يعد وضع الغرسات في نموذج الفئران إجراء تجريبيا أساسيا للبحث السريري. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا جراحيا شاملا لزرع غرسات التيتانيوم في قصبة نماذج الفئران المصابة بداء السكري وهشاشة العظام.
مقالة منهجية
تقنية زرع العظام الجراحية لنماذج الساق الجرذ لمرض السكري وهشاشة العظام
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لطالما خدم الجرذ كنموذج حيواني قيم في زراعة الأسنان وجراحة العظام ، لا سيما في دراسة التفاعلات بين المواد الحيوية والأنسجة العظمية. غالبا ما يتم اختيار قصبة الفئران بسبب سهولة الوصول الجراحي إليها من خلال طبقات الأنسجة الرقيقة (الجلد والعضلات) والشكل المسطح لوجهها الإنسي ، مما يسهل الإدخال الجراحي للأجهزة داخل العظم. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح هذا النموذج تحريض أمراض معينة ، ومحاكاة الحالات السريرية المختلفة لتقييم الاستجابات البيولوجية لظروف الزرع المختلفة مثل الهندسة أو نسيج السطح أو الإشارات البيولوجية. ومع ذلك ، على الرغم من تركيبتها القشرية القوية ، قد تتطلب بعض الأجهزة داخل العظم تعديلات في التصميم والحجم لنجاح عملية الزرع. لذلك ، يعد إنشاء طرق جراحية موحدة لمعالجة كل من الأنسجة الرخوة والصلبة في منطقة الزرع أمرا ضروريا لضمان وضع جهاز الزرع أو المسمار بشكل صحيح ، لا سيما في مجالات مثل طب الأسنان المزروع وجراحة العظام. شملت هذه الدراسة ثمانين فأرا من Sprague Dawley مقسمة إلى مجموعتين بناء على أمراض كل منها: المجموعة 1 المصابة بهشاشة العظام والمجموعة 2 المصابة بداء السكري من النوع 2. تم إجراء عمليات الزرع في 4 أسابيع و 12 أسبوعا ، مع نفس الجراح بعد تقنية جراحية متسقة. لوحظت استجابة بيولوجية إيجابية ، مما يشير إلى الاندماج العظمي الكامل لجميع الغرسات الموضوعة. تؤكد هذه النتائج نجاح البروتوكول الجراحي ، والذي يمكن تكراره لدراسات أخرى ويكون بمثابة معيار لمجتمع المواد الحيوية. والجدير بالذكر أن قيم الاندماج العظمي ظلت مستقرة في كل من 4 أسابيع و 12 أسبوعا لكلا نموذجي المرض ، مما يدل على تكامل دائم للزرع بمرور الوقت والتأكيد على إنشاء اتصال عظمي حميم في وقت مبكر من 4 أسابيع.
المقدمة
يرجع الاختيار الشائع للفئران كمواضيع تجريبية إلى حقيقة أنها سهلة التكاثر وغير مكلفة نسبيا مقارنة بالنماذج الحيوانية الأكبر. إن ظهور إجراءات جديدة ، مثل التكاثر الموثوق للاضطراب ، على سبيل المثال ، هشاشة العظام أو مرض السكري ، يجعل هذا النموذج مفيدا بشكل خاص لتحليل الاستخدام المحتمل للعلاجات و / أو تأثير المرض في الاستجابة البيولوجية للأدوية والأجهزة الجراحية أو الإجراءات1،2.
يحدث اكتساب كتلة عظام الفئران في الغالب خلال الأشهر ال 6 الأولى من الحياة ، على الرغم من أن بعض الباحثين يعتقدون أن العظم الطويل ينمو باستمرار لمدة عام على الأقل مع زيادة تدريجية في الطول1. مع الشيخوخة ، هناك انتقال من النمذجة إلى إعادة البناء ، والذي لا يحدث في جميع الحالات بالتساوي في جميع أنحاء العظام2. تنمو إناث فئران Sprague Dawley بشكل أبطأ من ذكور الفئران وتحقق ذروة وزن أقل من ذكور الفئران1. الاستطالة المستمرة للعظام وديناميكيات إعادة تشكيل العظام المتنوعة في الفئران هي عوامل يجب أخذها في الاعتبار عند معالجة قضايا صحة الإنسان. ومع ذلك ، لم يكن من الممكن حتى الآن العثور على أي بحث تجريبي يظهر إما تطور عظام الفئران مدى الحياة أو عدم قدرة الأنواع على إعادة تشكيل العظام1. إذا بدأت التجربة حوالي 10 أشهر من العمر ، فيجب ترك هامش لا يقل عن 1 مم من صفيحة نمو الساق سليما بسبب نمو العظام الطولي هذا ، وهي مشكلة يجب مراعاتها في دراسات زراعة الأسنان2. الهرمونات هي أيضا معلمة رئيسية في أبحاث العظام لأنه في عمر 8 أشهر ، وجد أن ذكور الفئران لديها عرض عظمي أكبر بنسبة 22٪ وقوة كسر أكبر بنسبة 33٪ من الإناث في الساق3.
وبالتالي ، فإن التكاثر الموثوق به للاضطراب مهم جدا في جراحة العظام وزراعة الأسنان لأن الاندماج العظمي لبرغي العظام أو زراعة الأسنان هو عملية معقدة تعتمد على العديد من العوامل التي تؤثر على الاستجابة الجهازية لزرع الجهاز في العظام. من المعروف أن الاضطرابات الجهازية مثل هشاشة العظام والسكري تؤثر على معدل النجاح في جراحة العظام وزراعة الأسنان ، لذلك يمكن تطبيق التكاثر الموثوق لتلك الاضطرابات في نماذج الفئران لاستكشاف طرق للتغلب على هذه القيود.
