مقالة منهجية

الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لرئة الفأر المزروعة

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

أبريل 19, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الرئة اليسرى للفأر المزروع باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. يمثل هذا أداة قيمة لدراسة الديناميات الخلوية والتفاعلات في الوقت الفعلي بعد زرع رئة الفئران.

الملخص

ترتبط المضاعفات بعد زراعة الرئة إلى حد كبير باستجابة الجهاز المناعي المضيف للطعم. يتم تنظيم هذه الاستجابات المناعية عن طريق الحديث المتبادل بين الخلايا المانحة والمتلقية. يعتمد الفهم الأفضل لهذه العمليات على استخدام النماذج الحيوانية قبل السريرية ويساعده القدرة على دراسة الاتجار بالخلايا المناعية داخل الكسب غير المشروع في الوقت الفعلي. يمكن استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لتصوير الأنسجة والأعضاء لأعماق تصل إلى عدة مئات من الميكرونات مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يوفر ميزة كبيرة على الفحص المجهري أحادي الفوتون. يسمح الاستخدام الانتقائي للفئران المعدلة وراثيا مع تعبير البروتين الفلوري الخاص بالمروج و / أو النقل بالتبني للخلايا الفلورية ذات العلامات الصبغية أثناء الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم بالدراسة الديناميكية للخلايا المفردة داخل بيئتها الفسيولوجية. طورت مجموعتنا تقنية لتثبيت رئتي الفأر ، مما مكننا من تصوير الديناميكيات الخلوية في الرئتين الساذجة والطعوم الرئوية المزروعة بشكل متعامد. تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم مفصل للسلوك الخلوي داخل الأوعية الدموية وفي الخلالي ، وكذلك لفحص التفاعلات بين مجموعات الخلايا المختلفة. يمكن تعلم هذا الإجراء وتكييفه بسهولة لدراسة آليات المناعة التي تنظم الاستجابات الالتهابية والتحمل بعد زرع الرئة. ويمكن أيضا توسيعه لدراسة الحالات الرئوية المسببة للأمراض الأخرى.

المقدمة

زرع الرئة هو الخيار النهائي للعديد من المرضى الذين يعانون من مرض رئوي في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل بعد زرع الرئة ضعيف مقارنة بعمليات زرع الأعضاء الصلبة الأخرى. البقاء على قيد الحياة في 5 سنوات هو فقط ~ 60٪ -70٪ 1 ، مقارنة ب 80٪ -90٪ في القلوب2 و 85٪ -90٪ في الكلى3. العديد من المضاعفات بعد زرع الرئة ، مثل خلل الكسب غير المشروع الأولي ، والرفض بوساطة الأجسام المضادة ، وخلل الطعم الخيفي الرئوي المزمن ، ترجع إلى الاستجابة المناعية للمضيف للطعم الخيفي. على سبيل المثال ، أظهرت مجموعتنا أن العدلات يتم تجنيدها بسرعة في الطعم الخيفي الرئوي بعد إصابة نقص التروية الناجم عن الزرع وتشكل مجموعات ديناميكية تحيط بوحيدات الدم4. الحديث المتبادل بين الخلايا المانحة والمتلقية مسؤول عن استجابات المناعة الخيفية الضارة5،6،7 ، والقدرة على دراسة هذه التفاعلات الخلوية الديناميكية في نموذج حيواني حي لا تقدر بثمن.

يسمح الفحص المجهري ثنائي الفوتون بالتصوير داخل الجسم عالي الدقة لأعماق تصل إلى عدة مئات من الميكرونات مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي للأنسجة 8,9. يتم استخدامه في مجموعة متنوعة من الأنسجة والمواقع التشريحية ، بما في ذلك القشرة المخية الحديثة10،11 ، والجلد12،13 ، والكلى14،15. في الآونة الأخيرة ، تم تكييفه مع الأعضاء غير الثابتة مثل الرئة والقلب4،16،17. في هذا البروتوكول ، نصف تقنية لتصوير الطعوم الرئوية المستقرة والتهوية والمثقوبة بعد زرع الرئة اليسرى لتقويم الفئران. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لنموذج الزرع في القدرة على التلاعب الوراثي بالمتبرع والمتلقي بشكل منفصل. يمكن تصور مجموعات الخلايا الفردية باستخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا مع تعبير البروتين الفلوري غير المباشر ، أو النقل بالتبني للخلايا ذات العلامات الفلورية5 ، أو الحقن الوريدي للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لربط العلامات الخاصة بالخلية4،16،17،18.

من أجل تثبيت الرئة أثناء التصوير ، يتضمن هذا البروتوكول لصق الرئة بغطاء زجاجي ، بينما وصفت مجموعات أخرى تثبيت الشفط باستخدام جهاز تفريغ قابل للانعكاس مصنوع خصيصا19. يتميز بروتوكولنا بالعديد من المزايا ، بما في ذلك مساحة أكبر من التصوير وسهولة الإعداد النسبية باستخدام المواد المتاحة بشكل شائع في مختبر الفحص المجهري (بما في ذلك غطاء الزجاج والغراء). نظرا لأن تقنية الإلتصاق هذه تقيد الرئة على السطح العلوي ، فمن المتوقع أن تقلل من حركة التهوية وتسمح بتصوير أعمق. تسمح تقنية التصوير داخل الجسم هذه بمراقبة مفصلة لسلوك الخلايا المناعية وتفاعلاتها في الوقت الفعلي ، مما يساهم في دراسة آليات المناعة التي تنظم الاستجابات الالتهابية مقابل الاستجابات المتسامحة بعد زرع الرئة.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات التعامل مع وفقا للمعاهد الوطنية للرعاية الصحية واستخدام إرشادات المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية الطب بجامعة واشنطن.

