مقالة منهجية

فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي

DOI:

10.3791/66543

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون شبكية العين من العديد من الخلايا التي تشكل دوائر عصبية متنوعة ، والتي تشكل المرحلة الأولى من المسار البصري. تتميز كل دائرة بميزات فريدة وناقلات عصبية متميزة ، تحدد دورها وأهميتها الوظيفية. بالنظر إلى أنواع الخلايا المعقدة داخل هيكلها ، فإن تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين يشكل تحديات للاستكشاف. للتحقيق بشكل أفضل في دوائر الشبكية والحديث المتبادل ، مثل الرابط بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي الدقيق (الناقلات العصبية أو الببتيدات العصبية) ، مثل وجود تفاعل مناعي يشبه المادة P في شبكية العين على الفأر ، استخدمنا طريقة المجهر الإلكتروني المناعي قبل التضمين (immuno-EM) لاستكشاف الروابط المشبكية والتنظيم. يمكننا هذا النهج من تحديد اتصالات متشابكة محددة بين الخلايا وتحديد الموقع الجزيئي الدقيق ويمكن أن يلعب دورا توجيهيا في استكشاف وظيفته. توضح هذه المقالة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك (1) إعداد تثبيت شبكية العين ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين تحديات للاستكشاف ، مع الأخذ في الاعتبار أنواع الخلايا المتنوعة داخل هيكلها 1,2. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الروابط المشبكية بين الخلايا المختلفة وتحديد التوطين الخلوي لناقلات عصبية معينة أو ببتيدات عصبية. مع تقدم البيولوجيا الجزيئية لإدخال بروتينات جديدة ، يصبح التوطين الدقيق في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائفها وتحليل دوائر الشبكية والوصلات المشبكية3،4،5.

نظرا للدقة المحدودة للفحص المجهري الضوئي ، يستخدم المجهر الإلكتروني (EM) بشكل شائع للكشف عن الهياكل تحت الخلوية للخلايا العصبية. يحتوي EM على تصنيفات مختلفة ، مع استخدام المجهر الإلكتروني التقليدي (TEM) لمراقبة الهياكل الفائقة للخلايا6،7،8،9. المجهر الإلكتروني المناعي (immuno-EM) ، الذي يجمع بين الدقة المكانية ل EM مع القدرة على التعرف الكيميائي للأجسام المضادة المرتبطة على وجه التحديد بالبروتينات10 ، يبرز كطريقة مثالية وحصرية للتحقيق في الاتصالات المشبكية وتوطين البروتين تحت الخلوي في شبكية العين11,12.

يمكن تقسيم تقنيات EM المناعية إلى طرق ما قبل التضمين وما بعد التضمين بناء على ترتيب التضمين وحضانة الأجسام المضادة. بالمقارنة مع طريقة ما بعد التضمين ، فإن نهج ما قبل التضمين قادر على تحديد13،14،15 على نطاق واسع وبعيد المدى ، مما يوفر نهجا مثاليا لدراسة عمليات الخلايا مثل المحاور العصبية والتشعبات. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إشارة قوية ومجال رؤية واسع ، مما يجعلها مفيدة للتحقيقات الشاملة للتعبير البروتيني والتوطين الجزيئي في السيتوبلازم. تثبت هذه الطريقة قيمتها بشكل خاص في ضمان الهياكل المحددة كيميائيا والتي تكون مرئية في جميع أنحاء السيتوبلازم أو الخلايا أو شبكية العين بأكملها.

ومع ذلك ، فإن طريقة ما بعد التضمين ، على الرغم من انخفاض الاختراق أو الانتشار مقارنة بطريقة التضمين المسبق ، ليست حساسة16,17. بعبارات بسيطة ، إذا كان الهدف هو استكشاف توطين ناقلات عصبية معينة في السيتوبلازم أو المحطات المشبكية ، فإن التضمين المسبق المناعي EM هو الطريقة المفضلة. على العكس من ذلك ، لتحديد توطين مستقبلات الغشاء ، يوصى باستخدام EM المناعي بعد التضمين.

بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، نختار طريقة التضمين المسبق المناعي الكهرومغناطيسي للتعمق في دوائر الشبكية ، بما في ذلك التفاعل بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي ، مثل التوزيع والتنظيم المشبكي للمادة P-LIKE IMMUNOACTIVITY (SP-IR) في شبكية الفأر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على رعاية والتعامل معها من قبل لائحة لجنة الأخلاقيات بجامعة ونتشو الطبية وفقا لإرشادات ARVO. تم استخدام الفئران البالغة (C57BL / 6J ، ذكورا وإناثا ، من 8 إلى 12 أسبوعا من العمر) في هذا البحث. يتم سرد المعدات والكواشف اللازمة للدراسة في جدول المواد.

1. التحضير لتثبيت الشبكية

  1. قم بتجميع المواد والأدوات التالية: مجهر تشريح ، وملقطان بأطراف دقيقة جدا ، ومقص ، وإبرة حقنة سعة 1 مل (حجم الإبرة: G26) ، وورق ترشيح.
  2. تخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2،2،2-ثلاثي برومو إيثانول عند 0.25 ملغ / غرام من وزن الجسم. بعد ذلك ، قطع رأس الفئران وقطع رؤوسهم16.
  3. قم باستئصال عيونهم بمقص الكوع ووضعها في طبق زجاجي يحتوي على 4٪ بارافورمالدهايد -0.2٪ حمض البكريك في 0.1 M فوسفات عازلة (PB ؛ درجة الحموضة 7.4).
  4. تحت المجهر التشريحي ، قم بعمل ثقب في طرف القرنية باستخدام إبرة حقنة سعة 1 مل وقطع الجزء الأمامي بالمقص ، بعد الثقب. ثم قم بإزالة العدسة من سطح الشبكية الداخلي بالملقط.
  5. استخدم ملقطين لتقشير الصلبة بعناية حتى يتم عزل الشبكية تماما عن فنجان العين (نسيج الشبكية الكوب المنفصل عن المشيمية تماما). في وقت لاحق ، قطع شبكية العين إلى أربع قطع.
  6. ثبت هذه المقاطع في 4٪ بارافورمالدهايد -0.2٪ حمض البكريك في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم انقل الأنسجة إلى 4٪ بارافورمالدهيد في 0.1 M PB (درجة الحموضة 10.4) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. التضمين المسبق للمناعة

  1. بعد الغسيل في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، احتضان أنسجة الشبكية في 1٪ بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4) في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة.
  2. اغسل أقسام الشبكية في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات على الأقل. في هذه الأثناء ، قم بإزالة الجسم الزجاجي بورق الترشيح ثم قطع شبكية العين إلى شرائح صغيرة تتراوح بين 100-300 ميكرومتر باستخدام شفرة حلاقة ذات حدين.
  3. بعد الحجب باستخدام مصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪ (NGS) في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعة واحدة في RT ، احتضان شرائح الشبكية بالأجسام المضادة الأولية (Anti-rabbit PKCα، 1:80; Anti-Rabbit SP ، 1: 100) جنبا إلى جنب مع 2٪ NGS في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة 2 ساعة في RT على شاكر. بعد ذلك ، احتضان لمدة 96 ساعة (5 أيام) عند 4 درجات مئوية على شاكر.
  4. بعد الغسيل ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ، احتضان شرائح الشبكية بالجسم المضاد الثانوي عند 1: 200 ، مثل الماعز المضاد للأرانب IgG ، جنبا إلى جنب مع 2٪ NGS في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة ساعتين في RT على شاكر. بعد ذلك ، احتضان لمدة 48 ساعة (2 أيام) عند 4 درجات مئوية على شاكر.
    ملاحظة: تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية وحدها في تجارب التحكم.
  5. اغسل خطوط الشبكية في 0.01 M PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها قبل الحضانة بالكاشف A والكاشف B من مجموعة ABC في 1: 100 في 0.01M PBS (درجة الحموضة 7.4) لمدة يومين عند 4 درجات مئوية. (تم تخفيف كل من الكاشف A والكاشف B ب 0.01 M PBS. على سبيل المثال: الحل: 6 ميكرولتر ؛ محلول ب: 6 ميكرولتر ؛ 0.01 م PBS: 588 ميكرولتر ، إجمالي 600 ميكرولتر).
  6. اغسل خطوط الشبكية في محلول 0.05 متر Tris (درجة الحموضة 7.2) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك ، قم باحتضان خطوط الشبكية مسبقا باستخدام كاشف 5٪ 1 وكاشف 5٪ 3 من مجموعة DAB في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. (النسبة على سبيل المثال: الكاشف 1: 50 ميكرولتر ؛ الكاشف 3: 50 ميكرولتر ؛ الماء المقطر: 900 ميكرولتر ، إجمالي 1000 ميكرولتر).
  7. تلطيخ خطوط الشبكية مع DAB. أضف نفس حجم المحلول من ثلاثة أنابيب في مجموعة DAB بالتسلسل (الكاشف 1-الكاشف 2-الكاشف 3). مراقبة حالة تلطيخ باستخدام المجهر تشريح. وقف تلطيخ عندما تصبح الخلايا بنية. تستغرق هذه العملية 10-20 دقيقة.
  8. اغسل خطوط الشبكية بمحلول 0.05 متر تريس (درجة الحموضة 7.2) ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ثم اغسلها في 0.01 متر PBS ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.

3. التثبيت والتضمين

  1. ثبت خطوط الشبكية في 2٪ جلوتارالدهيد لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، ثم اغسلها في 0.01 متر PBS (درجة الحموضة 7.4) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها.
  2. احتضان خطوط الشبكية مع 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) في 0.1 M PB لمدة 1 ساعة في RT واحتفظ بها في مكان مظلم.
  3. بعد الغسيل في الماء المقطر (ddH2O) ست مرات لمدة 10 دقائق لكل منها ، احتضان أنسجة الشبكية مع أسيتات اليورانيل لمدة 1 ساعة في RT واحتفظ بها في مكان مظلم لتلطيخ هذه الأنسجة.
  4. ضع أنسجة الشبكية في محاليل الأسيتون (50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، و 90٪) لمدة 10 دقائق لكل منها ، ثم في 100٪ مرتين لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  5. اغمس أنسجة الشبكية في خليط يحتوي على نفس الحجم من أسيتات اليورانيل وراتنجات الإيبوكسي لمدة ساعة واحدة عند فرن تجفيف 37 درجة مئوية ، متبوعا بخليط يحتوي على أسيتات اليورانيل والراتنج (1: 4) طوال الليل عند فرن تجفيف 37 درجة مئوية.
  6. انقل أنسجة الشبكية برفق باستخدام عود أسنان إلى الراتنج الجديد لمدة 1 ساعة عند 45 درجة مئوية في فرن تجفيف ، ثم يتم تضمين شريط الشبكية الموجه في لوحة التضمين مع الراتنج.
  7. ضع العينة في فرن تجفيف 45 درجة مئوية لمدة 3 ساعات وفرن تجفيف 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  8. قم بتشكيل كتل التضمين في شبه منحرف وقطع الكتلة إلى أقسام بسمك 1 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم فائق ، وقم بتلطيخ هذه الأقسام باللون الأزرق التولويدين ، ومناطق الفحص المسبق ذات الأهمية تحت المجهر الضوئي.
  9. اجمع المقاطع فائقة النحافة (70-90 نانومتر) على شبكات نحاسية واعرضها تحت المجهر الإلكتروني.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 1 أمثلة على تجارب التحكم دون احتضان الأجسام المضادة الأولية ضد بروتين كيناز C alpha (PKCα) أو SP ، حيث لم يتم العثور على نشاط مناعي (IR).

يوضح الشكل 2 PKCα-IR في شبكية الفأر. يعمل PKCα كعلامة لجميع الخلايا ثنائية القطب (RBC) في شبكية العين18. على مستوى المجهر الإلكتروني (EM) ، يمكن تحديد كرات الدم الحمراء من خلال PKCα-IR ، والتي يتم تصورها بواسطة منتج تفاعل ديامينوبنزيدين (DAB) بكثافة إلكترون عالية. يوضح الشكل 2 أ تغصنات RBC إيجابية PKCα تشكل مشبك عصبي مع طرف قضيب في الطبقة الضفيرية الخارجية (OPL) ، بينما يوضح الشكل 2B مشبك مخروطي RBC حيث تكون الزوائد الشجيرية RBC الموجبة PKCα بعد مشبكي إلى طرف مخروطي. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد منتج تفاعل DAB في تحديد أطراف كرات الدم الحمراء (الشكل 2C) والعمليات المحورية (الشكل 2D) في الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL).

يعرض الشكل 3 التعبير عن المادة P (SP) في كل من الوصلات قبل وبعد المشبكي في IPL لشبكية الفأر. خلايا الأمكرين SP-IR هي خلايا أماكرين قبل المشبكية إلى خلايا أماكرين سالبة SP (الشكل 3 أ) بالإضافة إلى عمليات أماكرين SP-IR (البيانات غير معروضة). علاوة على ذلك ، فإن خلايا الأمكرين SP-IR هي ما بعد المشبكي إلى الطرفات ثنائية القطب في مستويات الطبقة الفرعية 3 (S3) والطبقة الفرعية 5 (S5) من IPL ، على التوالي (الشكل 3B ، C). يوضح بحثنا السابق تحليل نقاط الاشتباك العصبي حيث تشكل عمليات خلايا الأماكرين SP-IR مخرجات متشابكة على عمليات أخرى في IPL19. والجدير بالذكر أن التوطين تحت الخلوي ل SP يوجد في الغالب في الحويصلات المشبكية في المحطات قبل المشبكية (الشكل 3).

figure-results-1
الشكل 1: الصور المجهرية الإلكترونية المناعية المأخوذة من تجارب التحكم. لم يظهر كل من عنيق المخروط (CP) مع شريطين (رأس السهم) (A) وقضيب كروي (RS) مع شريط واحد في OPL (B) أي تلطيخ. قضبان المقياس: 500 نانومتر (أ) ، 200 نانومتر (ب). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور مجهرية إلكترونية مناعية موصوفة بالجسم المضاد PKCα في شبكية الفأر. (A) يتصل RS ب RBC واحد إيجابي PKCα (تشير الأسهم إلى النشاط المناعي) وخليتين أفقيتين (H) في OPL. (B) يتصل CP مع كرات الدم الحمراء الإيجابية PKCα في OPL. (C) و (D) يظهران طرف كرات الدم الحمراء الإيجابي PKCα والعملية المحورية في IPL ، على التوالي. قضبان المقياس: 200 نانومتر (A) ، 500 نانومتر (B) ، 500 نانومتر (C) ، 500 نانومتر (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الصور المجهرية الإلكترونية المناعية المشار إليها بالجسم المضاد SP في IPL لشبكية الفأر. (A) خلية الأماكرين SP-IR (A +) هي خلية أماكرين قبل المشبكي لخلية أماكرين سالبة SP (A-). تلقت خلايا الأمكرين SP-IR مدخلات من المحطات ثنائية القطب في مستويات S3 (B) و S5 (C) من IPL ، على التوالي. قضبان المقياس: 200 نانومتر (أ) ، 200 نانومتر (ب) ، 200 نانومتر (ج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت هذه المقالة ثلاث خطوات حاسمة للمراقبة الناجحة للدوائر المشبكية وتوطين البروتين: (1) التثبيت السريع والضعيف ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.

نقترح أن التثبيت هو الخطوة الأساسية لنهج EM المناعي المقبول الناجح. وبالتالي ، يتم التأكيد هنا على أهمية التثبيت الجديد والتثبيت السريع ، وتسمية هذا المبدأ ب "مبدأ 4F" ، وهو أمر بالغ الأهمية في تحضير الأنسجة. ومع ذلك ، فإن تحقيق كل من اختراق الأجسام المضادة المعزز والتثبيت الفعال يشكل تحديا20. لمعالجة هذا ، تم استبدال الجلوتارالدهيد بحمض البكريك أثناء التثبيت الأولي لتحسين تغلغل الأجسام المضادة ، حيث يمكن أن يعطل الجلوتارالدهيد محددات المستضدات ويؤثر على التلوين المناعي21. في المقابل ، يحافظ حمض البكريك بشكل أفضل على بنية الغشاء وسلامة الأنسجة22 ، وإن كان ذلك مع حل وسط في فعالية التثبيت. في الخطوة الثالثة ، تم استخدام 2٪ جلوتارالدهيد للتثبيت اللاحق لتحسين تثبيت الأنسجة.

