يصف هذا البروتوكول جميع الإجراءات ، من زراعة الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية (ADSCs) وجمع المواد الطافية إلى استخراج الحويصلات خارج الخلية (EVs) باستخدام الطرد المركزي الفائق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنقية وتوصيف الحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية (ADSCs) أن تعزز تجديد وإعادة بناء الأنسجة والأعضاء المختلفة. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن وظيفتها التجديدية قد تعزى إلى ملامسة الخلايا وتأثيرات باراكرين الخلية. يعد تأثير paracrine طريقة مهمة للخلايا للتفاعل ونقل المعلومات عبر مسافات قصيرة ، حيث تلعب الحويصلات خارج الخلية (EVs) دورا وظيفيا كناقلات. هناك إمكانات كبيرة للمركبات الكهربائية ADSC في الطب التجديدي. وقد ذكرت دراسات متعددة عن فعالية هذه الأساليب. يتم حاليا وصف طرق مختلفة لاستخراج وعزل المركبات الكهربائية بناء على مبادئ مثل الطرد المركزي ، وهطول الأمطار ، والحجم الجزيئي ، والتقارب ، والموائع الدقيقة. يعتبر الطرد المركزي الفائق المعيار الذهبي لعزل المركبات الكهربائية. ومع ذلك ، لا يزال هناك بروتوكول دقيق لتسليط الضوء على الاحتياطات أثناء الطرد المركزي الفائق. تقدم هذه الدراسة المنهجية والخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها استزراع كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSC)، وجمع المواد الطافية، والطرد المركزي الفائق للمركبات الكهربائية. ومع ذلك ، على الرغم من أن الطرد المركزي الفائق فعال من حيث التكلفة ولا يتطلب مزيدا من العلاج ، لا تزال هناك بعض العيوب الحتمية ، مثل انخفاض معدل الاسترداد وتجميع المركبات الكهربائية.
المقدمة
تستمد معظم كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) من الأنسجة الدهنية وقد ثبت أنها تعزز تجديد وإعادة بناء الأنسجة والأعضاء المختلفة، بما في ذلك عضلة القلب والعظام والجلد1. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن الوظيفة التجديدية ل ADSCs قد تكون بسبب الاتصال بين الخلايا وتأثيرات paracrine للخلايا2. يعد تأثير paracrine وسيلة مهمة للخلايا للتفاعل ونقل المعلومات عبر مسافات قصيرة ، ويتم تحقيق هذه الوظيفة من خلال الحويصلات خارج الخلية (EVs).
EVs عبارة عن هياكل غشائية مزدوجة الطبقة تنتجها الخلايا ، ويتراوح قطرها من 40 نانومتر إلى 160 نانومتر (بمتوسط حوالي 100 نانومتر). أنها تؤثر على الوظائف الخلوية المختلفة ، مثل إنتاج السيتوكين ، وتكاثر الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، والتمثيل الغذائي 3,4. وقد أجريت العديد من الدراسات حول وظائف كليفات التفاضل التفاضلي للأوراق الصحية، بما في ذلك تعزيز تجديد العظام، وتجديد الأنسجة المخاطية الفموية، وبقاء الأنسجة الدهنية بعد زراعة الأنسجة، وإصلاح جروح الجلد5،6،7،8. إن الإمكانات الهائلة للمركبات الكهربائية التي تعمل بها شركة ADSC في الطب التجديدي واضحة. توجد طرق مختلفة لاستخراج وفصل المركبات الكهربائية عن المادة الطافية ، مثل التقنيات القائمة على الطرد المركزي ، وهطول الأمطار ، والحجم الجزيئي ، والتقارب ، والموائع الدقيقة. تعتبر طريقة الطرد المركزي الفائق على نطاق واسع المعيار الذهبي لعزل المركبات الكهربائية9. يعتمد المبدأ الأساسي للطرد المركزي الفائق لفصل EV على حقيقة أن الجسيمات في العينة لها معاملات ترسيب مختلفة ، مما يؤدي إلى ترسيبها وتجميعها في طبقات فصل متميزة. ومع ذلك ، لم يتم بعد وضع بروتوكول مفصل يؤكد على الاحتياطات أثناء الطرد المركزي الفائق.
لذلك، تحدد هذه الدراسة بشكل موضوعي ثقافة ADSC، وجمع المواد الطافية، وإجراءات الطرد المركزي الفائق للمركبات الكهربائية والنقاط الرئيسية مع تدفق منطقي للمعلومات ولغة رسمية واضحة. وهذا يوفر مرجعا قيما للتجارب المستقبلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تظهر نظرة عامة على خطوات البروتوكول في الشكل 1. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. إعداد وسائل الإعلام
- تحضير وسط استزراع ل ADSC بدون إكسوسومات باستخدام 450 مل من وسط الاستزراع القاعدي، و50 مل من مصل الأبقار الجنينية بدون إكسوسومات، و5 مل من المضادات الحيوية الثلاثية.
