مقالة منهجية

إنتاج دفعات ناقلات مرتبطة ب Adeno عالية الإنتاجية باستخدام خلايا تعليق HEK293

DOI:

10.3791/66532

⸱

أبريل 26, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على الخلايا HEK293 ، مما يؤدي إلى تقليل الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل باستخدام المكونات المتاحة لأغراض البحث من البائعين التجاريين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي (AAVs) هي أداة رائعة للتحقيق في الجهاز العصبي المركزي (CNS). قفيصات مبتكرة ، مثل AAV. PHP.eB ، تظهر نقيضا واسعا للجهاز العصبي المركزي عن طريق الحقن في الوريد في الفئران. لتحقيق نقل مماثل ، هناك حاجة إلى عيار أعلى بمقدار 100 ضعف (الحد الأدنى من 1 × 1011 نسخة جينوم / فأر) مقارنة بالحقن المباشر في حمة الجهاز العصبي المركزي. في مجموعتنا ، إنتاج AAV ، بما في ذلك AAV. يعتمد PHP.eB على خلايا HEK293T الملتصقة وطريقة النقل الثلاثي. إن تحقيق غلات عالية من AAV مع الخلايا الملتصقة يستلزم عملية كثيفة العمالة والمواد. دفع هذا القيد إلى تطوير بروتوكول لزراعة الخلايا القائمة على التعليق في الأنابيب المخروطية. تمت مقارنة AAVs المتولدة في الخلايا الملتصقة بطريقة إنتاج التعليق. تمت مقارنة الثقافة في التعليق باستخدام كواشف النقل Polyethylenimine أو TransIt. تم تنقية ناقلات AAV بواسطة الطرد المركزي الفائق التدرج اليوديكسانول متبوعا بتبادل المخزن المؤقت والتركيز باستخدام مرشح الطرد المركزي. باستخدام طريقة الالتصاق ، حققنا متوسط 2.6 × 1012 نسخة جينوم إجمالا (GC) ، في حين أن طريقة التعليق و Polyethylenimine أنتجت 7.7 × 1012 GC في المجموع ، وأسفرت TransIt عن 2.4 × 1013 GC في المجموع. لا يوجد فرق في كفاءة النقل في الجسم الحي بين النواقل المنتجة مع الالتصاق مقارنة بنظام خلية التعليق. باختصار ، تم تقديم بروتوكول إنتاج AAV قائم على خلية التعليق HEK293 ، مما أدى إلى تقليل مقدار الوقت والعمالة اللازمة لإنتاج النواقل مع تحقيق عوائد أعلى من 3 إلى 9 مرات باستخدام المكونات المتاحة من البائعين التجاريين لأغراض البحث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اكتشاف الفيروس المرتبط بالغدي (AAV) في عام 1965 ومنذ ذلك الحين تم استخدامه في عدد لا يحصى من التطبيقات1. تم تطبيق AAVs في أبحاث علم الأعصاب لدراسة الجينات والوظيفة العصبية ، أو رسم خرائط للدوائر العصبية ، أو إنتاج نماذج حيوانية للمرض2. تقليديا ، يتم ذلك عن طريق الحقن مباشرة في موقع الاهتمام ، لأن معظم الأنماط المصلية الطبيعية لا تعبر حاجز الدم في الدماغ أو تحتاج إلى جرعة عالية للقيام بذلك1،2،3.

مع اكتشاف AAV. PHP.B4 والجيل التالي من القفيصات مثل AAV. PHP.eB5 و AAV. CAP-B106 ، من الممكن استهداف الجهاز العصبي المركزي (CNS) باستخدام حقن جهازي بسيط. يكشف رسم الخرائط المكانية عن الخلايا التي تستهدفها AAV. PHP.eB على المستوى الخلوي 6,7. بالاقتران مع المروجين / المعززات المحددة ، توفر هذه القفيصات فرصا واسعة لعلماء الأعصاب لدراسة الجينات ووظائف المخ عن طريق توصيل AAV غير الغازية 4,8.

