مقالة منهجية

إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

مارس 8, 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة المستحلب المقلوب المستخدمة لتغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا (CFE) داخل حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة (GUV) للتحقيق في تخليق ودمج بروتين غشاء نموذجي في طبقة الدهون المزدوجة.

الملخص

تعد أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE) أدوات قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتقليد الحيوي للوظائف الخلوية مثل الاستشعار الحيوي وتجديد الطاقة في الخلايا الاصطناعية. ومع ذلك ، تتطلب إعادة بناء مجموعة واسعة من العمليات الخلوية إعادة تكوين ناجحة للبروتينات الغشائية في غشاء الخلايا الاصطناعية. في حين أن التعبير عن البروتينات القابلة للذوبان عادة ما يكون ناجحا في أنظمة CFE الشائعة ، فقد ثبت أن إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الطبقات الثنائية الدهنية للخلايا الاصطناعية يمثل تحديا. هنا ، يتم عرض طريقة لإعادة تكوين بروتين غشاء نموذجي ، مستقبلات الغلوتامات البكتيرية (GluR0) ، في حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كخلايا اصطناعية نموذجية تعتمد على تغليف وحضانة تفاعل CFE داخل الخلايا الاصطناعية. باستخدام هذه المنصة ، تم إثبات تأثير استبدال ببتيد الإشارة N-terminal ل GluR0 بببتيد إشارة proteorhodopsin على النقل المشترك الناجح ل GluR0 إلى أغشية GUVs الهجينة. توفر هذه الطريقة إجراء قويا يسمح بإعادة تكوين البروتينات الغشائية المختلفة في الخلايا الاصطناعية الخالية من الخلايا.

المقدمة

اكتسبت البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى اهتماما متزايدا على مدى العقد الماضي كمجال ناشئ مع العديد من التطبيقات المحتملة في الهندسة الحيوية ، وتوصيل الأدوية ، والطب التجديدي1،2. اجتذب تطوير الخلايا الاصطناعية كحجر زاوية في البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى ، على وجه الخصوص ، مجموعة واسعة من المجتمعات العلمية بسبب التطبيقات الواعدة للخلايا الاصطناعية بالإضافة إلى خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية الشبيهة بالخلايا التي تسهل الدراسات الفيزيائية الحيوية في المختبر 3،4،5،6. غالبا ما يتم تصميم الخلايا الاصطناعية في حويصلات أحادية الصفيحة عملاقة بحجم الخلية (GUVs) حيث يتم إعادة إنشاء عمليات بيولوجية مختلفة. إعادة تكوين الهيكل الخلويالخلوي للخلية 7,8 ، وتجديد الطاقة المعتمدة على الضوء9 ، والاتصالات الخلوية10,11 ، والاستشعار الحيوي12 هي أمثلة على الجهود المبذولة لإعادة بناء السلوكيات الشبيهة بالخلايا في الخلايا الاصطناعية.

بينما تعتمد بعض العمليات الخلوية على البروتينات القابلة للذوبان، فإن العديد من خصائص الخلايا الطبيعية، مثل الاستشعار والتواصل، غالبا ما تستخدم البروتينات الغشائية، بما في ذلك القنوات الأيونية والمستقبلات والناقلات. التحدي الرئيسي في تطوير الخلايا الاصطناعية هو إعادة تكوين البروتينات الغشائية. على الرغم من أن الطرق التقليدية لإعادة تكوين البروتين الغشائي في طبقات الدهون المزدوجة تعتمد على التنقية بوساطة المنظفات ، إلا أن هذه الطرق شاقة وغير فعالة للبروتينات السامة لمضيف التعبير ، أو غالبا ما تكون غير مناسبة لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs13.

