
البروتوكول
تم تربية وإيواءها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في مرافق رعاية في جامعة ويسكونسن (UW) - معهد ماديسون للأبحاث الطبية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة (رقم M006022) من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في كلية الطب والصحة العامة بجامعة واشنطن ، وتم التعامل مع جميع بشكل أخلاقي.
1.
- استخدم إناث فئران لويس البالغة التي تزن 205-235 جم وذكور لويس الذين يتراوح وزنهم بين 250 و 280 جراما كفئران مانحة. استخدم ذكور لويس وفئران النرويج البني البالغة التي تزن 365-420 جراما كمتلقين.
- قم بإجراء عمليات زرع متجانسة عن طريق زرع متبرعي لويس في متلقي لويس ، بينما استخدمت عمليات الزرع الخيفية متبرعي لويس المزروعين في متلقي النرويج البني.
- إجراء جميع العمليات الجراحية من قبل شخصين باستخدام مجهر مزدوج الرأس.
2. إجراء شراء متبرع بالكبد المساعد
- تخدير الجرذ المتبرع باستنشاق 5٪ من الأيزوفلوران في غرفة الحث. سجل وزن الجرذ واحلق البطن باستخدام مقص كهربائي.
- ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة جراحة ساخنة مع أنفه في مخروط تخدير وشل حركة الأطراف بشريط لاصق. تطهير البطن بالكحول بنسبة 75٪ وخفض الأيزوفلوران إلى 2٪.
- قم بعمل شق طولي للجلد والعضلات من العانة إلى الخنجري باستخدام المقص. بالقرب من منتصف الشق الطولي ، قم بتمديده بشكل جانبي إلى اليسار واليمين ، ثم قم بتثبيت مباعدات على جانبي جدار البطن وعملية الخنجري.
- باستخدام مسحات قطنية مبللة ، اسحب الأمعاء إلى الجانب الأيسر من البطن أثناء استخدام مقص زنبركي لقطع الأربطة المعدية المرتبطة بالكبد ، ثم شل حركة الأمعاء تحت شاش مبلل. غطي الكبد بقطعة صغيرة من الشاش المعقم المبللة بمحلول ملحي دافئ.
- استخدم مسحات قطنية رطبة لسحب الكبد وتشريح الأربطة المنجلية والمثلثة والكبدية المعدية والكبدية الاثني عشر. بعد ذلك ، قم بالكي باستخدام ملقط ثنائي القطب وقسم الأوعية شبه المريئية بين الفص المذنب الجانبي الأيسر والأمامي.
- باستخدام ملقط زاوية أو حاملات إبرة ، قم بتشريح خلف SHVC السفلي من الحجاب الحاجز ، ثم مرر خياطة حريرية 5-0 أسفل SHVC واربط عقدة مزدوجة بشكل فضفاض لاستخدامها لاحقا.
- اسحب الفص الجانبي الأيمن السفلي لأعلى ، وقطع الرباط ، وشل الحركة تحت شاش مبلل. اعزل IHVC من الأنسجة خلف الصفاق وصولا إلى الوريد الكلوي الأيمن وربط الوريد الكظري الأيمن بخياطة حريرية 6-0 بالقرب من IHVC قدر الإمكان. قسم هذا الوريد لاحقا عند إزالة الكسب غير المشروع.
- باستخدام إبرة تشريح مائي 27 جم (الشكل 2 أ) ، افصل الكهروضوئية عن النسيج الضام المحيط وافصلها عن الأوردة البوابية والطحال عن طريق ربطها وتقسيمها باستخدام خياطة حريرية 7-0.
- اعزل ، اربطه بخياطة حريرية 6-0 ، وقسم الشريان الكبدي المشترك بالقرب من المكان الذي يمر فيه تحت PV.