1. التخدير والتنبيب

ملاحظة: يتم إجراء عملية زرع الرئة اليسرى للفأر التقويمي ، كما هو موضح سابقا20,21. يتم زرع الرئتين من 20-25 جم C57BL / 6 (B6) الفئران في متلقي B6 المتطابقين مع الجنس والعمر. ب6. تستخدم الفئران المراسلة LysM-GFP كمتلقين لتجارب مختارة لتصور تسلل العدلات إلى ترقيع الرئة. يمكن تصوير الفئران المتلقية مباشرة بعد عملية زرع الرئة.

  1. إعادة تخدير الفئران مع إعطاء الكيتامين داخل الصفاق (80-100 ملغم / كغم) والزيلازين (8-10 ملغم / كغم). يتم تطبيق البوبرينورفين المستدام الإطلاق (0.5-1.0 ملغ/كغ) تحت الجلد لمزيد من السيطرة على الألم. تأكيد عمق التخدير الكافي مع قرصة مخلب.
    ملاحظة: إذا كان الوقت بين زرع الرئة والتصوير داخل الجسم المخطط له أقل من ساعتين ، يمكن إعادة جرعة التخدير مع 50 ٪ من الجرعة الأولية من الكيتامين.
  2. قم بإزالة الشعر من الصدر الأيسر بالكامل باستخدام ماكينة قص كهربائية وامسح الصدر لإزالة الشعر الزائد المقصوص.
  3. ضع مرهم العيون غير الطبي على عيون الفأر لمنع جفاف القرنية.
  4. إعادة تنبيب الفأر عن طريق الفم والقصبة الهوائية مع قسطرة وعائية 20 G ، كما هو موضح سابقا21.
  5. تهوية مع هواء الغرفة بمعدل 120 نفسا / دقيقة وحجم المد والجزر من 0.5 سم مكعب.
  6. تسليم 1 ٪ إيزوفلوران القصبة الهوائية خلال الإجراء بأكمله.
  7. لتصور الأوعية الدموية أثناء التصوير ، قم بحقن 20 ميكرولتر من 655 نانومتر من النقاط الكمومية غير المستهدفة (q-dots) في 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات عن طريق الوريد قبل 5 دقائق على الأقل من التصوير.

2. التحضير الجراحي للرئة اليسرى للتصوير

  1. ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن (انظر الشكل 1 أ).
  2. تطهير جلد الصدر بمزيج من 0.75 ٪ من اليود و 70 ٪ من الإيثانول ، ثلاث مرات.
  3. أعد فتح بضع الصدر الأيسر (من زرع رئة الفأر) من خلال الفضاء الوربي الثالث (انظر الشكل 1 أ).
  4. قم بإزالة جزء من الجلد والأنسجة الرخوة فوق موقع بضع الصدر الأيسر ، بقياس 1.5 سم × 1.5 سم (انظر الشكل 1 ب).
  5. قبل استئصال الضلع ، قم أولا بتثبيت الأضلاع لمدة ~ 10 ثوان لتخثر أي الأوعية الدموية الدقيقة لتحقيق الإرقاء (انظر الشكل 1C ، D).
  6. استئصال أجزاء منالأضلاع من3 إلى 5 لإنشاء نافذة تصوير كبيرة بما يكفي لتخليص الرئة (~ 0.8 سم من الناحية القحفية و ~ 1.0 سم من الأمام الخلفي ، الشكل 1D ، E).
  7. وقف أي نزيف إضافي من حواف الضلع مع الكي الكهربائي.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تحقيق الإرقاء في الحافة المقطوعة للأضلاع لتجنب فقدان الدم المفرط خلال فترة التصوير.
  8. ضع نتوءا صغيرا (شاش 4 سم × 4 سم مطوي طوليا 3 مرات) أسفل الصدر الأيمن (انظر الشكل 1E).
  9. باستخدام مسحات القطن ، ارفع طعم الرئة من الصدر وضع الجانب السفلي من الرئة على شريط 1 سم × 3 سم من الشاش المنقوع بالمحلول الملحي (انظر الشكل 1F).
    ملاحظة: يمنع هذا الشريط من الشاش المنقوع بالمحلول الملحي انزلاق الرئة ، ويحافظ على بيئة رطبة للرئة ، ويحمي الرئة من الحواف الحادة للأضلاع المقطوعة ، ويفصل الرئة عن حركة القلب. بمجرد تطبيق غرفة التصوير المحيطي على الرئة (الشكل 1G ، H ، الموصوف في القسم 3) ، يجب أن يكون هناك حد أدنى من الحرارة وفقدان السوائل من التجويف الصدري المفتوح خلال فترة التصوير.

3. إعداد غرفة التصوير

ملاحظة: غرفة التصوير مصممة خصيصا (انظر الشكل 2 أ). تتكون غرفة التصوير هذه من لوحة قاعدة ولوحة علوية يتم وضع الماوس بينهما وتثبيته في مكانه بمسامير محملة بنابض على كلا الجانبين (الشكل 2 ب). تحتوي اللوحة العلوية على فتحة دائرية قطرها ~ 2 سم. يتم وضع حلقة O سوداء الحجم في هذه الفتحة على الجانب الأمامي من اللوحة العلوية ، والتي ستحمي العدسة الموضوعية (الشكل 2C). يتم لصق غطاء زجاجي مقاس 24 مم × 50 مم على الجزء الخلفي من اللوحة العلوية باستخدام شحم فراغ عالي ، مما يخلق ختما مانعا للماء. سيكون غطاء الغطاء هذا بمثابة نافذة التصوير من خلال الالتصاق بالرئة أدناه وتثبيت وسائط التصوير (أي الماء) أعلاه. تأكد من عدم وجود شحم فراغ داخل نافذة التصوير الدائرية. سيتم استبدال غطاء الغطاء لكل تجربة تصوير جديدة. يتم تسخين لوحة القاعدة إلى 35-37 درجة مئوية باستخدام مسبار درجة حرارة مزدوج حراري (الشكل 2 أ).