طريقة بديلة للتعبير عن البروتين هي أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE). كانت أنظمة CFE أداة قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتعبير في المختبر عن البروتينات المختلفة باستخدام إما تحلل الخلية أو آلة ترجمة النسخالمنقى 14. يمكن أيضا تغليف أنظمة CFE في GUVs ، مما يسمح بتفاعلات تخليق البروتين المجزأة التي يمكن برمجتها لتطبيقات مختلفة ، مثل إنشاء خلايا اصطناعية لحصاد الضوء9 أو أجهزة استشعار حيوية حساسة ميكانيكيا15,16. على غرار طرق التعبير عن البروتين المؤتلف ، يمثل تعبير البروتين الغشائي تحديا في أنظمة CFE17. يعد التجميع والطي الخاطئ وعدم وجود تعديل ما بعد الترجمة في أنظمة CFE من الاختناقات الرئيسية التي تعيق تخليق البروتين الغشائي الناجح باستخدام أنظمة CFE. ترجع صعوبة إعادة تكوين البروتين الغشائي من أسفل إلى أعلى باستخدام أنظمة CFE جزئيا إلى عدم وجود مسار حيوي معقد للبروتين الغشائي يعتمد على ببتيدات الإشارة وجزيئات التعرف على الإشارات والترانسلوكونات وجزيئات المرافقة. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، اقترحت دراسات متعددة أن وجود هياكل غشائية مثل الميكروسومات أو الجسيمات الشحمية أثناء الترجمة يعزز التعبير الناجح للبروتين الغشائي18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، وجد Eaglesfield et al. و Steinküher et al. أن إدراج مجالات محددة كارهة للماء تعرف باسم ببتيدات الإشارة في المحطة N لبروتين الغشاء يمكن أن يحسن بشكل كبير تعبيره22,23. إجمالا ، تشير هذه الدراسات إلى أنه يمكن التغلب على التحدي المتمثل في إعادة تكوين البروتين الغشائي في الخلايا الاصطناعية إذا حدثت ترجمة البروتين في وجود غشاء GUV وإذا تم استخدام ببتيد إشارة N-terminal المناسب.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتغليف تخليق البروتين باستخدام تفاعلات CFE للعناصر المؤتلفة (PURE) لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs. يتم اختيار مستقبلات الغلوتامات البكتيرية24 (GluR0) كبروتين غشاء نموذجي ، ويتم دراسة تأثير ببتيد الإشارة الطرفية N على إعادة تكوين الغشاء. تم التحقيق في تأثير ببتيد إشارة البروتيورهودوبسين ، الذي ثبت أنه يحسن كفاءة إعادة تكوين البروتين الغشائي بواسطة Eaglesfield et al.22 ، من خلال بناء متغير متحور من GluR0 يشار إليه باسم PRSP-GluR0 وتتم مقارنة تعبيره وتوطين الغشاء مع GluR0 من النوع البري (يشار إليه باسم WT-GluR0 فيما بعد) الذي يؤوي ببتيد الإشارة الأصلي. يعتمد هذا البروتوكول على طريقة المستحلب المقلوب25 مع التعديلات التي تجعله قويا لتغليف CFE. في الطريقة المقدمة ، يتم استحلاب تفاعلات CFE أولا باستخدام محلول دهني في زيت يولد قطرات بحجم ميكرون تحتوي على نظام CFE ويتم تثبيتها بواسطة الطبقة الأحادية للدهون. ثم توضع قطرات المستحلب فوق واجهة الزيت والماء المشبعة بطبقة أحادية دهنية أخرى. ثم تجبر قطرات المستحلب على الانتقال عبر واجهة الزيت والماء عبر قوة الطرد المركزي. من خلال هذه العملية ، تحصل القطرات على طبقة أحادية أخرى ، وبالتالي تولد حويصلة دهنية ثنائية الطبقة. ثم يتم تحضين GUVs التي تحتوي على تفاعل CFE ، حيث يتم التعبير عن بروتين الغشاء ودمجه في غشاء GUV. على الرغم من أن هذا البروتوكول مخصص للتعبير الخالي من الخلايا ل GluR0 ، إلا أنه يمكن استخدامه للتوليف الخالي من الخلايا لبروتينات غشائية أخرى أو تطبيقات الخلايا الاصطناعية المختلفة مثل إعادة تكوين الهيكل الخلوي أو دراسات اندماج الغشاء26.

البروتوكول

وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تفاعلات CFE السائبة في وجود حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (SUVs)