في حين أن هناك حاجة إلى جرعة أقل ل AAV. PHP.eB (عادة من 1 إلى 5 × 1011 نسخة جينوم (GC) / ماوس) مقارنة ب AAV9 (4 × 1012 GC / ماوس) 7 ، لا يزال يتعين إنتاج المزيد من المتجهات مقارنة باستراتيجيات الحقن المباشر (عادة 1 × 109 GC / μL حقن). يمكن إنتاج معظم الأنماط المصلية الطبيعية باستخدام نظام زراعة الخلايا الملتصقة الكلاسيكي بالاشتراك مع تنقية اليوديكسانول9،10،11،12. ل AAV. PHP.eB يستلزم هذا عملية كثيفة العمالة لزراعة الخلايا ونقلها للحصول على ناقلات كافية لتجربة واحدة8. لذلك ، تم تطوير إنتاج AAV في زراعة الخلايا المعلقة في الأنابيب المخروطية. الأنابيب المخروطية ، بسعة تصل إلى 300 مل ، مدمجة ، مما يوفر مساحة الحاضنة والبلاستيك. خلايا التعليق أسهل بكثير في الزراعة والتعامل بكميات كبيرة من الخلايا الملتصقة على ألواح 15 سم. تظل مكونات النقل في البروتوكول كما هي. لذلك ، يمكن بسهولة استخدام البلازميدات المستخدمة سابقا مع النظام الملتصق في هذا البروتوكول بناء على الإنتاج في الخلايا المعلقة. تم نقل البروتوكول بنجاح إلى باحثين آخرين في المختبر واستخدم بنجاح لمختلف القفيصات والتركيبات.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام التابعة للأكاديمية الملكية الهولندية للعلوم (KNAW) وكانت متوافقة مع القانون الهولندي بشأن التجارب على بموجب المشروع رقم AVD8010020199126. في الشكل 1 ، يتم توفير نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الكامل. من خلايا البذر إلى تنقية AAV ، يستغرق البروتوكول 6 أيام حتى يكتمل.

1. إعداد الكاشف

  1. تنقية البلازميد
    1. إجراء استخراج البلازميد كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة مع بعض التعديلات لضمان عقم البلازميدات.
    2. تحضير 70 ٪ من الإيثانول باستخدام الماء المقطر المعقم والإيثانول المطلق.
    3. بعد خطوة الطرد المركزي الأيزوبروبانول ، جفف البلازميدات في غطاء خزانة التدفق وأضف 70٪ إيثانول معقم إلى الأنابيب. بعد ترسيب الإيثانول ، جفف البلازميدات في غطاء خزانة التدفق وأعد تعليق البلازميد في الماء المقطر المعقم. احرص على استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة.
    4. خذ حصة للقياس الكمي ، وتحليل التقييد ، وإذا لزم الأمر ، التسلسل. ينصح بالتحقق من سلامة التكرارات الطرفية المقلوبة (ITR) لأن الطفرات يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على العائد. اضبط تركيز العينة على 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
  2. إعداد 10x المخزن المؤقت لتحلل توين
    1. قم بإذابة 30.3 جم من محلول Tris و 2.033 جم MgCl2.6H 2O في 400 مل من الماء المقطر المعقم ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 ، وقم بزيادة الحجم الكلي إلى 450 مل.
    2. حافظ على Tween 20 معقما ، وأضف 50 مل من Tween 20 إلى محلول المخزن المؤقت في غطاء المحرك ، وقم بتعقيم المرشح باستخدام مرشح تفريغ 0.2 ميكرومتر.
  3. تخفيفات يوديكسانول
    1. يتم توفير محلول يوديكسانول بتركيز 60٪. استخدم حل البدء لعمل حلول 15٪ و 25٪ و 40٪.
    2. بالنسبة لمحلول 15٪ ، قم بتخفيف 60 مل من محلول 60٪ مع 48 مل من 5 M NaCl و 48 مل من PBS-MK (5x PBS مع 5 mM MgCl2 و 12.5 mM KCl) ، وأضف الماء المقطر حتى 240 مل.
    3. بالنسبة لمحلول 25٪ ، قم بتخفيف 67 مل من محلول 60٪ و 32 مل من PBS-MK. أضف الماء المقطر حتى 160 مل. تخلط جيدا وتضاف 1.6 مل من محلول الفينول الأحمر.
    4. بالنسبة لمحلول 40٪ ، قم بتخفيف 160 مل من محلول 60٪ مع 48 مل من PBS-MK وأضف الماء المقطر حتى 240 مل. بالنسبة لمحلول 60٪ ، أضف 1 مل من الفينول الأحمر إلى 100 مل من محلول 60٪.
  4. برنامج تلفزيوني 5٪ محلول السكروز
    1. أضف 25 جم من السكروز إلى زجاجة سعة 500 مل من DPBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. رج العبوة جيدا وقم بالتصفية باستخدام مرشح تفريغ زجاجة 0.2 ميكرومتر.
  5. محلول البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000
    1. قم بإذابة 400 جم من PEG 8000 و 24 جم من كلوريد الصوديوم في ماء مقطر معقم واضبطه على الحجم النهائي البالغ 1000 مل. يقلب مع التدفئة حتى يذوب تماما. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام ورق الأس الهيدروجيني.
    2. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح تفريغ زجاجة 0.2 ميكرومتر للحصول على محلول PEG 8000 بنسبة 40٪. لاحظ أن الترشيح سيستغرق بعض الوقت بسبب لزوجة مخزن المحلول عند 4 درجات مئوية.