- اربط القناة الصفراوية بخياطة حريرية 5-0 عند تفرع الشريان المعدي مع الحفاظ على الأنسجة الدهنية حول القناة الصفراوية قدر الإمكان ؛ على وجه الخصوص ، تجنب فصل القناة الصفراوية عن الشريان الكبدي المناسب مع الحفاظ على الطول الكلي قصيرا بقدر ما هو عملي.
- باستخدام مقص الزنبرك ، قم بعمل شق صغير في جدار القناة الصفراوية القريبة من الربط. أدخل دعامة أنابيب بوليميد بقطر 0.0215 بوصة بطول 5 مم في تجويف القناة الصفراوية وقم بتثبيتها بخياطة حريرية 6-0 ، مع ترك أحد طرفي الخيط طويلا لاستخدامه لاحقا. قسم القناة الصفراوية عن طريق القطع بين الربط 5-0 و 6-0.
- ضع علامة على الجانب العلوي من IHVC و PV بقلم صبغ جراحي للمساعدة في محاذاة الأوعية أثناء مفاغرة المرض ، ثم قم بتثبيت الوريد البابي بمشبك الأوعية الدقيقة بعيدا عن الكبد قدر الإمكان.
- أدخل حقنة سعة 20 مل بإبرة 26 جم في الكهروضوئية القريبة من المشبك الصغير وقم ببث الكبد ب 10-15 مل من محلول ملحي هيبارين مثلج ؛ في نفس الوقت ، قسم IHVC باستخدام مقص زنبركي بالقرب من الوريد الكلوي الأيمن قدر الإمكان.
- استئصال الكبد باستخدام مقص زنبركي عن طريق تشريح PV القريب من المشبك الصغير ، وشد الخيط 5-0 الموضوعة مسبقا حول SHVC ، وتشريح الحجاب الحاجز لتمرير الوريد الأجوف داخل الصدر.
- استمر بتشريح الأربطة المتبقية في الجزء الخلفي من الكبد وقسم الوريد الكظري المرتبط مسبقا. ضع الكبد المستأصل في محلول ملحي بارد على الثلج.
3. إجراء زراعة متلقي الكبد المساعد
- تخدير الجرذ المتلقي باستنشاق 5٪ من الأيزوفلوران في غرفة الحث. سجل وزن الجرذ واحلق البطن باستخدام مقص كهربائي.
- ضع الجرذ في وضع ضعيف على وسادة جراحة ساخنة مع أنفه في مخروط تخدير وشل حركة الأطراف بشريط لاصق. ضع مادة تشحيم للعين ، وعقم البطن ب 75٪ كحول ، وخفض الأيزوفلوران إلى 2٪.
- باستخدام المقص ، قم بعمل شق طولي للجلد والعضلات من العانة إلى الخنجري ، ثم قم بتثبيت مباعدات على جانبي جدار البطن.
- باستخدام مسحات قطنية مبللة ، اسحب الأمعاء إلى الجانب الأيمن من البطن وقم بتغطيتها بشاش مبلل. ضع شاشا رطبا آخر لتغطية المعدة والطحال والكبد ، مع تعريض الكلى اليسرى والأوعية الكلوية.
- باستخدام إبرة تشريح مائي 27 جم وملقط طرف غير حاد ، افصل الوريد الكلوي الأيسر عن الشريان الكلوي ، وقم بإزالة الدهون والأنسجة الضامة بعناية من كلا الوعاء.
- اعزل الأوردة الغددية والغدة الكظرية ، واستخدم 6-0 حرير لربطها بالقرب من الوريد الكلوي مؤقتا. كي جميع الفروع الجانبية الدقيقة باستخدام ملقط ثنائي القطب تعزل الوريد الكلوي والشريان بين الشريان الأورطي/VC والكلى.
- قم بتعبئة الحالب وربطه بخياطة حريرية 6-0 في القطب السفلي. ضع علامة على الوريد الكلوي والشريان بقلم صبغ جراحي للمساعدة في توجيه الأوعية أثناء مفاغرة والتأكد من عدم وجود التقلبات.