  1. إعداد سيارات الدفع الرباعي
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.
    1. تحضير 5 مللي متر 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) سيارات الدفع الرباعي في قنينة زجاجية عن طريق نقل 76 ميكرولتر من محلول مخزون الملوثات العضوية الثابتة 25 ملغم / مل المذاب في الكلوروفورم.
    2. أثناء تدوير القارورة الزجاجية برفق ، قم بنفخ تيار لطيف من الأرجون في القارورة لتشكيل طبقة من الدهون المجففة في الأسفل. بعد ذلك ، قم بنقل القارورة الزجاجية إلى مجفف مع غطاء مشدود بشكل فضفاض لتبخر الكلوروفورم الزائد.
    3. الحفاظ على قارورة الزجاج في المجفف لمدة 1 ساعة. ثم أضف 0.5 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء لإذابة طبقة الدهون والدوامة لمدة 2 دقيقة تقريبا.
    4. قم بإعداد جهاز بثق صغير عن طريق نقع دعامتين للمرشح في الماء منزوع الأيونات ووضعهما على كل من دعامات الغشاء الداخلي. بعد ذلك ، انقع مرشح البولي كربونات 100 نانومتر وضعه بين دعامتي الغشاء الداخليين المثبتين معا بواسطة الغلاف الخارجي للطارد وصامولة التجنيب. ضع هذا الإعداد في حامل الطارد.
    5. اغسل حقنتين محكمتين للغاز سعة 1 مل 3 مرات بماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
    6. قم بتحميل عينة مزيج الماء الدهني في واحدة من المحاقن المانعة لتسرب الغاز سعة 1 مل وضعها في أحد طرفي الطارد الصغير باستخدام مشابك ذراع التأرجح لتثبيت المحقنة في مكانها. أدخل المحقنة الثانية في الطرف الآخر من الطارد الصغير وتأكد من الضغط عليها تماما.
      ملاحظة: عند تحميل المحقنة بمزيج الماء الدهني ، تأكد من عدم وجود هواء في المحقنة قبل تمريرها عبر آلة البثق الصغيرة.
    7. مرر مزيج الماء الدهني برفق من المحقنة الأصلية إلى المحقنة الفارغة من خلال جهاز الطارد الصغير. كرر هذه الخطوة 11 مرة لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. انقل سيارات الدفع الرباعي إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين حل سيارات الدفع الرباعي في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. تجميع تفاعل CFE
    1. قم بتجميع تفاعل CFE باتباع بروتوكول التعبير الخالي من الخلايا الذي توفره الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة مفصلة في ما يلي.
    2. امزج 10 ميكرولتر من المحلول 1 (يحتوي على الأحماض الأمينية ، NTPs ، tRNAs والركائز للإنزيمات ، والمخزن المؤقت الضروري) ، 1 ميكرولتر من المحلول 2 (البروتينات في 20٪ جلسرين) ، 2 ميكرولتر من المحلول 3 (الريبوسوم (20 ميكرومتر)) ، كمية مناسبة من ترميز الحمض النووي للذوبان sfGFP-sfCherry (1-10) 27 (يشار إليه باسم sfGFP القابل للذوبان فيما بعد) ، WT-GluR0-sfGFP ، أو PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 نانوغرام / 1000 زوج قاعدة) ، 1 ميكرولتر مثبط RNAse الفئران ، و 4 ميكرولتر من محلول 5 mM SUV للبروتينات الغشائية أو 4 ميكرولتر ماء للبروتينات القابلة للذوبان.
    3. اجعل الحجم النهائي للتفاعل يساوي 20 ميكرولتر بإضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
      ملاحظة: عند تجميع نظام CFE ، يجب الاحتفاظ بجميع المكونات على الجليد. جميع المواد حساسة لدرجة الحرارة ويمكن أن تتحلل إذا وصلت إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. حضانة تفاعل CFE ورصده
    1. انقل محلول CFE إلى صفيحة مخروطية القاع على شكل حرف V مكونة من 96 بئرا. لمنع التبخر أثناء التفاعل ، قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب.
    2. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في قارئ لوحة لمدة 4-5 ساعات أثناء مراقبة تفاعل CFE عن طريق قياس إشارة GFP بكسب 100 عند 488 نانومتر / 528 نانومتر أطوال موجية للإثارة / الانبعاث كل 2 دقيقة.