  1. ضع الماوس الأنبوبي على اللوحة الأساسية لغرفة التصوير بحيث يكون الصدر الأيسر المفتوح متجها لأعلى (انظر الشكل 1G ، H). قم بتأمين الماوس بشريط حريري على الوجه والكفوف الأمامية والذيل (انظر الشكل 1H والشكل 2A).
  2. ضع الغراء على الجانب السفلي من زجاج الغطاء المتصل باللوحة العلوية (دائرة رمادية في الشكل 2C ، أسفل) ، تاركا دائرة خالية من الغراء 0.8-1.0 سم في المنتصف.
    ملاحظة: هناك مقايضة بين حجم الدائرة الخالية من الغراء وكمية قطعة أثرية الحركة ؛ وبالتالي ، يوصى بألا يتجاوز قطر الدائرة 1.0 سم.
  3. اخفض اللوحة العلوية حتى يتلامس الغطاء الزجاجي مع الرئة ، مع ملامسة الغراء لسطح الرئة (انظر الشكل 1G).
    ملاحظة: سيتم لصق الرئة اليسرى على غطاء الزجاج مع دائرة نظيفة وخالية من الغراء في المنتصف ، وهي المنطقة التي سيتم تصويرها.
  4. امسك غطاء الغطاء على الرئة وقم بتضخيم الرئة لمدة 1-2 ثانية حتى تلتصق منطقة الغراء بالأنسجة المحيطة. حقق تضخم الرئة عن طريق سد أنبوب التدفق الخارجي من أنبوب القصبة الهوائية للفأر إلى جهاز التنفس الصناعي.
    ملاحظة: لا تضخم الرئة لمدة تزيد عن 1-2 ثانية ، لأن هذا قد يسبب رضح ضغطي مفرط.
  5. تراجع عن اللوحة العلوية قليلا لتقليل الضغط على أنسجة الرئة. تأكد من أن منطقة الرئة داخل نافذة التصوير لا تتحرك مع التهوية.
  6. قم بتأمين طرفي اللوحة العلوية عن طريق تثبيت صامولة الإبهام فوق كل مسمار (انظر الشكل 2 ب).

4. التصوير ثنائي الفوتون

ملاحظة: يجب استخدام مجهر مستقيم ثابت المرحلة مع هدف غمر مائي بفتحة رقمية 20x أو 25x >1.0 (NA) للفحص المجهري داخل الجسم. فيما يلي الإعداد المستخدم في هذه الدراسة ل B6 إلى B6. زرع الرئة اليسرى LysM-GFP مع وضع علامات على الأوعية الدموية q-dot 655 نانومتر. عند تطبيق هذا البروتوكول ، يمكن تكييف إعداد المجهر والليزر والمرشحات ثنائية اللون بناء على احتياجات التجربة المحددة ومراسلي الفلورسنت المستخدمين.

  1. ضع غرفة التصوير بأكملها مع الماوس المتلقي للتنبيب (تم زرع الرئة اليسرى B6 في B6. LysM-GFP مع 655 نانومتر q-dots) على مرحلة المجهر (انظر الشكل 2 أ).
  2. استخدم مرشحات ثنائية اللون بأطوال موجية 480 نانومتر و 560 نانومتر و 635 نانومتر ، والتي ستفصل الإشارات بشكل مناسب عن مراسل GFP ، ونقاط q ، وإشارة الجيل التوافقي الثاني (SHG) (445 نانومتر) الناتجة عن الكولاجين. يمكن تكييف هذه المرشحات بناء على التجربة المحددة.
    ملاحظة: تحدد إشارة SHG الناتجة عن الكولاجين الهياكل الشبيهة بالحفرة المظلمة ، والتي تمثل المجالات الجوية السنخية (انظر الأسهم البيضاء في الشكل 3).
  3. اضبط الليزر النبضي الفيمتو ثانية من التيتانيوم والياقوت على 890 نانومتر (ضمن نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة) للإثارة. استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة لتحقيق إشارة كافية.
    ملاحظة: يجب ضبط إعدادات الليزر للتجربة المحددة لزيادة فصل الإشارة إلى أقصى حد.
  4. ضع ~ 1 مل من الماء لتغطية الغطاء الزجاجي بالكامل على اللوحة العلوية ، والذي سيتم الاحتفاظ به في مكانه بواسطة الحلقة O وختم الشحوم الفراغية لزجاج الغطاء إلى اللوحة العلوية (انظر الشكل 1G والشكل 2C).
  5. استخدم هدف الغمر بالماء 20x >1.0 NA على المجهر. تأكد من تكييف العدسة الموضوعية بناء على التجربة المحددة.
    ملاحظة: يسمح NA الأكبر حجما بجمع المزيد من الضوء والتباين العالي والصور الأكثر تفصيلا. يفضل استخدام أهداف الغمر في الماء لأن الماء أو المخزن المؤقت أكثر توافقا مع الأنسجة البيولوجية.
  6. خفض هدف المجهر في الماء والتركيز على سطح الرئة.
  7. قم بتنشيط سخان لوحة القاعدة والحفاظ على درجة الحرارة عند 35-37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كانت هناك مخاوف بشأن عدم القدرة على الحفاظ على درجة حرارة الأنسجة أو التروية الكافية للرئة ، فيمكن توصيل مقاومتين إضافيتين لتدفئة اللوحة العلوية بالإضافة إلى لوحة القاعدة (انظر الشكل التكميلي 1).
  8. احصل على مكدسات الصور باستخدام برنامج الاستحواذ الذي تختاره.
    ملاحظة: تأكد من أن الغرفة مظلمة تماما أثناء الاستحواذ ، مما قد ينطوي على استخدام ستائر / ستائر معتمة وتغطية استراتيجية لجميع مصادر الضوء.

5. اقتناء الفيديو

ملاحظة: يمكن تكييف المعلمات التالية بناء على التجربة المحددة. تصف الخطوات 5.1-5.3 المعلمات المحددة المستخدمة ل B6 إلى B6. زرع الرئة اليسرى Lysm-GFP الفئران ، والتي يمكن استخدامها كدليل مرجعي.

  1. باستخدام ماسح ضوئي ثنائي الاتجاه بمعدل الفيديو، اضبط أبعاد المسح الضوئي x-y على 512 × 512 بكسل.
  2. باستخدام وحدة السائر xyz ، احصل على تسجيلات الفاصل الزمني لمكدس z المكون من 21 خطوة بمتوسط 10 إطارات لكل خطوة. يستغرق الحصول على كل مكدس حوالي 20 ثانية ، والذي يتضمن الوقت اللازم لمتوسط الإطار ، ومحرك السائر للتحرك والتحقق من موضعه ، وتأخير 100 مللي ثانية.
    ملاحظة: يعمل الماسح الضوئي ثنائي الاتجاه على المجهر المستخدم في هذه الدراسة بمعدل فيديو يبلغ 30 إطارا / ثانية. قد يختلف هذا اعتمادا على إعداد المجهر المحدد.
  3. الحصول على 80 مكدس z متتالي للحصول على تصوير بفاصل زمني لهجرة الكريات البيض داخل حمة الأنسجة. يستغرق هذا حوالي ~ 27 دقيقة عند 20 ثانية / كومة.
    ملاحظة: يجب تقليل حجم المكدس ومتوسط الإطار وطاقة الليزر والطول الإجمالي لتسجيل الفاصل الزمني لمنع التعرض المفرط لليزر للأنسجة. إذا كان مراسلو الفلورسنت المستخدمون ساطعين (أي GFP) وكانت طاقة الليزر منخفضة ، فإن تكرار مكدس z المكون من 21 خطوة بمتوسط 10 إطارات ، مسح ضوئي 512 × 512 بكسل ، على فترات 20 ثانية ل ~ 27 دقيقة يتحمله الماوس جيدا. إذا كانت هناك حاجة إلى فترات أطول من التصوير ، فيجب زيادة وقت الاستحواذ لكل مكدس للحفاظ على إجمالي التعرض لليزر كما هو (أي دقيقة واحدة لكل مكدس يزيد عن ~ 1.5 ساعة). ستحتاج هذه الإعدادات إلى التحسين بناء على مراسلات الفلورسنت المستخدمة.
  4. القتل الرحيم للماوس في نهاية الحصول على الصورة. للقتل الرحيم ، قم بتخدير الفأر بالكيتامين (80-100 مجم / كجم) والزيلازين (8-10 مجم / كجم) ، متبوعا بخلع عنق الرحم اللاحق. ستحافظ مستحضرات التصوير النموذجية بسهولة على صلاحية الماوس لمدة تصل إلى 2 ساعة.
    ملاحظة: لتمديد هذه الفترة ، قد تكون هناك حاجة إلى مكملات السوائل الإضافية ، والتخدير مع الأيزوفلوران ، والاهتمام بتنظيم درجة الحرارة.
  5. عرض فيديو كامل باستخدام Imaris. يمكن أيضا استخدام برامج التصوير الأخرى (مثل ImageJ).
    ملاحظة: قد تتم معالجة الصور بعد الحصول عليها باستخدام تحسين التباين والتنعيم وحسابات القناة لإزالة التشويش المتبادل للقناة.

النتائج

بعد 1 ساعة من التخزين الإقفاري البارد عند 4 درجات مئوية ، قمنا بزرع الرئة اليسرى بشكل متعامد من فأر B6 إلى B6. ماوس LysM-GFP4 ، ثم تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم ، كما هو موضح أعلاه. أجرينا التصوير في نقطتين زمنيتين بعد الزرع - 2 ساعة (الشكل 3 أ) و 24 ساعة (الشكل 3 ب). يتم تمييز الأوعية الدموية باللون الأحمر بواسطة q-dots التي يتم حقنها مباشرة قبل التصوير. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا تصور الخلايا الوحيدة التي تناولت نقاط q عند 24 h4. يمكن رؤية العدلات المشتقة من المتلقي ذات العلامات الخضراء وهي تتسلل إلى طعم الرئة في الفيديو المقابل في 24 ساعة بعد الزرع (الفيديو التكميلي 1). يمكن تصور الحويصلات الهوائية على أنها حفر مظلمة بسبب SHG من الكولاجين (الأسهم البيضاء في الشكل 3). نلاحظ أنه في 24 ساعة بعد الزرع ، هناك المزيد من العدلات في الرئة مقارنة ب 2 ساعة بعد الزرع (الشكل 3).

figure-results-1
الشكل 1: تحضير الفأر للتصوير ثنائي الفوتون. أ: إعادة فتح الجلد على بضع الصدر الأيسر. ب: استئصال الجلد والأنسجة الرخوة على الصدر الأيسر. (ج، د) تم تثبيت الأضلاع لمدة 10 ثوان قبل التقسيم. (ه) تم استئصال 3أضلاع ثالثة إلى 5 لإنشاء نافذة بقياس ~ 0.8 سم من الناحية القحفية الذيلية × 1.0 سم من الأمام الخلفي. (F) الرئة اليسرى مرتفعة من الصدر الأيسر وموضوعة على شريط من الشاش. (ز) غرفة تصوير بها نافذة تصوير تغطي الرئة اليسرى. (ح) وضعت غرفة التصوير على مرحلة المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد غرفة التصوير. أ: حجرة التصوير الموضوعة على مرحلة المجهر. (B) عرض مكبرة لآلية الترباس المحملة بنابض لتأمين اللوحة العلوية فوق الرئة اليسرى. (C) الجزء الأمامي والخلفي من اللوحة العلوية مع تطبيق الحلقة O وغطاء الزجاج. تمثل الخطوط البيضاء المنطقة التي يتم فيها تطبيق شحم الفراغ للصق غطاء زجاجي باللوحة العلوية. تمثل الدائرة الرمادية حلقة من الغراء لتطبيقها على زجاج الغطاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التصوير داخل الجسم ثنائي الفوتون لزراعة الرئة اليسرى للفأر من B6 إلى B6. ماوس LysM-GFP مع تخزين نقص تروية بارد لمدة 1 ساعة. يتم إجراء التصوير في (أ) 2 ساعة و (ب) 24 ساعة بعد الزرع. يمثل اللون الأحمر q-dots. الأخضر يمثل العدلات من B6. مستلم LysM-GFP. يمثل اللون الأزرق SHG من الحويصلات الهوائية الغنية بالكولاجين. تظهر الأسهم البيضاء المجالات الجوية السنخية. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: لوحة علوية مع مقاومتين متصلتين لتوفير تدفئة إضافية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الفيديو التكميلي 1: تصوير بفاصل زمني ثنائي الفوتون للرئة اليسرى للفأر المزروع من B6 إلى B6. ماوس LysM-GFP مع 1 ساعة من التخزين الإقفاري البارد ، يتم إجراؤه عند 24 ساعة بعد الزرع. يمثل اللون الأحمر q-dots. يمثل اللون الأخضر العدلات من متلقي LysM-GFP. يمثل اللون الأزرق الجيل التوافقي الثاني من الحويصلات الهوائية الغنية بالكولاجين. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تم وصف إثارة الفوتون لأول مرة في أطروحة الدكتوراه الخاصة بها من قبل ماريا جوبرت ماير في عام 1931 ، والتي فازت لاحقا بجائزة نوبل في الفيزياء لوصفها بنية القشرة النووية22,23. يعتمد الفحص المجهري الفلوري التقليدي على إثارة الفوتون الواحد ، مع أطوال موجية للإثارة تكون أقصر وأعلى طاقة من الأطوال الموجية للانبعاثات. على عكس الفحص المجهري أحادي الفوتون ، يتضمن الفحص المجهري ثنائي الفوتون إثارة متزامنة بواسطة فوتونين ، لكل منهما أطوال موجية أطول من إشارة التألق المنبعثة24،25،26. نظرا لأن فوتونين فرديين يحتاجان إلى تحديد الموقع المشترك لإثارة نقطة بؤرية واحدة في الأنسجة ، فإن إثارة الفوتون الثنائي تكون مكانيا لحجم عينة صغير ، مما يسمح بالتقسيم البصري24،25،26 وهناك تبيض ضوئي أقل أعلى وأسفل المستوى الذي يحتوي على النقطةالبؤرية 27. احتمال الإثارة المتزامنة بواسطة فوتونين منخفض جدا ، لذلك هناك حاجة إلى ليزر نابض فيمتو ثانية لتحقيق شدة الإثارة المطلوبة لإشارة انبعاث مضان25،26،27. يقع ليزر الإثارة في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة (700-1100 نانومتر) ، وتتمثل ميزته في تشتت أقل ، مما يسمح للضوء بالتغلغل بعمق أكبر في الأنسجة28. يعتمد عمق التصوير على سرعة التذبذب وقوة الليزر24. داخل الرئة ، يمكن تحقيق أعماق التصوير ~ 500-600 ميكرومتر17. وبالتالي ، فإن الجمع بين عمق التصوير والتبييض الضوئي المنخفض يجعل الفحص المجهري ثنائي الفوتون مناسبا للغاية للتصوير داخل الجسم للأعضاء.

تم استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في العديد من الأنسجة المختلفة والمواقع التشريحية ، مثل الجلد12،13 ، والغدد الليمفاوية29 ، والبطانة الوريدية30 ، وقشرة الدماغ10،11 ، والكلى14،15 ، والكبد31،32. على سبيل المثال ، في أدمة الفئران ، تم استخدام التصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم لوصف أسراب العدلات بعد الإصابة الجسدية المعقمة12. في نموذج للتخثر الوريدي ، تم تصور وحيدات الدم والعدلات وهي تزحف على طول بطانة الوريد الأجوفالسفلي 30. تم تصوير الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية بنجاح في الجسم الحي بعد زرعها في نموذج عضوي في الدماغالبشري 33. مع التقدم المستمر في الفحص المجهري ثنائي الفوتون ، يمكن التصوير داخل الجسم على أعماق أكبر وحتى في الأعضاء غير الثابتة. على سبيل المثال ، تم تصوير أعماق تصل إلى 1000 ميكرومتر في القشرة المخية الحديثة في الفئران باستخدام مكبر للصوت التجديدي Ti: Al2O34.

أحد تحديات التصوير داخل الجسم في أعضاء الصدر هو تثبيت الصورة. بسبب الحركة من القلب النابض وتنفس الرئة ، يمكن أن تقلل القطع الأثرية المتحركة بشكل كبير من جودة الصورة. تم تطوير عدة طرق لتثبيت تصوير القلب والرئة ، بما في ذلك لصق العضو4،7 ، وتثبيت الشفط19،35،36،37 ، وتصحيح الحركة الخلفية38. تعتمد تقنيتنا في تصوير الرئة على لصق سطح الرئة بغطاء زجاجي ثابت. نحافظ على الرئة معطلة وجيدة التهوية وطبيعية الحرارة ، والتي تحاكي الظروف الموجودة في الجسم الحي. بالمقارنة مع طريقة تثبيت الشفط التي وصفها Looney et al.19 ، فإن هذا البروتوكول له العديد من المزايا. أولا ، لا نطلب إنشاء جهاز شفط متخصص. بدلا من ذلك ، يمكن بناء غرفة التصوير واللوحة العلوية بمواد متوفرة بسهولة في مختبر الفحص المجهري. بالإضافة إلى ذلك ، مقارنة بجهاز الشفط (الذي يبلغ قطره الداخلي 4 مم) ، فإن تقنية اللصق المستخدمة في هذه الدراسة تسمح بمساحة سطح أكبر للتصوير (تصل إلى 10 مم). مع الإلتصاق المحيطي ، تكون منطقة الرئة داخل دائرة الغراء مقيدة بشكل كاف ، ويتم تقليل حركة التهوية إلى الحد الأدنى. بالمقارنة مع تقنية الشفط ، يمنع نهج غطاء الزجاج التشوه المحدب لسطح الرئة ، مما قد يؤثر على تدفق الدم الشعري تحت الجنبة. تشمل عيوب نظامنا عدم القدرة على إزالة غطاء الغطاء دون المساس بالوصلة الجنبية. وبالتالي ، لا يمكن تصوير الرئة مرة ثانية باستخدام تقنية الغراء المستخدمة هنا ، في حين أن تقنية الشفط تسمح بالتصوير التسلسلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام بضع الصدر يستلزم فقدان الضغط السلبي الطبيعي داخل الصدر ، والذي ، جنبا إلى جنب مع تهوية الضغط الإيجابي ، ليس من الناحية الفسيولوجية. القيود الإضافية تتم مناقشة قيود التصوير ثنائي الفوتون أدناه.

في حين أن الصدر مفتوح أثناء التصوير داخل الجسم ، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على أقرب ما يمكن من البيئة الفسيولوجية. يتم الحفاظ على لوحة القاعدة التي يكمن عليها الماوس عند درجة حرارة 35-37 درجة مئوية. مع تسخين لوحة القاعدة فقط ، وجدنا أن درجة حرارة قلب الماوس (تقاس عبر مسبار المستقيم) منظمة جيدا على مدار عدة ساعات. في تجربتنا ، تتأثر حركة الخلية وسلوكها بشكل واضح فقط عندما تنخفض درجة الحرارة إلى أقل من 32 درجة مئوية ، وهو أمر غير مرجح أن يحدث مع هذا الإعداد. إذا واجهت صعوبة في الحفاظ على الحرارة الطبيعية للأنسجة أو نضح الرئة أثناء الإعداد الأولي لغرفة التصوير هذه ، فيمكن توصيل مقاومتين إضافيتين لتدفئة اللوحة العلوية بالإضافة إلى لوحة القاعدة (الشكل التكميلي 1). بمجرد تحسين غرفة التصوير ، ليس من الضروري مراقبة درجة الحرارة الداخلية للماوس بشكل روتيني أثناء كل تجربة تصوير. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن الجمع بين الشاش المنقوع بالمحلول الملحي الموضوع فوق التجويف الصدري المفتوح والحلقة الانسدادية للغراء حول منطقة الرئة المراد تصويرها فعال في تقليل فقد السوائل أثناء التصوير.

أحد الاعتبارات الفنية المهمة هو تحقيق إرقاء جيد أثناء استئصال الضلع عند إنشاء نافذة تصوير الصدر. يتم استئصال أجزاء منالأضلاع اليسرى من3 إلى 5 ، والنزيف المستمر من هذه الأضلاع المقطوعة سيضر ببقاء الفأر أثناء التصوير. لمكافحة هذا ، نوصي أولا بتثبيت الأضلاع بالقرب من المكان الذي سيتم استئصالها فيه لمدة 10 ثوان لتخثر الأوعية الدموية الدقيقة (انظر الشكل 1C ، D). ثم ، بعد استئصال الأضلاع ، يجب تخثر الحواف المقطوعة للأضلاع بحرية باستخدام الكي الكهربائي. أخيرا ، من الأهمية بمكان وضع الرئة اليسرى فوق شريط الشاش المنقوع بالمحلول الملحي (انظر الشكل 1F) أثناء التصوير لمنع حواف الضلع الحادة من ثقب الرئة. من خلال هذا المزيج من الاعتبارات الفنية ، يمكننا التقاط مقاطع فيديو واضحة لتهريب الخلايا المناعية داخل حمة الرئة مع الحد الأدنى من الحركة لعدة ساعات دون إصابة الرئة أو فقدان أنماط التروية الطبيعية.

تم استخدام المجهر ثنائي الفوتون في الرئتين لدراسة نماذج الأمراض المعدية والالتهابات المعقمة. استخدمت إحدى المجموعات التصوير ثنائي الفوتون لدراسة حركة الخلايا البائية المقيمة في الذاكرة والهجرة بعد تكرار تحديات رئتي الفأر بفيروسالأنفلونزا 39. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في زرع الجلد والكلى وجزيرة البنكرياس40،41،42،43. باستخدام نموذج الزرع ، يمكن تغيير المتبرع والمتلقي وراثيا لدراسة مجموعات الخلايا الخاصة بكل منهما. على حد علمنا ، كانت مجموعتنا أول من أجرى تصويرا ثنائي الفوتون داخل الجسم في عمليات زرع رئة الفئران4. لاحظنا التجنيد السريع للعدلات وتجميعها بعد إصابة نقص التروية بوساطة الزرع ، والتي تم تقليلها مع النضوب الدوائي لوحيدات الدم4. في العمل اللاحق ، أظهرنا أن الخلايا الوحيدة المشتقة من الطحال تسهل تسرب العدلات من خلال إنتاج IL-1B44. سمح لنا التصوير داخل الجسم في هذه الدراسات بالكشف عن منظمات المنبع لتسرب العدلات كأهداف علاجية محتملة لتقليل الاستجابة الالتهابية بعد الزرع45. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا أيضا تصويرا داخل الجسم في قلوب الفئران النابضة بعد زرع غير متجانس16. تصورنا تجنيد العدلات إلى عضلة القلب ووجدنا أن موت الخلايا الحديدية لخلايا الكسب غير المشروع القلبي يبدأ الالتهاب بعد زرع القلب46. طبقنا تقنية تثبيت مماثلة على أقواس الأبهر المزروعة لتصور الاتجار أحادي الخلايا في لويحات تصلب الشرايين47. أظهرت هذه الدراسات جدوى وفائدة التصوير داخل الجسم لأعضاء الصدر المزروعة غير الثابتة.

أخيرا ، يجدر مناقشة طرق تصور أنواع الخلايا المختلفة وحمة الرئة. يتم استخدام طريقتين رئيسيتين لتسمية الخلايا - 1) سلالات الفئران المعدلة وراثيا مع طفرات غير متوقعة من البروتينات الفلورية و 2) الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لتلطيخ الخلايا. تشمل سلالات الفئران المعدلة وراثيا شائعة الاستخدام لتحديد الخلايا المناعية بواسطة المجهر ثنائي الفوتون LysM-GFP للعدلات48 ، CX3Cr1-GFP لمختلف مجموعات البلاعم الخلالية49,50 ، CCR2-GFP للوحيدات الكلاسيكية51 ، CD19-tdTomato للخلايا البائية52 ، و Foxp3-GFP للخلايا التائية التنظيمية5. والجدير بالذكر أن CX3Cr1 وحده لا يكفي لتحديد الخلايا بشكل لا لبس فيه ، ولكن يمكن مساعدة ذلك من خلال مورفولوجيا الخلية والموقع بما يتفق مع البلاعم الخلالية. يمكن تصوير البلاعم السنخية دون وضع العلامات بسبب تألقها الذاتي53,54 ، والتشكل المميز ، والسلوك (أي نقص الحركة في دقة الوقت لتسجيلات الفاصل الزمني). بالمقارنة مع الحمضات ، والتي هي أيضا ذاتية الفلورسنت ، فإن البلاعم السنخية أكبر وأكثر إشراقا إلى حد كبير مع إثارة 890 نانومتر54. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تسمية البلاعم السنخية بناء على وظيفتها البلعمية عن طريق إعطاء مجاميع الصبغة داخل الرئة54.

يمكن أيضا تحقيق تصور الخلايا المناعية في متلقي الزرع عن طريق النقل بالتبني داخل الأوعية للخلايا ذات العلامات الفلورية أو عن طريق حقن الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت مقابل علامات السطح الخاصة بالخلية18,55. فائدة أخرى متأصلة في الفحص المجهري ثنائي الفوتون هي SHG بواسطة بعض الهياكل ثنائية الانكسار داخل الأنسجة ، مثل الكولاجين56. هذه الظاهرة مفيدة بشكل خاص لتصوير الرئة بسبب ارتفاع نسبة الكولاجين في الأكياس السنخية ، والتي تعمل كمؤشر جوهري للبنية السنخية دون أصباغ فلورية إضافية. علاوة على ذلك ، يتم تقييد الحويصلات الهوائية أيضا بواسطة الشعيرات الدموية السنخية التي تحمل علامة 655 نانومتر q-dots. أخيرا ، يمكن تسمية الأوعية الدموية بالحقن الوريدي لنقاط q (كما هو موضح في هذا البروتوكول) أو رودامين ب ديكستران. عند تصميم تجربة مجهرية ثنائية الفوتون داخل الجسم ، نوصي باستخدام ما لا يزيد عن أربع قنوات انبعاث مختلفة لتقليل مخاطر النزيف وضعف التمايز بين القنوات.

أحد القيود الرئيسية لتقنية تثبيت الغراء الموصوفة هو عدم القدرة على إزالة الغطاء الزجاجي من الرئة دون تلف الأنسجة المحتمل والغراء المتبقي على سطح الرئة. وبالتالي ، لا يمكن تصوير الرئة إلا مرة واحدة بدلا من نقاط زمنية متعددة على مدى عدة أيام. لمعالجة هذا القيد ، وصفت إحدى المجموعات نافذة تصوير الصدر شبه الدائمة ، والتي تسمح بالتصوير التسلسلي للرئة57. ومع ذلك ، في تجربتنا ، لا يسمح هذا النهج بتثبيت الرئة الكافي لفترات طويلة من التصوير. توفر هذه التقنية القدرة على تصوير الرئة لعدة ساعات ، مما يوفر رؤى رئيسية حول الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية بعد الزرع.

تشمل القيود الأخرى للتصوير ثنائي الفوتون التكلفة الأولية الباهظة للإعداد والخبرة المطلوبة لصيانة النظام. مجالات المسح صغيرة نسبيا مقارنة بالتصوير المناعي. يمكن أن يكون التلف الحراري والضوئي كبيرا دون تحسين معلمة الاستحواذ بعناية. وظيفة انتشار نقطة الإثارة ثنائية الفوتون واسعة ، مما يحد إلى حد ما من الدقة ، خاصة في البعد z. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب التصوير ثنائي الفوتون تسمية الخلايا ذات الأهمية بالفلورسنت ، ولا يمكن تسمية بعض الخلايا بشكل لا لبس فيه بعلامة خلية واحدة. غالبا ما يقتصر عدد الإشارات التي يمكن تصويرها في وقت واحد على أربع إشارات أو أقل. أخيرا ، قد يؤدي التخدير والجراحة والتصوير إلى حدوث التهاب إضافي وتغيرات فسيولوجية أعلى عملية زرع الرئة التي يمكن أن تربك النتائج والتفسيرات التجريبية على الرغم من بذل قصارى جهدها للحفاظ على بيئة فسيولوجية. تشمل الاتجاهات المستقبلية تطوير طرق طفيفة التوغل للتصوير داخل الجسم (مثل من خلال بضع الصدر الأصغر أو نهج تنظير القصبات).

في الختام ، يعد الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم أداة لا تقدر بثمن في دراسة عمليات الأمراض المتعددة. هنا ، نصف تقنية موثوقة لتجميد الرئة والتصوير ثنائي الفوتون ، والتي تسمح بالمراقبة داخل الجسم لتهريب الخلايا والتفاعلات الديناميكية بين مجموعات الخلايا المختلفة بعد زرع رئة الفئران. لقد وسعت هذه التقنية فهمنا للمشهد المناعي بعد الزرع وستظل أداة لا غنى عنها في دراسة زراعة الرئة وعمليات أمراض الرئة الأخرى.

الإفصاحات

لم يبلغ المؤلفون عن أي إفصاحات ذات صلة.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل بمنح من NIH 1P01AI11650 ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي. نشكر مركز التصوير في الجسم الحي في كلية الطب بجامعة واشنطن.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.75٪ بوفيدون اليودAplicareNDC 52380-0126-2للمطهر
1 بوصة 20G IV قسطرةTerumoSROX2025CAلأنبوب القصبة الهوائية (ETT)
شريط حريري مقاس 1 بوصةDurapore3M ID 7100057168لتأمين الماوس في موضعه
موضوعية طويلة بالغمر في الماء20x OlympusN20X-PFH
3M غراءVetbondMedi-Vet.com10872للصق الغطاء الزجاجي على الرئة
655 نانومتر النقاط الكمومية غير المستهدفةThermoFisherQ21021MPلوضع العلامات على الأوعية الدموية
70٪ إيثانولسيجما ألدريتشEX0281للتطهير
Argent High Temp Fine Tip PenMcKesson231
Black O ring (2 سم)متجر لاجهزة الكمبيوترغيرمتاح للتصوير المخصص غرفة
بولت (2)لاجهزة الكمبيوترغيرلغرفة التصوير المصممة خصيصا
صمولة الإبهام النحاسية (2)متجر لاجهزة الكمبيوترN / Aلغرفة التصوير المصممة خصيصا
Buprenorphine 1.3 mg / mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30للتحكم في الألم
Chameleon التيتانيوم والياقوت فيمتو ثانية ليزر نابضمتماسكN / A
غطاء زجاجي (24 مم × 50 مم)توماس سيانتيفك1202F63لغرفة التصوير المصممة خصيصا
مشبك البعوض المنحني (1)أدوات العلوم الدقيقة13009-12
وحدة تحكم سخان ثنائية القناةWarner InstrumentsTC-344B
مقص ناعم (1)أدوات العلوم الدقيقة15040-11
مجهر عموديأوليمبوسBX51WI
شاش (مقطوع إلى 1 سم × 3 سم)McKesson476709لوضعها تحت الرئة اليسرى
شحم عالي الفراغDow CorningN / Aللصق غطاء زجاجي على اللوحة العلوية
Isoflurane 1٪Sigma Aldrich26675-46-7للتخدير
هيدروكلوريد الكيتامين 100 مجم / ملVedcoNDC 50989-996-06للتخدير
صفائح معدنية (3 سم × 7 سم)متجر لاجهزة الكمبيوترN / Aلغرفة التصوير المصممة خصيصا
أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية مدببةSolon56225للتلاعب بالرئة والتشريح الحاد
Power Pro Ultra ClipperOster078400-020-001
مرهم العين Puralube VetMedi-Vet.com11897لمنع جفاف العين جهاز
التنفس الصناعي للحيوانات الصغيرةهارفارد جهاز55-0000
ملقط مستقيم (1)أدوات العلوم الدقيقة91113-10
سائق مصراع ثلاثي القنواتUniblitzVMM-D3ماسح ضوئي بالرنين
XYZ محرك متدرجبصري سابق ScientificOptiScan II
Xylazine 20 مجم / ملAkornNDC 59399-110-20للسيطرة على الألم
عدسة متجر متاح ثابت المرحلة

المراجع

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير الحيوي داخل الجسمزراعة الرئةطعم رئة الفأرانتقال الخلايا المناعيةزراعة الرئة في الموقع التشريحيارتشاح الخلايا المتعادلةالخلايا التائية التنظيميةنافذة التصويرالطعم الرئوي الخيفي
الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لرئة الفأر المزروعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.