- قم بتثبيت الشريان الكلوي والوريد الكلوي بمشبك الأوعية الدموية الدقيقة بالقرب من الشريان الأورطي و VC قدر الإمكان. انقل الشريان الكلوي بمقص زنبركي بعد تشعب الوعاء الدموي مباشرة واقسم الوريد الكلوي في منتصف الطريق تقريبا بين VC والكلى. حرك الكلية اليسرى من النسيج الضام المحيط وقم بإزالتها.
- اغسل كلا الوعاءين بمحلول ملحي هيباريني باستخدام إبرة تشريح مائي 27 جم لإزالة كل الدم المتبقي.
- باستخدام مقص زنبركي ، قم بقص فتحة فم سمكة صغيرة في شوكة تشعب الشريان الكلوي لعمل فتحة على شكل قمع وإدخال دعامة مقطوعة 8 مم من قسطرة 26 جم (الشكل 2 ب). قم بتأمين الدعامة بخياطة حريرية 6-0 ، مع ترك أحد طرفي الخيط طويلا لاستخدامه لاحقا.
- أدخل كبد المتبرع وضعه مع القناة الكهروضوئية و IHVC والقناة الصفراوية التي تواجه الوريد الكلوي الأيسر والشريان المتلقي. باستخدام خياطة نايلون 9-0 ، قم بتثبيت خيوط تثبيت على جانبي وصلة الوريد الكلوي IHVC.
- قارن عرض الأوعية وقم بعمل شق صغير في فم السمكة باستخدام مقص زنبركي في وجه الوريد الكلوي حتى يكون عرضه مماثلا ل IHVC للمتبرع (الشكل 2 ج).
- باستخدام خياطة نايلون 9-0 ، قم بمفاغرة الكبد IHVC من طرف إلى طرف إلى الوريد الكلوي باستخدام 9 أو 10 خيوط جراحية عبر كل من الجدران الأمامية والخلفية للوعاء. بدلا من ذلك ، استخدم طريقة الكفة لإكمال مفاغرة3،4.
- تأكد من أن وضع الشريان الكلوي يقع أسفل IHVC (الشكل 2 د) ، وأدخل الدعامة الموضوعة مسبقا في الشريان الكلوي في الوريد البابي للكبد وقم بتثبيتها بخياطة حريرية 6-0 ، مع ترك أحد طرفي الخيط طويلا ليعلق بالخيط المعاكس على الشريان. ارسم الأطراف معا لمنع كل منها من الانزلاق عن الدعامة.
- قم بإزالة المشبك الصغير الموجود على الوريد الكلوي أولا ، ثم قم بإزالة المشبك الصغير الموجود على الشريان الكلوي.
- أثناء إعادة تروية الكبد ، استخدم الشاش ومسحات القطن لتطبيق ضغط خفيف حول منطقة مفاغرة حتى يتم تحقيق مفاغرة براءة اختراع (الشكل 2 د). قم بإزالة الأربطة المؤقتة الموضوعة مسبقا على الأوردة الكظرية والغدد التناسلية.
- قم بتعبئة ما يقرب من 10 مم أسفل نهاية الحالب الأيسر من النسيج الضام المحيط ، مع ترك كمية كبيرة من الأنسجة الدهنية متصلة. باستخدام مقص زنبركي ، قم بعمل شق صغير في جدار الحالب القريب من الربط 5-0 الذي تم وضعه مسبقا.
- أدخل دعامة البوليميد التي تم توصيلها مسبقا بالقناة الصفراوية في الشق الصغير الذي تم إجراؤه في جدار الحالب. قم بتثبيته بخياطة حريرية 6-0 واربط أحد طرفيه مع الخيط الطويل الموجود على جانب القناة الصفراوية من الدعامة ، واسحب كلا الطرفين معا بإحكام.
