يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا

2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

مارس 8, 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة المستحلب المقلوب المستخدمة لتغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا (CFE) داخل حويصلة عملاقة أحادية الصفيحة (GUV) للتحقيق في تخليق ودمج بروتين غشاء نموذجي في طبقة الدهون المزدوجة.

الملخص

تعد أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE) أدوات قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتقليد الحيوي للوظائف الخلوية مثل الاستشعار الحيوي وتجديد الطاقة في الخلايا الاصطناعية. ومع ذلك ، تتطلب إعادة بناء مجموعة واسعة من العمليات الخلوية إعادة تكوين ناجحة للبروتينات الغشائية في غشاء الخلايا الاصطناعية. في حين أن التعبير عن البروتينات القابلة للذوبان عادة ما يكون ناجحا في أنظمة CFE الشائعة ، فقد ثبت أن إعادة تكوين البروتينات الغشائية في الطبقات الثنائية الدهنية للخلايا الاصطناعية يمثل تحديا. هنا ، يتم عرض طريقة لإعادة تكوين بروتين غشاء نموذجي ، مستقبلات الغلوتامات البكتيرية (GluR0) ، في حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كخلايا اصطناعية نموذجية تعتمد على تغليف وحضانة تفاعل CFE داخل الخلايا الاصطناعية. باستخدام هذه المنصة ، تم إثبات تأثير استبدال ببتيد الإشارة N-terminal ل GluR0 بببتيد إشارة proteorhodopsin على النقل المشترك الناجح ل GluR0 إلى أغشية GUVs الهجينة. توفر هذه الطريقة إجراء قويا يسمح بإعادة تكوين البروتينات الغشائية المختلفة في الخلايا الاصطناعية الخالية من الخلايا.

المقدمة

اكتسبت البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى اهتماما متزايدا على مدى العقد الماضي كمجال ناشئ مع العديد من التطبيقات المحتملة في الهندسة الحيوية ، وتوصيل الأدوية ، والطب التجديدي1،2. اجتذب تطوير الخلايا الاصطناعية كحجر زاوية في البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى ، على وجه الخصوص ، مجموعة واسعة من المجتمعات العلمية بسبب التطبيقات الواعدة للخلايا الاصطناعية بالإضافة إلى خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية الشبيهة بالخلايا التي تسهل الدراسات الفيزيائية الحيوية في المختبر 3،4،5،6. غالبا ما يتم تصميم الخلايا الاصطناعية في حويصلات أحادية الصفيحة عملاقة بحجم الخلية (GUVs) حيث يتم إعادة إنشاء عمليات بيولوجية مختلفة. إعادة تكوين الهيكل الخلويالخلوي للخلية 7,8 ، وتجديد الطاقة المعتمدة على الضوء9 ، والاتصالات الخلوية10,11 ، والاستشعار الحيوي12 هي أمثلة على الجهود المبذولة لإعادة بناء السلوكيات الشبيهة بالخلايا في الخلايا الاصطناعية.

بينما تعتمد بعض العمليات الخلوية على البروتينات القابلة للذوبان، فإن العديد من خصائص الخلايا الطبيعية، مثل الاستشعار والتواصل، غالبا ما تستخدم البروتينات الغشائية، بما في ذلك القنوات الأيونية والمستقبلات والناقلات. التحدي الرئيسي في تطوير الخلايا الاصطناعية هو إعادة تكوين البروتينات الغشائية. على الرغم من أن الطرق التقليدية لإعادة تكوين البروتين الغشائي في طبقات الدهون المزدوجة تعتمد على التنقية بوساطة المنظفات ، إلا أن هذه الطرق شاقة وغير فعالة للبروتينات السامة لمضيف التعبير ، أو غالبا ما تكون غير مناسبة لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs13.