تتضمن النقاط الرئيسية للبروتوكول المقدم هنا خمس خطوات: (1) التثبيت المبكر: استخدام حمض البكريك في المرحلة المبكرة لتحسين اختراق الأجسام المضادة مع تقليل تعطيل محددات المستضد. (2) بعد التثبيت: استخدام 2٪ جلوتارالدهيد لتعزيز تثبيت الأنسجة بعد التلوين المناعي. (3) علاج التخفيض: احتضان الأنسجة في 1٪ NaBH4 في 0.1 M PB (درجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة لاستعادة الكثير من النشاط المناعي وتحسين التفاعل المناعي للمستضدات والأجسام المضادة ، وتكثيف الإشارات الإيجابية23. (4) تحضير الأنسجة: إزالة أنسجة الشبكية الزجاجية وقطعها إلى شرائح صغيرة لتسهيل حضانة الأجسام المضادة الفعالة وضمان إشارات موحدة. (5) علاوة على ذلك ، من الضروري التعامل مع أنسجة الشبكية بعناية فائقة ، وتجنب أي ضرر يمكن أن يضر بالملاحظات اللاحقة طوال الإجراء بأكمله. تساهم هذه التدابير بشكل جماعي في نجاح طريقة EM المناعية قبل التضمين ، مما يسمح للمرء بدراسة جوانب متنوعة مثل نقاط الاشتباك العصبي المخروطيةRBC 24 ، والتوطين الجزيئي SP-IR19 ، والتعبير الدقيق عن α-Syn في شبكية الفأر25.

قبل احتضان الجسم المضاد الأول ، من الضروري سد شرائط الشبكية بنسبة 2٪ NGS للقضاء على تداخل الإشارة غير المحدد. يجب تحديد تركيز الجسم المضاد الأول بناء على الجسم المضاد نفسه ، وعادة ما يكون أعلى من ذلك المستخدم في تلطيخ القسم المجمد ، ويجب تحسينه مسبقا. خلال فترة حضانة الأجسام المضادة الأولية ، يعد الدوران المستمر لأنبوب الطرد المركزي الدقيق ضروريا لضمان الاتصال الكامل لشرائط الشبكية المكدسة بالجسم المضاد ، مما يمنع الاختراق غير الكامل للأجزاء المكدسة. لتضخيم الإشارة ، تم تحضين DAB مسبقا قبل تلطيخ DAB القياسي ، مع وقت التلوين المحدد الذي يتراوح عادة من 10-20 دقيقة. إذا كان الوقت قصيرا جدا ، فقد تكون الإشارة ضعيفة جدا بحيث لا يمكن مراقبتها ، وإذا كانت طويلة جدا ، فقد تؤدي إلى إشارات إيجابية خاطئة ، مما يؤثر على الحكم الدقيق. بشكل عام ، يعتمد وقت حضانة الأصباغ بشكل مباشر على لون سطح الأنسجة (البني إلى البني الداكن).

بينما أجريت التجارب على الأنسجة المتجمدة في النيتروجين السائل لتعزيز الإشارة ، كما ذكرنا سابقا18،26،27 ، قامت هذه الطريقة بتضخيم الإشارات الإيجابية ولكنها أدت إلى ضعف بنية الغشاء لخلايا الشبكية (البيانات غير معروضة). جعل هذا التدهور الهيكلي من الصعب تحديد أنواع الخلايا بدقة. بالنظر إلى ذلك ، لم يتم تجميد أنسجة الشبكية بشكل متكرر. لتعزيز الإشارة الإيجابية ، تم تمديد وقت حضانة الأجسام المضادة بشكل مناسب. يجمع البروتوكول المقترح بين المزايا السابقة ، ويبسط الخطوات مقارنة بتضمين أجار. هذا لا يحمي فقط المحددات المستضدية للبروتينات ولكن أيضا يحافظ على سلامة أغشية الخلايا. الهدف الشامل هو استكشاف الاتصالات المشبكية والتوطين الخلوي للناقلات العصبية في جميع أنحاء المسار بأكمله. لذلك ، لم تخضع منتجات تفاعل DAB في البروتوكول لعلاج تكثيف الفضة ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتحقيق في الوصلات والمسارات المشبكية الخاصة بالناقل العصبي28.

حاليا ، هناك طرق محدودة لتحديد المواد الكيميائية للمسارات أو الناقلات العصبية على مستوى البنية الفائقة. إحدى هذه الطرق هي المجهر الضوئي والإلكتروني المرتبط (CLEM)29,30 ، والذي ، مع ذلك ، يقتصر على منطقة صغيرة جدا ويفتقر إلى القدرة على تحديد الاتصالات في جميع أنحاء المسار بأكمله. تكمن نقاط القوة في التضمين المسبق المناعي الكهرومغناطيسي في إشارته القوية ونطاقه الواسع وقدرته على تحديد المواقع التحليلية لمسافات طويلة وتتبع13،14،15. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها أيضا حدودها ، مثل الإشارات المنتشرة ، مما يجعلها أقل تحديدا. من أجل التوطين الدقيق لمستقبلات الغشاء ، خاصة تلك الموجودة على الغشاء ، قد يكون من الأنسب استخدام EM المناعي بعد التضمين. تتيح هذه التقنية العد المباشر لجزيئات الذهب ، مما يسهل تحليل عدد وتنوع مستقبلات الغشاءهذه 16.

في المستقبل ، فإن دمج EM المناعي المسبق مع حجم EM يبشر بالخير كطريقة فعالة لاستكشاف الدوائر العصبية المحددة على المدى الطويل ، مما يمثل المنظورات المستقبلية لمزيد من التطوير لهذه الطريقة. يركز المجلد EM على إعادة بناء الهيكل ، بالاعتماد على التشكل لتحديد هياكل محددة ، ويفتقر إلى التحديد الكيميائي الدقيق31,32. من خلال الجمع بين التضمين المسبق المناعي الكهرومغناطيسي مع حجم EM ، يمكن تحديد هياكل أو مواد محددة أثناء إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، مما يوفر نهجا أكثر شمولا وبديهيا بصريا لتحديد الدوائر العصبية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل إبرة حقنةكانغديلاي
1٪ OsO4< / sub>المجهر الإلكتروني19100
2،2،2-TribromoethanolSigma-AldrichT48402
8٪ علم المجهر الإلكتروني الجلوتارالديهايد16020
علم المجهر الإلكترونيبارافورمالديهايد157-8
علم المجهر الإلكترونيالأسيتون10000
مضاد للأرانب PKCSigma-AldrichP4334
مضاد للأرانب SPAbcamab67006
DAB مجموعة الركيزةMXB التقنيات الحيويةKIT-9701/9702/9703
مقص الكوعSuzhou66 شركة الرؤية54010
المجهر الإلكترونيفيليبسCM120
راتنج إيبونعلم المجهر الإلكتروني14910
ملقطSuzhou66 شركة الرؤيةS101A
Millipore ورق الترشيحMerck Millipore PR05538
Na2HPO4· 12H2OSigma71650مكون من عازلة الفوسفات
NaH2PO4· H2OSigma71507مكون من عازلة الفوسفات
حمض البيكريكعلم المجهر الإلكتروني19550
بوروهيدريد الصوديوم (NaBH4) Sigma215511
TrisSolarbio917R071
UltramicrotomeLeica
Uranyl أسيتاتعلم المجهر الإلكتروني22400
مجموعة VACTASTAIN ABC ، مختبرات البيروكسيداز (Rabbit IgG)مختبرات ناقلاتPK-4001
علوم 8٪

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
  2. Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
  3. Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
  4. Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
  5. Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
  6. Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
  7. Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
  8. Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
  9. Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
  10. Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
  13. Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
  14. Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
  15. Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
  16. Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
  17. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
  18. Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
  19. Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
  20. van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
  21. Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
  22. Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
  23. Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
  24. Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
  25. Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
  26. Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
  27. Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
  28. Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
  29. Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
  30. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
  31. Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
  32. Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Retinal CircuitsImmunoelectron MicroscopyMolecular LocalizationSynaptic ConnectionsPre Embedding ImmunostainingRetinal Neuronal CircuitsSubstance P ImmunoreactivityRod Bipolar CellsOuter Plexiform LayerDAB Staining

مقالات ذات صلة