2. تفاعلات CFE المغلفة في GUVs

  1. تحضير محلول المخزن المؤقت الخارجي GUV
    1. في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، امزج 1.5 ميكرولتر من 1 متر سبيرميدين ، 37.5 ميكرولتر من 100 مللي متر ATP ، 25 ميكرولتر من 100 مللي متر GTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر CTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر UTP ، 25 ميكرولتر من 1 M فوسفات الكرياتين ، 18 ميكرولتر من 1 M خلات المغنيسيوم ، 93.33 ميكرولتر من 3 M غلوتامات البوتاسيوم ، 50 ميكرولتر من 1 M HEPES KOH (درجة الحموضة 7.4) ، 1.15 ميكرولتر من 332 mM حمض الفولينيك ، 100 ميكرولتر من 2 M الجلوكوز ، و 50 ميكرولتر من محلول المخزون من خليط 6 mM من كل من الأحماض الأمينية العشرين (أعدت باتباع البروتوكول الذي وصفه Sun et al.28).
    2. ارفع الحجم النهائي للمحلول إلى 1 مل عن طريق إضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
      ملاحظة: يجب حفظ جميع المكونات على الجليد. أضف خليط الأحماض الأمينية في النهاية لتجنب نضوب الأحماض الأمينية28. يمكن تسعير المحلول في حصص 330 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحضير خليط الدهون في الزيت
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.
    1. في غطاء الدخان ، امزج 17.3 ميكرولتر من محلول مخزون POPC 25 مجم / مل و 1.08 ميكرولتر من 50 مجم / مل بولي (بوتادين) -ب-بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO-b-PBD) كوبوليمر في قنينة زجاجية سعة 15 مل.
      ملاحظة: يحتوي محلول الدهون النهائي في الزيت على 0.5 مليمتر دهون مع 95٪ و 5٪ POPC و PEO-b-PBD ، على التوالي. تم استخدام PEO-b-PBD لتعزيز استقرار الغشاء أثناء التعبير عن البروتين ولكن تم الاحتفاظ به عند نسبة مولية منخفضة لتقليل ميل البوليمر المشترك إلى التجمع في مذيلات منفصلة عن جزيئات الدهون29,30.
    2. قم بنفخ تيار لطيف من غاز الأرجون بعناية في القارورة الزجاجية أثناء تدوير القارورة لتبخير الكلوروفورم.
    3. ماصة 1.2 مل من الزيت المعدني الخفيف في قنينة زجاجية سعة 15 مل تحتوي على الدهون المجففة.
    4. خلط الدهون والزيت عن طريق الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10-20 ثانية. سيبدو مزيج البوليمر المشترك الدهني المذاب غائما.
    5. لضمان إذابة جميع الركام الدهني الممكن في الزيت بالكامل وتشتيته في جميع أنحاء الزيت ، ضع القارورة الزجاجية في الفرن على حرارة حوالي 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الدوامة لمدة 10-20 ثانية إضافية بأقصى سرعة.
  3. تجميع وتغليف تفاعل CFE (يلخص الشكل 1 الخطوات التالية).
    1. تحضير 300 ميكرولتر من محلول GUV الخارجي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل عن طريق خلط 270 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت الخارجي CFE المحضر في الخطوة 2.1 ، و 15 ميكرولتر من 5 M NaCl ، و 15 ميكرولتر من 4.5 M KCl.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، أضف 0.45 ميكرولتر من 1 M 1،4-ديثيوثريتول (DTT) إلى محلول GUV الخارجي. الغرض من إضافة كلوريد الصوديوم و KCl هو ضبط أسمولية المحلول الخارجي لمطابقته مع محلول CFE الداخلي. يعتمد الحجم الدقيق لكلوريد الصوديوم و KCl على تعديل الأسمولية المطلوب. يمكن للمرء إضافة إما كلوريد الصوديوم أو KCl أو كليهما لضبط الأسمولية.
    2. ماصة بلطف 300 ميكرولتر من خليط الدهون في الزيت فوق محلول GUV الخارجي.
      ملاحظة: عند إضافة مزيج الزيت الدهني ، من المهم ألا يختلط الزيت بالمحلول الخارجي المائي. بعد الإضافة ، يجب أن يكون هناك واجهة مرئية بين خليط الدهون في الزيت والمحلول الخارجي GUV.
    3. احتضان واجهة الزيت والماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة للسماح للطبقة الأحادية الدهنية بالتشكل والاستقرار عند الواجهة.
    4. وفي الوقت نفسه ، اتبع القسم 1.2.1 لتجميع تفاعل CFE الذي يحتوي على الحمض النووي البلازميد الذي يشفر متغيرات بروتين الغشاء أو GFP القابل للذوبان. استبدل محلول 4 ميكرولتر من 5 مللي متر من محلول SUV أو الماء ب 4 ميكرولتر من 1 متر سكروز. سيكون هذا التفاعل هو الحل الداخلي GUV.
      ملاحظة: تم استخدام مقياس الأسمومتر لقياس الأسمولية للحلول الداخلية والخارجية. ثم تم تعديل أسمولية المحلول الخارجي وفقا لذلك بإضافة كلوريد الصوديوم أو الماء. عادة ما تكون الأسمولية لتفاعل CFE حوالي 1600 mOsm / Kg. تؤدي إضافة السكروز إلى التفاعل إلى زيادة كثافة المحلول الداخلي ، مما يسمح للحويصلات بالانتقال عبر واجهة الزيت والماء أثناء خطوة الطرد المركزي. بديل السكروز هو محلول تدرج الكثافة Opti-Prep.
    5. أضف 600 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على تفاعل CFE والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لمدة ~ 1 دقيقة لاستحلاب التفاعل في محلول الدهون في الزيت وتشكيل طبقة أحادية دهنية حول الخلايا الاصطناعية.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي الحل النهائي على أي فقاعات ويجب أن يبدو معتما.
    6. ماصة بلطف مستحلب المحلول الداخلي أعلى طبقة الزيت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل حيث تم إعداد واجهة الزيت والماء.
      ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الواجهة أو زعزعة استقرارها.
    7. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تم تحسين سرعة الطرد المركزي لهذا البروتوكول. أبلغ Adir et al.31 عن سرعة طرد مركزي مختلفة.
    8. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزالة الزيت الزائد والمحلول الخارجي بعناية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة. قم بإزالة المحلول الخارجي حتى يصبح الحجم المتبقي حوالي 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: عادة ما تكون حبيبات GUVs مرئية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ومع ذلك ، فإن عدم وجود حبيبات مرئية لا يعني بالضرورة عدم وجود عائد GUV. بدلا من استخدام الماصة ، يمكن إزالة الزيت الزائد الموجود أعلى المحلول الخارجي عن طريق الشفط. من الأهمية بمكان ضمان إزالة محلول الدهون في الزيت تماما. يمكن أن يتسبب تلوث الزيت في محلول GUV في الحصول على صور منخفضة الجودة.
    9. أعد تعليق حبيبات GUV في محلول 100 ميكرولتر المتبقي عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، انقل محلول GUV إلى صفيحة سفلية مسطحة نظيفة 96 جيدا لاحتضانها.

3. مغلفة CFE تفاعل الحضانة والتصوير

  1. قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب لمنع التبخر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعات. يمكن للمرء استخدام قارئ الألواح واتباع الخطوة 1.3.2 لإعداد قارئ اللوحة لخطوة الحضانة.
  2. بمجرد انتهاء الحضانة ، ضع لوحة البئر 96 على مرحلة التصوير لمجهر مقلوب مزود بكاميرا EMCCD (أو كاميرا sCMOS) ، ليزر يتم التحكم فيه DAQ-MX (أو نظام دمج ليزر متكامل) ، وقرص دوار CSU-X1 متحد البؤر (أو بؤري مسح بالليزر). ركز على أي عائد استثمار يحتوي على GUVs والتقط صورا بطول موجي مثير يبلغ 488 نانومتر باستخدام هدف Plan-Apochromat 60 x / 1.4 NA.
  3. احفظ صور GUVs بتنسيق .tiff.
  4. افتح الصور في برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال ، ImageJ أو Fiji). افتح لوحة إعداد السطوع / التباين . اضبط السطوع والتباين على الإعدادات المناسبة التي تجعل البروتينات الفلورية مرئية.
  5. إذا كان الهدف هو مقارنة شدة الإشارة للبروتينات المعبر عنها المختلفة ، فقم أولا بتكديس الصور الفردية ل GUVs التي تحتوي على بروتينات مختلفة باستخدام لوحة Images to Stack الموجودة أسفل القائمة الفرعية Image > Stacks . بعد ذلك ، اضبط السطوع والتباين لجميع الصور باستخدام لوحة السطوع / التباين .

النتائج

قبل تغليف تفاعلات CFE ، تم التعبير عن نوعين مختلفين من GluR0-sfGFP يؤويان ببتيدات إشارة أصلية وبروتيورهودوبسين (يتم عرض تسلسل ببتيد الإشارة في الجدول التكميلي 1) ، وتم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان بشكل فردي في تفاعلات مجمعة ، وتم رصد تعبيرهما عن طريق اكتشاف إشارة sfGFP باستخدام قارئ لوحة (الشكل 2 أ). تم التعبير عن البروتينات الغشائية في غياب أو وجود سيارات الدفع الرباعي 100 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام منحنى معايرة يربط إشارة sfGFP بتركيزها (الشكل التكميلي 1) ، تم تقدير تركيزات البروتينات المركبة (الجدول التكميلي 2). من الواضح أن sfGFP القابل للذوبان كان له أعلى تعبير بين البروتينات الثلاثة ، مما يشير إلى أن التعبير عن البروتينات الغشائية يفرض عبئا على نظام CFE ، وبالتالي يبطئ التفاعل ويخفض إنتاجه. بالإضافة إلى ذلك ، في المتوسط ، أظهرت التفاعلات التي تعبر عن بروتينات الغشاء في وجود سيارات الدفع الرباعي إشارة sfGFP أعلى مقارنة بالتفاعلات التي تفتقر إلى سيارات الدفع الرباعي. تتوافق هذه الملاحظة مع النتائج التي توصل إليها Steinküher et al. ، الذي أظهر أن التعبير عن البروتينات الغشائية يقلل من قدرة أنظمة CFE على إنتاج البروتينات23. ومع ذلك ، بالنظر إلى العرض الناجح لتعبير البروتين في تفاعل CFE السائب ، يمكن للمرء أن يستنتج أن CFE المغلف سيقوم أيضا بتجميع البروتينات داخل GUVs.

