يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصنيع مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا المشتقة من الفئران

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66520

⸱

فبراير 9, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Local Joint Engineering Research Center for Precision Surgery and Regenerative Medicine, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 2Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 3Center for Regenerative and Reconstructive Medicine, Med-X Institute, The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, 4Department of Graduate School, Xi'an Medical University

في هذه المقالة

ملخص

تحمل مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) تطبيقات واعدة في مجال هندسة أنسجة الكبد. يحدد هذا البروتوكول إجراءات تحضير DSM للفئران ، والتي تشمل حصاد طحال الفئران ، وإزالة الخلايا منها من خلال التروية ، وتقييم DSM الناتج لتأكيد خصائصه.

الملخص

زراعة الكبد هي العلاج الأساسي لمرض الكبد في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن النقص وعدم كفاية جودة الأعضاء المانحة يستلزمان تطوير علاجات بديلة. ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة. ومع ذلك ، لا يزال الحصول على DLMs المناسبة يمثل تحديا. تم استكشاف استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs ، مما يوفر بديلا متاحا بسهولة. في هذه الدراسة ، تم حصاد طحال الفئران وإزالة الخلايا باستخدام مزيج من دورات التجميد والذوبان والتروية مع كواشف إزالة الخلايا. حافظ البروتوكول على البنى المجهرية ومكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل DSM. استغرقت عملية إزالة الخلايا الكاملة حوالي 11 ساعة ، مما أدى إلى وجود ECM سليم داخل DSM. أكد التحليل النسيجي إزالة المكونات الخلوية مع الاحتفاظ بهيكل ECM وتكوينه. يوفر البروتوكول المقدم طريقة شاملة للحصول على DSM ، ويقدم تطبيقات محتملة في هندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. تساهم هذه النتائج في تطوير مناهج بديلة لعلاج مرض الكبد في المرحلة النهائية.

المقدمة

لا يزال زرع الكبد هو العلاج النهائي الوحيد لمرض الكبد في المرحلة النهائية1،2،3. ومع ذلك ، فإن النقص الحاد وانخفاض جودة الأعضاء المانحة قد زاد من الحاجة إلى علاجات بديلة4. في مجال الطب التجديدي ، ظهرت الكبد الاصطناعي الحيوي (BALs) باستخدام مصفوفة الكبد المنزوعة الخلايا (DLM) كحلول واعدة5،6،7. يحافظ DLM على بنية الكبد الأصلية ، بما في ذلك شبكة الأوعية الدموية الدقيقة المعقدة ومكونات ECM ، مما يوفر سقالة لإنشاء BALs قابلة للزرع يمكن أن تخفف من أمراض الكبد.

على الرغم من الوعد ، فإن اعتماد هذه التكنولوجيا يواجه تحديات ، لا سيما في الحصول على DLMs المناسبة. هناك نقص في DLMs المشتقة من الإنسان ، في حين أن تلك من مصادر حيوانية تحمل مخاطر انتقال المرض والرفض المناعي. في نهج مبتكر ، استكشف بحثنا استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كأساس ل BALs8،9،10،11. يتوفر الطحال بسهولة أكبر في حالات طبية مختلفة ، مثل ارتفاع ضغط الدم البابي ، والتمزق الرضحي ، ورفرية نقص الصفيحات مجهول السبب ، والتبرع بعد الموت القلبي. لذلك ، الطحال متاح على نطاق أوسع من الكبد لأغراض البحث. المرضى الذين خضعوا لاستئصال الطحال لا يعانون من حالات قاسية ، مما يؤكد بشكل أكبر إمكانية الاستغناء عن الطحال. البيئة المكروية للطحال ، وخاصة المصفوفة خارج الخلية والجيوب الأنفية ، تشبه تلك الموجودة في الكبد. هذا يجعل الطحال عضوا مناسبا لالتصاق الخلايا وانتشارها في أبحاث زراعة خلايا الكبد. بناء على هذه النتائج ، أظهرت تحقيقاتنا السابقة أن DSMs تشترك في الهياكل المجهرية والمكونات المماثلة مع DLMs ويمكن أن تدعم بقاء ووظيفة خلايا الكبد ، بما في ذلك إنتاج الألبومين واليوريا. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن DSMs تعزز التمايز الكبدي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم ، مما يؤدي إلى تحسين الوظائف واتساقها.