طريقة بديلة للتعبير عن البروتين هي أنظمة التعبير الخالي من الخلايا (CFE). كانت أنظمة CFE أداة قوية في البيولوجيا التركيبية تسمح بالتعبير في المختبر عن البروتينات المختلفة باستخدام إما تحلل الخلية أو آلة ترجمة النسخالمنقى 14. يمكن أيضا تغليف أنظمة CFE في GUVs ، مما يسمح بتفاعلات تخليق البروتين المجزأة التي يمكن برمجتها لتطبيقات مختلفة ، مثل إنشاء خلايا اصطناعية لحصاد الضوء9 أو أجهزة استشعار حيوية حساسة ميكانيكيا15,16. على غرار طرق التعبير عن البروتين المؤتلف ، يمثل تعبير البروتين الغشائي تحديا في أنظمة CFE17. يعد التجميع والطي الخاطئ وعدم وجود تعديل ما بعد الترجمة في أنظمة CFE من الاختناقات الرئيسية التي تعيق تخليق البروتين الغشائي الناجح باستخدام أنظمة CFE. ترجع صعوبة إعادة تكوين البروتين الغشائي من أسفل إلى أعلى باستخدام أنظمة CFE جزئيا إلى عدم وجود مسار حيوي معقد للبروتين الغشائي يعتمد على ببتيدات الإشارة وجزيئات التعرف على الإشارات والترانسلوكونات وجزيئات المرافقة. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، اقترحت دراسات متعددة أن وجود هياكل غشائية مثل الميكروسومات أو الجسيمات الشحمية أثناء الترجمة يعزز التعبير الناجح للبروتين الغشائي18،19،20،21. بالإضافة إلى ذلك ، وجد Eaglesfield et al. و Steinküher et al. أن إدراج مجالات محددة كارهة للماء تعرف باسم ببتيدات الإشارة في المحطة N لبروتين الغشاء يمكن أن يحسن بشكل كبير تعبيره22,23. إجمالا ، تشير هذه الدراسات إلى أنه يمكن التغلب على التحدي المتمثل في إعادة تكوين البروتين الغشائي في الخلايا الاصطناعية إذا حدثت ترجمة البروتين في وجود غشاء GUV وإذا تم استخدام ببتيد إشارة N-terminal المناسب.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتغليف تخليق البروتين باستخدام تفاعلات CFE للعناصر المؤتلفة (PURE) لإعادة تكوين البروتين الغشائي في GUVs. يتم اختيار مستقبلات الغلوتامات البكتيرية24 (GluR0) كبروتين غشاء نموذجي ، ويتم دراسة تأثير ببتيد الإشارة الطرفية N على إعادة تكوين الغشاء. تم التحقيق في تأثير ببتيد إشارة البروتيورهودوبسين ، الذي ثبت أنه يحسن كفاءة إعادة تكوين البروتين الغشائي بواسطة Eaglesfield et al.22 ، من خلال بناء متغير متحور من GluR0 يشار إليه باسم PRSP-GluR0 وتتم مقارنة تعبيره وتوطين الغشاء مع GluR0 من النوع البري (يشار إليه باسم WT-GluR0 فيما بعد) الذي يؤوي ببتيد الإشارة الأصلي. يعتمد هذا البروتوكول على طريقة المستحلب المقلوب25 مع التعديلات التي تجعله قويا لتغليف CFE. في الطريقة المقدمة ، يتم استحلاب تفاعلات CFE أولا باستخدام محلول دهني في زيت يولد قطرات بحجم ميكرون تحتوي على نظام CFE ويتم تثبيتها بواسطة الطبقة الأحادية للدهون. ثم توضع قطرات المستحلب فوق واجهة الزيت والماء المشبعة بطبقة أحادية دهنية أخرى. ثم تجبر قطرات المستحلب على الانتقال عبر واجهة الزيت والماء عبر قوة الطرد المركزي. من خلال هذه العملية ، تحصل القطرات على طبقة أحادية أخرى ، وبالتالي تولد حويصلة دهنية ثنائية الطبقة. ثم يتم تحضين GUVs التي تحتوي على تفاعل CFE ، حيث يتم التعبير عن بروتين الغشاء ودمجه في غشاء GUV. على الرغم من أن هذا البروتوكول مخصص للتعبير الخالي من الخلايا ل GluR0 ، إلا أنه يمكن استخدامه للتوليف الخالي من الخلايا لبروتينات غشائية أخرى أو تطبيقات الخلايا الاصطناعية المختلفة مثل إعادة تكوين الهيكل الخلوي أو دراسات اندماج الغشاء26.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وترد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تفاعلات CFE السائبة في وجود حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (SUVs)

  1. إعداد سيارات الدفع الرباعي
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.
    1. تحضير 5 مللي متر 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين (POPC) سيارات الدفع الرباعي في قنينة زجاجية عن طريق نقل 76 ميكرولتر من محلول مخزون الملوثات العضوية الثابتة 25 ملغم / مل المذاب في الكلوروفورم.
    2. أثناء تدوير القارورة الزجاجية برفق ، قم بنفخ تيار لطيف من الأرجون في القارورة لتشكيل طبقة من الدهون المجففة في الأسفل. بعد ذلك ، قم بنقل القارورة الزجاجية إلى مجفف مع غطاء مشدود بشكل فضفاض لتبخر الكلوروفورم الزائد.
    3. الحفاظ على قارورة الزجاج في المجفف لمدة 1 ساعة. ثم أضف 0.5 مل من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء لإذابة طبقة الدهون والدوامة لمدة 2 دقيقة تقريبا.
    4. قم بإعداد جهاز بثق صغير عن طريق نقع دعامتين للمرشح في الماء منزوع الأيونات ووضعهما على كل من دعامات الغشاء الداخلي. بعد ذلك ، انقع مرشح البولي كربونات 100 نانومتر وضعه بين دعامتي الغشاء الداخليين المثبتين معا بواسطة الغلاف الخارجي للطارد وصامولة التجنيب. ضع هذا الإعداد في حامل الطارد.
    5. اغسل حقنتين محكمتين للغاز سعة 1 مل 3 مرات بماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
    6. قم بتحميل عينة مزيج الماء الدهني في واحدة من المحاقن المانعة لتسرب الغاز سعة 1 مل وضعها في أحد طرفي الطارد الصغير باستخدام مشابك ذراع التأرجح لتثبيت المحقنة في مكانها. أدخل المحقنة الثانية في الطرف الآخر من الطارد الصغير وتأكد من الضغط عليها تماما.
      ملاحظة: عند تحميل المحقنة بمزيج الماء الدهني ، تأكد من عدم وجود هواء في المحقنة قبل تمريرها عبر آلة البثق الصغيرة.
    7. مرر مزيج الماء الدهني برفق من المحقنة الأصلية إلى المحقنة الفارغة من خلال جهاز الطارد الصغير. كرر هذه الخطوة 11 مرة لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. انقل سيارات الدفع الرباعي إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين حل سيارات الدفع الرباعي في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
  2. تجميع تفاعل CFE
    1. قم بتجميع تفاعل CFE باتباع بروتوكول التعبير الخالي من الخلايا الذي توفره الشركة المصنعة مع تعديلات طفيفة مفصلة في ما يلي.
    2. امزج 10 ميكرولتر من المحلول 1 (يحتوي على الأحماض الأمينية ، NTPs ، tRNAs والركائز للإنزيمات ، والمخزن المؤقت الضروري) ، 1 ميكرولتر من المحلول 2 (البروتينات في 20٪ جلسرين) ، 2 ميكرولتر من المحلول 3 (الريبوسوم (20 ميكرومتر)) ، كمية مناسبة من ترميز الحمض النووي للذوبان sfGFP-sfCherry (1-10) 27 (يشار إليه باسم sfGFP القابل للذوبان فيما بعد) ، WT-GluR0-sfGFP ، أو PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 نانوغرام / 1000 زوج قاعدة) ، 1 ميكرولتر مثبط RNAse الفئران ، و 4 ميكرولتر من محلول 5 mM SUV للبروتينات الغشائية أو 4 ميكرولتر ماء للبروتينات القابلة للذوبان.
    3. اجعل الحجم النهائي للتفاعل يساوي 20 ميكرولتر بإضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
      ملاحظة: عند تجميع نظام CFE ، يجب الاحتفاظ بجميع المكونات على الجليد. جميع المواد حساسة لدرجة الحرارة ويمكن أن تتحلل إذا وصلت إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. حضانة تفاعل CFE ورصده
    1. انقل محلول CFE إلى صفيحة مخروطية القاع على شكل حرف V مكونة من 96 بئرا. لمنع التبخر أثناء التفاعل ، قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب.
    2. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في قارئ لوحة لمدة 4-5 ساعات أثناء مراقبة تفاعل CFE عن طريق قياس إشارة GFP بكسب 100 عند 488 نانومتر / 528 نانومتر أطوال موجية للإثارة / الانبعاث كل 2 دقيقة.

2. تفاعلات CFE المغلفة في GUVs

  1. تحضير محلول المخزن المؤقت الخارجي GUV
    1. في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، امزج 1.5 ميكرولتر من 1 متر سبيرميدين ، 37.5 ميكرولتر من 100 مللي متر ATP ، 25 ميكرولتر من 100 مللي متر GTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر CTP ، 12.5 ميكرولتر من 100 مللي متر UTP ، 25 ميكرولتر من 1 M فوسفات الكرياتين ، 18 ميكرولتر من 1 M خلات المغنيسيوم ، 93.33 ميكرولتر من 3 M غلوتامات البوتاسيوم ، 50 ميكرولتر من 1 M HEPES KOH (درجة الحموضة 7.4) ، 1.15 ميكرولتر من 332 mM حمض الفولينيك ، 100 ميكرولتر من 2 M الجلوكوز ، و 50 ميكرولتر من محلول المخزون من خليط 6 mM من كل من الأحماض الأمينية العشرين (أعدت باتباع البروتوكول الذي وصفه Sun et al.28).
    2. ارفع الحجم النهائي للمحلول إلى 1 مل عن طريق إضافة ماء منزوع الأيونات فائق النقاء.
      ملاحظة: يجب حفظ جميع المكونات على الجليد. أضف خليط الأحماض الأمينية في النهاية لتجنب نضوب الأحماض الأمينية28. يمكن تسعير المحلول في حصص 330 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحضير خليط الدهون في الزيت
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء دخان باتباع تعليمات السلامة للعمل مع الكلوروفورم.
    1. في غطاء الدخان ، امزج 17.3 ميكرولتر من محلول مخزون POPC 25 مجم / مل و 1.08 ميكرولتر من 50 مجم / مل بولي (بوتادين) -ب-بولي (أكسيد الإيثيلين) (PEO-b-PBD) كوبوليمر في قنينة زجاجية سعة 15 مل.
      ملاحظة: يحتوي محلول الدهون النهائي في الزيت على 0.5 مليمتر دهون مع 95٪ و 5٪ POPC و PEO-b-PBD ، على التوالي. تم استخدام PEO-b-PBD لتعزيز استقرار الغشاء أثناء التعبير عن البروتين ولكن تم الاحتفاظ به عند نسبة مولية منخفضة لتقليل ميل البوليمر المشترك إلى التجمع في مذيلات منفصلة عن جزيئات الدهون29,30.
    2. قم بنفخ تيار لطيف من غاز الأرجون بعناية في القارورة الزجاجية أثناء تدوير القارورة لتبخير الكلوروفورم.
    3. ماصة 1.2 مل من الزيت المعدني الخفيف في قنينة زجاجية سعة 15 مل تحتوي على الدهون المجففة.
    4. خلط الدهون والزيت عن طريق الدوامة بأقصى سرعة لمدة 10-20 ثانية. سيبدو مزيج البوليمر المشترك الدهني المذاب غائما.
    5. لضمان إذابة جميع الركام الدهني الممكن في الزيت بالكامل وتشتيته في جميع أنحاء الزيت ، ضع القارورة الزجاجية في الفرن على حرارة حوالي 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الدوامة لمدة 10-20 ثانية إضافية بأقصى سرعة.
  3. تجميع وتغليف تفاعل CFE (يلخص الشكل 1 الخطوات التالية).
    1. تحضير 300 ميكرولتر من محلول GUV الخارجي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل عن طريق خلط 270 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت الخارجي CFE المحضر في الخطوة 2.1 ، و 15 ميكرولتر من 5 M NaCl ، و 15 ميكرولتر من 4.5 M KCl.
      ملاحظة: في هذه الخطوة ، أضف 0.45 ميكرولتر من 1 M 1،4-ديثيوثريتول (DTT) إلى محلول GUV الخارجي. الغرض من إضافة كلوريد الصوديوم و KCl هو ضبط أسمولية المحلول الخارجي لمطابقته مع محلول CFE الداخلي. يعتمد الحجم الدقيق لكلوريد الصوديوم و KCl على تعديل الأسمولية المطلوب. يمكن للمرء إضافة إما كلوريد الصوديوم أو KCl أو كليهما لضبط الأسمولية.
    2. ماصة بلطف 300 ميكرولتر من خليط الدهون في الزيت فوق محلول GUV الخارجي.
      ملاحظة: عند إضافة مزيج الزيت الدهني ، من المهم ألا يختلط الزيت بالمحلول الخارجي المائي. بعد الإضافة ، يجب أن يكون هناك واجهة مرئية بين خليط الدهون في الزيت والمحلول الخارجي GUV.
    3. احتضان واجهة الزيت والماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة للسماح للطبقة الأحادية الدهنية بالتشكل والاستقرار عند الواجهة.
    4. وفي الوقت نفسه ، اتبع القسم 1.2.1 لتجميع تفاعل CFE الذي يحتوي على الحمض النووي البلازميد الذي يشفر متغيرات بروتين الغشاء أو GFP القابل للذوبان. استبدل محلول 4 ميكرولتر من 5 مللي متر من محلول SUV أو الماء ب 4 ميكرولتر من 1 متر سكروز. سيكون هذا التفاعل هو الحل الداخلي GUV.
      ملاحظة: تم استخدام مقياس الأسمومتر لقياس الأسمولية للحلول الداخلية والخارجية. ثم تم تعديل أسمولية المحلول الخارجي وفقا لذلك بإضافة كلوريد الصوديوم أو الماء. عادة ما تكون الأسمولية لتفاعل CFE حوالي 1600 mOsm / Kg. تؤدي إضافة السكروز إلى التفاعل إلى زيادة كثافة المحلول الداخلي ، مما يسمح للحويصلات بالانتقال عبر واجهة الزيت والماء أثناء خطوة الطرد المركزي. بديل السكروز هو محلول تدرج الكثافة Opti-Prep.
    5. أضف 600 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على تفاعل CFE والماصة لأعلى ولأسفل بقوة لمدة ~ 1 دقيقة لاستحلاب التفاعل في محلول الدهون في الزيت وتشكيل طبقة أحادية دهنية حول الخلايا الاصطناعية.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي الحل النهائي على أي فقاعات ويجب أن يبدو معتما.
    6. ماصة بلطف مستحلب المحلول الداخلي أعلى طبقة الزيت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل حيث تم إعداد واجهة الزيت والماء.
      ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الواجهة أو زعزعة استقرارها.
    7. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 2000 × جم عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تم تحسين سرعة الطرد المركزي لهذا البروتوكول. أبلغ Adir et al.31 عن سرعة طرد مركزي مختلفة.
    8. بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزالة الزيت الزائد والمحلول الخارجي بعناية من أنبوب الطرد المركزي الدقيق باستخدام ماصة. قم بإزالة المحلول الخارجي حتى يصبح الحجم المتبقي حوالي 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: عادة ما تكون حبيبات GUVs مرئية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ومع ذلك ، فإن عدم وجود حبيبات مرئية لا يعني بالضرورة عدم وجود عائد GUV. بدلا من استخدام الماصة ، يمكن إزالة الزيت الزائد الموجود أعلى المحلول الخارجي عن طريق الشفط. من الأهمية بمكان ضمان إزالة محلول الدهون في الزيت تماما. يمكن أن يتسبب تلوث الزيت في محلول GUV في الحصول على صور منخفضة الجودة.
    9. أعد تعليق حبيبات GUV في محلول 100 ميكرولتر المتبقي عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل. بعد ذلك ، انقل محلول GUV إلى صفيحة سفلية مسطحة نظيفة 96 جيدا لاحتضانها.

3. مغلفة CFE تفاعل الحضانة والتصوير

  1. قم بتغطية اللوحة باستخدام فيلم مانع للتسرب لمنع التبخر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 5-6 ساعات. يمكن للمرء استخدام قارئ الألواح واتباع الخطوة 1.3.2 لإعداد قارئ اللوحة لخطوة الحضانة.
  2. بمجرد انتهاء الحضانة ، ضع لوحة البئر 96 على مرحلة التصوير لمجهر مقلوب مزود بكاميرا EMCCD (أو كاميرا sCMOS) ، ليزر يتم التحكم فيه DAQ-MX (أو نظام دمج ليزر متكامل) ، وقرص دوار CSU-X1 متحد البؤر (أو بؤري مسح بالليزر). ركز على أي عائد استثمار يحتوي على GUVs والتقط صورا بطول موجي مثير يبلغ 488 نانومتر باستخدام هدف Plan-Apochromat 60 x / 1.4 NA.
  3. احفظ صور GUVs بتنسيق .tiff.
  4. افتح الصور في برنامج معالجة الصور (على سبيل المثال ، ImageJ أو Fiji). افتح لوحة إعداد السطوع / التباين . اضبط السطوع والتباين على الإعدادات المناسبة التي تجعل البروتينات الفلورية مرئية.
  5. إذا كان الهدف هو مقارنة شدة الإشارة للبروتينات المعبر عنها المختلفة ، فقم أولا بتكديس الصور الفردية ل GUVs التي تحتوي على بروتينات مختلفة باستخدام لوحة Images to Stack الموجودة أسفل القائمة الفرعية Image > Stacks . بعد ذلك ، اضبط السطوع والتباين لجميع الصور باستخدام لوحة السطوع / التباين .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل تغليف تفاعلات CFE ، تم التعبير عن نوعين مختلفين من GluR0-sfGFP يؤويان ببتيدات إشارة أصلية وبروتيورهودوبسين (يتم عرض تسلسل ببتيد الإشارة في الجدول التكميلي 1) ، وتم التعبير عن sfGFP القابل للذوبان بشكل فردي في تفاعلات مجمعة ، وتم رصد تعبيرهما عن طريق اكتشاف إشارة sfGFP باستخدام قارئ لوحة (الشكل 2 أ). تم التعبير عن البروتينات الغشائية في غياب أو وجود سيارات الدفع الرباعي 100 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام منحنى معايرة يربط إشارة sfGFP بتركيزها (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تقريبا أي عملية خلوية تعتمد على نقل الجزيئات أو المعلومات عبر غشاء الخلية ، مثل إشارات الخلية أو إثارة الخلية ، تتطلب بروتينات غشائية. وهكذا ، أصبحت إعادة تكوين البروتينات الغشائية عنق الزجاجة الرئيسي في تحقيق تصميمات الخلايا الاصطناعية المختلفة لتطبيقات مختلفة. تتطلب إعادة تكوين البروتينات الغشائية بوساطة المنظفات التقليدية في الأغشية البيولوجية طرق توليد GUV مثل التورم اللطيف أو التشكيل الكهربائي. عادة ما تنتج طرق التورم حويصلات صغيرة الحجم ، وينخفض إنتاج التكوين الكهربائي بشكل كبير عندما يتم تغليف المحاليل المعقدة ، و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تعترف APL بالدعم المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (EF1935265) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01-EB030031 و R21-AR080363) ، ومكتب أبحاث الجيش (80523-BB)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100 نانومتر فلتر البولي كربوناتSTERLITECH1270193
96 لوحة سفلية واضحةجيدا ThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M قارئ هجين متعدد الأوضاعAgilent11-120-533
فوسفات الكرياتينMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 وحدة الماسح الضوئي متحد البؤرYokogawaCSU-X1 
وسط التدرج الكثافة (Optiprep)Millipore SigmaD1556اختياري للتبديل مع السكروز في المحلول الداخلي
يدعم المرشحأفانتي610014
فيشربراند الدقيقة (1.5 مل)فيشر ساينتفيك05-408-129 & nbsp ؛
حمض الفولينيك ملح الكالسيوم هيدراتMillipore SigmaF7878
الجلوكوزMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 camera أندورDU-897E-CS0 
L-حمض الجلوتاميك ملح البوتاسيوم أحادي الهيدراتMillipore SigmaG1501
زيت معدني خفيفMillipore SigmaM5904
أسيتات المغنيسيوم رباعي الهيدرات   ؛طقم الطارد الصغير Millipore SigmaM5661
(بما في ذلك حامل الحقنة وحامل الطارد)Avanti610020
Olympus IX81 المجهر المقلوب  أوليمبوسIX21
أوليمبوس بلاندأبو N 60x مجهر الزيت الهدف أوليمبوس1-U2B933 
مصدر البوليمر PEO-b-PBDP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP البلازميد DNAمحلي الصنعN / A
pET28b-sfGFP-sfCherry (1-10) البلازميدDNA محلي الصنعN / A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP البلازميدمحلي الصنعN / A
POPC الدهون في الكلوروفورم   ؛Avanti850457C
كلوريد البوتاسيومMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
مجموعة محلول الريبونوكليوتيدNew England BioLabsN0450
RNase مثبط ، الفئراننيو إنجلاند BioLabsM0314S
RTS عينات الأحماض الأمينيةBiotechrabbitBR1401801
كلوريد الصوديومMillipore SigmaS9888
SpermidineMillipore SigmaS2626
السكروزMillipore SigmaS0389
VAPRO مقياس التناضح بضغط البخار موديل 5600ELITechGroupVAPRO 5600
أنابيب DNA

المراجع

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إعادة تشكيل البروتينات الغشائيةالخلايا الاصطناعيةالحويصلات أحادية الطبقة العملاقةمستحلب القطيرات المقلوبالطبقة الليبيدية المزدوجةالمجهر البؤريتغليف البروتينتخليق القنوات الأيونية
إعادة تكوين قناة مستقبلات الغلوتامات البكتيرية عن طريق تغليف نظام التعبير الخالي من الخلايا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.