- أعد الأمعاء إلى وضعها الطبيعي (الشكل 2 ه) ، وقم بالري ب 2-3 مل من المحلول الملحي ، وأغلق البطن في طبقتين باستخدام 3-0 خيوط جري من الحرير.
- حقن 0.1 ملغم/كغ بوبرينورفين تحت الجلد، وضع المتلقي في قفص نظيف وساخن، ومراقبة التعافي لمدة 1-2 ساعة قبل إعادة إلى مرفق إسكان.
4. متابعة ما بعد الجراحة
- بدءا من اليوم 2 بعد الجراحة، يتم حقن متلقي الزرع الخيفي بالهيبارين (1 وحدة دولية / جم) تحت الجلد يوميا.
- بدءا من اليوم الثاني بعد الجراحة، يتم حقن متلقي الزرع الزاوي بالهيبارين (1 وحدة دولية / 2 جم) تحت الجلد كل يومين.
النتائج
في الوقت الحاضر ، تم استخدام 29 زوجا من الفئران لإنشاء بروتوكول HALT-PVA ، و 17 عملية زرع متجانسة ، و 12 عملية زرع خيفي. نجت الكبد المزروعة متجانسة إلى نقطة النهاية التجريبية المحددة لمدة 8 أو 30 يوما بمعدل نجاح 70٪ ، بينما نجت الكبد المزروعة خيفية إلى نقاط النهاية المحددة لمدة 3 أو 8 أيام بمعدل نجاح 50٪. تشمل حالات الفشل الفئران التي ماتت بسبب المضاعفات الجراحية والكبد المساعد الذي فشل حتى عندما نجا المتلقي.
كان متوسط مدة العملية 130 دقيقة ، مع وقت نقص تروية بارد يبلغ حوالي 35 دقيقة ، ووقت نقص التروية الدافئ أقل من 25 دقيقة. شريطة عدم وجود مضاعفات أثناء الجراحة ، استيقظ المتلقين وأصبحوا نشطين في غضون 10-20 دقيقة ، وبدأوا في الشرب والتجول في غضون ساعة و 24 ساعة بعد ذلك ، تصرفوا مثل الفئران السليمة العادية.
أظهرت ترقيع الكبد المتزاوي صبغة ممتازة في اللون وسالكية القناة الصفراوية بعد 30 يوما من الزرع (الشكل 3) ، بينما أظهرت أنسجة الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) بنية طبيعية لخلايا الكبد مع عدم وجود تغييرات متني كبيرة في كل من النقاط الزمنية لمدة 8 أيام و 30 يوما (الشكل 4 أ ، ب). بعد 3 أيام فقط ، أظهر علم الأنسجة لعمليات الزرع الخيفية التهابا كبيرا في البابات (الشكل 4 ج) ، بينما أظهرت الطعوم الخيفية لمدة 8 أيام رفضا خلويا حادا مع تسلل الخلايا الليمفاوية على نطاق واسع (الشكل 4 د).
تم تقييم عينات LTx الخيفية والمتجانسة التمثيلية من قبل أخصائي أمراض الكبد المعتمد من مجلس الإدارة ، وتم تسجيل الرفض باستخدام مؤشر نشاط رفض مخطط بانف (RAI) 12. حدد التقييم المرضي عدم وجود رفض ، مع Banff RAI 0 ، في كل من عمليات الزرع الزاوية لمدة 8 أيام و 30 يوما ، بينما تم رفض الطعوم الخيفية لمدة 8 أيام بشدة بدرجة Banff RAI 9 (الجدول 1).