من خلال استخدام DSMs المعالجة بالهيبارين ، قمنا بتصميم BALs وظيفية قادرة على إظهار منع تخثر الدم الفعال على المدى القصير والتعويض الجزئي لوظائف الكبد11. وبالتالي ، فإن هذا الدليل التشخيصي والإحصائي للاضطرابات النفسية ثلاثي الأبعاد يحمل وعدا كبيرا للنهوض بهندسة أنسجة الكبد والعلاج بالخلايا. في هذا العمل ، نقدم الطرق التفصيلية لحصاد طحال الفئران وإعداد DSM التي تحافظ على الهياكل المجهرية ومكونات ECM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على بجامعة Xi'an Jiaotong وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر.

1. حصاد الطحال

  1. استخدام الفئران الذكور Sprague Dawley التي تزن 250-280 جم. إيواء الفئران في غرف ذات درجة حرارة ورطوبة يتم التحكم فيها ، وتزويدهم بالطعام والماء حسب الطلب ، باستثناء الصيام قبل الجراحة.
  2. حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 مل / كجم) كمسكن لمدة 1 ساعة قبل العملية. تخدير الفئران عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. استخدم معدل تدفق 1.5 لتر / دقيقة من 5٪ إيزوفلوران للتخدير التعريفي في صندوق زجاج شبكي وحافظ على التخدير بمعدل تدفق 0.6-0.8 لتر / دقيقة من 2٪ إيزوفلوران من خلال قناع. تأكيد عمق التخدير عن طريق الضغط على أصابع القدم.
  3. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الجلد على كامل البطن. تأمين الفئران في وضع ضعيف على طاولة الجراحة. حقن 2 مل من محلول ملحي هيبارين (1000 وحدة من الهيبارين) عبر الوريد الظهري للقضيب لتحقيق منع تخثر الدم الجهازي. تطهير الجلد المحلوق بمحلول بوفيدون اليود وتغطيته بقطعة قماش معقمة.
  4. قم بعمل شق صليبي باستخدام مقص جراحي في البطن ، وكشف تجويف البطن عن طريق التمدد بالملقط المرقئ ، واقلب الكبد نحو الحجاب الحاجز. قم بإخراج الجهاز الهضمي من الجانب الأيمن من البطن وقم بتغطيته بشاش رطب.
  5. افصل بعناية وقطع الرباط الطحال المعدي لفضح الطحال.
    ملاحظة: يمكن التعرف على الطحال ، الذي يظهر كهيكل ممدود محمر ، بحجم 3.0 سم × 0.6 سم × 0.6 سم تقريبا ، في البطن الأيسر.
  6. افصل تدريجيا وكشف الشريان الكبدي المشترك والشريان المعدي الاثني عشر والشريان الطحال عن طريق التشريح على طول الهيلوم الطحالي. ربط وقطع الشريان المعدي المعوي والشريان الكبدي المشترك مع فصل الأنسجة المحيطة تدريجيا.
  7. اقلب الطحال نحو الجانب الأيمن لكشف الشريان الأورطي البطني. أداء تشريح حادة بلطف وفضح الشريان الأورطي البطني والجذع الاضطرابات الهضمية باستخدام مسحات القطن. ضع خيطا حريريا 3-0 ، طوله حوالي 3 سم ، أعلى وأسفل فروع جذع الاضطرابات الهضمية ، وضع خياطة حريرية 6-0 ، طولها حوالي 10 سم ، عند فرع جذع الاضطرابات الهضمية.
  8. رباط الشريان الأورطي البطني أسفل وفوق فروع الجذع الاضطرابات الهضمية. قم بعمل شق صغير في الفرع الشرياني. ارفع الخيط الحريري 6-0 برفق ، وأدخل قسطرة وريدية 24 جراما في الشريان الطحال على طول الجذع البطني ، وقم بتثبيته وتثبيته.
  9. باستخدام مضخة حقنة بمعدل 4 مل / دقيقة ، قم بضخ محلول ملحي طبيعي هيبارين (25 وحدة / مل) بحجم 50 مل. في الوقت نفسه ، قم بقطع الوريد البابي كقناة تدفق للسماح للسائل المملوء بالتدفق من الطحال. يتم القتل الرحيم للحيوان عن طريق الاستنزاف.
  10. تشريح الأنسجة المحيطة بالطحال بعناية ، وتجنب تلف البنكرياس ، مع الحفاظ على الأوعية الملحقة الرئيسية.
  11. تحقق من وجود أي تسرب حول الطحال ، ثم قم بإزالة الطحال والبنكرياس وشطفهما في محلول ملحي طبيعي.
    ملاحظة: يرتبط الطحال والبنكرياس من الفئران ارتباطا وثيقا ، مع التفاف البنكرياس حول الشريان الطحالي. إذا تمت إزالة الطحال بشكل منفصل ، فقد يكون من الصعب ربط العديد من الأوعية الدموية الصغيرة. في هذا الإجراء ، تتم إزالة الطحال مع البنكرياس. بعد إزالة الخلايا ، يصبح الطحال والبنكرياس شفافين وتكون الأوعية الدموية الدقيقة مرئية ، مما يسهل الحفاظ على الطحال بأوعية دموية سليمة.
  12. انقل الطحال إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مملوء بمحلول ملحي عادي وقم بتخزينه في مجمد -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيتم حفظ الطحال والقسطرة الوريدية التي يتم إدخالها في الشريان الطحال معا للتوصيل المريح أثناء تجارب التروية.

2. إزالة الخلايا من الطحال

  1. كرر دورة التجميد والذوبان 3x في وعاء معقم لتحلل خلايا الطحال.
    ملاحظة: دورة التجميد والذوبان هي طريقة فيزيائية تستخدم لإزالة الخلايا من السقالة. يتم وضع أنسجة الطحال في الفريزر -80 درجة مئوية طوال الليل للتجميد ، ثم إزالتها من بيئة درجة الحرارة المنخفضة ووضعها في درجة حرارة الغرفة أو حمام مائي 37 درجة مئوية للذوبان. تتكرر عملية التجميد والذوبان هذه 3-6 مرات ، مما يعطل أغشية الخلايا ويؤدي إلى تحلل الخلايا.
  2. قم بإعداد نظام نضح داخل مقعد نظيف يتكون من مضخة تمعجية وخزان سعة 2 لتر وأنبوب سيليكون بقطر داخلي 2.4 مم ومصيدة فقاعات (الشكل 1).
  3. املأ نظام التروية بالماء منزوع الأيونات (ddH2O) واستمر في تشغيله لمدة 10 دقائق.
  4. انقل الطحال المحصود بعناية إلى الحاوية المملوءة ddH2O.
  5. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بالقسطرة الوريدية التي تم إدخالها في الشريان الطحالي.
  6. ابدأ التروية ب ddH2O بمعدل 2 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.
  7. استمر في التروية باستخدام ddH2O بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 30 دقيقة.
  8. Perfuse مع 0.1٪ (وزن / حجم) حل SDS لمدة 4 ساعات.
  9. Perfuse مع 1٪ (v / v) محلول Triton X-100 لمدة 2 ساعة.
  10. قم بالإعلاء باستخدام برنامج تلفزيوني بمعدل 4 مل / دقيقة لمدة 4 ساعات لغسل DSM.
    ملاحظة: استخدام المضخة التمعجية للتروية أحادية الاتجاه لجميع السوائل.
  11. بعد اكتمال التروية ، قم بربط وعبور فروع الأوعية الدموية بين البنكرياس والطحال ، ثم قم بإزالة البنكرياس. قم بتخزين DSM في أنبوب طرد مركزي نظيف ومختوم سعة 50 مل منقوع في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ بنسلين-ستربتومايسين عند -20 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام في التجارب المستقبلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدم هذا البروتوكول مزيجا من دورات التجميد والذوبان المتكررة والتروية مع كواشف إزالة الخلايا لإزالة الخلايا من طحال الفئران. تم تحقيق إزالة الخلايا الكاملة للطحال في حوالي 11 ساعة (الشكل 2 أ). طوال عملية إزالة الخلايا ، انتقل لون الطحال تدريجيا من الأحمر الغامق إلى الأحمر الفاتح المرقش ، وفي النهاية ، مظهر أبيض شفاف (الشكل 2 ب). ظل التشكل العام سليما نسبيا ، مع وجود هياكل وعائية مرئية (الشكل 2 ب).

أكد ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تمثل BALs نهجا فعالا لعلاج أمراض الكبد في المرحلة النهائية ، لا سيما في الحالات التي يعوق فيها زرع الكبد النقص الحالي في الأعضاء المانحة6. خيار واعد لإنشاء BALs هو استخدام DLM ، الذي يحافظ على ECM الطبيعي للكبد الأصلي وهيكل الأوعية الدموية. ومع ذلك ، فإن ندرة DLM البشري والمخاطر المحتملة للعدوى والمناعة المرتبطة ب DLM الحيوانية تشكل قيودا كبيرة. لمواجهة هذا التحدي ، نقترح استراتيجية جديدة تتضمن استخدام مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا (DSM) كسقالة بديلة ل BALs8،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82000624) ، وبرنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية في شنشي (2022JQ-899 و 2021JM-268) ، وبرنامج دعم القدرة على الابتكار في مقاطعة شنشي (2023KJXX-030) ، والمشروع المشترك لجامعة خطة البحث والتطوير الرئيسية لمقاطعة شنشي - المشروع الرئيسي (2021GXLH-Z-047) ، والتأسيس المؤسسي لأول مستشفى تابع لجامعة شيان جياوتونغ (2021HL-42 و 2021HL-21).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آلة التخديرهارفارد جهازمنضديةفقاعة التخدير الحيواني
فخشاندونغ ويجاو المجموعة الطبية بوليمر المحدودةقطر المسام: 5 مو ؛ ممنع فقاعات الهواء
BuprenorphineTIPR الصيدلانية المسؤولة المحدودةملقط
مرقئمسكن شنغهاي الأدوات الطبية   المحدودةJ31020أداة جراحية
Heparinized SalineSPH No.1 الكيمياء الحيوية & شركة المستحضرات الصيدلانية المحدودة  منع تكوين تجلط الدم ؛
IsofluraneRWD Life Scienceالتخدير:لتحريض وصيانة التخدير
البنسلين - الستربتومايسين   ؛Beyotime التكنولوجيا الحيوية المحدودةC0222في المختبر لمنع التلوث الميكروبي
مضخة التمعجيةBaoding Longer Precision Pump Co.، Ltd.BT100-1L
ملحي مخزن بالفوسفاتشنغهاي تيتان العلمية المحدودة4481228محلول الملح العازل لحمض الفوسفوريك
أنبوب سيليكونBaoding Longer Precision Pump Co.، Ltd.2.4 & مرات ؛ 0.8 مم
خياطة الحريرYangzhou Jinhuan مصنع الأدوات الطبية6-0 و 3-0ربط الأوعية الدموية
الصوديوم دوديسيلكبريتات شنغهاي تيتان العلمية المحدودة.151-21-3منظف أيوني ، يذوب كل من الأغشية الخلوية والنووية مضخة
حقنةشنتشن Mindray Bio-Medical Electronics Co.، LtdBeneFusion SP5التسريب الوريدي
Triton X-100Shanghai Titan Scientific Co.، Ltd.9002-93-1منظف غير أيوني ، يعطل تفاعلات الدهون والبروتين الدهني والبروتين الحمض
القسطرة الوريديةB. شركة براون24Gالتي تدخل شريان الطحال
شركة المضادات الحيوية محلول النووي

المراجع

  1. Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
  2. Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285(2023).
  3. Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
  4. Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972(2022).
  5. Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36(2022).
  6. Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
  7. Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
  8. Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
  9. Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
  10. Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
  11. Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003(2019).
  12. Somuncu, Ö Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
  13. Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299(2022).
  14. Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
  15. Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
  16. Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إزالة الخلايا من الطحالالمصفوفة خارج الخلويةكبد اصطناعي حيويهندسة أنسجة الكبدإزالة الخلايا عن طريق الترويةدورات التجميد والإذابةسِقالة طحال جرذالحفاظ على الشبكة الوعائيةسِقالة لزراعة الخلايا
تصنيع مصفوفة الطحال منزوعة الخلايا المشتقة من الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.