بعد ذلك ، تم تغليف تفاعلات CFE الفردية في GUVs باستخدام طريقة المستحلب المقلوب للتعبير عن متغيرات GluR0 ، وهي WT-GluR0 و PRSP-GluR0 و sfGFP القابل للذوبان. في حين أن WT-GluR0 ، الذي يؤوي ببتيد الإشارة الأصلي GluR0 ، أظهر تعبيرا ممتازا وتوطينا غشائيا (الشكل 2B ، اللوحة اليسرى) ، فإن نظيره ، PRSP-GluR0 ، الذي يحتوي على ببتيد إشارة بروتيورهودوبسين N-terminal ، لم يظهر توطينا غشائيا قويا مماثلا. ووجد أن PRSP-GluR0 أكثر عرضة للتجميع وتشكيل النقاط (الشكل 2B، اللوحة الوسطى). كما هو متوقع ، تم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان في GUVs وبقي في تجويف GUV (الشكل 2B ، اللوحة اليمنى ؛ انظر الشكل التكميلي 2 للحصول على صور لمجموعات GUVs).

figure-results-1
الشكل 1: الخطوات التجريبية للمستحلب المقلوب. (1) يتم تصور الخطوة 2.3.1 إلى الخطوة 2.3.3 من البروتوكول لتوضيح تجميع الطبقة الأحادية الدهنية عند واجهة مزيج الزيت الدهني والمحلول العازل الخارجي. (2) يظهر هنا تصور للخطوة 2.3.5 من البروتوكول لتمثيل تكوين الطبقة الأحادية الدهنية حول قطرات مستحلبة تغلف محلول CFE الداخلي. (3) توضح الخطوة 2.3.6 من البروتوكول إضافة GUVs أحادية الطبقة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع الطبقة الأحادية الدهنية عند واجهة مزيج زيت الدهون ومحلول المخزن المؤقت الخارجي. (4) تم تصوير الخطوة 2.3.7 هنا ، حيث يؤدي الطرد المركزي إلى تكوين حبيبات GUV في المحلول الخارجي. (5) تظهر هنا الخطوة 2.3.8 ، مما يشير إلى عملية إزالة خليط الدهون الزائدة في الزيت والمحلول الخارجي. (6) أخيرا ، تم تصوير الخطوة 2.3.9 هنا ، حيث يتم إعادة تعليق حبيبات GUV في المحلول الخارجي ، وتكون GUVs جاهزة للحضانة ، متبوعة بالتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تعبير البروتين في تفاعلات CFE السائبة وفي GUVs التي تغلف تفاعلات CFE. (أ) قراءات مضان لتفاعلات CFE السائبة الفردية التي تعبر عن WT-GluR0-sfGFP و PRSP-GluR0-sfGFP و sfGFP القابلة للذوبان. يمثل الرسم البياني sfGFP القابل للذوبان الإشارة من تفاعل 2.5 ميكرولتر (حجم التفاعل القياسي هو 20 ميكرولتر) لتجنب التشبع الزائد لقياسات قارئ اللوحة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± S.D ، n = 3. (B) على اليسار: صورة تمثيلية متحدة البؤر لتفاعل GUV المغلف CFE الذي يعبر عن WT-GluR0-sfGFP. الوسط: صورة تمثيلية متحدة البؤر ل GUVs تغلف تفاعل CFE معبرة عن PRSP-GluR0-sfGFP. على اليمين: صورة تمثيلية متحدة البؤر لتفاعل CFE مغلف GUV يعبر عن sfGFP القابل للذوبان. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: منحنى معايرة إشارة sfGFP وتحليل الانحدار الخطي المقابل له. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: صورة تمثيلية متحدة البؤر لمجموعات من GUVs تعبر (يسار) عن WT-GluR0-sfGFP ، (وسط) PRSP-GluR0-sfGFP ، و (يمين) sfGFP قابل للذوبان. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: تسلسل الأحماض الأمينية للببتيدات البرية وببتيدات إشارة البروتيورهودوبسين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: تركيز البروتينات المركبة في تفاعلات CFE السائبة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تقريبا أي عملية خلوية تعتمد على نقل الجزيئات أو المعلومات عبر غشاء الخلية ، مثل إشارات الخلية أو إثارة الخلية ، تتطلب بروتينات غشائية. وهكذا ، أصبحت إعادة تكوين البروتينات الغشائية عنق الزجاجة الرئيسي في تحقيق تصميمات الخلايا الاصطناعية المختلفة لتطبيقات مختلفة. تتطلب إعادة تكوين البروتينات الغشائية بوساطة المنظفات التقليدية في الأغشية البيولوجية طرق توليد GUV مثل التورم اللطيف أو التشكيل الكهربائي. عادة ما تنتج طرق التورم حويصلات صغيرة الحجم ، وينخفض إنتاج التكوين الكهربائي بشكل كبير عندما يتم تغليف المحاليل المعقدة ، وهو ما يحدث غالبا عند توليد الخلايا الاصطناعية، 32. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل المنظفات على إذابة بروتين الغشاء ، ويمكن أن تتسبب إزالتها أثناء عملية إعادة التكوين في اختلال البروتين33,34. من ناحية أخرى ، يعتمد النهج المقدم هنا على الدمج الانتقالي لبروتين الغشاء في طبقة الدهون المزدوجة ، والتي تشبه إلى حد كبير مسار التكوين الحيوي للبروتين الطبيعي في الخلايا22.