إن عظم الساق الجرذ ، نظرا لسهولة الوصول الجراحي ، وحجم العظام المعتدل ، والشكل المسطح على الصفيحة الإنسية ، يجعله مناسبا لتجارب زرع العظام الجراحية 4,5 ، وقد تم استخدامه في العديد من الدراسات البحثية التي تستكشف آثار سطح الزرع على الاندماج العظمي4،5،6. يقيم عدد متزايد من الدراسات التأثيرات على الاندماج العظمي للطلاءات والمواد المضافة إلى سطح الزرع في كل من السليمة7 وفي المعرضة للخطر المصابة بمرض السكري أو هشاشة العظام8،9،10،11،12،13،14.
عدد أجهزة الزرع الموضوعة في قصبة فأر واحد محدود ويمكن أن يختلف حسب نوع الدراسة. اعتمادا على عدد الغرسات أو ظروف الدراسة ، يجب تكييف أبعاد الأجهزة لتقليل الصدمات الجراحية. في الدراسات التي أجريت على غرسة واحدة ، يمكن وضع غرسة بحجم الإنسان تقريبا (قطرها 2.0 مم وطولها من 4 إلى 5 مم) ، ويمكن تحقيق مرساة ثنائية القشرة6،7،15،16. يجب أن تعتمد أبعاد الغرسات في بروتوكولات الغرسات المتعددة حجم غرسة مناسب (قطرها 1.5 مم وطولها 2.5 مم)4,17.
تهدف الدراسة الحالية إلى وصف بروتوكول جراحي موحد لوضع غرسة التيتانيوم على قصبة ساق نموذجين من الفئران: هشاشة العظام ونموذج فئران السكري. علاوة على ذلك ، تسمح هذه الدراسة باختبار البروتوكول الجراحي لتقييم أنواع مختلفة من الوظائف الحيوية لسطح الزرع وتأثيرها على الاندماج العظمي.
تم تقسيم عينة من 80 فأرا إلى مجموعتين. في المجموعة 1 ، تم اختيار 40 أنثى Sprague Dawley التي تم استئصال المبيض بها و 5 صورية ، بمتوسط وزن 484 جم ومتوسط عمر 12 أسبوعا. بناء على توصيات البائعين (انظر جدول المواد) ، بعد ثلاثة أشهر من الخصي ، بدأت التجربة. ضمنت فترة الانتظار هذه اختفاء الهرمونات الجنسية. تم تأكيد هشاشة العظام في وقت الجراحة بناء على تحليل العظام بالتصوير المقطعي الدقيق (micro-CT) ، والذي يعكس فقدان العظام بنسبة 20٪ في المتوسط مقارنة بالمجموعة الوهمية. تألفت المجموعة 2 من 40 فأر BBDR (مقاومة مرض السكري للتربية الحيوية) المعدلة وراثيا Sprague Dawley المصابة بداء السكري من النوع الثاني. كان متوسط الوزن 730 جم ، وكان متوسط العمر 12 أسبوعا. قبل الجراحة ، تم تأكيد حالة مرض السكري مع ثلاثة أيام متتالية من قياسات الجلوكوز مع نتائج أعلى من 200 ملغ / ديسيلتر. تم قياس الجلوكوز باستخدام جهاز قياس السكر في 6 ساعات من الصيام ، وتم جمع قطرة دم عن طريق ثقب الذيل.
تم استخدام غرسات التيتانيوم من الدرجة 3 بطول 2 مم وقطر 1.8 مم. تم تعقيم جميع الغرسات في ظروف الغرفة النظيفة ، من خلال تنظيفها بالموجات فوق الصوتية في سيكلو هكسان (3 مرات لمدة 2 دقيقة) ، الأسيتون (مرة واحدة لمدة 1 دقيقة) ، الماء منزوع الأيونات (3 مرات لمدة دقيقتين) ، الإيثانول (3 مرات لمدة دقيقتين) ، والأسيتون (3 مرات لمدة دقيقتين) باستخدام حمام الموجات فوق الصوتية (230 فولت تيار متردد ، 50/60 هرتز ، 360 واط). بعد ذلك ، تم تجفيف العينات بغاز النيتروجين ، وتم تطبيق حزمة نيتروجين عند 0.5 بار مباشرة على العينات. قبل الزرع ، تم نقع الغرسات أولا في ماء منزوع الأيونات ثم غمرها في 70٪ إيثانول (v / v) لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تم نقل الغرسات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة ، وبقيت تحت ظروف معقمة حتى الجراحة.
البروتوكول
تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجماعة الأوروبية لحماية المستخدمة للأغراض العلمية (التوجيه 2010/63 / EU) كما هو مطبق في القانون الإسباني (المرسوم الملكي 53/2013) ولوائح Generalitat de Catalunya (المرسوم 214/97). تم الحصول على الموافقة الأخلاقية لجميع الإجراءات والمناولة الحيوانية من لجنة الأخلاقيات للتجارب على التابعة لمعهد Vall D'Hebron في Recerca (رقم التسجيل 72/18 CEEA). بالنسبة لنموذج هشاشة العظام ، تم استخدام إناث فئران Sprague Dawley بمتوسط وزن 484 جم ومتوسط عمر 12 أسبوعا. أما بالنسبة لنموذج السكري ، فقد تم استخدام إناث الفئران المعدلة وراثيا BBDR (المقاومة لمرض السكري الحيوي (Bio Breeding Diabetes Resistant) بمتوسط وزن 730 جم ومتوسط عمر 12 أسبوعا. تم الحصول على جميع من مورد تجاري. يتم سرد التفاصيل المحددة للحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. التخدير / الصيدلة وإعداد
- يجب تطبيق التسكين قبل الجراحة باستخدام البوبرينورفين بمعدل 0.05 ملغ/كغ وميلوكسيكام عند 2 ملغ/كغ عن طريق الحقن تحت الجلد قبل 10-15 دقيقة من بدء العملية الجراحية.
- إجراء التخدير داخل الجراحة مع الأيزوفلوران المستنشق: ابدأ بنسبة 5٪ في الهواء النقي أثناء الحث وحافظ على 3٪. حث التخدير في غرفة الفئران والحفاظ على إمدادات الأيزوفلوران مع تكيف الأنف المخروطي أثناء الجراحة.
2. التحضير للجراحة
- قم بقياس درجة حرارة جسم المخدر باستخدام مسبار المستقيم واستخدم وسادة تسخين يتم التحكم فيها إلكترونيا للدعم الحراري طوال العملية الجراحية. يجب تطبيق مرهم العين قبل بدء الجراحة لتجنب جفاف القرنية.
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، يجب إعادة تطبيق المرهم بعد فحص جفاف العين. - قم بقص الشعر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وتطبيق كريم إزالة الشعر للتخلص من أي فرو متبقي.
- احصل على مجال جراحي معقم عن طريق تنظيف جلد الركبة بنمط من اليود و 70٪ (v / v) من الإيثانول باستخدام مسحات معقمة ، بدءا من الداخل وتحريك خط الشق إلى الخارج دون استرجاع. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاث دورات تنظيف متتالية (اليود-الإيثانول-اليود).
- اعزل مجال التشغيل عن طريق وضع ثنى جراحي معقم فوق ، وتعريض الساق من خلال الفتحة المركزية (الشكل 1).
3. الجراحة
- التعرض الجراحي
- قم بعمل شق جلدي كامل السمك يبلغ طوله حوالي 1 سم عموديا على طول الحدود القريبة للوجه الأمامي للساق ، في منطقة metaphysis لكشف العظم (الشكل 2).
- ثبت الساق واسحب الجلد مشدودا ضد العظم الأساسي أثناء إجراء الشق ، مما يضمن بقاء شق نظيف في المكان الصحيح. الإدارة عن طريق تنظيف النزيف الخفيف المتوقع بضغط منقوع في محلول ملحي (الشكل 2).
ملاحظة: جلد الفئران رقيق ومترهل أو فضفاض. استقرار الجلد أمر بالغ الأهمية ومطلوب. - افصل الأنسجة بالكامل عن العظم باستخدام مصاعد السمحاق الصغيرة (الشكل 3).
- كشف العظم حتى التعرف على إدخال عضلة الظنبوب القحفية ، و gracilis ، وعضلة الرأس الجانبية gastrocnemius في الحد الخلفي للجانب الإنسي من الظنبوب ، كنسيج أبيض ليفي ملتصق بقوة بالعظم (الشكل 3).
ملاحظة: من المهم تحديد هذه المجموعة من الإدخالات العضلية لتمكين وضع الغرسة في منطقة عظمية ذات خصائص ومحفزات متشابهة عبر العينة بأكملها ، بغض النظر عن حجم الفئران.
- عملية الحفر
- ابدأ عملية الحفر في المنطقة الصحيحة بين قمة الظنبوب القريبة والحد الخلفي للوجه الإنسي لعظم الظنبوب ، المتاخمة لإدخال عضلة الظنبوب القحفية ، والجراسيليس ، وعضلة الرأس الجانبية الساقية ، وتجنب أي إصابة عضلية.1
ملاحظة: يجب أن يكون الموقع الصحيح 5 مم ± 2 مم من هضبة الظنبوب. - قم بالحفر بحد أقصى 150 دورة في الدقيقة (دورات / دقيقة) تحت الري بالمحلول الملحي عند درجة حرارة قريبة من 20 درجة مئوية باستخدام محرك كهربائي جراحي بزاوية مضادة للاختزال 20: 1.
ملاحظة: كانت هناك حاجة إلى تدريبين فقط. - ابدأ بمثقاب تجريبي رمح (الشكل 4) على عمق 2.4 مم تحت الري بالمحلول الملحي.
ملاحظة: كان لكل مثقاب 10 استخدامات كحد أقصى. - كمثقاب ثان ، استخدم (الشكل 4) مثقاب تصميم ملتوي على عمق 2.4 مم بقطر 1.6 مم تحت محلول ملحي.
ملاحظة: كان لكل مثقاب 10 استخدامات كحد أقصى.
- ابدأ عملية الحفر في المنطقة الصحيحة بين قمة الظنبوب القريبة والحد الخلفي للوجه الإنسي لعظم الظنبوب ، المتاخمة لإدخال عضلة الظنبوب القحفية ، والجراسيليس ، وعضلة الرأس الجانبية الساقية ، وتجنب أي إصابة عضلية.1
- وضع الزرع
- أدخل الغرسة بقطعة وسيطة (الشكل 5) متصلة بزاوية الاختزال 20: 1.
- قبل وضع الغرسة ، قم بتنظيف الغرسة من أي معقم كيميائي متبقي عن طريق تدويرها في الزاوية المعاكسة مع الري الملحي المتزامن لمدة 10 ثوان (الشكل 5).
- ضع غرسة التيتانيوم (2 مم بالطول وقطر 1.8 مم) باستخدام القطعة الوسيطة عند 20 دورة في الدقيقة مع مراقبة قيمة عزم الدوران في الوقت الفعلي ، وتسجيل أقصى عزم دوران للإدراج.
ملاحظة: من المتوقع وجود صعوبة أولية في إدخال الغرسة بسبب الاختلاف بين المثقاب النهائي والزرع ، بالإضافة إلى المظهر الأسطواني للزرع ؛ ومع ذلك ، يتم تطبيع هذه الصعوبة الأولية بسرعة بمجرد اختراق الغرسة للعظم القشري الأولي. - قم بإنهاء إدخال الزرع قبل أن يمر تماما بالعظم القشري حيث يتم إدخاله ، أي الوجه الإنسي المسطح للساق.
ملاحظة: في اللحظة الأخيرة من إدخال الغرسة ، من المهم ترك الغرسة خارج العظم القشري قليلا أو مستوية مع العظم القشري حيث يتم إدخالها ، أي الوجه الإنسي المسطح للساق ، لضمان الاستقرار الأساسي (الشكل 6).
- إغلاق الجرح
- خياطة حدود الأنسجة العضلية بخيوط داخلية بسيطة باستخدام خيوط اصطناعية قابلة للامتصاص 4/0 أحادية الشعيرات (Glyconate) (الشكل 7).
- قم بإجراء إغلاق الجلد بخياطة داخل الأدمة باستخدام خياطة قابلة للامتصاص الاصطناعية 4/0 أحادية الشعيرات (Glyconate) (الشكل 7).
4. التصوير المقطعي المحوسب الدقيق
- بعد الانتهاء من الجراحة وما زلت تحت التخدير العام ، قم بإجراء فحص بالأشعة المقطعية الدقيقة لتأكيد وضع الزرع المناسب.
- أخرج الجرذ من سرير الجراحة وضعه على سرير المسح. حدد موقع الساق التي خضعت للجراحة باستخدام وضع المسح المباشر بالأشعة المقطعية الدقيقة وقم بتوسيط مجال الرؤية على الغرسة.
ملاحظة: معلمات الاستحواذ الموصى بها هي مجال رؤية 5 مم ، ودقة مكانية تبلغ 0.0001 مم3 ، و 50 كيلو فولت ، و 200 ميكرو أمبير ، ووقت اكتساب 3 دقائق. - بمجرد الحصول على الفحص ، تأكد من المسافة الصحيحة بين الجانب القريب من الغرسة وسطح الهضبة الظنبوبية ، وفقا للخطوة 5.2.1.
ملاحظة: ستكون هذه القيمة مفيدة لتوحيد التقنية (الشكل 8).
5. رعاية ما بعد الجراحة
- بعد الحصول على التصوير ، أعد الجرذ إلى قفصه وراقبه حتى الشفاء التام.
ملاحظة: يستغرق هذا حوالي 5-10 دقائق ، اعتمادا على النموذج الحيواني. من المتوقع أن تظل الفئران المصابة بالسكري مخدرة لفترة أطول ولديها وقت أطول للتعافي بسبب التغيرات الأيضية المرتبطة بمرض السكري. - تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/ كغ) كل 6-8 ساعات وميلوكسيكام (5 ملغ/ كغ) كل 24 ساعة، تحت الجلد، حتى 72 ساعة.
- وقت إزالة خياطة
- افحص الجرح الجراحي يوميا بحثا عن العدوى أو سلامة الخياطة أو غيرها من المشكلات ، وقم بإزالة بقايا الخيوط ، إذا لزم الأمر ، بعد 15 يوما من الجراحة.
6. القتل الرحيم
- القتل الرحيم للحيوانات باستخدام غرفة CO2 ، وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، بمعدل ملء CO2 بنسبة 30٪ -70٪ من حجم الغرفة / دقيقة بعد وقت الزرع (4 أسابيع أو 12 أسبوعا).
7. تحليل ما بعد الجراحة
- لكلا النموذجين (هشاشة العظام والسكري) ، قم بإزالة الساق عن طريق التفكك بعد القتل الرحيم لمزيد من التحليل.
ملاحظة: فيما يتعلق بتحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، سمحت البيانات بحساب ملامسة زرع العظام (BIC). تم إجراء الاستحواذ على التصوير المقطعي المحوسب باستخدام المعلمات الموصوفة سابقا ، وتم إجراء تحليل BIC بقسمة منطقة العظم (مم2) على منطقة الزرع (مم2) المحسوبة في المنطقة القشرية ، مع تكييف بروتوكول سبق وصفه في الأدبيات18. يتم عرض صور تمثيلية لكل نموذج ، هشاشة العظام (الشكل 9) ومرض السكري (الشكل 10).
النتائج
المرحلة الجراحية
من المهم الإشارة إلى أن كلا النموذجين الحيوانيين المستخدمين في هذه الدراسة يمثلان قيودا معينة بسبب الأمراض المستحثة. تنعكس هذه القيود المتعلقة بالتلاعب بالأنسجة الصلبة والرخوة أثناء العملية الجراحية.
في نموذج السكري ، يكون الجرذ أكبر ، مما يجعل من الصعب تثبيت الساقين أثناء العمليات الجراحية. هذا يزيد من وقت الجراحة ، وبالتالي وقت التخدير ، الأمر الذي يتطلب وقتا أطول للشفاء ، وبالتالي يتطلب قدرا أكبر من اليقظة في فترة ما بعد الجراحة.
أما بالنسبة لنموذج هشاشة العظام ، فقد كانت المتطلبات مختلفة تماما ، حيث كانت أكثر تركيزا في وقت التلاعب بالعظام. في هذه الحالة ، من الممكن ملاحظة نزيف أكبر أثناء إجراء الحفر. بالإضافة إلى ذلك ، تصبح عملية وضع الزرع أكثر صعوبة. قد تحدث بعض المضاعفات ، مثل الشقوق الصغيرة في العظام ، وتغيير تقدم الغرسة أثناء دخولها وجعلها أكثر استقرارا بسبب عدم وجود مقاومة العظام على الجدران الجانبية للزرع. يتطلب هذا القيد مزيدا من الضغط اليدوي والاستقرار أثناء التنسيب ، مما يجعل التحكم فيه أكثر صعوبة حتى يتم تحقيق الموضع الصحيح للزرع.
فيما يتعلق بعزم الدوران الأقصى لإدخال الزرع ، لوحظت قيم مختلفة نسبيا للمرضين (الجدول 1). بشكل عام ، كان الحد الأقصى لمتوسط عزم الإدراج الملاحظ لنموذج هشاشة العظام أعلى من نموذج السكري. مع هذه النتائج ، من المثير للاهتمام فهم تأثير مرض السكري على كثافة العظام ومقاومة العظام لإدخال الزرع ، حيث يبدو أن هذه الحالة لها تأثير أكثر حدة على الخواص الميكانيكية للعظام مقارنة بهشاشة العظام.
تحليل ما بعد الجراحة
تم تحليل الموضع المناسب لزراعة التيتانيوم بعد 4 أسابيع و 12 أسبوعا من الزرع عن طريق التصوير المقطعي المحوسب الدقيق. يتم توفير صور تمثيلية لكل من الفئران المصابة بهشاشة العظام (الشكل 9) والسكري (الشكل 10). بشكل عام ، تم زرع الغرسات بشكل صحيح من خلال الظنبوب القشري والتربيقي ، مما يدل على اتصال حميم ومستمر مع الجزء القشري ، وبدون أي علامات التهاب أو ردود فعل سلبية ، مما يثبت نجاح البروتوكول الجراحي لكلا النموذجين من علم الأمراض.
بشكل جماعي ، سمح تحليل الصور أيضا بحساب نسبة مساحة العظام (مم2) مقابل مساحة الزرع (مم2) ، المشار إليها باسم V (BIC) ، في المنطقة القشرية ، ومقارنة أداء الإجراء الجراحي بمرور الوقت وداخل النماذج. كما هو موضح في الشكل 11 ، ظلت قيم V (BIC) ثابتة لنموذج هشاشة العظام في 4 أسابيع و 12 أسبوعا ، مما يشير إلى تكامل مستقر للزرع بمرور الوقت ويسلط الضوء على أن الاتصال الحميم بالعظام مضمون بالفعل في 4 أسابيع. وتجدر الإشارة إلى أنه تم الحصول على قيم متشابهة جدا لنموذج السكري ، مما يدل على كفاية بروتوكول الدراسة لكلا النموذجين من علم الأمراض.
الشكل 1: المجال الجراحي. يظهر المجال الجراحي الموضع الصحيح للفأر وتعرض المنطقة المراد تدخلها ، وتكييف المحول المخروطي مع الشعب الهوائية للحفاظ على التخدير أثناء العملية ، وكذلك الأدوات اللازمة للتدخل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شق جراحي. التثبيت الصحيح لمخلب الفئران ، وفي الوقت نفسه ، تثبيت الجلد المتحرك الرقيق للحصول على شق صحيح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعرف على تعرض العظام وإدخال العضلات. الجانب الأيسر: انفصال كامل للأنسجة مع ما يترتب على ذلك من تعرض للعظام. للحفاظ على وتجنب الأضرار التي لحقت إدخال عضلة الظنبوب القحفية ، و gracilis ، وعضلات الرأس الجانبية gastrocnemius ، من المهم تحديد الأنسجة البيضاء الليفية الملتصقة بقوة بالعظم بشكل صحيح ، والتي تظهر في الشكل على الجانب الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تسلسل الحفر. يبدأ تسلسل عملية الحفر بمثقاب الرمح التجريبي على اليسار ، متبوعا بمثقاب الالتواء على اليمين. لضمان إجراء حفر مستقر وآمن ، من المهم الحفاظ على استقرار كل من الساق والأنسجة الرخوة أثناء الحفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحضير لإدخال الغرسة. يتم إدخال الغرسة على قطعة وسيطة لتقديمها لعملية التنظيف بمحلول ملحي بينما تدور الغرسة عند 20 دورة في الدقيقة. تسمح هذه القطعة الوسيطة بإدخال الغرسة في العظم بجهاز إلكتروني. يضمن هذا الجهاز التحكم في سرعة إدخال الغرسة ويسجل عزم الإدخال في الوقت الفعلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: وضع غرسة التيتانيوم. يتطلب وضع الغرسة داخل العظم وضعها على الوجه المسطح للعظم الإنسي ، بعيدا عن الحدود القريبة للوجه الأمامي الإنسي للعظم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إغلاق الجرح. لوحظت خطوات إغلاق الجرح في 2 طائرات مختلفة. على اليسار: يتكون المستوى الأول الأعمق بغرز بسيطة لتقريب حواف الأنسجة العضلية. اليمين: يتم تنفيذ المستوى الثاني الأكثر سطحية بخياطة داخل الأدمة لتقريب الجلد مع منع العقدة من أن تكون في وضع خارجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لوضع الزرع بعد العملية الجراحية. يوضح الشكل موضع الجرذ في الماسح الضوئي Micro-CT ، وتنقسم صور موضع الزرع إلى ثلاثة أقسام ، تتوافق مع وجهات النظر x و y و z ، على التوالي. يتم توجيه الغرسة بسهم أحمر في وجهات النظر المختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لغرسة موضوعة في قصبة فأر مصاب بهشاشة العظام. صور تمثيلية للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق بعد الجراحة لزراعة التيتانيوم الموضوعة في قصبة الفئران المصابة بهشاشة العظام بعد (أ) 4 أسابيع و (ب) 12 أسبوعا من الزرع. تنقسم كل صورة إلى ثلاثة أقسام ، تتوافق مع طرق العرض x و y و z ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لزرع يوضع في قصبة فأر مصاب بالسكري. صور تمثيلية للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق بعد الجراحة لزراعة التيتانيوم الموضوعة في قصبة الفئران المصابة بهشاشة العظام بعد (أ) 4 أسابيع و (ب) 12 أسبوعا من الزرع. تنقسم كل صورة إلى ثلاثة أقسام ، تتوافق مع طرق العرض x و y و z ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: تحليل ملامسة العظام والغرسة (BIC). قيم V (BIC) محسوبة على أنها مساحة العظام (مم2) * 100 / مساحة الزرع (مم2) من صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لنماذج هشاشة العظام (Osteo) والسكري (Diab) بعد 4 أسابيع (4 واط) و 12 أسبوعا (12 واط) بعد الزرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أقصى عزم دوران لإدخال الغرسة [N·cm] | ||
| نموذج | الساق اليمنى | الساق اليسرى |
| هشاشه العظام | 6.11 ± 0.96 | 6.49 ± 1.34 |
| داء السكري | 4.79 ± 1.70 | 4.90 ± 1.76 |
الجدول 1: أقصى عزم دوران للإدراج. الاختلافات في قيم عزم الدوران القصوى التي تم الحصول عليها أثناء إدخال الزرع بين الفئران المصابة بالسكري والفئران المصابة بهشاشة العظام. تقدم الفئران المصابة بداء السكري قيم عزم دوران قصوى أقل من الفئران المصابة بهشاشة العظام.
المناقشة
على الرغم من أن الجرذ هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الاندماج العظمي ، فمن المهم تحديد ووصف تقنية جراحية قابلة للتكرار لوضع الغرسات بشكل مناسب. ويمكن أن تكون هذه التقنية بمثابة دليل للمجتمع العلمي. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أن بعض الأمراض ، مثل هشاشة العظام والسكري ، تغير عملية التمثيل الغذائي للعظام تعني مطالب أقوى لتصميم العمليات الجراحية بشكل صحيح. يقارن الجرذ بشكل إيجابي مع النماذج الحيوانية الأخرى لأنه يقدم السمات الرئيسية لكل من هشاشة العظام (الكسور العفوية ومنخفضة التأثير) ومرض السكري والسمنة الناجمة عن النظام الغذائي دون الحاجة إلى مرافق متخصصة مكلفة وتجارب طويلة ومكلفة ، والسيطرة والصيانة بعد العمليةالجراحية 19. يسهل حجم الجرذ الصغير وخصوبته العالية وعمره القصير إجراء تجارب واسعة النطاق وفعالة من حيث الوقت مع تلبية متطلبات R الثلاثة للتجارب على (الاستبدال والتقليل والصقل)20.
على الرغم من الكم الكبير من الأدبيات العلمية في هذا المجال ، لا يوجد سوى عدد قليل من المقالات العلمية التي تصف التقنيات الجراحية التفصيلية. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى تغفل المعلومات الجراحية الحاسمة ، مما يمنع إمكانية تكرار التقنيات الموصوفة.
في هذا البروتوكول الجراحي ، يجب مراعاة العديد من الخطوات الحاسمة طوال العملية الجراحية ، مثل موقع الشق ، والموقع الدقيق للحفر ووضع الزرع ، وتقنية الحفر ، والأبعاد الدقيقة للزرع ، والمثقاب النهائي المستخدم لإدخال الزرع.
في الأدبيات ، غالبا ما يكون الموقع الدقيق للشق غير دقيق ، ويفتقر إلى أساس علمي لوضعه. يجب إجراء الشق في منطقة مختلفة عن منطقة وضع الزرع. من المهم تجنب وضع الشق والخيط الناتج مباشرة فوق المنطقة المزروعة للحفاظ على سلامة السمحاق المنفصل فوق الغرسة. يمكن أن يؤدي الشق والانفصال الأولي للسديلة كاملة السماكة إلى تعطيل تدفق الدم وإتلاف السمحاق ، مما قد يؤدي إلى اضطراب في نشاط الخلايا السمحاق أثناء تكوين العظام الجديدة ، كما لوحظ في دراسات أخرى21. يهدف هذا النهج إلى تحسين تكوين العظام المحيطة بالزرع وتقليل الصدمات أو ضعف الشفاء أو التليف أو خطر الاستعمار البكتيري في منطقة الخياطة. في هذه الطريقة ، يتم تفصيل الشق وصنعه في قمة الظنبوب القريبة ، مما يضمن أنه ليس فوق موقع وضع الزرع مباشرة.
عند تحديد منطقة وضع الزرع ، من الضروري ضمان كثافة عظام موحدة عبر العينة. عادة ، تتم الإشارة إلى القياسات إلى هضبة الظنبوب. بالنظر إلى اختلاف الحجم الطولي بين الفئران ، فإن المرجع التشريحي ضروري لوضع الغرسات باستمرار في نفس المنطقة. في هذه الطريقة ، تعمل المنطقة المجاورة لإدخال عضلات الرأس الجانبية الظنبوبية ، و gracilis ، و gastrocnemius كمرجع تشريحي موثوق. من المتوقع أن تظهر هذه المنطقة ، التي تتميز بإدخالات عضلية ، كثافة عظام متجانسة في جميع أنحاء العينة.
عند مناقشة طريقة الحفر ، من الضروري تقديم تفاصيل دقيقة حول نوع / أبعاد المثقاب (المثقاب) ، وسرعة الحفر (تقاس عادة بعدد الدورات في الدقيقة) ، ودرجة حرارة المحلول الملحي. هذه العوامل ضرورية في منع منطقة نخرية واسعة النطاق والتكوين اللاحق للأنسجة الليفية 22,23 ، كما هو موضح في العديد من الدراسات التي تركز على التفاعلات الميتة التي يسببها الحفر. ومع ذلك ، فإن بعض المواد تتجاوز هذه الحدود البيولوجية24 في طرق الحفر الخاصة بها ، في حين أن البعض الآخر يحذف هذه المعلومات الهامة تماما4،25،26،27،28. تؤكد هذه الدراسة على الاحتياطات الدقيقة المتخذة أثناء إجراءات الحفر لتقليل الصدمات الجراحية ونخر الأنسجة. لقد اخترنا إجراء حفر آمن بسرعة قصوى تبلغ 150 دورة في الدقيقة ، وهو مستوى يعتبر آمنا من حيث درجة حرارة العظام حتى بدون محلول ملحي. هذا النهج فعال من حيث سرعة الحفر ويسمح بالتحكم الجيد في الحفر أثناء الإجراء29,30. بالإضافة إلى ذلك ، حافظنا على الري والتبريد باستخدام محلول ملحي عند حوالي 20 درجة مئوية للتخفيف من أي آثار حرارية محتملة.
معلومة أخرى ذات صلة يتم حذفها بشكل متكرر هي حجم الغرسة المستخدمة. هذا الإغفال يجعل من المستحيل تفسير العلاقة بين حجم المثقاب النهائي وحجم الغرسة. هذا التناقض أمر بالغ الأهمية في تقييم استقرار الغرسة ، والتي قد تؤدي في العجز إلى عدم الاستقرار ، بينما في الزائدة ، قد تسبب ضغطا زائدا وتفاعلا إقفاريا نخريا.
من الأهمية بمكان ملاحظة أنه لتحقيق الاستقرار الأساسي ، يجب أن يكون هناك اختلاف طفيف في القطر بين المثقاب النهائي والزرع ، مع كون الغرسة أكبر قليلا في القطر. هذه المعلمة الجراحية الحرجة لتحقيق الاستقرار الأولي ليست متسقة دائما في الأدبيات ، حيث تتميز بعض المنهجيات بمثقاب نهائي بقطر أكبر من الغرسة الموضوعة4. بالنظر إلى أن هذه المنطقة تتميز بإدخالات عضلية ، فمن المتوقع وجود كثافة عظام متجانسة وقوية في جميع أنحاء العينة. تساعد هذه الخاصية على تجنب القيد الأساسي المبلغ عنه لتدخلات الظنبوب للفئران ، أي النمو الطولي للساق بمرور الوقت31. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة بالتحكم في درجة الحرارة ، ومعالجة أحد أسباب المضاعفات والمراضة اللاحقة23. ومع ذلك ، على غرار الدراسات الأخرى ، تواجه هذه الدراسة أيضا قيودا تتعلق بالحاجة إلى تكييف الجهاز بسبب الاختلافات في حجم الساق 4,17.
مصدر قلق آخر يتعلق بعدد المستخدمة هو أهمية اختيار حجم العينة المناسب. هذا أمر بالغ الأهمية لتعظيم تأثير نتائج البحوث مع تقليل استخدام. مثل هذه الاستراتيجية لا تحسن كفاءة وموثوقية الدراسات فحسب ، بل تؤكد أيضا على الاعتبارات الأخلاقية في البحث العلمي. وينبغي بذل جهود متواصلة لتحقيق أقصى قدر من هذه الكفاءة.
باختصار ، توفر الطريقة الحالية وصفا مفصلا لجميع العمليات الجراحية وتسمح بمراقبة التحديات الجراحية المختلفة في كلا المرضين. علاوة على ذلك ، يبرز هذا البروتوكول كطريقة صالحة لأن جميع العينات ذات الاتصال المباشر بالعظم حققت قيم V (BIC) مستقرة. ومع ذلك ، فإنه يختلف عن غالبية الدراسات التجريبية في الأدبيات من خلال تقديم تقنية مفصلة ومبررة ، مما يسمح بالتكاثر الدقيق. وبالتالي ، يمكن استخدامه لدراسة تأثير أسطح الزرع المختلفة في الأمراض المختلفة ، بما في ذلك تلك التي تؤثر على كثافة العظام.
الإفصاحات
نعلن بموجب هذا أنه لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه المقالة العلمية.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون وكالة الأبحاث الحكومية الإسبانية على الدعم المالي من خلال المشاريع PID2020-114019RBI00 و PID2021-125150OB-I00.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 22 إبر G + A2: C30 | Terumo | NN-2238R | |
| 4/0 خياطة اصطناعية قابلة للامتصاص خياطة أحادية الشعيرات | براون (MonoSyn) | ||
| 5 مل ، 10 مل محاقن | براون | 4617100V-02 4606051V | |
| ملقط Adson | Ant & atilde ؛ o المرجع الطبي | : A586 | |
| BBDR (مقاومة للتربية الحيوية لمرض السكري) Sprague Dawley Rats | Janvier Labs | ||
| Betadine | Mylan | ||
| Buprecare | Animalcare (المملكة المتحدة) | ||
| Castroviejo Caliper 0-40 مم 15 سم بزاوية | UL AMIN Industries | ||
| Castroviejo حامل إبرة | Ant & atilde ؛ o المرجع الطبي | : AM1702 | |
| مقص جراحة الأسنان منحني ومستقيم | Ant & atilde ؛ o ماكينة حلاقة كهربائية طبية | AMA603 / AMA600 | |
| Oster Pro 3000i | 34264482227 | ||
| ملقط Graefe فائق الدقة | FST | المرجع: 11150-10 | |
| وسادات شاش | COVIDIEN | 441001 | |
| Glucometer | Menarini (إيطاليا) | ||
| مثقاب حلزوني / OSTEO-PIN DRILL & Oslash ؛ 1.6 مم | soadco | المرجع OS-8001 | |
| يزرع / SCREW OSTEO-PIN & Oslash ؛ 1.8 × 2.0 مم | soadco | المرجع OS-3 | |
| Isoflo | Le Vet Pharma (هولندا) | ||
| مثقاب تجريبي لانس / مثقاب لانسولات (DS) | soadco | المرجع 10 02 01 قفازات | |
| T Latex - قفازات جراحية معقمة | Hartmann | المرجع: 9426495 | |
| Lucas Surgical Curette | Ant & atilde ؛ o المرجع الطبي | : AMA940-3 | |
| Metacam | Boehringer Ingelheim (ألمانيا) | ||
| ملقط دقيق مستقيم | nopa | المرجع: AB 542/12 | |
| Micro-CT (Quantum Fx microCT) Perkin | Elmer (الولايات المتحدة) | ||
| هشاشة العظام Sprague Dawley الإناث الفئران Janvier | Labs | ||
| مصعد السمحاق - ؛ تساقط 2-4 | النمل & atilde; o المرجع الطبي | : A1564 | |
| الحل الفسيولوجي للري | Hygitech | المرجع: 10238 | |
| شفرة مشرط الكربون الصلب 15C | Razor Med | المرجع: 02846 | |
| مسحات شاش معقمة | Alledental | المرجع: 270712 | |
| نظام الري المعقم | Hygitech | المرجع: HY1-110001D | |
| مناشف معقمة (قطعة واحدة لكل) | Dinarex | 4410 | |
| قبضة الزاوية المضادة الجراحية | W & H | المرجع: WS-75 LED G | |
| قبضة الزاوية المضادة الجراحية | W & H | SN 08877 | |
| قبضة جراحية مضادة الزاوية | W & H | SN 01309 | |
| محرك كهربائي جراحي | WH نوع المزروع: SI-1023 | ؛ المرجع: 30288000 | |
| مقبض مشرط جراحي | AsaDental | Ref: 0350-3 | |
| مشابك منشفة | Xelpov الجراحية | AF-773-11 | |
| جهاز الموجات فوق الصوتية | JP Selecta ، Abrera ، إسبانيا |
المراجع
- Turner, R. T., et al. Animal models for osteoporosis. Rev Endocr Metab Disord. 2 (1), 117-127 (2001).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: Animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (3), 193-207 (2001).
- Kim, B. T., et al. The structural and hormonal basis of sex differences in peak appendicular bone strength in rats. J Bone Miner Res. 18 (1), 150-155 (2003).
- Alenezi, A., Galli, S., Atefyekta, S., Andersson, M., Wennerberg, A. Osseointegration effects of local release of strontium ranelate from implant surfaces in rats. J Mater Sci Mater Med. 30 (10), 116(2019).
- Blanc-Sylvestre, N., Bouchard, P., Chaussain, C., Bardet, C. Pre-clinical models in implant dentistry: Past, present, future. Biomedicines. 9 (11), 1538(2021).
- Schliephake, H., et al. Functionalization of titanium implants using a modular system for binding and release of VEGF enhances bone-implant contact in a rodent model. J Clin Periodontol. 42 (3), 302-310 (2015).
- Mafra, C. E. S., et al. Effect of different doses of synthetic parathyroid hormone (1-34) on bone around implants: A preclinical rat model. Braz Dent J. 30 (1), 43-46 (2019).
- Rybaczek, T., Tangl, S., Dobsak, T., Gruber, R., Kuchler, U. The effect of parathyroid hormone on osseointegration in insulin-treated diabetic rats. Implant Dent. 24 (4), 392-396 (2015).
- Zou, G. K., et al. Effects of local delivery of bfgf from plga microspheres on osseointegration around implants in diabetic rats. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 114 (3), 284-289 (2012).
- Zhang, J., et al. Effect of nerve growth factor on osseointegration of titanium implants in type 2 diabetic rats. Int J Oral Maxillofac Implants. 31 (5), 1189-1194 (2016).
- Kuchler, U., et al. Intermittent parathyroid hormone fails to stimulate osseointegration in diabetic rats. Clin Oral Implants Res. 22 (5), 518-523 (2011).
- Hashiguchi, C., Kawamoto, S., Kasai, T., Nishi, Y., Nagaoka, E. Influence of an antidiabetic drug on biomechanical and histological parameters around implants in type 2 diabetic rats. Implant Dent. 23 (3), 264-269 (2014).
- Han, Y., et al. Sustained topical delivery of insulin from fibrin gel loaded with poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres improves the biomechanical retention of titanium implants in type 1 diabetic rats. J Oral Maxillofac Surg. 70 (10), 2299-2308 (2012).
- De Molon, R. S., et al. Impact of diabetes mellitus and metabolic control on bone healing around osseointegrated implants: Removal torque and histomorphometric analysis in rats. Clin Oral Implants Res. 24 (7), 831-837 (2013).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of c57bl/6j and c57bl/6n mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
- Cirano, F. R., et al. Effect of curcumin on bone tissue in the diabetic rat: Repair of peri-implant and critical-sized defects. Int J Oral Maxillofac Surg. 47 (11), 1495-1503 (2018).
- De Oliveira, M. A., et al. The effects of zoledronic acid and dexamethasone on osseointegration of endosseous implants: Histological and histomorphometrical evaluation in rats. Clin Oral Implants Res. 26 (4), e17-e21 (2015).
- Vandeweghe, S., Coelho, P. G., Vanhove, C., Wennerberg, A., Jimbo, R. Utilizing micro-computed tomography to evaluate bone structure surrounding dental implants: A comparison with histomorphometry. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 101 (7), 1259-1266 (2013).
- Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 140-162 (2018).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: Innovation, implementation, ethics and society. Front Vet Sci. 10, 1185706(2023).
- Melcher, A. H. Role of the periosteum in repair of wounds of the parietal bone of the rat. Arch Oral Biol. 14 (9), 1101-1109 (1969).
- Barrak, I., et al. Heat generation during guided and freehand implant site preparation at drilling speeds of 1500 and 2000 rpm at different temperatures: An in vitro study. Oral Health Prev Dent. 17 (4), 309-316 (2019).
- Kniha, K., et al. Effect of thermal osteonecrosis around implants in the rat tibia: Numerical and histomorphometric results in context of implant removal. Sci Rep. 12 (1), 22227(2022).
- Da Silva, J. P., et al. Apoptosis in bone defect of diabetic rats treated with low intensity laser: Radiological and immunohistochemical approach. International Journal of Morphology. 35, 178-183 (2017).
- Zeller-Plumhoff, B., et al. Analysis of the bone ultrastructure around biodegradable Mg-χGd implants using small angle X-ray scattering and X-ray diffraction. Acta Biomater. 101, 637-645 (2020).
- Bruns, S., et al. On the material dependency of peri-implant morphology and stability in healing bone. Bioact Mater. 28, 155-166 (2023).
- De Morais, J. A., et al. Effect of diabetes mellitus and insulin therapy on bone density around osseointegrated dental implants: A digital subtraction radiography study in rats. Clin Oral Implants Res. 20 (8), 796-801 (2009).
- Aydemir Celep, N., Kara, H., Erbas, E., Dogan, E. Radioprotective role of amifostine on osteointegration of titanium implants in the tibia of rats. J Vet Sci. 24 (3), 35(2023).
- Delgado-Ruiz, R. A., et al. Slow drilling speeds for single-drill implant bed preparation. Experimental in vitro study. Clin Oral Investig. 22 (1), 349-359 (2018).
- Abdel Motagly, M., El Khadem, A., Abdel Rassoul, M. Assessment of low-speed drilling without irrigation, versus convencionaldrilling with irrigation regarding heat generation and peri-implant marginal bone loss (randomised clinical trial). Alex Dent J. 46 (2), 33-38 (2021).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن