مقالة منهجية

قياس إجهاد الشبكة الإندوبلازمية واستجابة البروتين المتكشف في الخلايا التائية المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 وتحليل دورها في تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1

3.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

يونيو 14, 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بعض الطرق المعمول بها لتحديد إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) وتنشيط استجابة البروتين غير المطوية (UPR) ، مع التركيز بشكل خاص على عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1. تصف هذه المقالة أيضا مجموعة من البروتوكولات للتحقيق في تأثير إجهاد ER / الاستعراض الدوري الشامل على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1 وعدوى الفيروسات.

الملخص

يمكن أن تسبب العدوى الفيروسية إجهاد الشبكة الإندوبلازمية (ER) بسبب تراكم البروتين غير الطبيعي ، مما يؤدي إلى استجابة البروتين غير المطوية (UPR). طورت الفيروسات استراتيجيات للتلاعب بالاستعراض الدوري الشامل المضيف ، ولكن هناك نقص في الفهم التفصيلي لتعديل الاستعراض الدوري الشامل وأهميته الوظيفية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 في الأدبيات. في هذا السياق ، تصف المقالة الحالية البروتوكولات المستخدمة في مختبرنا لقياس مستويات إجهاد ER و UPR أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الخلايا التائية وتأثير الاستعراض الدوري الشامل على تكاثر الفيروس والعدوى.

تلطيخ Thioflavin T (ThT) هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن إجهاد ER في الخلايا عن طريق الكشف عن مجاميع البروتين. هنا ، أوضحنا بروتوكول تلطيخ ThT في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 للكشف عن إجهاد ER وقياسه. علاوة على ذلك ، تم الكشف عن إجهاد ER أيضا بشكل غير مباشر عن طريق قياس مستويات علامات الاستعراض الدوري الشامل مثل BiP و IRE1 المفسفرة و PERK و eIF2α وربط XBP1 وانقسام ATF6 و ATF4 و CHOP و GADD34 في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، باستخدام النشاف المناعي التقليدي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-PCR). لقد وجدنا أن مضان ThT يرتبط بمؤشرات تنشيط الاستعراض الدوري الشامل. توضح هذه المقالة أيضا بروتوكولات تحليل تأثير إجهاد ER وتعديل الاستعراض الدوري الشامل على تكرار HIV-1 عن طريق تجارب ضربة قاضية وكذلك استخدام الجزيئات الدوائية. تم تحليل تأثير الاستعراض الدوري الشامل على التعبير الجيني / التكاثر الجيني لفيروس العوز المناعي البشري -1 وإنتاج الفيروس بواسطة فحوصات مراسل Luciferase والتقاط مستضد p24 ELISA ، على التوالي ، في حين تم تحليل التأثير على عدوى virion عن طريق تلطيخ خلايا المراسل المصابة. بشكل جماعي ، توفر هذه المجموعة من الأساليب فهما شاملا لمسارات استجابة البروتين غير المطوية أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، مما يكشف عن ديناميكياتها المعقدة.

المقدمة

تتميز متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) بانخفاض تدريجي في عدد الخلايا الليمفاوية التائية CD4 + ، مما يؤدي إلى الفشل التدريجي للاستجابة المناعية. فيروس نقص المناعة البشرية -1 (HIV-1) هو العامل المسبب للإيدز. إنه فيروس RNA مغلف ، إيجابي ، مفرد تقطعت به السبل مع نسختين من الحمض النووي الريبي لكل virion وينتمي إلى عائلة retroviridae. إن إنتاج تركيزات عالية من البروتينات الفيروسية داخل الخلية المضيفة يضع ضغطا مفرطا على آلية طي البروتين في الخلية1. ER هو المقصورة الأولى في المسار الإفرازي للخلايا حقيقية النواة. وهي مسؤولة عن إنتاج وتغيير وتوصيل البروتينات إلى المسار الإفرازي والمواقع المستهدفة الفضائية خارج الخلية. تخضع البروتينات للعديد من التغييرات بعد الترجمة وتطوى في شكلها الطبيعي في ER ، بما في ذلك الجليكوزيل المرتبط بالهليون وإنشاء روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئاتوبين الجزيئات 2. لذلك ، توجد تركيزات عالية من البروتينات في تجويف ER وهي عرضة جدا للتجميع والاختلال. تؤدي الحالات الفسيولوجية المختلفة ، مثل الصدمة الحرارية أو العدوى الميكروبية أو الفيروسية ، والتي تتطلب تخليقا محسنا للبروتين أو طفرة في البروتين ، إلى إجهاد ER بسبب زيادة تراكم البروتين في ER ، مما يزعج توازن تجويف ER. ينشط إجهاد ER شبكة من مسارات نقل الإشارات التكيفية المحفوظة للغاية ، استجابة البروتين غير المطوية (UPR) 3. يتم استخدام الاستعراض الدوري الشامل لإعادة الحالة الفسيولوجية الطبيعية للطوارئ من خلال مواءمة عبء البروتين غير المطوي وقدرته على الطي. يتم تحقيق ذلك عن طريق زيادة حجم ER والمرافقين الجزيئيين المقيمين في ER والطيات ، مما يؤدي إلى ارتفاع قدرة طي ER. يقلل الاستعراض الدوري الشامل أيضا من حمل البروتين في ER من خلال التوهين العالمي لتخليق البروتين على المستوى الانتقالي ويزيد من إزالة البروتينات غير المطوية من ER عن طريق تنظيم التحلل المرتبط ب ER (ERAD)4,5.

يتم استشعار إجهاد ER بواسطة ثلاثة بروتينات عبر غشائية مقيمة في ER: بروتين كيناز R (PKR) الشبيه بالشبكة الإندوبلازمية كيناز (PERK) ، وتنشيط عامل النسخ 6 (ATF6) ، والإنزيم الذي يتطلب الإينوزيتول من النوع 1 (IRE1). يتم الاحتفاظ بجميع هذه المستجيبات غير نشطة عن طريق الارتباط بعائلة بروتين الصدمة الحرارية Chaperone A (Hsp70) العضو 5 (HSPA5) ، المعروف أيضا باسم البروتين المرتبط (BiP) / 78-kDa البروتين المنظم للجلوكوز (GRP78). عند إجهاد ER وتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، ينفصل HSPA5 ويؤدي إلى تنشيط هذه المستجيبات ، والتي تنشط بعد ذلك سلسلة من الأهداف النهائية التي تساعد في حل إجهاد ER ، وفي الظروف القاسية ، تعزز موت الخلايا6. عند الانفصال عن HSPA5 ، يتم تنشيط PERK autophosphorylates ، ونشاط الكيناز7. نشاط الكيناز يفسفر eIF2α ، مما يؤدي إلى التوهين الانتقالي ، مما يقلل من حمل البروتين في ER8. ومع ذلك ، في وجود عامل بدء الفوسفو حقيقي النواة 2α (eIF2α) ، تصبح إطارات القراءة المفتوحة غير المترجمة على mRNAs محددة مترجمة بشكل تفضيلي ، مثل ATF4 ، الذي ينظم الجينات التي يسببها الإجهاد. ATF4 و C / EBP البروتين المتماثل (CHOP) هي عوامل النسخ التي تنظم الجينات التي يسببها الإجهاد وتنظم موت الخلايا المبرمج ومسارات موت الخلايا 9,10. أحد أهداف ATF4 و CHOP هو توقف النمو والبروتين المسبب لتلف الحمض النووي (GADD34) ، والذي ، جنبا إلى جنب مع بروتين الفوسفاتيز 1 dephosphorylate peIF2α ويعمل كمنظم تغذية مرتدة للتوهين الانتقالي11. تحت ضغط ER ، ينفصل ATF6 عن HSPA5 ، وتتعرض إشارة توطين Golgi الخاصة به ، مما يؤدي إلى نقلها إلى جهاز Golgi. في جهاز جولجي ، يتم شق ATF6 بواسطة بروتياز الموقع 1 (S1P) وبروتياز الموقع 2 (S2P) لإطلاق الشكل المشقوق من ATF6 (ATF6 P50). ثم يتم نقل ATF6 p50 إلى النواة ، حيث يحفز التعبير عن الجينات المشاركة في طي البروتين ونضجه وإفرازه بالإضافة إلى تدهور البروتين12,13. أثناء إجهاد ER ، ينفصل IRE1 عن HSPA5 ، ومتعدد الميمرات ، والفسفرة التلقائية14. تنشط فسفرة IRE1 مجال RNase الخاص بها ، وتحديدا تتوسط في ربط 26 نيوكليوتيدات من الجزء المركزي من mRNA لبروتين ربط X-box 1 (XBP1) 15,16. هذا يولد نهاية C جديدة تمنح وظيفة التنشيط ، وتوليد بروتين XBP1s وظيفي ، وهو عامل نسخ قوي يتحكم في العديد من الجينات التي يسببها الإجهاد ER17,18. يعمل النشاط المشترك لعوامل النسخ هذه على تشغيل البرامج الجينية التي تهدف إلى استعادة توازن ER.

هناك طرق مختلفة للكشف عن إجهاد ER و UPR. وتشمل هذه الطرق التقليدية لتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل19,20. تشمل الطرق غير التقليدية المختلفة قياس حالة الأكسدة والاختزال للاستعراض الدوري الشامل وتوزيع الكالسيوم في تجويف ER بالإضافة إلى تقييم هيكل ER. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني لمعرفة مدى تضخم تجويف ER استجابة لإجهاد ER في الخلايا والأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وتعتمد على توفر المجهر الإلكتروني ، والذي قد لا يكون متاحا لكل مجموعة بحثية. أيضا ، يعد قياس تدفق الكالسيوم وحالة الأكسدة والاختزال في ER أمرا صعبا بسبب توفر الكواشف. علاوة على ذلك ، فإن قراءات هذه التجارب حساسة للغاية وقد تتأثر بعوامل أخرى من التمثيل الغذائي الخلوي.

تتمثل إحدى التقنيات القوية والبسيطة لرصد مخرجات الاستعراض الدوري الشامل في قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل وقد استخدمت لعقود في سيناريوهات إجهاد مختلفة. هذه الطرق التقليدية لقياس تفعيل الاستعراض الدوري الشامل اقتصادية ومجدية وتوفر المعلومات في وقت أقل مقارنة بالطرق الأخرى المعروفة. وتشمل هذه المناعية لقياس التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل على مستوى البروتين ، مثل فسفرة IRE1 و PERK و eIF2α وانقسام ATF6 عن طريق قياس شكل P50 من ATF6 وتعبير البروتين لعلامات أخرى مثل HSPA5 و XBP1 المقسم و ATF4 و CHOP و GADD34 بالإضافة إلى RT-PCR لتحديد مستويات mRNA وكذلك ربط XBP1 mRNA.

توضح هذه المقالة مجموعة من البروتوكولات التي تم التحقق من صحتها وموثوق بها لمراقبة إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل في الخلايا المصابة بفيروس HIV-1 ولتحديد الأهمية الوظيفية للاستعراض الدوري الشامل في تكرار HIV-1 والعدوى. تستخدم البروتوكولات الكواشف المتاحة بسهولة وكذلك الكواشف الاقتصادية وتوفر معلومات مقنعة حول مخرجات الاستعراض الدوري الشامل. إجهاد ER هو نتيجة لتراكم البروتينات غير المطوية / غير المطوية ، والتي تكون عرضة لتشكيل مجاميع البروتين21. نصف هنا طريقة للكشف عن تجمعات البروتين هذه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. تلطيخ Thioflavin T هو طريقة جديدة نسبيا تستخدم للكشف عن هذه المجاميع البروتينية وقياسها22. وصف بيريولت وويرستوك هذه التقنية للكشف عن مجاميع البروتين وقياسها ، وبالتالي مستويات إجهاد ER في الخلايا الحية. لقد ثبت أن جزيء الفلورسنت الصغير ثيوفلافين T (ThT) يرتبط بشكل انتقائي بمجاميع البروتين ، وخاصة ألياف الأميلويد.

في هذه المقالة ، نصف استخدام ThT للكشف عن إجهاد ER وقياسه في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 وربطه بالطريقة التقليدية لمراقبة الاستعراض الدوري الشامل عن طريق قياس تنشيط مسارات الإشارات المختلفة للاستعراض الدوري الشامل.

نظرا لوجود نقص في المعلومات الشاملة المتعلقة بدور الاستعراض الدوري الشامل أثناء الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 ، فإننا نقدم مجموعة من البروتوكولات لفهم دور الاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 وعدوى الفيروسات. تشمل هذه البروتوكولات ضربة قاضية بوساطة فيروس العدس لعلامات الاستعراض الدوري الشامل بالإضافة إلى العلاج بمحفزات الإجهاد ER الدوائية. توضح هذه المقالة أيضا أنواع القراءات التي يمكن استخدامها لقياس التعبير الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، والإنتاج الفيروسي بالإضافة إلى عدوى الفيروسات المنتجة ، مثل مقايسة لوسيفيراز القائمة على التكرار الطرفي الطويل (LTR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم p24 (ELISA) ومقايسة تلطيخ مراسل β جالون على التوالي.

باستخدام غالبية هذه البروتوكولات ، أبلغنا مؤخرا عن الآثار الوظيفية لعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 على الاستعراض الدوري الشامل في الخلاياالتائية 23 ، وتشير نتائج تلك المقالة إلى موثوقية الطرق الموضحة هنا. وبالتالي ، توفر هذه المقالة مجموعة من الطرق للحصول على معلومات شاملة بشأن تفاعل HIV-1 مع إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل.

البروتوكول

ملاحظة: خطوط الخلايا المستخدمة هنا هي HEK-293T و Jurkat J6 (خط خلية CD4 + T) ، والتي تم الحصول عليها من مستودع الخلايا ، NCCS ، بيون ، الهند ؛ تم الحصول على TZM-bl ، وهو خط خلايا مشتق من HeLa يحتوي على نسخ متكاملة من جينات β-galactosidase و luciferase تحت مروج التكرار الطرفي الطويل لفيروس نقص المناعة البشرية -1 (LTR)24 و CEM-GFP (خط خلية مراسل CD4 + T آخر) 25 من مستودع الإيدز NIH ، الولايات المتحدة الأمريكية.

1. إعداد مخزون فيروس العوز المناعي البشري -1 وتخزينه

  1. إعداد مخزون فيروس العوز المناعي البشري -1
    ملاحظة: ينصح بممارسة المبادئ التوجيهية الدولية المتعلقة بالسلامة الأحيائية على النحو المتاح في دليل منظمة الصحة العالمية (WHO) أو مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) في جميع التجارب التي تنطوي على HIV-1. يجب أن يتم التعامل مع الفيروس وأي تجربة مع الفيروس الحي فقط في خزانة السلامة البيولوجية المناسبة الموجودة في مختبر احتواء على مستوى BSL2 على الأقل. يتم وصف إنتاج جزيئات فيروس العوز المناعي البشري -1 المعدية باستخدام مجموعة نقل فوسفات الكالسيوم في الثدييات في هذا الجزء من البروتوكول.
    1. بذور خلايا HEK-293T في أطباق 90 مم مع 10 مل كاملة (تستكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين) DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco) في خزانة السلامة الحيوية من النوع الثاني A2 واحتفظ بها لمدة 12 ساعة تقريبا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية بحيث يكون التقاء الخلايا بين 50٪ -60٪.
    2. في اليوم التالي ، اصنع مزيج النقل: قم بإعداد المحلول A الذي يحتوي على 25 ميكروغرام من pNL4.3 (استنساخ جزيئي لفيروس نقص المناعة البشرية -1) الحمض النووي البلازميد في محلول معقم ، 86.8 ميكرولتر من 2 M CaCl2 ، والماء المعقم المتبقي لجعل الحجم النهائي 700 ميكرولتر لكل لوحة. تحضير محلول B يحتوي على 700 ميكرولتر من 2x محلول ملحي مخزن HEPES (HBS) للوحة 1. ثم اضبط الحساب لإجمالي عدد اللوحات.
    3. أضف الآن الحل B إلى الحل A بطريقة قطرة مع الدوامة المستمرة للحل A. يصبح الحجم الكلي لمزيج النقل الآن 1.4 مل للوحي الواحد.
      ملاحظة: تؤدي الإضافة الدقيقة للمحلول B إلى المحلول A بينما تؤدي الدوامة المستمرة إلى تكوين مجمعات نقل مثالية.
    4. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، أضف الخليط ببطء إلى كل طبق يحتوي على 9 مل طازجة من DMEM الكامل وانقل الألواح إلى حاضنة CO2 . بعد 8-10 ساعات ، قم بتغيير الوسائط الحالية ب 10 مل جديدة من DMEM الكامل.
    5. بعد 24 ساعة من تغيير الوسائط ، اجمع المادة الطافية (التي تحتوي على جزيئات الفيروس) من جميع اللوحات في أنابيب مخروطية. أجهزة طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز طرد مركزي منضدية منخفض السرعة (جدول المواد) لإزالة حطام الخلية.
    6. انقل المادة الطافية إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق polyallomer وضعها في الدوار المتأرجح لجهاز الطرد المركزي الفائق (جدول المواد). تحقق من أوزان حاملات الأنابيب للتأكد من توازنها واضبطها باستخدام وسيط معقم إذا لزم الأمر.
    7. أجهزة الطرد المركزي الفائقة عند 1،41،000 × جم لمدة 2.5 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، أخرج الأنابيب بعناية وصب المادة الطافية ببطء داخل خزانة السلامة الحيوية.
    8. إلى الحبيبات (وهو الفيروس المركز الآن) في كل أنبوب ، أضف 1 مل من متوسط RPMI غير المكتمل (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 وقم بسحب قوي لإزاحة الحبيبات.
      ملاحظة: الحبيبات بعد أجهزة الطرد المركزي الفائقة تكاد تكون غير مرئية للعين المجردة. لذلك ، يجب التأكد من إضافة RPMI 1640 في منتصف الأنبوب حتى يتم إزاحة الحبيبات بشكل صحيح.
    9. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولتر من 1 M HEPES pH 7.4 إلى 1 مل من تعليق الفيروس. Aliquot 50 ميكرولتر من التعليق إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية على الفور للتخزين على المدى الطويل.
  2. القياس الكمي لتركيز الفيروس وعدوى الفيروس
    ملاحظة: لحساب عدوى الفيروس ، من الضروري أولا تحديد تركيزه ، والذي يتم بواسطة p24 Antigen Capture ELISA (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وبالتالي لا يتم وصفه هنا ؛ انظر جدول المواد). تعطي هذه العملية تركيز الفيروس بالنانوجرام لكل ميكرولتر (نانوغرام / ميكرولتر) من المخزون ، والذي يستخدم بعد ذلك لتحديد رقم virion المعدي في المخزون من خلال التجربة التالية في خلايا مراسل TZM-bl26.
    1. عد وبذر 0.1 × 106 خلايا TZM-bl في صفيحة بئر 24 باستخدام 500 ميكرولتر من DMEM الكامل لكل بئر واحتفظ بها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10-12 ساعة.
    2. تأكد من أن الخلايا متقاربة بنسبة 50٪ -60٪ قبل البدء في الإصابة بكمية الفيروس. قم بتغيير الوسائط الموجودة باستخدام 250 ميكرولتر من DMEM الكامل الجديد لكل بئر.
      ملاحظة: حافظ على تحكم إيجابي جيدا لاستبعاد أي خطأ تجريبي.
    3. احسب كمية فيروس المخزون اللازمة للعدوى من 1 نانوغرام و 0.1 نانوغرام و 0.01 نانوغرام في التكرارات. أضف الكمية المناسبة من الفيروس إلى الآبار واحتفظ باللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
    4. اغسل الخلايا مرتين ب 500 ميكرولتر من DMEM غير المكتمل ثم أضف 500 ميكرولتر من DMEM الكامل.
    5. تابع إجراء تلطيخ β جالون بعد 36 ساعة من تغيير الوسائط.
      1. تخلص من الوسائط الموجودة واغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإصلاح الخلايا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول التثبيت (0.25٪ جلوتارالدهيد في PBS) إلى كل بئر واحتضانها في RT داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 5-7 دقائق.
      2. تحضير محلول تلطيخ كما هو موضح في الجدول 1. احفظه بعيدا عن الضوء لأن X-gal حساس للضوء.
      3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من برنامج تلفزيوني. قم بتراكب الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول التلوين الطازج واحتضانها عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 2-18 ساعة.
      4. لإيقاف التفاعل بعد ذلك ، اشطف الخلايا ب 500 ميكرولتر من 3٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في PBS مرتين ثم احتفظ بالخلايا في 500 ميكرولتر من PBS الطازج.
      5. عد الخلايا المصابة باللون الأزرق (كما هو موضح في الشكل 1 أ) تحت المجهر بتكبير 10x ل 5 حقول عشوائية. خذ متوسط عدد الحقول ال 5 واضربه في عامل المجال وعامل التخفيف. هذا يحدد جزيئات virion المعدية في مخزون الفيروس.
        ملاحظة: بالنسبة للوحة 24 بئر ، يكون عامل المجال هو 75.
مكوناتاعدادالحجم المطلوب
برنامج تلفزيونيقم بإعداد 1x PBS من مخزون 10x PBS14 مل
البوتاسيوم فيري فيرو سيانيدقم بإذابة 0.82 جم من فيريسيانيد البوتاسيوم و 1.06 جم من فيروسيانيد البوتاسيوم في 25 مل من 1x PBS0.75 مل
كلوريد المغنيسيوم1 م في 1 مل من 1x PBS15 ميكرولتر
إكس غاليذوب 30 مجم في 0.6 مل من N، N-dimethyl formamide (في الظلام)0.3 مل
المجموع = 15 مل

الجدول 1: قائمة المكونات المطلوبة لتلطيخ β غال في خلايا TZM-bl.

2. عدوى فيروس نقص المناعة البشرية -1 من خطوط الخلايا التائية

  1. ذوبان الجليد وثقافة خط الخلايا التائية الخالدة. استخدمت هذه الدراسة خط خلايا CEM-GFP المزروع في وسط RPMI 1640 الكامل المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، و 500 ميكروغرام / مل G418.
  2. عد وخذ 2 مليون خلية لكل نقطة زمنية (غير مصابة ، 24 ساعة ، 48 ساعة ، 72 ساعة ، و 96 ساعة). احصد الخلايا غير المصابة على الفور عن طريق الطرد المركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وأضف محلول تحلل الخلية (50 مللي متر Tris-HCl pH 7.4 ، 0.12 M NaCl ، 5 mM EDTA ، 0.5٪ NP40 ، 0.5 mM NaF ، 1 mM DTT) ، مع استكمال كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني ، 0.5 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ومثبط فوسفاتيز واحد (50 ميكرولتر ل 1-3 مليون خلية) أو التحلل في كاشف Trizol (1 مل ل 1-3 مليون خلية) لعزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1 مل من وسط RPMI 1640 الكامل الذي يحتوي على بوليبرين (5 ميكروغرام / مل) عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسط الكامل.
    ملاحظة: Polybrene هو بوليمر كاتيوني يستخدم لتعزيز العدوى الفيروسية القهقرية في خلايا الثدييات.
  4. إعادة تعليق 8 ملايين خلية في 1 مل من البوليبرين تحتوي على وسط كامل. الآن احسب حجم المخزون الفيروسي المطلوب ل 4 ملايين جسيم فيريون ، وأضف مخزون الفيروس ، وشكل الحجم الإجمالي إلى 2 مل عن طريق إضافة وسائط كاملة. هذا يجعلها MOI من 0.5.
  5. احتفظ بالخلايا داخل حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، مع النقر المتقطع كل 30-45 دقيقة.
  6. بعد 4 ساعات ، قم بتدوير الخلايا وتخلص من المادة الطافية بعناية داخل خزانة السلامة البيولوجية بطرق التخلص المناسبة.
    ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بطرد الخلايا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
  7. اغسل الخلايا مرتين ب 1 مل من الوسط غير المكتمل. أعد تعليق الخلايا في 8 مل من الوسط الكامل ، مما يجعلها 1 مليون خلية / مل.
  8. في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار ، قم بزرع عدد متساو من الخلايا في العدد المطلوب من الآبار واحتفظ بالصفيحة في حاضنة CO2 التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية.
  9. لمدة 4 أيام القادمة ، احصد الخلايا كل 24 ساعة عن طريق إضافة مخزن مؤقت لتحلل الخلية. أيضا ، اجمع المادة الطافية وانقلها على الفور إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
  10. للتحقق مما إذا كانت العدوى قد حدثت ، تابع التقاط مستضد p24 ELISA لجميع النقاط الزمنية. قم بإجراء التخفيفات المناسبة للنقاط الزمنية ، أي تخفيف أقل للنقاط الزمنية الأولية وأعلى للنقاط اللاحقة التي تتراوح من 1:50 إلى 1:500. ارسم القراءات في رسم بياني يصور تطور العدوى (الشكل 1 ب).

3. تلطيخ ثيوفلافين T لتحديد إجهاد ER

  1. إصلاح 1 مليون خلية غير مصابة و 0.5 خلية مصابة ب CEM-GFP (تؤخذ 72 ساعة من الخلايا المصابة) مع 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT.
  2. قم برش الخلايا عند 100 × جم لمدة 5 دقائق وعالج ب 500 ميكرولتر من 0.1 متر جليكاين لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالغسيل ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مرتين. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS.
  3. قم بتجميع الشرائح الزجاجية وبطاقات الترشيح وغرف العينات. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها إلى غرف العينة وقم بتدوير الخلايا عند 1000 × جم لمدة 4 دقائق للصق الخلايا بالشرائح في جهاز طرد مركزي خلوي (جدول المواد).
    ملاحظة: لن يكون هناك ما يكفي من الخلايا التي يتم تجميدها على الشريحة بعد الطرد المركزي للطرد المركزي الخلوي إذا كان تعليق الخلية مخففا جدا. من المحتمل أن تتجمع الخلايا ويتم توزيعها بشكل سيئ بعد جهاز الطرد المركزي الخلوي ، إذا كان تعليق الخلية شديد التركيز.
  4. قم بتخلل الخلايا لمدة 10 دقائق باستخدام قطرات من 0.1٪ Triton-X-100 في PBS (يكفي لتغطية المنطقة التي التصقت بها الخلايا) وغسل الخلايا مرتين عن طريق وضع برنامج تلفزيوني قطرة ومسح PBS بالأنسجة عن طريق إمالة الشريحة.
  5. احتضان الخلايا مع 10 ميكرولتر من 5 ميكرومتر ثيوفلافين T لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لا تغسل بعد الحضانة مع ThT.
  6. قم بتركيب الشرائح باستخدام 5 ميكرولتر من وسائط التركيب (80٪ جلسرين v / v ، 20٪ PBS v / v ، و 8 مجم / مل 1،4-ديازابيسيكلو [2.2.2] أوكتان [DABCO]) ، ضع غطاء الغطاء وأغلق غطاء الغطاء باستخدام طلاء الأظافر. اترك الشرائح حتى تجف.
    ملاحظة: في كل هذه الخطوات ، تأكد من أن الخلايا لا تجف.
  7. التقط صورا متحدة البؤر للخلايا الثابتة باستخدام عدسة غمر الجلسرين 63x على مجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد). اضبط إعدادات الإثارة والانبعاثات التالية: GFP (على سبيل المثال 494 نانومتر ، Em. 519 نانومتر) و ThT (على سبيل المثال 458 نانومتر ، Em. 480-520 نانومتر).
    ملاحظة: يجب تصوير كل قناة فلورية بالتتابع ، بدلا من تصويرها في وقت واحد ، لتجنب تداخل القنوات. تم أخذ GFP كمؤشر على الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 حيث أن خلايا CEM-GFP لديها GFP تحت تنظيم مروج LTR ، والذي يطلق النار على عدوى HIV-125.
  8. قم بتحويل صور الفلورسنت إلى 8 بت قبل القياس الكمي عن طريق تحليل العتبة. حدد كثافة كل خلية يدويا باستخدام برنامج مثل Image J (~ 50 خلية) 27. ارسم الرسم البياني بكثافة كل خلية كنقاط على المحور Y مقابل المعايير غير المصابة والمصابة.
  9. لإثبات فعالية هذا البروتوكول ، خذ تحكما إيجابيا ، على سبيل المثال ، علاج Thapsigargin (محفز الإجهاد ER المعروف) في هذه الحالة28. عالج مليون خلية CEM-GFP ، كل منها يحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO (التحكم في السيارة) و 100 نانومتر من Thapsigargin لمدة 12 ساعة.
  10. حصاد الخلايا وعملية تلطيخ ThT كما هو مذكور للعينات المصابة (الخطوات 3.1-3.8).
    ملاحظة: بالنسبة لهذه العينات، لا يلزم مضان GFP. وبالتالي ، يتم التقاط مضان ThT فقط في الفحص المجهري متحد البؤر.

4. تحديد تفعيل والتعبير عن مختلف علامات الاستعراض الدوري الشامل

ملاحظة: لتحديد التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل يتم استخدام طريقتين: النشاف المناعي و RT-PCR. بالنسبة للنشاف المناعي ، احصد 0.5 خلية مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 من MOI في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة (24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة) وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول التحلل (كما هو مذكور في الخطوة 2.2). بالتناوب ، بالنسبة ل RT-PCR ، يتم تحليل كريات الخلايا في كاشف Trizol (1 مل لكل 1-3 مليون خلية) (انظر جدول المواد). يمكن تخزين الخلايا المعاد تعليقها في محلول التحلل وكاشف Trizol عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

  1. النشاف المناعي لتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل.
    1. احتفظ بالخلايا المعاد تعليقها في مخزن التحلل على الثلج لمدة 45 دقيقة مع الخلط المتقطع باستخدام دوامة.
    2. قم بإنزال الخلايا عند 18000 × جم لمدة 15 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي عالي السرعة على الطاولة (انظر جدول المواد). جمع طاف في أنبوب جديد.
    3. حدد تركيز البروتين في كل عينة باستخدام برادفورد أو كاشف مشابه.
    4. خذ تركيزا متساويا من البروتين لكل عينة وقم بإعداد عينات البروتين في محلول Laemmli (6x buffer: 250 mM Tris-Cl pH 6.8 ، 10٪ SDS ، 30٪ Glycerol ، و 0.02٪ Bromophenol blue ؛ 5٪ β-Mercaptoethanol).
      ملاحظة: بالنسبة للنشاف المناعي لكل علامة UPR ، تم استخدام ما لا يقل عن 60-80 ميكروغرام من البروتين.
    5. تغلي عينات البروتين على حرارة 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتعطي دورة قصيرة.
    6. حل عينات البروتين على هلام SDS-PAGE 10٪ -12٪ ونقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) (انظر جدول المواد).
    7. احصله على 5٪ من الحليب الجاف الخالي من الدسم أو ألبومين مصل الأبقار (BSA) لمدة 1-2 ساعة ، واغسله مرتين باستخدام TBST (20 mM Tris pH7.4 و 0.137 M NaCl ؛ 0.1٪ Tween 20) ، ودقق في الأجسام المضادة الأولية الخاصة بالبروتين ضد علامات الاستعراض الدوري الشامل (انظر جدول المواد) في الروك ، طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي بعد غسل البقع مرتين باستخدام TBST ، قم بالتحقيق مع الأجسام المضادة الثانوية المعنية لمدة 1.5 ساعة.
    8. اغسل البقع مرة أخرى باستخدام TBST وتصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة للكشف عن التلألؤ الكيميائي (انظر جدول المواد) في أداة تصوير اللطخة الغربية.
  2. RT PCR
    1. عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا باستخدام كاشف Trizol (انظر جدول المواد).
    2. تحضير cDNA من تركيز متساو من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي لفيروس Moloney Murine Leukemia (MMLV-RT) (انظر جدول المواد).
    3. تحليل تعديل تعبير mRNA ل HSPA5 ، XBP1 المقسم ، ATF4 ، CHOP و GADD34 باستخدام qRT-PCR مع البادئات الخاصة بالجينات (الجدول 2). باختصار ، قم بإعداد مخاليط تفاعل 10 ميكرولتر تحتوي على قالب cDNA (100 نانوغرام) ، و 5 ميكرولتر من صبغة SYBR الخضراء (انظر جدول المواد) ، و 10 pmol لكل زوج أوليغونيوكليوتيد خاص بالجينات. اضبط مستوى الصوت باستخدام H2O المعقم.
    4. قم بتشغيل المخاليط على جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام البرنامج التالي: تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية متبوعا بتحليل منحنى الذوبان. احسب تغير الطي في التعبير الجيني المستهدف بالنسبة لجين التدبير المنزلي (على سبيل المثال β-Actin) على النحو التالي:
      تغيير الطي = 2-Δ (ΔCT)
      حيث ΔCT = CT (الهدف) - CT (جين التدبير المنزلي)
      و Δ (ΔCT) = ΔCT (معالجة) -ΔCT (تحكم)
    5. لمزيد من تأكيد الربط ل XBP1 ، قم بإجراء RT-PCR شبه كمي مع عينات غير مصابة و 72 ساعة.
      ملاحظة: تمت دراسة ربط XBP-1 mRNA باستخدام RT-PCR عبر موقع اللصق.
    6. تضخيم cDNA باستخدام بادئات XBP1 (الجدول 2) باستخدام مزيج رئيسي PCR عالي الدقة (انظر جدول المواد) في ظل الظروف التالية: دورة واحدة من 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 65 * Δ-5 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 30 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، يليها تمديد نهائي قدره 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق والاحتفاظ عند 4 درجات مئوية.
    7. افصل الأمبليكونات على هلام أغاروز 2.5٪ يحتوي على 50 نانوغرام من بروميد الإيثيديوم / مل وتصوره في أداة وثيقة هلامية. شريط XBP1 المقسم أصغر بمقدار 26 نيوكليوتيدات.

5. ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل وتحليل التعبير الجيني المدفوع بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR وإنتاج الفيروس

  1. إعداد تركيبات shRNA لضربة قاضية من علامات الاستعراض الدوري الشامل
    1. إنشاء تركيبات shRNA باستخدام العمود الفقري لناقل pLKO.1-TRC (ناقل استنساخ الفيروسات العدسية)29.
    2. بناء بنيتين shRNA لكل جين (IRE1 و PERK و ATF6 و HSPA5). تم تصميم قليل النيوكليوتيدات الحسية والمضادة للإحساس التي تستهدف mRNA للجين المعني بواسطة اتحاد RNAi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (الجدول 3).
      ملاحظة: بطريقة مماثلة ، يمكن إجراء تركيبات shRNA لعلامات UPR الأخرى.
    3. قم بتلدين البادئات (100 نانومتر لكل من الأمام والخلف) عند 95 درجة مئوية متبوعة بالتبريد التدريجي إلى RT.
    4. بعد ذلك ، قم بربطه في مواقع Age1 و EcoRI لناقل pLKO.1 باستخدام رابط الحمض النووي T4 (انظر جدول المواد). تأكيد التسلسل عن طريق تسلسل الحمض النووي.
      ملاحظة: يتم استخدام بنية shRNA التي تستهدف جين LacZ كعنصر تحكم غير مستهدف.
  2. ضربة قاضية من PERK ، ATF6 ، IRE1 و HSPA5 في خلايا HEK-293T ، مقايسة Luciferase و p24 ELISA
    1. قم بإعداد مزيج من بنية shRNA (0.9 ميكروغرام) وكاشف نقل مثل polyethylenimine (PEI) (3 ميكرولتر من PEI مقابل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) (انظر جدول المواد) في 50 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل عن طريق الدوامة واحتضانها لمدة 20 دقيقة.
    2. من خلايا HEK-293T المتقاربة التي تحتوي على قارورة ، التربسينيز والبذور ~ 0.25 × 106 خلايا جنبا إلى جنب مع مزيج النقل في لوحة بئر 24 ، مما يجعل الحجم الإجمالي 125 ميكرولتر واحتضان لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . تسمى هذه الطريقة النقل العكسي حيث يتم زرع الخلايا مع خليط النقل.
    3. بعد 6 ساعات ، أضف 125 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى الآبار وأعد تعليق الخلايا للبذر المتساوي.
      ملاحظة: بالنسبة لتجارب الضربة القاضية ، يعطي النقل العكسي (الخطوات 5.2.1-5.2.3) كفاءة أفضل مع كل من shRNAs و siRNAs.
    4. بعد 24 ساعة ، قم بإجراء عملية نقل ثانية. قم بإعداد مزيج من pNL4-3 (100 نانوغرام) ، pLTR-Luc (100 نانوغرام) ، و pEGFP-N1 (50 نانوغرام) (pNL4-3: pLTR-Luc: pEGFPN1-1: 1: 0.5) مع PEI (3 ميكرولتر من PEI ل 1 ميكروغرام من الحمض النووي) في 50 ميكرولتر من الوسائط غير المكتملة عن طريق الدوامة. احتضان المزيج لمدة 20 دقيقة في RT. قم بتغيير الوسائط الموجودة باستخدام 250 ميكرولتر من الوسائط الجديدة غير المكتملة وأضف المزيج إلى الخلايا.
      ملاحظة: تم تطوير ناقل مراسل ل HIV-1 LTR عن طريق الاستنساخ الفرعي LTR من pU3RIII30,31 إلى pGL3basic في المختبر في وقت سابق32. تم استخدام تعبير GFP باستخدام pEGFP-N1 لتطبيع كفاءة النقل32.
    5. قم بتغيير الوسائط بعد 6 ساعات بعد النقل باستخدام 500 ميكرولتر من DMEM الكامل. حصاد الخلايا بعد 36 ساعة لفحص المناعة واختبار لوسيفيراز.
    6. بالنسبة لمقايسة لوسيفيراز ، قم بتجميع الخلايا وإعادة تعليقها في ركيزة لوسيفيراز المشتراة تجاريا (50 ميكرولتر) (انظر جدول المواد). أضف محللة الخلية المعاد تعليقها إلى صفيحة بئر 96 غير شفافة واحتضنها لمدة 10-15 دقيقة. احصل على قراءة لوسيفيراز في مقياس الإنارة. قم أيضا بقياس مضان GFP في نفس العينات لتطبيع قراءة لوسيفيراز في قارئ لوحة microplate micromode (على سبيل المثال: 494 نانومتر ، Em: 519 نانومتر).
    7. ارسم الرسم البياني على أنه وحدة Luciferase / GFP على المحور Y.
      ملاحظة: يجب فحص ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل المعنية ، ويمكن إجراؤها إما عن طريق النشاف المناعي أو qRT-PCR باستخدام الأجسام المضادة أو البادئات الخاصة بالجينات ، على التوالي.
    8. اجمع المواد الطافية لمعالجة p24 ELISA كما هو مذكور أعلاه.
  3. إنشاء خلايا مستقرة مع ضربة قاضية من علامات الاستعراض الدوري الشامل وعدوى فيروس العوز المناعي البشري -1.
    1. قم بإعداد جزيئات Lentivirus عن طريق نقل خلايا HEK-293T المصنفة في صفيحة 6 آبار ، مع تركيبات shRNA (1 ميكروغرام) المعنية جنبا إلى جنب مع pMD2.G (ناقل مغلف VSV-G) (0.75 ميكروغرام) ، و psPAX2 (بلازميد تغليف Lentiviral ) (0.25 ميكروغرام) (انظر جدول المواد) باستخدام PEI بنسبة 1 ميكروغرام من الحمض النووي: 3 ميكرولتر من جزيرة الأمير إدوارد. تحضير الخليط في 100 ميكرولتر من DMEM غير مكتملة واحتضانها لمدة 20 دقيقة في RT. أضف الخليط إلى 1.8 مل من الوسائط الكاملة في خلايا HEK-293T المصنفة.
      ملاحظة: خلايا البذور HEK-293T في صفيحة بئر 6 على الأقل قبل 12 ساعة من النقل حتى تكتسب مورفولوجيا وتكون متقاربة بنسبة 60-70٪ تقريبا.
    2. بعد 24 ساعة من النقل ، أضف 1 مل من DMEM الكامل إلى كل بئر.
    3. اجمع المواد الطافية بعد 48 ساعة ، واحفظها في الفريزر -80 درجة مئوية ، وقم بإجراء p24 ELISA لتأكيد وجود الفيروس في هذه المواد الطافعة. استخدم هذا الطافي الفيروسي الخام لتحويل خلايا J6.
    4. احتضان 2 مليون خلية في صفيحة 6 آبار بحجم متساو من طاف الفيروسات العدسية (500 ميكرولتر) لكل عنصر تحكم وفيروس عدسي ضربة قاضية خاصة بالجينات وإضافة وسط RPMI 1640 كامل جديد في وجود بوليبرين (5 ميكروغرام / مل) لتعويض الحجم إلى 2 مل.
    5. بعد 24 ساعة ، أضف Puromycin (1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر لتحديد الخلايا المستقرة. بعد إضافة Puromycin ، قم بتجميع الخلايا كل 24 ساعة وإضافة 2 مل من الوسائط الطازجة باستخدام Puromycin.
    6. افعل ذلك حتى لا يكون هناك موت للخلايا (~ 1 أسبوع). الخلايا الباقية هي الخلايا المستقرة ذات الضربة القاضية الجينية المطلوبة.
      ملاحظة: يمكن فحص ضربة قاضية للجينات المعنية على فترات منتظمة ، وأخيرا ، عندما تكون الخلايا الباقية فقط مرئية في الوسائط المحتوية على Puromycin باستخدام immunoblotting أو qRT-PCR.
    7. تصيب خلايا LacZ والخلايا الضربة القاضية الخاصة بالجينات ب 0.5 MOI من HIV-1 كما هو موضح في القسم 2 وحصاد الخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة.
    8. اجمع المادة الطافية من كل عينة وقم بمعالجة p24-ELISA كما هو موضح سابقا وقم بمعالجة الخلايا للتحقق من مستوى الضربة القاضية عن طريق النشاف المناعي.

6. العلاج بمحفز الإجهاد ER وتحليل تأثيره على تكرار HIV-1

ملاحظة: لتحديد تأثير الإفراط في تحفيز الاستعراض الدوري الشامل أثناء تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 ، يمكن استخدام جزيء المحفز الدوائي ، Thapsigargin.

  1. تحديد النسبة المئوية لصلاحية الخلية عند علاج Thapsigargin.
    ملاحظة: يتم تحديد السمية الخلوية للثابسيجارجين بواسطة كاشف MTT (انظر جدول المواد).
    1. بذر 25000-30000 خلية CEM-GFP لكل بئر في 96 صفيحة بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من RPMI 1640 الكامل. أضف 100 نانومتر ثابسيجارجين إلى الوسائط واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة.
      ملاحظة: تم أخذ الخلايا المعالجة ب 1 ميكرولتر من DMSO كعنصر تحكم في السيارة.
    2. بعد 48 ساعة ، أضف 10 ميكرولتر من MTT (5 مجم / مل) في كل بئر واحتضانها في الظلام لمدة 4 ساعات لتشكيل بلورات الفورمازان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    3. بعد 4 ساعات ، قم بإذابة البلورات باستخدام 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لتشكيل لون أرجواني وقياس الامتصاص عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
    4. احسب النسبة المئوية لصلاحية الخلية بناء على المعادلة الواردة أدناه
      ٪ صلاحية الخلية = (التحكمOD570 - العلاجOD570) / التحكمOD570 × 100
  2. المعالجة المسبقة لثابسيجارجين وتحليل تطور عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 بواسطة p24 ELISA.
    1. قم بزرع مليون خلية CEM-GFP في صفيحة بئر 12 تحتوي على 1 مل من RPMI 1640 الكامل وعالج الخلايا ب 100 نانومتر من Thapsigargin أو 1 ميكرولتر من DMSO (التحكم في السيارة) لمدة 12 ساعة في حاضنة CO2 التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. بعد 12 ساعة ، اغسل الخلايا باستخدام RPMI 1640 الكامل وأصاب ب 0.5 MOI من HIV-1 كما هو موضح سابقا.
    2. احصد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة ، مثل 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة ، من أجل النشاف المناعي.
    3. اجمع المواد الطافية من كل عينة وقم بإجراء p24 ELISA كما هو موضح سابقا.
    4. ارسم التمثيل البياني بتركيز p24 في العينة باعتباره المحور Y والنقاط الزمنية ذات الصلة كمحور X.
    5. باستخدام immunoblotting ، قم بتحليل تحريض إجهاد ER بسبب علاج Thapsigargin عن طريق قياس مستوى أي علامات UPR. استخدمت هذه الدراسة HSPA5 كعلامة.

7. مقايسة عدوى TZM-bl β-gal لتحديد تأثير الاستعراض الدوري الشامل على عدوى virion

ملاحظة: لفهم دور الاستعراض الدوري الشامل في عدوى الفيروسية ، يمكن استخدام المادة الطافية من ضربة قاضية وكذلك العلاج باستخدام Thapsigargin ، لمقايسة عدوى TZM-bl β-gal كما هو موضح في القسم 1.2 ، بناء على تركيز p24 المحدد بواسطة p24 ELISA.

  1. تصيب خلايا TZM-bl بتركيز متساو من p24 من كل عينة وقم بإجراء تلطيخ β غالون. عد الخلايا المصابة الزرقاء تحت المجهر بتكبير 10x ل 5 حقول عشوائية.
  2. خذ متوسط عدد الحقول ال 5 لكل عينة من الخطوات المذكورة أعلاه.
  3. احسب تغيير الطي كما هو مذكور أدناه:
    تغيير الطي = متوسط عدد الخلايا الزرقاء في عينات الاختبار / متوسط عدد الخلايا الزرقاء في عينة التحكم.

النتائج

في هذا العمل ، وصفنا بروتوكولا مفصلا لدراسة إجهاد ER في المختبر وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل عند الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 في الخلايا التائية (الشكل 2). تصف هذه الدراسة أيضا طرق تحليل الأهمية الوظيفية للاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 وعدوى الفيروس (الشكل 3).

لهذا الغرض ، قمنا بتحليل إجهاد ER الناجم عن عدوى HIV-1 من خلال مراقبة مجاميع البروتين داخل الخلية عن طريق تلطيخ Thioflavin T. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، تمثل شدة ThT تجمعات البروتين في الخلايا غير المصابة والمصابة. وبالمثل ، كعنصر تحكم إيجابي ، يمثل الشكل 4B تلطيخ ThT في الخلايا المعالجة ب Thapsigargin. تشير كثافة ThT المحسنة إلى وجود المزيد من مجاميع البروتين ، والتي ترتبط بإجهاد ER المعزز.

علاوة على ذلك ، للتحقق من صحة هذه الملاحظة ، تم استخدام طريقة أكثر تقليدية ، والتي تضمنت تحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل. تم تحليل تنشيط الاستعراض الدوري الشامل في البداية من خلال تنشيط المستجيبات الأولية -IRE1 و ATF6 و PERK. تم قياس تنشيط IRE1 من خلال تحليل مستويات phospho-IRE1 عن طريق النشاف المناعي لمحللات الخلايا غير المصابة والمصابة التي تم حصادها في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة ، كما هو موضح في الشكل 5A. تشير الزيادة في مستويات pIRE1 / Total IRE1 إلى تنشيط IRE1. وبالمثل ، تم قياس تنشيط PERK من خلال مستويات phospho-PERK في الخلايا غير المصابة والمصابة (الشكل 5B). تم تحديد تنشيط ATF6 كميا من خلال مستوى التعبير عن شكل ATF6 P50 عن طريق النشاف المناعي (الشكل 5C). علامة أخرى مهمة للاستعراض الدوري الشامل هي المنظم الرئيسي ومرافقة ER ، HSPA5. تم تحليل مستوى HSPA5 أيضا عن طريق النشاف المناعي ، كما هو موضح في الشكل 5D. تم اتباع بروتوكول مماثل لعلامات الاستعراض الدوري الشامل الأخرى ، مثل sXBP1 و peIF2α و ATF4 و CHOP و GADD34 ، باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بها (الشكل التكميلي 1). يمكن تحليل ربط XBP1 mRNA بواسطة كل من RT-PCR الكمي (الشكل 5E) و RT-PCR شبه الكمي. نظرا لأن RT-PCR الكمي لم يتمكن من تحديد الربط على وجه التحديد ، فقد تم إقرانه بمقايسة الربط ، حيث تم استخدام RT-PCR شبه الكمي (الشكل 5F). مع البروتوكول المذكور أعلاه ، لاحظنا أن بيانات qRT-PCR تتطابق مع بيانات شبه qRT-PCR. على غرار qRT-PCR الذي تم إجراؤه ل sXBP1 ، تم استخدام البروتوكول لتحليل علامات أخرى للاستعراض الدوري الشامل ، مثل HSPA5 و ATF4 و CHOP و GADD34 على مستوى mRNA (الشكل التكميلي 2)

بعد ذلك ، للتحقيق في دور الاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1 وعدوى الفيروس ، أجرينا ضربة قاضية لبعض علامات الاستعراض الدوري الشامل: PERK و HSPA5. باستخدام البروتوكولات المذكورة ، حققنا ضربة قاضية لهذه العلامات إلى مستوى كبير في كل من خلايا HEK-293T (الشكل 6A) وكذلك خلايا J6 (الشكل 6B). باستخدام هذه الخلايا الضربة القاضية ، قمنا بالتحقيق في تأثير ضربة قاضية لنشاط الجينات المدفوع بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR (الشكل 6A) ، والذي يتم تمثيله كنسبة تعبير Luc / GFP في العينات المعنية. تم قياس إنتاج الفيروس بواسطة p24 ELISA للطافية ، كما هو موضح في الشكل 6B. يمكن أيضا تحليل عدوى الفيروسات الناتجة باستخدام بروتوكول تلطيخ β-gal بنفس الطريقة الموضحة في الشكل 1A.

علاوة على ذلك ، باستخدام محفز كيميائي لإجهاد ER ، Thapsigargin ، يمكن دراسة تأثير الإفراط في تحفيز الاستعراض الدوري الشامل على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، وإنتاج الفيروس ، وعدوى الفيروس. تم تحليل السمية الخلوية ل Thapsigargin عند التركيز المحدد باستخدام مقايسة MTT (الشكل 7A) ، مما يدل على أن السمية الخلوية عند التركيز المطلوب غير مهمة. تم إجراء النشاف المناعي ل HSPA5 لتحليل تأثير الدواء على إجهاد ER (الشكل 7B). تظهر النتائج أن المعالجة المسبقة لمدة 12 ساعة ل 100 نانومتر Thapsigargin تسببت في التعبير عن HSPA5 في جميع الأوقات. يوضح p24 ELISA التأثير على إنتاج الفيروس وعدوى الفيروسات المنتجة ، والتي يمكن تحليلها كما هو موضح سابقا.

figure-results-1
الشكل 1: القياس الكمي لعدوى الفيريون وتحليل تطور العدوى. (أ) القياس الكمي لعدوى الفيريون بواسطة مقايسة β غال القائمة على TZM-bl. تم تحديد عدوى الفيروس عن طريق إضافة 1 نانوغرام و 0.1 نانوغرام و 0.01 نانوغرام من الفيروس إلى خلايا TZM-bl ، متبوعا بتلطيخ β جالون وحساب عدد الخلايا الزرقاء. التكبير: 10x. (ب) تحليل تطور العدوى في 0.5 خلية مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 من MOI CEM-GFP بناء على مستضد p24 يلتقط ELISA من طافات الثقافة. أصيبت خلايا CEM-GFP ب 0.5 MOI من HIV-1 ، وتمت معالجة المواد الطافية ل p24 ELISA. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. تشير العلامات النجمية إلى مستوى الدلالة ، والذي يشار إليه في الأشكال على النحو التالي: ns = p ≥ 0.05 ، * = p ≤ 0.05 ، ** = p ≤ 0.01 ، *** = p ≤ 0.001 و ****=p ≤ 0.0001 كما تم تحليلها بواسطة اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: عرض تخطيطي للخطوات الواجب اتباعها لتحليل تأثير عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 على إجهاد الطوارئ والاستعراض الدوري الشامل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: مخطط انسيابي للخطوات الواجب اتباعها لتحليل تأثير الاستعراض الدوري الشامل على تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 وإنتاج الفيروس وعدوى الفيروس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل مستوى إجهاد ER في الخلايا التائية بسبب عدوى HIV-1 باستخدام تلطيخ ThT. (أ) أصيبت خلايا CEM-GFP ب 0.5 MOI من فيروس العوز المناعي البشري -1 وتم حصادها بعد 72 ساعة من الإصابة. تم إصلاح الخلايا وتلطيخها بثيوفلافين T. يشير تعبير GFP إلى خلايا CEM-GFP المصابة. يوضح التمثيل البياني شدة ثيوفلافين تي في حالة الخلايا غير المصابة والمصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. يتم عرض البيانات من ~ 50 خلية من n = 3 مكررات بيولوجية في الرسم البياني. (ب) عولجت خلايا CEM-GFP باستخدام DMSO و TG لمدة 12 ساعة. تم إصلاح الخلايا وتلطيخها بثيوفلافين تي. يوضح التمثيل البياني شدة ثيوفلافين تي في حالة الخلايا المعالجة DMSO و TG. يتم عرض البيانات من ~ 50 خلية من n = 3 مكررات بيولوجية في الرسم البياني. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. تشير العلامات النجمية إلى مستوى الأهمية ، والذي يشار إليه في الأشكال ك ns = p ≥ 0.05 ، * = p ≤ 0.05 ، ** = p ≤ 0.01 ، *** = p ≤ 0.001 و **** = p ≤ 0.0001 كما تم تحليلها بواسطة اختبار t للطالب. الأمم المتحدة: غير مصابة؛ في: مصاب; TG: ثابسيجارجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل المختلفة في الخلايا التائية المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1. (A-E) تم حصاد الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 (0.5 MOI) CEM-GFP حتى اليوم 4 كل 24 ساعة وتمت معالجتها لإجراء تحليلات مختلفة كما هو موضح أدناه. (أ) تم تحليل تنشيط IRE1 عن طريق النشاف المناعي ل pIRE1. (ب) تم تحليل تنشيط PERK عن طريق النشاف المناعي ل pPERK. (ج) تم تحليل تنشيط ATF6 عن طريق النشاف المناعي لشكل ATF6 P50. (د) تم تحليل التعبير عن مرافق ER HSPA5 بواسطة النشاف المناعي HSPA5. (ه) تم تحليل الربط ل XBP1 بواسطة qRT-PCR ل sXBP1 باستخدام بادئات محددة في الوقت الفعلي. (F) لتحليل ربط XBP1 بواسطة شبه qRT-PCR ، تم تضخيم XBP-1 mRNA باستخدام RT-PCR عبر موقع لصق ، وتم تصور النطاقات. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. الأمم المتحدة: غير مصاب. في: مصاب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تحليل دور الاستعراض الدوري الشامل في تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1 وإنتاج الفيروس. (أ) تم هدم PERK (اللوحة اليسرى) و HSPA5 (اللوحة اليمنى) في خلايا HEK-293T ، وتم إجراء اختبار luciferase لتحليل نشاط الجينات الذي يحركه HIV-1 LTR. تظهر البقع المناعية مستويات ضربة قاضية للبروتينات المعنية. (B) تم هدم PERK (اللوحة اليسرى) و HSPA5 (اللوحة اليمنى) في خلايا J6 ، وتم إجراء p24 ELISA مع جمع المادة الطافية لتحليل إنتاج الفيروس. تظهر البقع المناعية مستويات ضربة قاضية للبروتينات المعنية. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. تشير العلامات النجمية إلى مستوى الدلالة ، والذي يشار إليه في الأشكال على النحو التالي: ns = p ≥ 0.05 ، * = p ≤ 0.05 ، ** = p ≤ 0.01 ، *** = p ≤ 0.001 و ****=p ≤ 0.0001 كما تم تحليلها بواسطة اختبار t للطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: تحليل تأثير محفز الإجهاد الكيميائي ER ، Thapsigargin ، على تطور عدوى HIV-1. (أ) صلاحية خلايا CEM-GFP عند العلاج ب 100 نانومتر ثابسيجارجين. يتم تحليل صلاحية الخلية بواسطة مقايسة MTT. (ب) أصيبت خلايا CEM-GFP المعالجة مسبقا ب 100 نانومتر من TG لمدة 12 ساعة ب 0.5 MOI من HIV-1 وتم حصادها في 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة. تظهر اللطخة المناعية تأثير TG على التعبير عن HSPA5 ، بينما يوضح الرسم البياني إنتاج الفيروس كما تم تحليله بواسطة p24 ELISA. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. تشير العلامات النجمية إلى مستوى الأهمية ، والذي يشار إليه في الأشكال ك ns = p ≥ 0.05 ، * = p ≤ 0.05 ، ** = p ≤ 0.01 ، *** = p ≤ 0.001 و ****= p ≤ 0.0001 كما تم تحليلها بواسطة اختبار t للطالب. TG: ثابسيجارجين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: تحليل التعبير عن مختلف العلامات النهائية للاستعراض الدوري الشامل. التعبير عن (A) sXBP1 و (B) فسفرة eIF2α و (C) ATF4 و (D) CHOP و (E) GADD34 كما تم تحليلها بواسطة immunoblotting. (أ-ه) تم حصاد خلايا CEM-GFP المصابة ب 0.5 MOI من HIV-1 في 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة وتم استخدامها في النشاف المناعي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تحليل مختلف علامات الاستعراض الدوري الشامل على مستوى mRNA بواسطة qRT-PCR. (أ-د) تم حصاد خلايا CEM-GFP المصابة ب 0.5 MOI من HIV-1 كل 24 ساعة حتى اليوم الرابع وتم استخدامها ل qRT-PCR من (A) HSPA5 و (B) ATF4 و (C) CHOP و (D) GADD34. يتم عرض أشرطة الخطأ كمتوسط ± قيم S.E. تشير العلامات النجمية إلى مستوى الأهمية ، والذي يشار إليه في الأشكال على النحو التالي ns = p ≥ 0.05 ، * = p ≤ 0.05 ، ** = p ≤ 0.01 ، *** = p ≤ 0.001 و **** = p ≤ 0.0001 كما تم تحليلها بواسطة اختبار t للطالب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

بناءتسلسل التمهيدي 5 'إلى 3'
مقايسة الربط XBP1 FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 مقايسة الربط RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
مقسم XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
مقسم XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
مستشفى فيلادلفيا للأطفال FCAGTCCCGAAGGAGAAAG
مستشفى فيلادلفيا للأطفال RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
جاد 34 فATGGACAGTGACCTTCTCGG
جاد 34 صCTGGGCTCCTCCTAGGCT
أكتين فAGAAAATCTGGCACCACACC
أكتين آرGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

الجدول 2: قائمة البادئات المستخدمة في تحليل RT-PCR. F: إلى الأمام. R: عكس

بناء shRNAتسلسل التمهيدي 5 'إلى 3'
ميزة SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATATATATATATGACCTGCCGTTTTTG
ميزة SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATATATATATGACCTGCCG
ميزة SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
ميزة SH2 RAATTCAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGGAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTCCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGGGGGTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTCTCCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCCCTTTTTGG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTGG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTGATCGTACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
لاكز إفCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
لاكز آرAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTCGTCACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

الجدول 3: قائمة الاشعال المستخدمة لتوليد تركيبات shRNA. F: إلى الأمام. R: عكس

المناقشة

يشمل نطاق هذا البروتوكول (i) التعامل مع مخزونات فيروس HIV-1 وقياس تركيز الفيروس وعدوى virion ، (ii) إصابة الخلايا التائية بفيروس HIV-1 وتقييم تأثيرها على إجهاد ER وعلامات مختلفة من الاستعراض الدوري الشامل ، (iii) تأثير ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل وتأثيرها على النشاط الجيني المدفوع بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR ، إنتاج الفيروس وعدوى virion و (iv) الإفراط في تحفيز الاستعراض الدوري الشامل باستخدام الجزيء الدوائي وتحليل تأثيره على تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1. باستخدام المجموعة الحالية من البروتوكولات ، يمكن الحصول على معلومات شاملة حول التفاعل بين فيروس نقص المناعة البشرية -1 والاستعراض الدوري الشامل. البروتوكولات المدرجة في هذه الدراسة سهلة الأداء وفعالة من حيث التكلفة وموثوقة للغاية.

نظرا لأن الاستعراض الدوري الشامل هو مسار إشارات حساس للإجهاد ، فإن العمل على ذلك ينطوي على خطوات دقيقة إلى حد ما. بالنسبة لجميع التجارب ، نوصي بتجنب الخلايا الطويلة من أجل الحصول على الاتساق في النتائج. من المهم أيضا الحفاظ على ظروف معقمة في جميع تقنيات زراعة الخلايا لتجنب التلوث البكتيري والخميرة ، لأنها يمكن أن تعيق التجارب والنتائج المقابلة. علاوة على ذلك ، عند التعامل مع الخلايا أثناء التجارب ، بما في ذلك زراعتها اللاحقة ، امنع التغيرات القاسية أو الطويلة في درجات الحرارة وتأكد من أن الخلايا صحية وغير مضغوطة في البداية. خلاف ذلك ، قد تسبب التغييرات ضغطا إضافيا على الخلايا ، مما قد يغير النتائج. حاول أن تبقي النقاط الزمنية ثابتة قدر الإمكان لأن الاستعراض الدوري الشامل هو مسار إشارات حساس ، ويمكن أن يؤدي التغيير الطفيف في النقاط الزمنية إلى تغيير النتائج.

طريقة تلطيخ ThT التي تكتشف مجاميع البروتين وتستخدم لتحديد إجهاد ER22، مستويات إجهاد ER في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 بوضوح شديد. يعتمد تلطيخ ThT على اكتشاف مجاميع البروتين ، والتي ترتبط بإجهاد ER. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن تنشيط الاستعراض الدوري الشامل لا يمكن ربطه دائما بمجاميع البروتين حيث يمكن تنشيط مسارات إشارات الاستعراض الدوري الشامل الفردية مباشرة دون إشراك مجاميع البروتين. لذلك ، على الرغم من أن طريقة تلطيخ ThT هذه تعطي فكرة عن مستويات إجهاد ER ، من أجل التحليل المتعمق لتنشيط الاستعراض الدوري الشامل ، يجب دائما التحقق من صحتها بمزيد من التحليل لعلامات الاستعراض الدوري الشامل. أيضا ، لمزيد من تحديد التوطين دون الخلوي لتلطيخ ThT ، يمكن استخدام علامات مثل KDEL في حالة وضع علامة على ER. علاوة على ذلك ، في كثير من الحالات ، يؤدي إجهاد ER إلى تغيير في حجم الخلية وشكلها ، لذلك يمكن للمرء أيضا أن يأخذ مساحة الخلايا في الاعتبار أثناء تحديد شدة ThT. أحدث توافر الأجسام المضادة التجارية الخاصة بالجينات الحساسة للغاية والموثوقة والفعالة من حيث التكلفة ثورة في العديد من جوانب مجال علوم الحياة ، مما سمح بتحليل أسهل لمستويات البروتين في الخلايا. أيضا ، في الوقت الحاضر ، تتوفر أنواع حساسة للغاية من المعدات لتصور نطاقات البروتين على البقع وجعل القياس الكمي سريعا وأسهل. وبالتالي ، يمكن تحليل تنشيط علامات الاستعراض الدوري الشامل بسهولة عن طريق التشطيع المناعي. ومع ذلك ، نظرا لأن التعبير عن بروتينات علامة الاستعراض الدوري الشامل منخفض نسبيا ، لذلك يحتاج المرء إلى استخدام تركيز كبير من البروتين لتحليل تعبيرها. علاوة على ذلك ، يجب تحسين تخفيف الأجسام المضادة الأولية بشكل صحيح بناء على تعبير البروتين في الخلايا المستخدمة لتجنب الارتباط غير المحدد وضوضاء الخلفية في البقع. أيضا ، كما هو موضح في الشكل 4 ج، فإن الجسم المضاد ATF6 متعدد النسيلة ويعطي عددا من النطاقات غير المتخصصة. هناك حاجة إلى التحسين المناسب للغسيل وتركيز الأجسام المضادة لتقليل هذه النطاقات غير المحددة إلى حد ما. يجب غسل البقع بشكل صحيح بعد الحضانة في محلول مانع ، وجسم مضاد أولي ، وجسم مضاد ثانوي لتقليل الخلفية والأحزمة غير المحددة. أثناء تطوير البقع ، يجب تجنب التشبع الزائد للعصابات للحصول على تصور مناسب للنمط في النتائج التي تم الحصول عليها. بالنظر إلى التركيز الواسع لمقالة الطريقة هذه ، لم نركز على الطرق التفصيلية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتقنيات المناعة العامة ؛ ومع ذلك ، يمكن للمرء الرجوع إلى مقالات الطريقة التي كتبها محمود ويانغ33 وكذلك غوش وآخرون.34 لنفسه. نظرا لأن RT-PCR في الوقت الحاضر طريقة شائعة الاستخدام للغاية ، فإن البادئات وأجهزة RT-PCR المتاحة بسهولة توفر بيانات لتحليل بعض علامات الاستعراض الدوري الشامل. ومع ذلك ، يجب اتخاذ الاحتياطات أثناء تحضير الحمض النووي الريبي والحمض النووي cDNA ل RT-PCR لأنها طريقة حساسة للغاية ، ويمكن أن تؤدي الاختلافات الطفيفة في جودة العينات والماصات إلى اختلافات كبيرة في القراءة. يجب إزالة أي تلوث بالحمض النووي أو البروتين من عينات الحمض النووي الريبي. أيضا ، خذ العينات دائما في ثلاث نسخ ل qRT-PCR بحيث يمكن تقليل خطأ الماصة. يجب تحسين تركيز الحمض النووي المستخدم في qRT-PCR بحيث تكون قيمة التصوير المقطعي المحوسب لكل عينة أقل من 30 ، لأن أي شيء يتجاوز 30 يعتبر غير مثالي. يجب دائما الاحتفاظ بعنصر تحكم سلبي ل qRT-PCR لتجنب أي قراءات إيجابية خاطئة. يمكن تحليل الربط ل XBP1 بواسطة كل من qRT-PCR وكذلك شبه qRT-PCR. نظرا لأن qRT-PCR لن يظهر الربط بدقة ، يجب دائما إجراء شبه qRT-PCR بصرف النظر عن qRT-PCR للتحقق من صحة البيانات وتحديد نسبة XBP1 المقسمة النسبية إلى نسبة XBP1 غير المقسمة. نظرا لأن الفرق بين حجم XBP1 المقسم وغير المقسم هو 26 nt فقط ، يجب استخدام نسبة أعلى من هلام الأغاروز لحل الجل. أيضا ، يجب حل النطاقات في الجهد المنخفض ومدة أطول لفصل أفضل. هناك طريقة أخرى أكثر شيوعا في الوقت الحاضر لمراقبة ربط XBP1 ، وهي مقايسة الربط التي تستخدم Pst1 هضم إنزيم تقييد cDNA ويوفر تصورا أفضل للربط XBP135. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتصور ربط XBP1 في العينات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. يمكن استخدام النتائج التي تم الحصول عليها من النشاف المناعي و RT-PCR للتحقق من صحة نتائج تلطيخ ThT.

تشير النتائج التمثيلية الموضحة في الشكل 5 إلى أن تنشيط الاستعراض الدوري الشامل عند الإصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 يرتبط بتلطيخ ThT المعزز الموضح في الشكل 4. ومع ذلك ، فإن قيود استخدام النشاف المناعي و RT-PCR لتحليل الاستعراض الدوري الشامل هي أنها صارمة ، وعلى المرء مراقبة منتجات جينية متعددة حيث يمكن تعديل جينات UPR الفردية بشكل مستقل عن طريق عوامل الإجهاد غير ER. أيضا ، تقيس هذه الطرق بشكل غير مباشر إجهاد ER من خلال النظر إلى علامات الاستعراض الدوري الشامل المختلفة. هذا هو السبب في أنه يمكن استخدام تلطيخ ThT وتحليل علامات الاستعراض الدوري الشامل عن طريق النشاف المناعي و RT-PCR معا لتحليل تأثير عدوى HIV-1 على إجهاد ER وتنشيط الاستعراض الدوري الشامل في الخلايا التائية.

يتناول الجزء الثاني من هذه المقالة البروتوكولات المشاركة في فهم تأثير الاستعراض الدوري الشامل على تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1. تم العثور على طريقة النقل العكسي المستخدمة في ضربة قاضية لعلامات الاستعراض الدوري الشامل الموصوفة في هذه المقالة لإعطاء انخفاض كبير في التعبير عن علامات الاستعراض الدوري الشامل. كما هو مذكور في البروتوكول ، تم استخدام مضان GFP لتطبيع قراءة لوسيفيراز لمقايسة لوسيفيراز. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، يمكن أن تتأثر قراءة GFP أيضا بسبب نقل الجينات المحدد36، لذلك في هذه الحالة ، يمكن للمرء استخدام علامات الفلورسنت الأخرى مثل RFP أو YFP أو تركيز البروتين الكلي لتطبيع قراءة لوسيفيراز. أيضا ، في بعض الحالات التي يصعب فيها تحلل الخلايا ، مثل خلايا TZM-bl ، يمكن إضافة كاشف تحلل إضافي قبل إضافة ركيزة لوسيفيراز. كما هو موضح في النتائج ، فإن نتائج لوسيفيراز (الشكل 6 أ اللوحة اليسرى) تطابق مع نتائج p24 ELISA في حالة PERK (الشكل 6 ب اللوحة اليسرى) ، حيث تقلل ضربة قاضية PERK بشكل كبير من نشاط جين HIV-1 وإنتاج الفيروس. بينما في حالة HSPA5 ، لا تؤثر ضربة قاضية ل HSPA5 على نشاط الجينات الذي يحركه LTR (الشكل 6 أ اللوحة اليمنى) وفقا لنتائج فحص luciferase ، بينما يؤثر على إنتاج الفيروس وفقا ل p24 ELISA (الشكل 6 ب اللوحة اليمنى). وبهذه الطريقة ، تشير هذه النتائج إلى أن علامات الاستعراض الدوري الشامل المختلفة يمكن أن يكون لها تأثيرات مختلفة على نشاط الجينات المدفوعة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR وإنتاج الفيروس. يشير مستضد p24 الذي تم قياسه في المادة الطافية بواسطة ELISA بشكل أساسي إلى تركيز جزيئات الفيروس المنبعثة في طاف الثقافة. وهكذا ، استخدم الباحثون بشكل روتيني نتائج ELISA لالتقاط مستضد p24 كمؤشر غير مباشر لإنتاج الفيروس في طافية الخلية37. وبالتالي ، يمكن استخدام مقايسة luciferase في الخلايا و p24 ELISA للطافي معا لتحديد التأثير على نشاط الجينات المدفوع بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR وإنتاج الفيروس. أيضا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحليل تأثير علامات الاستعراض الدوري الشامل الأخرى على نشاط الجينات المدفوعة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 LTR وإنتاج الفيروس باستخدام shRNAs الخاصة بالجينات. بالنسبة لجميع تلك التجارب التي تتضمن قراءات لمقايسة p24 ELISA و luciferase ، من المهم التأكد من الحفاظ على التخفيفات المناسبة ووقت الحضانة وعدم مراعاة القيم التي تندرج تحت فئة القيم المتطرفة. على سبيل المثال ، أثناء القيام ب p24 ELISA ، OD450 تعتبر القيمة بين 0.1-2 مثالية. النهج الثاني للتحقيق في دور الاستعراض الدوري الشامل في تكرار فيروس العوز المناعي البشري -1 هو استخدام الجزيئات الدوائية مثل Thapsigargin ، وهو محفز الإجهاد ER أو TUDCA ، وهو مثبط الإجهاد ER. تستخدم هذه الأدوية بشكل شائع جدا لدراسة الاستعراض الدوري الشامل في سياقات مختلفة38,39,40,41. في هذه المقالة ، أظهرنا بروتوكول علاج Thapsigargin وقمنا بتحليل تأثيره على تطور عدوى HIV-1 في الخلايا التائية. قبل استخدام الدواء لأي تجربة ، يوصى بشدة باختبار صلاحية الخلية لمجموعة من الجرعات للدواء في خط الخلية المراد استخدامه. يجب تجنب التركيز الذي يعطي أقل من ~ 80٪ من صلاحية الخلية في خط الخلية المحدد. علاوة على ذلك ، بالنسبة لفحوصات صلاحية الخلية ، يجب دائما أخذ الخلايا السليمة ، لأن الخلايا التي تم إجهادها بالفعل لن تظهر القراءة المناسبة ، ويمكن أن يؤدي حطام الخلايا إلى حدوث تعكر وإعطاء قراءات خاطئة. يظهر البروتوكول المذكور في هذه الدراسة تأثير Thapsigargin على تكاثر الفيروس على مدار 72 ساعة بعد الإصابة ، مما يوفر فهما أفضل لتأثير الدواء على تكاثر الفيروس على مدار فترة زمنية. يمكن للمرء أيضا أن يستغرق فترات زمنية أقصر مثل 12 ساعة و 24 ساعة و 36 ساعة و 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة بعد الإصابة لإجراء مزيد من التحليل لأقرب نقطة زمنية يبدأ فيها الدواء في إظهار تأثيره على تكاثر الفيروس.

نظرا لأن الاستعراض الدوري الشامل يشارك أيضا في تدهور البروتين وديناميكيات الغشاء42,43 ، فمن الممكن أن يكون للاستعراض الدوري الشامل دور في إصابة الفيروسات. يمكن أيضا تحليل عدوى الفيروسات التي تنتجها الخلايا باستخدام البروتوكول المحدد. يمكن أيضا استخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه لتحديد تأثير عدوى HIV-1 على إجهاد ER و UPR وأهميتها الوظيفية في PBMCs البشرية لمزيد من الدراسات ذات الصلة بيولوجيا. يعد فهم وظيفة ER-UPR في عدوى فيروس العوز المناعي البشري -1 أمرا ضروريا بسبب الوعي المتزايد بمشاركته في تطوير العديد من الأمراض الخطيرة. ستضيف المعلومات التي تم الحصول عليها باستخدام هذه المجموعة من الأساليب إلى هذا المجال غير المكتشف من خلال تقديم فهم مهم للتفاعل بين فيروس نقص المناعة البشرية -1 والاستعراض الدوري الشامل.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نشكر المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند ، على الدعم الداخلي. AT و AD ممتنان للدكتوراه الدعم البحثي الذي تلقاه من المركز الوطني لعلوم الخلية ، قسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند. DM ممتنة لزمالة JC Bose الوطنية من SERB ، حكومة الهند.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكريلاميدبيوراد ، الولايات المتحدة الأمريكية1610107
AgaroseG-Biosciences ، الولايات المتحدة الأمريكيةRC1013
بيرسلفات الأمونيومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةA3678
الأجسام المضادة للأجسام المضادة ATF4تقنية إشارات الخلية ، الولايات المتحدة الأمريكية11815كشف اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
الأجسام المضادة ATF6Abcam ، المملكة المتحدةab122897كشف اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
الأجسام المضادة المضادةل CHOP تكنولوجيا إشارات الخلية ، الولايات المتحدةالأمريكية 2897الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
المضادة ل eIF2 & ألفا الأجسام المضادةسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة الأمريكيةsc-11386كشف اللطخة الغربية التخفيف -1: 2000 & nbsp ؛
الأجسام المضادة المضادة GADD34Abcam ، المملكة المتحدةab236516الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDHسانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية ، الولايات المتحدة الأمريكيةsc-32233كشف اللطخة الغربية التخفيف - 1: 3000   ؛
المضادة للأجسام المضادة HSPA5، الولايات المتحدة الأمريكية3177الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف - 1: 1000
تقنية إشارات الخلية المضادة للأجسام المضادة IRE1، الولايات المتحدة الأمريكية3294تخفيف الكشف عن اللطخة الغربية - 1: 2000
الجسم المضاد المترافق HRP المضاد للفأر   ؛Biorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1706516الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف - 1: 4000
anti-peIF2 & alpha الأجسام المضادةInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية44-728Gالكشف عن اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
تقنية إشارات الخلايا للأجسام المضادة المضادةل PERK ، الولايات المتحدة الأمريكية5683كشف اللطخة الغربية التخفيف -1: 2000
الأجسام المضادة المضادة ل pIRE1Abcam ، المملكة المتحدةab243665الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف -1: 1000
الأجسام المضادة المضادة ل pPERKInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةPA5-40294الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف -1: 2000
الأجسام المضادة المترافقة HRP المضادة للأرانبBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1706515الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف - 1: 4000
الأجسام المضادة المضادة ل XBP1Abcam ، المملكة المتحدةab37152الكشف عن اللطخة الغربية التخفيف - 1: 1000
مقعد الطرد المركزي عالي السرعةEppendorf ، الولايات المتحدة الأمريكية5804Rالدوار - F-45-30-11
مقعد أعلى جهاز طرد مركزي منخفض السرعةEppendorf ، الولايات المتحدة الأمريكية5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1610201
مصل الأبقار الألبومين (BSA)MP الطب الحيوي ، الولايات المتحدة الأمريكية160069
كاشف برادفوردBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية5000006
طقم تعداء الثديياتCalPhos Clontech ، Takara Bio ، الولايات المتحدة الأمريكية631312مخزون الفيروسات تحضير
CEM-GFPNIH ، AIDS REPOSITORY ، الولايات المتحدة الأمريكية3655
ركيزة Clarity ECLBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1705061الركيزة للكشف عن التلألؤ الكيميائي الركيزة
الركيزة Clarity max ECLBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1705062الركيزة للكشف عن التلألؤ الكيميائي
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرأوليمبوس ، اليابانالموديل: FV3000
جهاز الطرد المركزي CytospinThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةASHA78300003
DMEMInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية11995073
DMSOSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةD2650
dNTPsPromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةU1515
DTTInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكيةR0861
EDTAInvitrogen ، الولايات المتحدةالأمريكية 12635
EtBrInvitrogen ، الولايات المتحدةالأمريكية 15585011
مصل الأبقار الجنينيInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية16000044
G418Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية11811023
Glutaraldehyde 25٪Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةG6257مقايسة العدوى
GlycineThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةQ24755
HEK-293TNCCS ، الهند
HIV-1 استنساخ جزيئي معدي pNL4-3المعاهد الوطنية للصحة ، مستودع الإيدز ، الولايات المتحدة الأمريكية114
مجهر مقلوبنيكون ، اليابانالموديل: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1715124
Jurkat J6NCCS ، الهند
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةM8266العدوى فحص
MMLV-RT  Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية28025013
كاشف MTTSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةM5655مقايسة صلاحية الخلية
N ، N-dimethyl formamideFluka Chemika40255مقايسة العدوى
NaClThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكيةQ27605
NaFSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية201154
NP40Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية85124
التقاط مستضد P24 ELISAABL ، الولايات المتحدة الأمريكية5421
PageRuler سلم البروتين الملونمسبقا Sci-fiction Biologicals ، الهندPGPMT078
ParaformaldehydeSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP6148
pEGFP-N1Clontech ، الولايات المتحدة الأمريكية632515
البنسلين / StreptomycinInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية151140122
مثبط الفوسفاتيزسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية4906837001
فوسيون ماستر ميكس PCR عالي الدقة مع عازلة GCNEB ، الولايات المتحدة الأمريكيةM05532
pLKO.1-TRCAddgene ، الولايات المتحدة الأمريكية10878ناقلات استنساخ العدسات
pMD2.GAddgene ، الولايات المتحدة الأمريكية12259ناقلات مغلف VSV-G
PMSFSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP7626
بولي إيثيلينيميني (PEI)  Polysciences, Inc., USA23966
فيريسيانيد البوتاسيومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية244023مقايسة العدوى
فيروسيانيد البوتاسيومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةP3289مقايسة العدوى
مثبط أنزيم البروتينسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية & nbsp ؛5056489001
psPAX2Addgene ، الولايات المتحدة الأمريكية12260البلازميد التعبئة والتغليف الفيروسي
PuromycinSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP8833اختيار الخلايا المستقرة
غشاء PVDFBiorad ، الولايات المتحدة الأمريكية1620177
بادئات عشوائيةInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية48190011
RPMI 1640Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية22400105
SDSSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةL3771
Steady-Glo الركيزةPromega ، الولايات المتحدة الأمريكيةE2510Luciferase
assay T4 DNA ligaseInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15224017
TEMEDInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية17919
ThapsigarginSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةT9033
Thioflavin TSigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية596200
تريسثيرمو فيشر العلمي ، الولايات المتحدة الأمريكيةQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةT8787
TrizolInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15596018
Tween 20Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةP1379
TZM-blNIH ، مستودع الإيدز ، الولايات المتحدة الأمريكية8129
طرد مركزي فائقبيكمان Optima L90K ، الولايات المتحدة الأمريكية330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15520-018مقايسة العدوى
تكنولوجيا إشارات الخلايا مجموعة جهاز

المراجع

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

T P24
قياس إجهاد الشبكة الإندوبلازمية واستجابة البروتين المتكشف في الخلايا التائية المصابة بفيروس العوز المناعي البشري -1 وتحليل دورها في تكاثر فيروس العوز المناعي البشري -1
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.