2. ثقافة خلايا التعليق HEK293

  1. استخدم مناديل مبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول للتنظيف. تنظيف غطاء السلامة الحيوية وإعداد وتنظيف جميع المواد اللازمة لزراعة الخلايا.
  2. سخن 30 مل من الخلية المعلقة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب زراعة مخروطي 50 مل. استرجع خلايا الإنتاج الفيروسي من النيتروجين السائل. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قبل إذابة القارورة تماما ، قم بتنظيفه بمنديل منقوع في 70٪ من الإيثانول ونقل القارورة إلى غطاء الأمان الحيوي.
    ملاحظة: يتم توفير تفاصيل خلايا الإنتاج الفيروسي المستخدمة هنا في جدول المواد.
  3. انقل الخلايا بسرعة إلى أنبوب الزراعة المخروطي سعة 50 مل المسخن مسبقا. خلايا استزراع في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية ، رطوبة 80٪ ، 8٪ CO2 ، 200 دورة في الدقيقة (RPM) ، وقطر اهتزاز 50 مم. خلايا المرور ، بمجرد أن تكون الصلاحية أعلى من 90٪ وكثافة الخلية أعلى من 1-3 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: الحاضنة المستخدمة لها قطر اهتزاز 50 مم ؛ يجب ضبط ظروف الاستزراع لقطر اهتزاز مختلف.
  4. خلايا المرور 3-4 أيام بعد ذوبان الجليد. فحص أنبوب (أنابيب) المزرعة للتأكد من عدم وجود علامات تلوث ؛ على سبيل المثال ، ستظهر الفطريات كحلقة متغيرة اللون (سوداء أو خضراء).
  5. قم بإعداد 400 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق 0.4٪ لكل عينة باستخدام شريط 1 مل.
  6. استرداد الخلايا المعلقة بسرعة من الحاضنة. استخراج 500 ميكرولتر على الفور من الأنبوب باستخدام شريط 1 مل. ماصة بلطف صعودا وهبوطا.
  7. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب التريبان الأزرق المحضر. اقلب الأنبوب برفق لخلطه ؛ لا تخلط الماصة ، لأن هذا سيؤدي إلى موت الخلايا. إعادة الخلايا إلى الحاضنة.
  8. خذ 50 ميكرولتر من تعليق الخلايا المعالجة باللون الأزرق المثقب وقم بتطبيقه على شريحة مقياس الدم. عد إجمالي الخلايا القابلة للحياة واحسب كمية تعليق الخلية والوسط اللازم للمرور أو النقل في اليوم التالي.
  9. وسط دافئ في الحاضنة لمدة 10-15 دقيقة. أضف تعليق الخلية إلى الوسط الدافئ والعودة إلى الحاضنة. لتمرير الخلايا لمدة 3 أيام (أي من الاثنين إلى الخميس) ، اضبط على 0.5 × 106 خلايا / مل ؛ لتمرير الخلايا لمدة 4 أيام (أي من الخميس إلى الاثنين) ، اضبط على 0.3 × 106 خلايا / مل.
    ملاحظة: وفقا للشركة المصنعة ، تتضاعف خلايا الإنتاج الفيروسي كل 26 ساعة ويجب أن تكون بين 3.5 × 106 و 5.5 × 106 قبل المرور. يمكن الاحتفاظ بالخلايا لمدة تصل إلى الممر 20.

3. النقل

  1. اليوم 1
    1. في 24 ساعة قبل النقل ، ثقافة 1 × 106 خلايا لكل / مل في 300 مل من الوسائط.
  2. اليوم 2
    1. وسط دافئ ، بلازميدات ، وكاشف نقل إلى درجة حرارة الغرفة. وللاطلاع على المبالغ التي يتعين إعدادها، انظر الجدول 1.
    2. لفترة وجيزة البلازميدات الدوامة والكواشف. أضف البلازميدات إلى الوسط المحضر ، دوامة. أضف كاشف النقل والدوامة لفترة وجيزة. لا تحرك الخليط بعد هذه الخطوة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. في غضون ذلك ، عد الخلايا المعدة في اليوم 1. يجب أن تكون الخلايا بين 2 و 2.5 × 106 خلايا لكل مل > 95٪ قابلة للحياة.
    4. بعد الحضانة ، بالتنقيط ، أضف خليط النقل إلى الخلايا أثناء تدوير الأنبوب برفق. احتضان لمدة 72-96 ساعة.

4. حصاد الخلايا

  1. اليوم 5
    1. أضف 33 مل من محلول تحلل الخلايا 10x (500 مللي متر Tris pH 8 ، 10٪ Tween 20 ، 20 mMMgCl 2) ، اخلطه بالرج برفق ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة مع الرج.
    2. جهاز طرد مركزي عند 3428 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. قم بالتصفية من خلال مرشح فراغ PES 0.45 ميكرومتر لتوضيح تحلل الخلية ، مع ترك المحللة الموضحة في حاوية الفلتر.
      ملاحظة: اختياري بعد الترشيح: خذ 50 ميكرولتر من العينة لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Q-PCR).
    3. أضف 90 مل من محلول PEG 8000 بنسبة 40٪ إلى 360 مل من محلول الخلايا المفلترة.
    4. نظف شريط التحريك بنسبة 70٪ إيثانول وأضفه إلى العينة. يقلب على الجليد أو في الغرفة الباردة عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة. احتضان على حرارة 4 درجة مئوية دون التقليب طوال الليل.
      ملاحظة: تم اختبار أوقات الحضانة من 1 ساعة إلى 72 ساعة. أوقات الحضانة الأطول لها تأثير سلبي على ترسيب البروتين الكلي.