الشكل 1: رسم تخطيطي لإجراء HALT-PVA للفئران. يتم شريان PV بالشريان الكلوي الأيسر باستخدام دعامة ، ويتم مفاغرة IHVC من طرف إلى طرف إلى الوريد الكلوي الأيسر ، ويتم توصيل القناة الصفراوية بالحالب باستخدام دعامة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء جراحي. (أ) التشريح المائي للكهروضوئية. افصل الكهروضوئية عن النسيج الضام المحيط بإبرة تشريح مائي 27 جم. (ب) إدخال الدعامة الشريانية. يتم إدخال الدعامة الشريانية في فتحة صغيرة على شكل قمع مقطوعة في شوكة تشعب الشريان الكلوي. (ج) توسيع الوريد الكلوي. من أجل مطابقة العرض الأكبر ل IHVC للمتبرع للمفاغرة ، يتم إجراء قطع فم سمكة صغيرة في وجه الوريد الكلوي للمتلقي بعد وضع خيوط بقاء. (د) طعم الكبد المنفوخ مباشرة بعد مفاغرة. يعد وضع الشريان الكلوي والاتصال الكهروضوئي تحت الوريد الكلوي و IHVC أمرا بالغ الأهمية لمنع تجلط الدم في الطعم. (ه) RAT-HALT-PVA في الموقع. يتم وضع الكبد المساعد على الجدار الأيسر للبطن قبل إعادة الأمعاء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: HALT-PVA المتزابقي بعد 30 يوما من الزرع. (أ) بعد 30 يوما ، يكون للكبد المساعد لون وملمس مماثل للكبد الأصلي ، بينما (ب) تظل القناة الصفراوية والدعامة الكهروضوئية براءة اختراع وغير مقيدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: أنسجة ترقيع الكبد المساعد. تلطيخ H & E ل (أ) 8 أيام و (ب) 30 يوما بعد الزرع الطعوم الزاوية التي تظهر بنية طبيعية لخلايا الكبد جنبا إلى جنب مع (ج) 3 أيام و (د) 8 أيام الطعوم الخيفية التي تعرض التهاب البابات وتسلل الخلايا اللمفاوية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| Tx الخيفي | التهاب البوابة | إصابة القناة الصفراوية | التهاب الوريد | بانف راي |
| 3 أيام (LT-34) | 2 | 2 | 3 | 7 |
| 3 أيام (LT-38) | 1 | 0 | 0 | 1 |
| 8 أيام (LT-20) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| 8 أيام (LT-40) | 3 | 3 | 3 | 9 |
| Syngeneic Tx | ||||
| 8 أيام (LT-13) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 أيام (LT-19) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 يوما (LT-28) | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 30 يوما (LT-32) | 0 | 0 | 0 | 0 |
الجدول 1: مخطط بانف. مؤشر نشاط الرفض (RAI) للفئران الخيفية والمتجانسة LTx.
المناقشة
زراعة الكبد هي الخيار العلاجي الوحيد للمرضى الذين يعانون من أمراض الكبد في المرحلة النهائية ، حيث يتم إجراء ما يقرب من 9,000 LTxs سنويا فيالولايات المتحدة 13. لسوء الحظ ، يظهر الرفض المناعي في ما يصل إلى 25٪ من متلقي LTx ، وهذا الرفض يضر بالعضو المزروع والمريض14،15. لتحسين النتائج بعد LTx ، يلزم تطوير نماذج مبتكرة لدراسة رفض الأعضاء وتنفيذ استراتيجيات لتقليل الرفض.
بالمقارنة مع زراعة كبد الفئران التقويمية ، فإن النموذج غير المتجانس الحالي سهل الإنشاء بشكل ملحوظ. من الأفضل حساب درجة الصعوبة الفنية من خلال النظر في أصعب خطوة في الإجراء ، وهي مفاغرة IHVC من طرف إلى طرف إلى الوريد الكلوي. تفضيلنا الشخصي لهذا الاتصال هو استخدام الخياطة التقليدية بينما يجد الآخرون نظام الكفة أكثر ملاءمة 3,4; في كلتا الحالتين ، فإن أي شخص مرتاح للمفاغرة الشاملة للوريد 3 مم بأي طريقة لديه جميع المهارات الفنية اللازمة لإنجاز هذا الإجراء. من خلال الوصول إلى مجهر مزدوج الرأس ، نفضل إجراء هذه العمليات الجراحية مع شخصين. ومع ذلك ، هذا ليس شرطا للنجاح مع هذا البروتوكول حيث تم إجراؤه منفردا أيضا.
المضاعفات الأساسية بعد الجراحة لهذا النموذج هي تجلط الدم في الكبد غير المشروع الذي تثيره ثلاثة أشياء. أولا ، يمكن أن تسبب الدعامة الشريانية نفسها تجلط الدم إذا كانت نهايات الدعامة بها أي نتوءات أو مخالفات تسبب اضطراب الدوامة في تدفق الدم. يجب قطع الدعامة بشفرة حلاقة حادة ، وليس بالمقص ، ثم فحصها تحت المجهر للتأكد من عدم وجود عيوب. ثانيا ، إذا تم وضع مفاغرة الشريان الكلوي / الدعامة الكهروضوئية أعلى الوريد الكلوي / مفاغرة IHVC ، فسيؤدي ذلك إلى تقييد تدفق الدم وتحفيز تجلط الدم. يجب أن يكون الموضع النهائي للدعامة الشريانية أسفل IHVC ، انظر الشكل 2 د. ثالثا ، يعد علاج ما بعد الجراحة باستخدام الهيبارين المضاد للتخثر ضروريا لمنع تجلط الدم في عمليات الزرع الخيفية ، في حين أن جرعة أقل من الهيبارين مفيدة أيضا في القضاء على خطر تجلط الدم في الطعوم التركيبية.
يعكس معدل البقاء على قيد الحياة المنخفض لعمليات الزرع الخيفية مقارنة بالطعوم الزاوية المذكورة هنا الطبيعة المؤيدة للتخثر للكبد الإضافي الرافض ، مما يؤدي إلى تجلط الدم في الدعامة الشريانية. كانت هناك حاجة إلى عدة محاولات لإيجاد مخطط جرعات الهيبارين الذي يمكن أن يمنع الدعامة من التخثر في عمليات الزرع الخيفية. في البداية ، من بين أول 6 متلقين للطعم الخيفي نجوا من الجراحة ، فشل 50٪ من الكبد المساعد بسبب تجلط الدم ، ولكن بعد زيادة جرعات الهيبارين ، نجت عمليات الزرع الخيفية الثلاث الأخيرة التالية بدون تجلط الدم. من الآن فصاعدا ، بعد تحديد جرعة الهيبارين الفعالة ، نتوقع أن يزداد معدل نجاح عمليات الزرع الخيفية بشكل كبير. وبالمثل ، حدثت معظم حالات الفشل الزاوي في وقت مبكر من التطور ، ونتوقع أن يتحسن معدل نجاح عمليات الزرع الزاوية.
استخدمنا نموذج الرفض الحاد من لويس إلى براون النرويج LTx لأن تركيبة سلالة براون النرويج إلى لويس لا ترفض16. من الجدير بالذكر أنه عندما يتم استخدام طرق زراعة تقويم العظام مع نموذج الرفض هذا ، ويحدث رفض الكبد ، فإن المتلقية تعاني من مراضة شديدة حيث تصبح مكتئبة وغير نشطة وتتوقف عن الأكل قبل الموت في غضون 14 يوما16. ومع ذلك ، مع نموذج LTx غير المتجانس هذا ، لا يتم استخدام الموت كنقطة نهاية ، ولا تحدث المراضة. يظل بصحة جيدة ونشطا طوال مدة التجربة حتى عندما يتم رفض الكبد المساعد تماما. مما لا شك فيه أن نموذج LTx غير المتجانس هذا يساهم بشكل كبير في تقليل الألم والمعاناة والضيق الذي تعاني منه المتلقية.