2. إنعاش وزراعة ADSCs
ملاحظة: إنعاش ADSCs.
- قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية للطاولة فائقة التنظيف مسبقا وقم بتطهيرها لمدة 30 دقيقة.
- سخني الوسط في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية مسبقا.
- استرجع أنبوبين من كاليزات التفاضل المنشط للجسم (P3) من النيتروجين السائل وحركها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع درجة حرارة ثابتة حتى تذوب تماما.
ملاحظة: يجب ألا يكون فتح أنبوب التجميد ملامسا للماء لمنع التلوث. - قم بتطهير أنبوب الحفظ بالتبريد باستخدام 75٪ كحول ثم انقله إلى طاولة فائقة التنظيف. نضح تعليق الخلية باستخدام ماصة ووضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- ضع أنبوب الطرد المركزي في آلة طرد مركزي منخفضة السرعة وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تحضير أربعة أطباق ثقافة 10 سم ووضع 9 مل من المتوسط في كل طبق. حدد الاسم ونوع الخلية والتوليد والتاريخ التجريبي ، ثم قم بتسخينها مسبقا في حاضنة خلايا ثرموستاتية 37 درجة مئوية.
- تطهير أنبوب الطرد المركزي ونقله إلى طاولة فائقة التنظيف. إزالة طاف مع ماصة.
- أضف 4 مل من الوسط وحرك المحلول برفق (1 × 105 خلايا / مل) حتى يتم تفريقه بالتساوي.
ملاحظة: احرص على عدم التخلص من حبيبات الخلية عند استخراج المادة الطافية. - أضف 1 مل من معلق الخلية إلى كل طبق. هز الأطباق بطريقة متقاطعة.
ملاحظة: ضع اللوحة على سطح مستو وحركها في نمط متقاطع (حركها لأعلى ولأسفل ولليسار ولليمين) لمدة 5-6 تكرارات. تجنب الحركات الدائرية ، لأنها قد تسبب تراكم الخلايا في المركز. - راقب الخلايا عند تكبير 40x باستخدام المجهر الضوئي ، ثم ضع الأطباق في الحاضنة.
ملاحظة: الغرض الأساسي من مراقبة الخلايا هو تحديد ما إذا كانت موزعة بالتساوي ، لأن التوزيع غير المتكافئ سيؤثر على النمو اللاحق. - إعداد وسط التبادل للخلايا.
- قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية للطاولة فائقة التنظيف مسبقا وقم بتطهيرها لمدة 30 دقيقة.
- سخني الوسط في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية مسبقا.
- راقب حالة الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 40x. مستوى التقاء حوالي 50 ٪.
ملاحظة: يتم حساب مستوى الالتقاء كنسبة المساحة التي تشغلها الخلايا إلى مساحة سطح طبق بتري بعد التصاق الخلايا بالجدار وتمتد بالكامل. - انقل طبق الاستزراع إلى طاولة فائقة النظافة (مستوى السلامة الحيوية 2) بعد التطهير وقم بإزالة الوسط.
- شطف كل طبق ثقافة مرتين مع 2 مل من محلول PBS بلطف.
- أضف 10 مل من المتوسط إلى كل طبق. نقل الأطباق إلى الحاضنة.
3. جمع طافات ADSCs واستخراج المركبات الكهربائية
- قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية للطاولة فائقة التنظيف مسبقا وقم بتطهيرها لمدة 30 دقيقة.
- مراقبة حالة الخلية تحت المجهر. مستوى التقاء حوالي 80 ٪.
- انقل الطبق إلى الطاولة فائقة النظافة بعد التطهير. اجمع بعناية المادة الطافية باستخدام ماصة وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
ملاحظة: يمكن تجميد الخلايا أو التخلص منها. إذا لم يكن العقم مطلوبا ، فيمكن تنفيذ الخطوات التالية على طاولة العمليات. في هذه المرحلة ، يمكن إيقاف التجربة مؤقتا ثم إعادة تشغيلها لاحقا. إذا توقفت التجربة ، قم بتخزين المادة الطافية في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. لا ينصح بالتخزين طويل الأجل لأنه قد يؤثر على نشاط المركبات الكهربائية. النهج الأمثل هو استخراج المركبات الكهربائية على الفور. - أجهزة طرد مركزي (300 × جم ، 10 دقائق ، في درجة حرارة الغرفة) لإزالة الخلايا العالقة. جمع طاف مع ماصة.
ملاحظة: لا تصب. اترك القليل من المواد الطافية لمنع امتصاص الحبيبات. - جهاز طرد مركزي لإزالة الحطام الخلوي (2000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، ثم استمر في جمع المادة الطافية باستخدام ماصة.
ملاحظة: النقاط الرئيسية هي نفسها كما في الخطوة 3.4. - قم بتصفية المادة الطافية بغشاء 0.22 um لإزالة الجسيمات الكبيرة وحطام الخلايا.
ملاحظة: قم بتصفية المادة الطافية ب 2 مل من برنامج تلفزيوني معقم لترطيب غشاء المرشح قبل الترشيح. - أجهزة الطرد المركزي في آلة الطرد المركزي الفائقة (10000 × جم ، 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
- بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي عند 1،00،000 × غرام لمدة 70 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الحبيبات وجمع المادة الطافية.
ملاحظة: تم تنقية المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي عدة مرات لزيادة نقاوتها. قد لا تكون الحبيبات مرئية للعين المجردة. لذلك ، من الضروري تشغيل الماصة برفق وترك القليل من المادة الطافية في الأسفل لتجنب تجمع الحبيبات. - إزالة طاف مع ماصة. أعد تعليق الحبيبات باستخدام PBS وأجهزة الطرد المركزي (1,00,000 × جم ، 70 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
ملاحظة: قد لا تكون الحبيبات مرئية للعين المجردة. لذلك ، عند استنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة ، من الأهمية بمكان إزالة المادة الطافية برفق ودقة لزيادة نقاء المركبات الكهربائية. - قم بإزالة المادة الطافية واحصل على حبيبات EVs. أعد تعليقه ب 1 مل من PBS ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1 مل ، وقم بتخزينه في ثلاجة 4 درجات مئوية للكشف عنه لاحقا.
ملاحظة: قد لا تكون الحبيبات مرئية للعين المجردة. وبالتالي ، عند استنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة ، من الضروري إزالة المادة الطافية برفق ودقة لزيادة نقاء المركبات الكهربائية. إذا لم تكن هناك حاجة للعينات لفترة طويلة ، فقم بتخزينها في ثلاجة -80 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أولا، تم توصيف وكالات المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs)، بما في ذلك مورفولوجيتها10 والأجسام المضادة السطحية. استنادا إلى الشكل 2 أ، من الواضح أن ADSCs مرتبة في شكل مغزل وتشكل دوامة بعد النمو الكثيف. تم تمييز الخلايا المستزرعة إلى خلايا دهنية المنشأ وعظمية المنشأ وكوندروجينية وملطخة بالزيت الأحمر O والأحمر الأليزارين والأزرق الألسياني11. أثبتت تجربة التمايز المستحث وقياس التدفق الخلوي أنهما بالفعل كالوريديان التفاضلية مع إمكانية التمايز متعدد الاتجا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خلال العملية التجريبية الرسمية ، هناك عدة نقاط حاسمة لتحقيق أفضل النتائج التجريبية. بناء على تجربتنا السابقة، يوصى باختيار المقطع 3-6 كاليستيدات المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs)، لأنها تضمن أفضل حالة ممكنة للخلية. قبل P3 ، ربما لم يتم فحص خلايا الدم الحمراء والخلايا البطانية والخلايا المتنوعة الأخرى. بعد P6 ، قد تتقدم الخلايا تدريجيا ، مما قد يؤثر على حالة المركبات الكهربائية المفرزة. ثانيا ، يجب جمع المادة الطافية عندما تكون درجة التقاء الخلية بين 80٪ و 90٪ لضمان إفراز كاف لأكبر عدد ممكن من المركبات الكهربائية. للحفاظ على ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس للمؤلفين أي مصلحة مالية يعلنونها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82202473).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرشح إبرة Acrodisc من غشاء سوبور | Acros Organics | 4652 | 0.22 & م |
| متوسطة قاعدية لزراعة الخلايا | OriCell | BHDM-03011 | |
| مصل الأبقار الجنيني بدون مكمل EXO + الثقافة (للخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون البشرية) | مجهر مقلوب OriCell | HUXMD-05002 | |
| مجهر مقلوب | أوليمبوس | Lx70-S8F2 | |
| جهاز طرد مركزي منخفض السرعة | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co.، Ltd. | SC-3612 | |
| نورموسين | إنفيفوجين | ant-nr-05 | |
| أوبتيما ماكس-إكس بي جهاز طرد مركزي فائق الطاولة | بيكمان كولتر | 393315 | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين الجنتاميسين (100x) | Solarbio | P1410 |
المراجع
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