5. تنقية يوديكسانول

  1. اليوم 6
    1. انقل عينة حجم الاستزراع المترسب PEG بالكامل إلى أنبوب مخروطي كبير نظيف وجهاز طرد مركزي عند 2820 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات PEG في 15 مل من DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. من الصعب إنعاش الحبيبات ؛ خذ الوقت الكافي للقيام بذلك بعناية.
    3. انقل الجزء المعاد تعليقه إلى أنبوب نظيف سعة 50 مل. سيبقى PEG على جانبي أنبوب المفاعل الحيوي. أضف 10 مل إضافية ، مع الحرص على جمع كل راسب PEG. انقل الكل إلى حاوية سعة 50 مل لحجم إجمالي يتراوح بين 25 و 30 مل.
    4. أضف 40 ميكرولتر من DNaseI (10 وحدة / ميكرولتر). ضعه في الحاضنة لمدة 1 ساعة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: اختياري بعد حضانة DNase: خذ 50 ميكرولتر من العينة ل Q-PCR.
    5. نظف قضبان التقليب التي تم استخدامها لترسيب PEG جيدا بمحلول كلوريد متبوعا ب 70٪ إيثانول. اترك قضبان التحريك في 70٪ إيثانول للتجربة التالية.
    6. املأ أنبوب بولي ألومر 25 مم × 89 مم باستخدام ماصة باستور زجاجية مع 15.5 مل من محللات الخلايا المركزة في كل أنبوب. بعد إضافة محللة الخلية ، استبدل ماصة باستور الزجاجية بأخرى جديدة.
    7. أضف محاليل اليوديكسانول من 15٪ -60٪: اغرس 9 مل من محلول اليوديكسانول 15٪ برفق تحت محلول الخلية. بعد ذلك ، أضف 5 مل من محاليل اليوديكسانول 25٪ و 40٪ ، وأخيرا ، أضف 5 مل من محلول اليوديكسانول 60٪.
    8. قم بإغلاق الأنبوب باستخدام حقنة مع DPBS +/+ لإزالة معظم فقاعات الهواء ، مع الحرص على عدم إزعاج طبقات اليوديكسانول. أغلق الأنبوب باستخدام غطاء أنبوب كهربائي.
    9. جهاز طرد مركزي في دوار غير متأرجح لمدة 1 ساعة و 10 دقائق عند 490000 × جم عند 16 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي فائق. قم بإزالته من أجهزة الطرد المركزي الفائقة ، وقم بتجميع الأنابيب في قفل معدني ، وقم بإعداد أنابيب التجميع. افتح الدوار في غطاء المحرك في حالة الانسكابات أثناء الدوران.
    10. قم بإعداد أنبوب واحد سعة 50 مل (للتخلص من الأنبوب الدوار) ، وأنبوب واحد سعة 15 مل (لتجميع الفيروسات) ، ومحقنة سعة 5 مل ، وإبرة 30 جم و 19 جم لكل تدرج.
    11. ثقب ثقب في الجزء العلوي من الأنبوب بإبرة 30G. اترك الإبرة في مكانها. ضع إبرة 19G على المحقنة.
    12. ثقب الأنبوب بعناية أسفل واجهة 40٪ / 60٪ مباشرة ، والتي يمكن رؤيتها بواسطة مؤشر الفينول الأحمر. تأكد من أن شطبة الإبرة تواجه طبقة 40٪.
    13. قم بإزالة إبرة 30G من أعلى الأنبوب باستخدام اليد غير المهيمنة. مع مشطوفة الإبرة ، استخرج الفيروس / اليوديكسانول ببطء. الهدف هو استخراج ما بين 3 مل و 4.5 مل. في منتصف الطريق تقريبا وفي الطبقة الشفافة 40٪ / ، قم بتدوير الإبرة حتى يصبح الشطبة متجهة لأسفل واستمر في الاستخراج لتجنب التجمع من طبقة البروتين.
    14. قم بإعداد أنبوب 50 مل باليد غير المهيمنة ، واستخرج الإبرة بعناية أثناء وضع الأنبوب في أنبوب 50 مل وتخلص منه. قم بتخفيف تعليق AAV / iodixanol 5x في DPBS عن طريق ملء ما يصل إلى 15 مل.
    15. نقل إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 3428 × ز ، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تجاهل التدفق من خلال ؛ قم بإزالة حامل الفلتر برفق وقم بقلب الحاوية السفلية في زجاجة نفايات. أضف 15 مل من السكروز PBS-5٪ للترشيح وإعادة التأهيل.
    16. أجهزة الطرد المركزي عند 3428 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. كرر تبادل المخزن المؤقت 3x على الأقل. تخزين الفيروس (~ 150-250 ميكرولتر) في 4 °C (PHP. المتغيرات B بحد أقصى 3 أشهر) أو القسمة إلى 50 ميكرولتر من القسمة وتخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل.
      ملاحظة: PHP. متغيرات قفيصة B حساسة للتجميد / الذوبان ، لذلك يجب تجنب ذلك.
    17. قم بإجراء المعايرة بالتحليل الحجمي كما هو موضح في البروتوكولالسابق 10.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم معظم المختبرات الأكاديمية خلايا HEK293T الملتصقة لإنتاج AAV 8,9. في حين أن هذا يعمل بشكل جيد نسبيا عندما تكون هناك حاجة إلى كميات صغيرة من AAV للحقن المباشر ، هناك حاجة إلى عيار أعلى 100 مرة (الحد الأدنى 1 ×10 11 GC / الماوس) لتحقيق نقل مماثل مع قفيصات جهازية مثل AAV. بي إتش بي إي بي.

في هذا البروتوكول ، تم إنشاء إنتاج AAV باستخدام خلايا تعليق HEK293 المزروعة في أنابيب مخروطية. يمكن إجراء الثقافات الصغيرة في أنابيب سعة 50 مل وعلى نطاق واسع في أنابيب سعة 600 مل. بالنسبة لهزازات محددة (انظر جدول المواد) ، يمكن استخدام رف يمكن فيه زراعة ما يصل إلى 16 أنبوبا كبيرا في وقت واحد. يستخدم هذا الرف مع إدخالات خاصة لأنابيب 50 مل (الشكل 2 أ). يوفر هذا النظام مكسبا كبيرا في الوقت المناسب لقطاع الاستزراع والنقل في هذا البروتوكول. تم الإعداد الأولي للإنتاج باستخدام تركيبات مراسلة للوسيفيراز وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) 10,11. في موازاة ذلك ، تم إنتاج بناء GFP في لوحات 12 ، 15 سم2 كما هو موضح في البروتوكولالمنشور سابقا 12. في المتوسط ، تم تحقيق عائد إجمالي قدره 7.7 × 1012 GC باستخدام polyethylenimine (PEI) و 2.4 × 1013 GC باستخدام TransIt (الشكل 2B). بالنسبة لجزيرة الأمير إدوارد ، يعد هذا تحسنا بمقدار 3 أضعاف تقريبا. بالنسبة إلى TransIt ، فهو تحسن بمقدار 9.2 أضعاف مقارنة بعيار تم الحصول عليه باستخدام ثقافة ملتصقة (2.6 × 1012). عند استخدامه لنقل الخلايا المعلقة ، يعطي TransIt تحسنا بمقدار 3 أضعاف تقريبا في المحصول مقارنة ب PEI (الشكل 2B).