تعد التطورات الحديثة في نضح الكبد الطبيعي للحرارة خارج الجسم الحي (NEVLP) تقدما مثيرا في طريقة تخزين الكبد قبل الزرع السريري17،18،19. خلال NEVLP ، يستأنف الكبد المتبرع النشاط الفسيولوجي الذي يسمح بالتدخلات العلاجية قبل الزرع20،21. يتم استخدام NEVLP أيضا بشكل متزايد لتقييم جدوى الأعضاء الهامشية (كبد المتبرعين الأكبر سنا أو السمنة المفرطة أو الكبد الذي تم شراؤه من المتبرعين بعد الموت القلبي)22،23. على الرغم من أنه مثير ، إلا أن عددا قليلا فقط من المختبرات تمكن من زرع كبد الفئران بعد NEVLP24،25. من المحتمل أن يكون هذا بسبب الضغط الجراحي على والطلب الفني المرتفع على إعداد الكبد لكل من NEVLP والزرع. في المقابل ، فإن تقنية LTx غير المتجانسة الموضحة في هذه المخطوطة أقل تطلبا من الناحية الفنية وتسبب ضغطا أقل على. على هذا النحو ، قد يكون خيارا قابلا للتطبيق لنماذج الصغيرة من NEVLP والزرع اللاحق.
في الختام ، نقدم نموذجا بديلا لزراعة الكبد منخفض المراضة قد يكون مفيدا لدراسات رفض الزرع المستقبلية.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من قبل المعهد الوطني للصحة (NIH) K08AI155816 ، الممنوح ل DA.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3-0 خياطة الحرير | إيثيكون | ج013د | |
| 5-0 ربطات حرير | أدوات العلوم الجميلة | 18020-50 | |
| 6-0 ربطات عنق حريرية | أدوات العلوم الجميلة | 18020-60 | |
| 7-0 ربطات عنق حريرية | تليفلكس | 103 ثانية | |
| 9-0 خياطة البولي أميد | الجراحة | T05A09N10-13 | أسود |
| الكي ثنائي القطب | كودمان & شركة Shurtleff | ص 234 | |
| بوبرينورفين هيدروكلورايد | هوسبيرا | 409201232 | |
| ملقط ، أدسون براون | أدوات العلوم الجميلة | 11627-12 | 12.5 سم |
| ملقط ، دومون بزاوية ؛ | أدوات العلوم الجميلة | 11253-25 | طبي # 5/45 11 سم |
| ملقط ، ربط خياطة ؛ | أدوات العلوم الجميلة | 18025-10 | 10 سم |
| حقن الهيبارين الصوديوم ، USB | فريسينيوس كابي | 504015 | 10,000 وحدة USP لكل 10 مل |
| التشريح المائي قنية | أمبلر الجراحية | 1021 [إ] | 27 جرام |
| إيزوفلوران | منتجات Dechra Vet. | 17033-091-25 | |
| القسطرة الوريدية | كندال | 2619بور | 26 جم × 3/4 بوصة |
| نظام التراجع المغناطيسي | أدوات العلوم الجميلة | 18200-50 | |
| المشابك الصغيرة | أدوات العلوم الجميلة | 18055-05 | 6 مم |
| المشابك الصغيرة | أدوات العلوم الجميلة | 18055-06 | 4 ملم |
| قضيب المشبك الصغير | أدوات العلوم الجميلة | 18057-14 | 14 سم |
| حامل إبرة صغيرة | S& T | سي -14 | 14 سم |
| مجهر | زييس | يونيفرسال S3 | رأس مزدوج |
| مرهم العيون | بورالوب | 14590500 | |
| أنابيب بوليميدي | كول بارمر | 95820-04 | OD 0.0215 "، معرف 0.0195" ، الجدار 0.0010 " |
| ملح | باكستر | 281324 | 0.9٪ كلوريد الصوديوم |
| مقص زنبركي جراحي | S& T | إسدك-15 | بلانت 14 سم |
| مقص زنبركي جراحي | أدوات العلوم الجميلة | 15021-15 | فاناس 14 سم |
المراجع
- Lee, S., Edgington, T. S. Heterotopic liver transplantation utilizing inbred rat strains. Am J Pathol. 52 (3), 649-669 (1968).