من وجهة نظر فنية ، يعد البروتوكول المقدم مفيدا لطرق التغليف الشائعة الأخرى ، مثل التشكيل الكهربائي وواجهة القطرات المستمرة التي تعبر التغليف7،8،35،36 (cDICE) ، لتسهيل التنفيذ لأن المعدات المعملية الوحيدة المطلوبة لتوليد GUV هي جهاز طرد مركزي. على عكس التكوين الكهربائي ، تسمح طريقة المستحلب المقلوب بتغليف مجموعات مختلفة من الجزيئات بتركيزات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع تقنية المستحلب المقلوب الأصلية25 ، فإن هذا النهج يولد GUVs أكثر استقرارا ومناسبة لتغليف محللات CFE أو أنظمة PURE . يرجع استقرار GUV العالي إلى وجود بوليمر مشترك ثنائي الكتلة في تكوين غشاء GUV37 بالإضافة إلى الحضانة الطويلة لواجهة الزيت والماء التي تسمح بتشبع الواجهة بجزيئات الدهون. أخيرا ، على عكس نهج الموائع الدقيقة ، لا يتطلب البروتوكول المقدم هنا قنوات وأنابيب صغيرة. لذلك ، يمكن تغليف تفاعل CFE بمجرد تجميعه ، والوقت الأقصر لتجميع GUV بسبب نقص التدفق والانسداد المحتمل يمنع البدء المبكر لتفاعل CFE. في حين أن إظهار تعبير البروتين الغشائي في هذا البروتوكول يقتصر على تفاعلات PUREfrex ، يمكن للمرء أن يوسع هذه الطريقة لتوليف البروتينات باستخدام أنظمة CFE المختلفة المتاحة ، مثل أنظمة CFE البكتيرية أو الثديية القائمة على المحللات.

النهج المقدم هنا له قيود ناجمة عن الطبيعة المعتمدة على النفط لعملية تشكيل GUV والنية في الحصول على GUVs مستقرة. عادة ما يكون هذا النهج أطول مقارنة بالطرق الأخرى ، مثل cDICE أو الموائع الدقيقة ، نظرا لوقت الحضانة الطويل لواجهة الزيت والماء المطلوبة لتثبيت الواجهة وإنتاجية GUV العالية. بالإضافة إلى ذلك ، يقتصر تكوين الدهون في المقام الأول على POPC مع جرعات صغيرة من الدهون الأخرى أو البوليمرات المشتركة ، في حين أن الطرق الأخرى ، مثل التكوين الكهربائي ، أكثر ملاءمة لدمج الدهون ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة. في حين أن تكوين غشاء GUV في هذه الطريقة هو مزيج من POPC و PBD-PEO لزيادة إنتاجية CFE إلى أقصى حد ، يمكن اختبار الاختلافات المحتملة في تكوين غشاء GUV. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحسين للمعلمات لبروتينات الغشاء الأخرى. نظرا لأن استحلاب القطيرات يحدث من خلال السحب اليدوي ، فإن GUVs الناتجة عن هذه الطريقة متعددة التشتت وغير متجانسة تماما في الحجم. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة ذوبان الدهون في المرحلة العضوية قد تتسبب أحيانا في وجود طبقة من الزيت بين وريقتي غشاء GUV أو تلوث غرفة التصوير بالزيت الذي يمكن أن يضر بجودة الصورة. يتمثل أحد الحلول الممكنة لتحدي الزيت المتبقي في استبدال الزيوت المعدنية بمذيب عضوي متطاير ، مثل ثنائي إيثيل الأثير ، كما هو موضح من قبل Tsumoto et al.38 ، للاعتماد على تبخر المذيبات جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي أثناء تكوين GUV.