بعد ذلك ، تم اختبار أداء ناقلات AAV في الجسم الحي. تم إنتاج متجهات GFP مع PEI و TransIt ومقارنتها بناقلات GFP المنتجة مع نظام الالتزام الكلاسيكي. في 4 أسابيع بعد الحقن ، تم التضحية بالفئران (6 أسابيع C57BL / 6 إناث الفئران التي تزن 20-25 جم) ، وتم تقييم تعبير GFP في أدمغة الفئران بواسطة الأنسجة (الشكل 3 أ). تم إجراء تحليل مقارن على أقسام الدماغ السهمي. لم يلاحظ أي اختلاف في نمط نقل الفيروس المنتج باستخدام طرق الإنتاج هذه (الشكل 3 ب). كما تم تقييم نشاط لوسيفيراز للنواقل المنتجة باستخدام أي من الطريقتين. تم قياس النقل في الجسم الحي لمدة 3 أسابيع. نمط التعبير بمرور الوقت متشابه بغض النظر عن كاشف النقل المستخدم (الشكل 4).

بعد ذلك ، تم اختبار البروتوكول وتنفيذه من قبل أعضاء آخرين في الفريق (الجدول 2). كان إنتاج القفيصات الأخرى مع PEI ناجحا ، مما أسفر عن متوسط عائد قدره 3.5 × 1012 GC متجهات. بالنسبة لإنتاج قفيصة B10 ، يمكن تحقيق تحسن بمقدار 3 أضعاف باستخدام TransIt مقابل PEI. بالنسبة لمشروع آخر ، أعطت العديد من التركيبات المعبأة في AAv.PHP.eB متوسط عائد قدره 3.7 × 1012 ، وهو ما يكفي لحقن 7 فئران عن طريق الوريد بجرعة 5 × 1011 GC لكل فأر. توضح هذه النتائج أنه يمكن استخدام البروتوكول بنجاح من قبل العديد من الباحثين لمختلف القفيصات وبناء مجموعات.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية للإنتاج. في اليوم الأول (D1) ، يتم زراعة الخلايا في أنابيب سعة 300 مل. في اليوم الثاني (D2) ، يتم نقل الخلايا مع البلازميدات ذات الصلة. في اليوم الخامس (D5) ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها باستخدام مخزن مؤقت لتحلل التوين 10x. بعد التحلل ، تتم إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، يتم ترشيح تحلل الخلية لإزالة البروتينات الكبيرة ، ويتم ترسيب فيروس AAV باستخدام البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000. في اليوم 6 (D6) ، يتم إجراء تنقية وتركيز اليوديكسانول. يتم التعامل مع تركيز PEG من اليوم السابق مع DNase وبعد ذلك يوضع من خلال تدرج اليوديكسانول. يتم بعد ذلك تحلية النواقل المنقاة وتركيزها باستخدام مرشح الطرد المركزي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد الحاضنة وعوائد AAV. (أ) تزرع خلايا الإنتاج الفيروسي في حاضنة اهتزازية قطرها اهتزاز ٥٠ سم. تم تجهيز هذه الحاضنة بلوحة محول لأنابيب 600 مل وإدخالات خاصة لأنابيب 50 مل التي ينتجها قسم الميكاترونكس. (ب) بعد الإعداد الأولي ، يقوم المراسل بالبناء باستخدام إما البولي إيثيلين (PEI ؛ إجمالي 7.7 × 1012 GC ، n = 5) أو TransIt (إجمالي 2.4 × 1013 GC ، n = 5) كطريقة نقل ومقارنتها بالعوائد المحققة باستخدام طريقة الالتصاق الكلاسيكية (إجمالي 2.6 × 1012 GC ، n = 5) كما هو موضح في Verhaagen et al.12. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: نمط تعبير GFP بعد التقييم في الجسم الحي . (أ) تصوير تخطيطي لبنية متجه AAV نموذجية تحتوي على محسن CMV الفوري المبكر للمروج في كل مكان ، ومروج β أكتين الدجاج ، وموقع متقبل لصق β-Globin للأرانب (CAG) متبوعا ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، وفيروس التهاب الكبد Woodchuck (WHV) العنصر التنظيمي لما بعد النسخ (WPRE) وذيل polyadenylation (pA)13. هنا ، تلقت إناث الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع (ن = 3) حقنة في وريد الذيل تحتوي على 5 × 1011 نسخة جينومية إجمالية (gc) / فأر. في 4 أسابيع بعد الحقن ، تم التضحية بالفئران ، وتم تحليل الأدمغة عن طريق الأنسجة. (ب) تصوير تمثيلي لنمط التنبيغ في المقاطع السهمية ، باستخدام خلايا HEK293T الملتصقة والخلايا المعلقة مع البولي إيثيلين (PEI) أو كاشف النقل العابر ، لوحظ نمط نقل مماثل بغض النظر عن طريقة الإنتاج المستخدمة. شريط المقياس = 1000 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نشاط لوسيفيراز مماثل بغض النظر عن طريقة النقل. (أ) تصوير تخطيطي للبنية المستخدمة التي تحتوي على المروج في كل مكان CMV محسن مبكر فوري ، ومروج β أكتين الدجاج ، وموقع متقبل لصق β-Globin (CAG) لوسيفيراز (LUC) مع علامة V5 وذيل متعدد الأدينيل لهرمون النمو البقري (BGHpA) ، تم حقن 5 × 1011 GC الإجمالي / الفأر (ن = 3) عبر الوريد الذيل ، نشاط لوسيفيراز في منطقة الجمجمة (محاط بدائرة باللون الأحمر ، في صورة المثال) حيث تم قياس صورة التوهج الحيوي أسبوعيا. (B) تم قياس نشاط التوهج الحيوي كوحدات تلألؤ نسبية (RLU) مصورة على أنها شريط أزرق لإنتاج جزيرة الأمير إدوارد وشريط بني للعبور. لم يلاحظ أي فرق كبير في نشاط لوسيفيراز في منطقة الدماغ المختارة بين المجموعات. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: معلمات النقل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: عوائد البروتوكول المنفذ. بروتوكول التعليق المستخدم من قبل باحثين آخرين لإنتاج AAV. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإدارة الجهازية ل AAV هي أداة قوية لنقل الجينات إلى الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، فإن إنتاج AAV هو عملية مكلفة وشاقة. باستخدام خلايا التعليق ، يتم تقليل العمالة والبلاستيك مقارنة بالثقافة الملتصقة HEK293T على ألواح 15 سم2 . علاوة على ذلك ، فإن الأنابيب المخروطية المنفذة هنا سهلة التعامل معها وتعظيم استخدام مساحة المختبر. تم إعداد البروتوكول من قبل اثنين من الباحثين وتم تطبيقه لاحقا من قبل آخرين في المختبر. أسفرت سلسلة من الإنتاجات التي قام بها ثلاثة باحثين مستقلين ، في المتوسط ، ما يكفي من النواقل لكل دفعة لحقن 6-7 فئران.

تم وصف استخدام خلايا التعليق HEK293 في وقت سابق13,14. ومع ذلك ، فإن خط خلية التعليق الموصوف غير متاح مجانا لأغراض البحث. هذا هو عنق الزجاجة للباحثين الأكاديميين عند تطبيق الأساليب الموصوفة. خط خلية التعليق الموصوف في هذا البروتوكول متاح مجانا لأغراض البحث. تم إجراء زراعة الخلايا المعلقة في أنابيب مخروطية بدلا من Erlenmeyer لتوفير المساحة والوقت. مع Erlenmeyer ، يمكن استزراع ما يصل إلى 4 إنتاجات في وقت واحد ، مقابل 12 إنتاجا باستخدام أنابيب مخروطية. يمكن نقل الأنابيب المخروطية مباشرة إلى أجهزة الطرد المركزي للحصاد.

أحد الاحتمالات البديلة لنظام زراعة الخلايا المعلقة هو نظام baculoviral . من مزايا نظام baculo أن هذه الخلايا والوسائط متاحة للجمهور ويمكن تطبيقها بسهولة. بالنسبة للأكاديميين ، تتوفر مستودعات مثل Addgene ، تحتوي على مكتبة كبيرة من بلازميدات نقل AAV الجاهزةللاستخدام 12. في حين أن هذه يمكن أن يكون لها أيضا محاذير ، مثل لوائح الاتصالات الدولية الخاطئة ، إلا أنها تعمل كمصدر جيد لتجارب التوصيل والتشغيل. تم اختيار الحفاظ على نظام إنتاج قائم على HEK293 حيث يمكن استخدام البلازميدات المتاحة مباشرة للإنتاج دون نقل البنية إلى الفيروس البقعي.

بالنسبة للنقل ، يعتبر البولي إيثيلين رخيصا نسبيا ، وبالتالي فهو كاشف النقل المفضل. كبديل ، تم تقييم طريقة نقل جديدة (TransIt) لزيادة إنتاجية النواقل. لوحظ تحسن ثلاثة أضعاف باستخدام نصف كمية البلازميدات. هذا يجعل TransIt كاشف نقل بديل مثير للاهتمام عند الحاجة إلى مخزونات أكبر. أحد القيود على ذلك هو التكلفة ، مما يجعلها أقل إثارة للاهتمام للدفعات الصغيرة.

باختصار ، هنا ، يتم تقديم بروتوكول يمكن استخدامه لإنتاج AAV عالي الإنتاجية في الخلايا المعلقة في بيئة معملية أكاديمية. يتم وصف الأدوات التي يمكن استخدامها في بيئة المختبر الأكاديمي لإنتاج AAV بعائد مرتفع.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقديم عينة مجانية من TransIT بواسطة Mirus للاختبار الأولي ، وبعد ذلك تم شراء الكاشف لمزيد من الاستخدام. ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة أخرى للإبلاغ عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنحة من صندوق أبحاث الأكاديمية الملكية الهولندية للفنون والعلوم (KNAW) ومنحة من Start2Cure (0-TI-01). نشكر ليشا كوب على مساهمتها ونصائحها في إعداد البروتوكول. تم إنشاء الأرقام باستخدام Biorender.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
39 مل ، أنبوب بولي بروبلين دائري سريع الغلق ، 25 × 89 مم - 50 بكسلبيكمان كولتر342414
محول 600 مل أنابيب مخروطية الشكل ، للدوار S-4x1000 ،   ؛5920701002eppendorf
16 مفاعلا حيويا سعة 600 ملInfors HT / TPP587633
أغطية محكمة الغلق بالهباء الجوي ، لدلاء مستديرة سعة 750 ملeppendorf5820747005
جهاز طرد مركزي 5920 RG ، 230 فولت ، 50-60 هرتز ، بما في ذلك الدوار S-4x1000 ، دلاء مستديرة ومحول 15 مل / 50 مل أنابيب مخروطيةeppendorf5948000315
الماء المقطرGibco15230147
DNase I مؤتلف ،Roche4716728001
DNase I المؤتلف الخالي منRoche4716728001
، الكالسيوم ، المغنيسيومGibco14040091
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومGibco14190144
Fisherbrand وحدات تصفية PES يمكن التخلص منها 0،2فيشرFB12566504
Fisherbrand وحدات تصفية PES القابل للتصرف 0،45FB12566505فيشر
لأنابيب استزراع 50 مل يناسب أيضا أنبوب الصقرInfors HT / TPP31362
حامل لأنبوب ثقافة الخلايا 600 ملInfors HT / TPP66129
حاضنة Minitron 50 ممInfors HT500043
LV-MAX الإنتاج متوسطجيبكوA3583401
N-Tray UniversalInfors HT / TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Transfection Grade خطي بولي إيثيلينيمين هيدروكلوريد (MW 40،000)Poly-sciences24765-100
محلول الفينول الأحمر   ؛سيجما ألدريتش72420100
بولي (إيثيلين جلايكول) 8000سيجما ألدريتش89510
ترانس آي تي فايروسجينميروسمير 6706
محلول تريبان بلو ، 0.4٪جيبكو5250061
تيوبسبين بيو-رياكتورز -50 ملTTP87050
TubeSpin Bioreactors-600 ملTTP87600
خلايا الإنتاج الفيروسيGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
تناسب لوحة محول RNase ، DPBS الخالي من RNase حامل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914(2022).
  2. Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483(2021).
  3. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  4. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  5. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
  6. Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
  7. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
  8. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
  9. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960(2019).
  10. Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
  11. Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
  12. Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
  13. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  14. Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AAV AAV

مقالات ذات صلة