- Hess, F., Jerusalem, C., Van der Heyde, M. N. Advantages of auxiliary liver homotransplantation in rats. Arch Surg. 104, 76-80 (1972).
- Marni, A., Ferrero, M. Heterotopic liver grafting in the rat. A simplified method using cuff techniques. Transplantation. 39 (3), 329-331 (1985).
- Kobayashi, E., et al. Auxiliary heterotopic liver transplantation in the rat: a simplified model using cuff technique and application for congenitally hyperbilirubimemic Gunn rat. Microsurgery. 18 (2), 97-102 (1998).
- Schleimer, K., et al. Auxiliary liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization offers a successful therapeutic option in acute hepatic failure--investigations in heterotopic auxiliary rat liver transplantation. Transpl Int. 19 (7), 581-588 (2006).
- Qiao, J., Han, C., Zhang, J., Wang, Z., Meng, X. A new model of auxiliary partial heterotopic liver transplantation with liver dual artery supply. Exp Ther Med. 9 (2), 367-371 (2015).
- Li, J., Ren, J., Zhang, J., Meng, X. A. Modified kidney-sparing portal vein arterialization model of heterotopic auxiliary liver transplantation increases liver IL-6, TNF-α, and HGF levels and enhances liver regeneration: an animal model. BMC Surg. 2, 281-292 (2022).
- Ono, Y., et al. Regeneration and cell recruitment in an improved heterotopic auxiliary partial liver transplantation (APLT) model in the rat. Transplantation. 101 (1), 92-100 (2017).
- Wang, J., et al. Auxiliary partial liver grafting in rats: effect of host hepatectomy on graft regeneration, and review of literature on surgical technique. Microsurgery. 22 (8), 371-377 (2002).
- Schleimer, K., et al. Heterotopic auxiliary rat liver transplantation with flow-regulated portal vein arterialization in acute hepatic failure. J Vis Exp. (91), e51115(2014).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document. Hepatology. 25 (3), 658-663 (1997).
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2020 Annual Data Report: Liver. Am J Transplant. 22, Suppl 2 204-309 (2022).
- Nacif, L. S., et al. Late acute rejection in liver transplant: a systematic review. Arq Bras Cir Dig. 28 (3), 212-215 (2015).
- Levitsky, J., et al. Acute rejection increases risk of graft failure and death in recent liver transplant recipients. Clin Gastroenterol Hepatol. 15 (4), 584-593 (2017).
- Gong, J., Cao, D., Chen, Y., Li, J., Gong, J., Zeng, Z. Role of programmed death ligand 1 and Kupffer cell in immune regulation after orthotopic liver transplantation in rats. Int Immunopharmacol. 48, 8-16 (2017).
- Ceresa, C. D. L., Nasralla, D., Coussios, C. C., Friend, P. J. The case for normothermic machine perfusion in liver transplantation. Liver Transpl. 24 (2), 269-275 (2018).
- Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
- Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
- Goldaracena, N., et al. Anti-inflammatory signaling during ex vivo liver perfusion improves the preservation of pig liver grafts before transplantation. Liver Transpl. 22 (11), 1573-1583 (2016).
- Carlson, K. N., et al. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta cytokines decrease immune activation during normothermic ex vivo machine perfusion of the rat liver. Liver Transpl. 27 (11), 1577-1591 (2021).
- Ig-Izevbekhai, K., Goldberg, D. S., Karp, S. J., Foley, D. P., Abt, P. L. Immunosuppression in donation after circulatory death liver transplantation: Can induction modify graft survival. Liver Transpl. 26 (9), 1154-1166 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion Injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890(2019).
- Schlegel, A., Graf, R., Clavien, P. A., Dutkowski, P. Hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects from biliary injury in a rodent model of DCD liver transplantation. J Hepatol. 59 (5), 984-991 (2013).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