على الرغم من عدم وجود عرض لوظيفة القناة في هذا العمل ، مستوحى من المقايسات السابقة المستخدمة لفحص وظائف القناة الميكانيكية أو الحساسة للضوء المعاد تشكيلها ، فقد تم تحديد الفحص القائم على الفحص المجهري الفلوري. تم الإبلاغ عن أن فتح قناة GluR0 يزيد من الموصلية الغشائية لأيونات K + 24. نظرا لأن تفاعلات CFE تحتوي بالفعل على تركيز عال من K + ، فإن مؤشرات البوتاسيوم النموذجية لن تكون مناسبة لتقييم وظائف القناة. ومع ذلك ، نظرا لأن تدفق البوتاسيوم يغير إمكانات الغشاء ، فإن مؤشرات إمكانات الغشاء الحساسة مثل DiBAC4 (3) 22 أو BeRST 139 يمكن أن تبلغ عن نشاط GluR0 في وجود الغلوتامات.

تفتح إعادة التكوين الناجحة للبروتينات الغشائية في الخلايا الاصطناعية العديد من الاحتمالات لإنشاء خلايا اصطناعية ذات قدرات غير مسبوقة تحاكي الخلايا الطبيعية بشكل أوثق. العيب الرئيسي الحالي للخلايا الاصطناعية هو عدم قدرتها على إعادة إنتاج الطاقة وإعادة تدويرها. ومع ذلك ، مع مخططات تجديد الطاقة المعتمدة على الضوء والمواد الكيميائية التي تعتمد بشكل كبير على البروتينات الغشائية ، يمكن للمرء أن يتصور خلايا اصطناعية طويلة الأمد40. يسمح استخدام أنظمة CFE بإعادة تكوين بروتينات غشائية متعددة يمكنها أداء مهام معينة بشكل جماعي. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي إعادة تكوين قناة أيونية ذات بوابات ليجند مشابهة ل GluR0 الموصوفة هنا ، جنبا إلى جنب مع القنوات الأيونية المختلفة ذات الجهد الكهربائي ، إلى بناء خلية اصطناعية تشبه الخلايا العصبية القابلة للاستثارة.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تعترف APL بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (EF1935265) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-EB030031 و R21-AR080363) ، ومكتب أبحاث الجيش (80523-BB)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 نانومتر فلتر البولي كربوناتSTERLITECH1270193
96 لوحة سفلية واضحةجيدا ThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M قارئ هجين متعدد الأوضاعAgilent11-120-533
فوسفات الكرياتينMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 وحدة الماسح الضوئي متحد البؤرYokogawaCSU-X1 
وسط التدرج الكثافة (Optiprep)Millipore SigmaD1556اختياري للتبديل مع السكروز في المحلول الداخلي
يدعم المرشحأفانتي610014
فيشربراند الدقيقة (1.5 مل)فيشر ساينتفيك05-408-129 & nbsp ؛
حمض الفولينيك ملح الكالسيوم هيدراتMillipore SigmaF7878
الجلوكوزMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 camera أندورDU-897E-CS0 
L-حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدراتMillipore SigmaG1501
زيت معدني خفيفMillipore SigmaM5904
أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات   ؛طقم الطارد الصغير Millipore SigmaM5661
(بما في ذلك حامل الحقنة وحامل الطارد)Avanti610020
Olympus IX81 المجهر المقلوب  أوليمبوسIX21
أوليمبوس بلاندأبو N 60x مجهر الزيت الهدف أوليمبوس1-U2B933 
مصدر البوليمر PEO-b-PBDP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP البلازميد DNAمحلي الصنعN / A
pET28b-sfGFP-sfCherry (1-10) البلازميدDNA محلي الصنعN / A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP البلازميدمحلي الصنعN / A
POPC الدهون في الكلوروفورم   ؛Avanti850457C
كلوريد البوتاسيومMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
مجموعة محلول الريبونوكليوتيدNew England BioLabsN0450
RNase مثبط ، الفئراننيو إنجلاند BioLabsM0314S
RTS عينات الأحماض الأمينيةBiotechrabbitBR1401801
كلوريد الصوديومMillipore SigmaS9888
SpermidineMillipore SigmaS2626
السكروزMillipore SigmaS0389
VAPRO مقياس التناضح بضغط البخار موديل 5600ELITechGroupVAPRO 5600
أنابيب DNA

المراجع

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة