نماذج الرئة على رقاقة تتجاوز الثقافات التقليدية 2D من خلال محاكاة واجهة الهواء السائل ونضح الخلايا البطانية، ومحاكاة تدفق الدم وتبادل المغذيات حاسمة لدراسات فسيولوجيا الرئة. هذا يعزز أهمية أبحاث الرئة ، ويوفر بيئة ديناميكية ودقيقة من الناحية الفسيولوجية لتعزيز فهم وعلاج التهابات الجهاز التنفسي.
مقالة منهجية
نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة المناعي لدراسة الاستجابات المناعية المخاطية السنخية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقدم نموذجا متقدما للرئة على الرقاقة ذات الكفاءة المناعية مصمما لتكرار البنية السنخية البشرية ووظيفتها. يستخدم هذا النموذج المبتكر رقاقة حيوية ذات موائع دقيقة تدعم واجهة الهواء والسائل التي تحاكي البيئة في الحويصلات الهوائية البشرية. تستخدم هندسة الأنسجة لدمج المكونات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك الخلايا البطانية والبلاعم والخلايا الظهارية ، لإنشاء نموذج نسيجي تمثيلي للحويصلات الهوائية. يسهل النموذج إجراء فحوصات متعمقة للاستجابات المناعية المخاطية لمسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والفطريات ، وبالتالي تعزيز فهمنا لمناعة الرئة. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير تفاصيل لإنشاء نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة كمنصة قوية في المختبر لدراسات العدوى ، مما يمكن الباحثين من مراقبة وتحليل التفاعلات المعقدة بين مسببات الأمراض والجهاز المناعي للمضيف داخل البيئة الرئوية عن كثب. يتم تحقيق ذلك من خلال تطبيق التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية الرئيسية للحويصلات الهوائية البشرية ، بما في ذلك تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ، إلى جانب الحفاظ على واجهة الهواء والسائل الضرورية للتعرض الواقعي للخلايا الظهارية للهواء. يتوافق النظام النموذجي مع مجموعة من المقايسات الموحدة ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، وتوصيف السيتوكين ، وتحليل وحدة تكوين المستعمرات (CFU) / اللويحات ، مما يسمح برؤى شاملة لديناميكيات المناعة أثناء العدوى. تتكون الحويصلات الهوائية على الرقاقة من أنواع الخلايا الأساسية ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وجود بلاعم أولية مشتقة من الخلايا الوحيدة في وضع استراتيجي بين الطبقات الظهارية والبطانية. يعزز نموذج الأنسجة القدرة على تشريح وتحليل العوامل الدقيقة التي تنطوي عليها الاستجابات المناعية الرئوية في المختبر. كأداة قيمة ، يجب أن تساهم في تقدم أبحاث الرئة ، وتوفير نموذج أكثر دقة وديناميكية في المختبر لدراسة التسبب في التهابات الجهاز التنفسي واختبار التدخلات العلاجية المحتملة.
المقدمة
تلعب الرئة البشرية دورا ملحوظا في التنفس والدفاع المناعي ، مع تفاعلات معقدة بين الاستجابات المناعية للغشاء المخاطي السنخي1. تعد قدرة الحويصلات الهوائية على خلق استجابة مناعية فعالة أمرا حيويا للوقاية من التهابات الرئة وتأمين الصحة الرئوية. نظرا لأن الرئتين تتعرض باستمرار لمجموعة واسعة من المخاطر المحتملة ، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والفطريات والحساسية والجسيمات ، فإن فهم تعقيدات الاستجابات المناعية المخاطية السنخية أمر بالغ الأهمية لاكتشاف الآليات الكامنة وراء التهابات الجهاز التنفسي والاضطرابات الالتهابية وعلاج الأمراض الرئوية1.
لدراسة العدوى والعمليات المرتبطة بالالتهاب في الجهاز التنفسي في المختبر ، هناك حاجة إلى نماذج يمكن أن تحاكي بأمانة الوسط السنخي والاستجابات المناعية. وقد استخدمت 2D ثقافة الخلايا والوحدات الحيوانية لعقود من الزمن كأدوات أساسية للبحوث الطبية الحيوية على الاستجابة المناعية للرئة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لديهم قيود في إمكاناتهم الانتقالية للمواقف البشرية. يمكن أن تساهم نماذج الرئة على الرقاقة في سد الفجوة بين النماذج التقليدية في المختبر وفي الجسم الحي وتوفر نهجا جديدا لدراسة الاستجابات المناعية الخاصة بالإنسان 2,3. يمكن لنماذج الرئة على الرقاقة أن تحاكي واجهة الهواء والسائل ، وهو أمر مطلوب لخلايا الرئة لتلخيص الظروف الفسيولوجية للجهاز التنفسي وتطوير نموذج أنسجة أكثر دقة وقوة. تتيح تقنية المزرعة هذه فحصا دقيقا لتمايز الخلايا وعملها واستجاباتها للأدوية أو المحفزات المرتبطة بالأمراض في المختبر2.
في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا قائما على الموائع الدقيقة للحويصلات الهوائية البشرية كأداة فعالة لتلخيص الوسط السنخي البشري من خلال تطبيق التروية لتقليد تدفق الدم والتحفيز الميكانيكي الحيوي للخلايا البطانية ودمج واجهة الهواء السائل مع الخلايا الظهارية المعرضة نحو مرحلة الهواء4. لقد قمنا بتطوير الحويصلات الهوائية ذات الموائع الدقيقة على الرقاقة التي تحاكي البنية الفيزيائية والتفاعلات البيولوجية للحويصلات الهوائية البشرية ، مع التركيز بشكل خاص على واجهة الهواء والسائل. تلعب هذه الواجهة دورا حاسما في تمايز الخلايا الظهارية التنفسية ، وهو أمر ضروري لنمذجة البيئة الرئوية بدقة. يستخدم النموذج الخلايا الظهارية الرئوية البشرية البعيدة (H441) والخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) ، مفصولة بأغشية البولي إيثيلين تيريفثاليت المسامية (PET) ، مع وضع البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الوحيدة بين طبقات الخلايا. يكرر هذا الإعداد الترتيب الخلوي المعقد للحويصلات الهوائية وهو أمر بالغ الأهمية لمحاكاة واجهة الهواء والسائل بدقة ، وهو عامل مهم في الوظيفة الفسيولوجية لأنسجة الرئة.
يمتد الأساس المنطقي وراء تطوير النموذج إلى دمج كل من الخلايا المناعية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة. تم تصميم هذا النهج لمحاكاة استجابة المضيف الالتهابية بدقة لالتهابات الجهاز التنفسي البشرية ، مما يوفر بيئة ديناميكية لدراسة التفاعلات بين العامل الممرض والمضيف. يسمح وجود الضامة بفحص الاستجابات المناعية الفورية وتفاعلها مع مسببات الأمراض ، مما يعكس خط الدفاع الأول ضد التهابات الجهاز التنفسي. علاوة على ذلك ، يسهل تصميم منصة الرقاقة الحيوية المعالجة المريحة والدقيقة لكل من الإشارات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتكرار وظيفة الحويصلات الهوائية في المختبر. هذه المرونة مفيدة في تشريح العوامل المساهمة في العدوى البشرية ، مما يمكن الباحثين من تعديل الظروف لتعكس حالات المرض المختلفة أو لاختبار التدخلات العلاجية المحتملة. إن توافق المنصة مع تقنيات القراءة المتعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المتقدم والتحليلات الميكروبيولوجية وتحليل النفايات السائلة الكيميائية الحيوية ، يعزز فائدتها. تسمح هذه القدرات بإجراء تقييم شامل لاستجابة الأنسجة للعدوى ، بما في ذلك تقييم السلوك الخلوي ، وانتشار مسببات الأمراض ، وفعالية الاستجابات المناعية.
نقدم بروتوكولا وتقنيات مفصلة لإنشاء واستخدام نموذج الحويصلات الهوائية البشرية على الرقاقة الذي يركز على تكرار واجهة الهواء السائل ودمج الخلايا المناعية لدراسة العدوى البشرية في المختبر.
البروتوكول
يتم عزل خلايا HUVEC من الحبال السرية وتستخدم حتى الممر 4. يتم عزل الخلايا الوحيدة الأولية من المتبرعين الأصحاء من الدم الكامل. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة يينا ، يينا ، ألمانيا (3939-12 / 13). وفقا لإعلان هلسنكي ، أعطى جميع الأفراد الذين يتبرعون بالخلايا للدراسة موافقتهم المستنيرة.
1. اليوم الأول: تحضير الرقاقة الحيوية
- الرقائق الحيوية متوفرة بأحجام ونماذج مختلفة. للتجارب هنا ، استخدم النموذج BC002. ضع الرقاقة الحيوية في طبق بتري زجاجي ، واملأ الطبق ، واغسل جميع التجاويف بالإيثانول المعقم بنسبة 70٪ (EthOH). احتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بمسح التجاويف 2x باستخدام ddH2O. قم بإزالة ddH2O.
- قم بتغطية غشاء الرقاقة الحيوية لكلا التجويفين بمحلول وريدي معقم للكولاجين (0.5 مجم / مل في 0.5 مللي متر من حمض الأسيتيك ؛ استخدم تركيز 1: 100 في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco يحتوي على المغنيسيوم والكالسيوم PBS (+/+)) عن طريق شطف محلول الكولاجين الوريدي برفق عبر كلا التجويفين باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع أطراف زرقاء. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر مع أطراف مرشح أزرق (P1000) في جميع أنحاء البروتوكول بأكمله. يغطي قطر فتحة طرف المرشح تماما فتح المنافذ التي تربط القنوات ، مما يتجنب إدخال فقاعات الهواء في الشريحة. - بعد 30 دقيقة من الحضانة ، اغسل الغرف السفلية والعلوية 2x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم (+/+) لطرد الكولاجين المتبقي وحمض الأسيتيك.
- قم بإعداد وسط EC بإضافة 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل). املأ الغرفة العلوية لكل تجويف ب 250 ميكرولتر من وسط EC والغرفة السفلية ب 150 ميكرولتر من وسط EC.
- حصاد HUVEC من دورق T25 متقارب: يغسل ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco بدون المغنيسيوم والكالسيوم PBS (-/-) ، أضف 1 مل من 0.25٪ Trypsin + 1 mM EDTA في PBS (-/-) واحتضانه لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية. أوقف نشاط التربسين بإضافة 5 مل من PBS (+/+) + 5٪ FCS وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط EC.
- استخدم تخفيفا تسلسليا بنسبة 1:10 عند إجراء عد الخلايا. أضف 10 ميكرولتر من حبيبات الخلايا المعاد تعليقها إلى 90 ميكرولتر من وسط الخلية. الجمع بين العينات بعناية. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق مع 10 ميكرولتر من صبغة تريبان الزرقاء. قم بتخفيف محلول الخلية باستخدام التريبان الأزرق (1: 1) باستخدام شرائح غرفة عد الخلايا. عد الخلايا إما يدويا باستخدام غرفة نيوباور أو باستخدام عداد خلايا آلي. تحديد عدد الخلايا وضبط التركيز إلى 0.4 × 106 خلايا لكل 200 ميكرولتر.
- استبدل وسط الخلية البطانية في الغرفة العلوية للرقاقة الحيوية ب 200 ميكرولتر من وسط EC الذي يحتوي على HUVECs المعلقة. ماصة بلطف لتجنب تشكيل فقاعات الهواء في القنوات أو الغرف. ضع طبق بتري الزجاجي مع الرقائق الحيوية على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
2. اليوم الثاني: فحص طبقة الخلية
- في اليوم 2 ، تحقق بصريا من التقاء طبقة خلية HUVEC في الغرفة العلوية. قم بإجراء تبادل متوسط في الغرفة العلوية باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC. ماصة بلطف لتجنب انفصال الخلايا عن الغشاء. إجراء تبادل وسائل الإعلام يوميا بعد 24h. ضع طبق بتري الزجاجي مع الرقائق الحيوية مرة أخرى على حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
3. اليوم الثالث: إعداد الغرفة السفلى
- تحقق بصريا من التقاء طبقة الخلايا البطانية. عند هذه النقطة ، حدد وجود طبقة متقاربة ومورفولوجيا تشبه الحصى (الشكل 1). قم بإجراء تبادل متوسط في الغرفة العلوية باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC.
- بعد ذلك ، قم بإعداد الغرفة السفلية لبذر الخلايا التي تشكل الطبقة الظهارية. اغسل الحجرة السفلية برفق باستخدام 150 ميكرولتر من وسط RPMI (أضف 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، مصل بقرة الجنين 5٪ ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون).
- بالنسبة للغرفة السفلية ، يتم تعليق خلايا البذور 0.5 × 106 H441 في 200 ميكرولتر من وسط RPMI (RPMI) لكل تجويف.
- حصاد خلايا H441
- اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS (-/-) مرة واحدة. أضف 2 مل من 0.25٪ تربسين + 1 مللي مول EDTA في برنامج تلفزيوني (-/-).
- احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. يختلف وقت الحضانة اعتمادا على التقاء الطبقة. في غضون 5-7 دقائق ، يجب أن تنفصل الخلايا تماما.
- أوقف نشاط التربسين باستخدام 10 مل من PBS (+/+) + 5٪ FBS ، واجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق.
- بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من RPMI ، وعدها.
- بذرة 0.5 × 106 خلايا لكل غرفة عن طريق سحب محلول الخلية برفق في الغرفة السفلية. أغلق جميع المنافذ واقلب الرقاقة الحيوية رأسا على عقب حتى تتمكن الخلايا من الالتصاق بغشاء PET. حافظ على الرقاقة الحيوية رأسا على عقب واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
4. الأيام 4 - اليوم 7: صيانة الخلايا وحصاد الخلايا الوحيدة
- أداء التبادل المتوسط اليومي في الغرفة العلوية والسفلية. بالنسبة للغرفة العلوية ، قم بإجراء التبادل المتوسط باستخدام 300 ميكرولتر من وسط EC.
- استخدم 200 ميكرولتر من RPMI + (متوسط RPMI بالإضافة إلى 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، مصل بشري ذاتي المنشأ 10٪ ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون) للغرفة السفلية. في اليوم 7 ، اغسل الغرفة السفلية باستخدام RPMI + لإعداد التجويف لبذر الخلايا الوحيدة.
- البذور 0.1 × 106 حيدات معلقة في 200 ميكرولتر RPMI + في الغرفة السفلية.
- حصاد وحيدات
- اغسل الخلايا ب 1 مل من PBS (-/-) واحتضانها لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا (-/-) يحتوي على 4 مجم / مل ليدوكائين + 5 مللي مول EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- اجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 7 دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من RPMI + ، وقم بالعد. ضع منافذ الرقاقة الحيوية متجهة لأسفل بحيث تلتصق الخلايا بالغشاء.
5. اليوم 8: تروية الرقاقة الحيوية
- في هذه المرحلة ، تأكد من أن الرقائق الحيوية جاهزة للتوصيل بالتدفق والتعطير. قبل البدء في التروية ، قم بإعداد حاضنة فارغة ووضع المضخة التمعجية في الداخل.
- نضح الرقائق الحيوية
- قبل توصيل الأنبوب المعقم بالرقاقة الحيوية ، اغسل الأنبوب ب 200 ميكرولتر من PBS (+/+) ، متبوعا ب 200 ميكرولتر من وسط EC. يبلغ قطر الأنبوب الداخلي 0.5 مم ، ويتكون من جوانب أطول (20 سم) وأقصر (12 سم) مقسومة على سدادتين للمضخة التمعجية. ضع الأنبوب جانبا وقم بإعداد الخزانات للوسط.
- قم بإجراء تبادل متوسط في الغرف العلوية والسفلية عن طريق غسلها بوسط زراعة الخلايا المحضر حديثا.
- أدخل الخزان على جانب مخرج الرقاقة الحيوية وقم بتوصيل الخزان بالأنبوب بمدخل الرقاقة الحيوية (الشكل 2). قم بتوصيل الأنبوب بالخزان والرقاقة الحيوية بحيث يكون هناك نضح متوسط دائري بين الخزان والرقاقة الحيوية.
- بمجرد توصيل كل شيء بالمنافذ ، املأ الخزان ب 500 ميكرولتر من وسيط EC. قم بتوصيل الرقاقة الحيوية بالأنبوب الموجود على التروية بمعدل تدفق 21 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 2). راقب عن كثب خلال أول 15 دقيقة من التروية لإدخال الفقاعات. أداء التبادل المتوسط يوميا في كلا المجلسين.
6. اليوم 9 - اليوم 11: إنشاء واجهة هواء سائل
- أوقف التروية ، وأفرغ الخزانات ، وأعد تعبئتها بوسط طازج تحت خزانة أمان معقمة. ماصة 500 ميكرولتر من وسط EC في الخزانات واغسل الغرفة السفلية برفق ب 200 ميكرولتر من RPMI +. ابدأ التروية مرة أخرى بمعدل تروية يبلغ 21 ميكرولتر / دقيقة.
- واجهة سائل الهواء (ALI)
- قم بإنشاء ALI من اليوم 12 حتى نهاية التجربة (اليوم 14). أثناء زراعة ALI ، قم بتعريض الخلايا الظهارية للهواء.
- لإنشاء ثقافة ALI ، قم بإعداد وسط وعائي جديد EC (أضف 1: 100 (v / v) البنسلين / الستربتومايسين (10000 وحدة / مل) ، 10 نانوغرام / مل GM-CSF ، 20٪ مصل بشري ذاتي المنشأ ، 1μM ديكساميثازون) للحفاظ على جميع أنواع الخلايا في الشريحة. في هذه المرحلة ، يحتوي الوسط على تركيز أعلى من AS (20٪).
- افتح المقابس الموجودة في الحجرة السفلية أسفل خزانة أمان معقمة وامتص الوسط بعناية حتى تظهر فقاعة هواء ، كما هو موضح في الشكل 3. تأكد من إزالة السائل بالكامل من القناة والغرفة وأغلق المنافذ بعناية.
- املأ الخزانات بوسط EC (-/-) واستمر في زراعة التروية بمعدل تدفق 21 ميكرولتر / دقيقة. تبادل الوسط فقط في الغرفة العلوية حتى اليوم 14 والحفاظ على الخلايا الظهارية في الغرفة السفلية بالهواء فقط.
7. اليوم 14: حصاد الأنسجة وتحليلها
- افصل الرقاقة الحيوية عن التدفق. قم بتوصيل الأنبوب وتحقق من المجهر بحثا عن التقاء الخلايا. بسبب الهواء في الغرفة السفلية ، قد تبدو طبقات الخلايا غامضة ويصعب تصورها. في هذه المرحلة ، يكون النموذج جاهزا لمزيد من التجارب.
- تثبيت وتلطيخ الأنسجة في الرقاقة الحيوية
- اغسل التجاويف باستخدام PBS (+/+) لإزالة وسط زراعة الخلايا. ماصة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) يذوب في PBS (-/-) إلى الغرفة العلوية و 200 ميكرولتر في الغرفة السفلية ويحتضن لمدة 10 دقائق في RT.
ملاحظة: عند العمل مع المواد الكيميائية المثبتة مثل PFA، استخدم غطاء الدخان. جمع النفايات والتخلص منها وفقا لذلك. - اغسل الغرف 3x باستخدام PBS (+/+). بعد التثبيت ، قم بتخزين الرقائق الحيوية في درجة حرارة 4 درجات مئوية أو استخدمها مباشرة لتلطيخ الخلايا المناعية.
- للنفاذية ، ماصة 300 ميكرولتر من 0.25٪ Triton X-100 في PBS (+/+). احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
- بعد الحضانة ، اغسل كلتا الغرفتين باستخدام PBS (+/+) وماصة 300 ميكرولتر من 3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS (+/+) في كلا الغرفتين. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
- في غضون ذلك ، قم بإعداد لوحة الأجسام المضادة لتلطيخ التألق المناعي. لإعداد لوحة الأجسام المضادة لتلطيخ التألق المناعي ، تم إعداد أنبوب يحتوي على كمية كافية من 3٪ BSA لتخفيف الأجسام المضادة. استخدم 50 ميكرولتر من تخفيفات الأجسام المضادة لكل غشاء. استخدم نسبة تخفيف تبلغ 1: 100 لألواح الأجسام المضادة الأولية و 1: 200 لألواح الأجسام المضادة الثانوية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للوحة الأجسام المضادة الثانوية ، قم بإعداد DAPI بنسبة تخفيف 1: 2,000. للاطلاع على الأجسام المضادة المقابلة، انظر (الجدول 1).
- للوصول مباشرة إلى الخلايا داخل الرقاقة الحيوية ، يجب إزالة رقائق الترابط. لفتح غرف الموائع الدقيقة ، قم بإجراء قطع دقيق عبر الجزء الخارجي من التجويف وإزالة رقائق الترابط. اقطع الغشاء عن طريق إزالة الحواف المختومة على الرقاقة الحيوية بالمشرط.
ملاحظة: اعمل بدقة ودقة خلال هذه الخطوة لتجنب أي تلف في الغشاء وإصابات بسبب حدة المشرط. - بعد فصل الغشاء عن الرقاقة الحيوية ، قسم الغشاء إلى قطعتين. جمع قطع الغشاء مع ملقط ووضعها على شريحة مجهرية لتلطيخ.
- ماصة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لكل قطعة غشاء. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء.
- بعد الحضانة ، ضع الغشاء في 500 ميكرولتر من PBS (-/-) في 24 صفيحة بئر واغسل الغشاء 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما في PBS (+/+). بعد الغسيل ، ماصة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي واحتضان لمدة 1 ساعة في RT محمية من الضوء.
- اغسل الغشاء باستخدام برنامج تلفزيوني (+/+) 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. في هذه الأثناء ، قم بإعداد وتسمية الشرائح المجهرية للتجربة. ضع قطرة من وسيط التثبيت على الشريحة وضع الغشاء المقابل. كرر هذه الخطوة لجميع الأغشية. في النهاية ، ضع قطرة أخرى من وسيط التثبيت في الجزء العلوي من الغشاء واستخدم غطاء زجاجي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- اغسل التجاويف باستخدام PBS (+/+) لإزالة وسط زراعة الخلايا. ماصة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) يذوب في PBS (-/-) إلى الغرفة العلوية و 200 ميكرولتر في الغرفة السفلية ويحتضن لمدة 10 دقائق في RT.
النتائج
يمكن إجراء فحص للتغيرات المورفولوجية والتعبير عن بروتينات العلامة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. بعد الزراعة المشتركة لمدة 14 يوما ، يتم تحليل الجوانب الوعائية والظهارية للتعبير عن علامات الخلايا المعنية. هذه الطريقة مفيدة لدراسة تفاعلات وسلامة المكونات الوعائية والظهارية ، وهو أمر ضروري لنمذجة المرض كقراءة بيولوجية وظيفية تتعلق بالعدوى. يمكن دعم تلطيخ التألق المناعي من خلال التحليل الكمي والتقييم المورفولوجي والمقايسات الوظيفية ، بما في ذلك إطلاق السيتوكين ، وتحليل النفايات السائلة لعلامات موت الخلايا مثل إطلاق LDH ، والتغيير في القياسات الشكلية للخلايا5. على الجانب الوعائي ، يمكن دراسة سلامة ومورفولوجيا بروتينات تقاطع الخلايا البطانية ، مثل VE-cadherin ، لتقييم التقاء وتشكيل الحاجز البطاني6 (الشكل 4 أ). بعد التروية ، يجب أن تكون طبقة الخلايا البطانية متقاربة مع تعبير منظم بوضوح عن VE-cadherin عند حدود الخلايا البطانية. يمكن أن يكون الجزء السفلي من الغشاء مناعيا للعلامات الظهارية مثل E-cadherin وبروتين الفاعل بالسطح A (SP-A) 7. إن التعبير عن SP-A ، وهو مكون رئيسي للخافض للتوتر السطحي الرئوي ومزيج معقد من الدهون والبروتينات ، يقلل من التوتر السطحي عند واجهة الهواء والسائل الظهارية وبالتالي يمنع في الجسم الحي انهيار الحويصلات الهوائية أثناء الزفير والحفاظ على وظائف الرئة المناسبة وتبادل الغازات 6,8. في نموذجنا ، تعبر الخلايا الظهارية عن SP-A بعد علاج ALI ويمكن تصورها عن طريق تلطيخ التألق المناعي (الشكل 4B). يمكن تأكيد التقاء وسلامة طبقة الخلايا الظهارية من خلال تلطيخ التألق المناعي ل E-cadherin ، وهي علامة وصلة ظهارية مهمة للخلايا الظهارية السنخية (الشكل 4C). يمكن تأكيد وجود الضامة عن طريق تلطيخ التألق المناعي لبروتين صانع البلاعم CD686 (الشكل 4C). لدراسة العدوى الفيروسية أو البكتيرية أو الفطرية ، يرجى العثور على تفاصيل حول نماذج العدوى المقدمة في Deinhardt-Emmer et al.6 و Schicke et al.7 و Hoang et al.9.
الشكل 1: صورة تمثيلية لطبقة HUVECs المتقاربة في الرقاقة الحيوية في اليوم 3. تظهر الصورة مجهر برايت فيلد بتكبير 10x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الإعداد لحث الحويصلات الهوائية على الرقاقة وتحريض ALI. (أ) صورة تمثيلية لإعداد التروية لنموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة؛ (ب) صورة تمثيلية لتحفيز الحويصلات الهوائية في الحجرة عن طريق امتصاص الوسط وإدخال الهواء إلى الخلايا. يشير تكوين فقاعة هواء داخل الغرفة إلى أن الخلايا تتعرض للهواء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نظرة عامة تخطيطية على الحويصلات الهوائية على الرقاقة. يشير بروتوكول مفصل لمدة 14 يوما من الثقافة إلى خطوات مهمة لبذر الخلايا وتنميتها داخل الرقاقة الحيوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلطيخ التألق المناعي لطبقات الخلايا البطانية والطلائية. (أ) الخلايا البطانية HUVEC التي تعبر عن تعبير VE-cadherin (برتقالي) و (B-C) H441 الطلائية التي تعبر عن (B) SP-A (أحمر) و (C) E-cadherin (برتقالي) و SP-A (أحمر) و CD68 (أخضر) على الجانب الطلائي. DAPI (الأزرق) بقع الحمض النووي ويشير إلى نواة الخلية. يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تجويف | خلايا |
| التجويف العلوي | البطانية (0.4 × 106) |
| تجويف سفلي | الظهارية (0.5x106H441 + 1x105 وحيدات) |
الجدول 1: نظرة عامة على بذر الخلية في الرقاقة الحيوية.
المناقشة
يمثل نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة نموذجا نسيجيا متعدد الطبقات للحويصلات الهوائية البشرية ، يدمج أنواع الخلايا الأساسية في الجهاز التنفسي السفلي ، بما في ذلك الخلايا الظهارية الرئوية والخلايا البطانية والبلاعم ، المزروعة بترتيب عضوي في ALI مع نضح متوسط للبطانة البطانية. تعبر خلايا الطبقات المختلفة عن بروتينات علامة خلية محددة مثل E-cadherin ، وهو جزيء التصاق يعتمد على الكالسيوم للخلايا الظهارية الرئوية ، وهو أمر أساسي في إنشاء حواجز ظهارية بين الخلايا 5,10. يشكل E-cadherin عنصر حاجز مادي ويتحكم في الاستجابة المناعية لمسببات الأمراض والمواد الضارة في البيئة10,11. تعبر الخلايا الظهارية H441 عن البروتين الخافض للتوتر السطحي A ، وهو أمر حاسم أيضا في الخط الأول من دفاع المضيف ضد العدوى عن طريق التوسط في النشاط المناعي والمضاد للبكتيريا8. يؤدي دمج الخلايا المناعية في نموذج الحويصلات الهوائية إلى زيادة تعقيدها الخلوي ، وبالتالي تكرار الاستجابة المناعية للمحفزات الالتهابية بشكل أفضل ، أي أثناء العدوى. وفي هذا السياق، استخدم النموذج لدراسة العدوى المشتركة لفيروس الأنفلونزا A والممرض الانتهازي البشري المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus)5. في الدراسة ، تم الكشف عن آلية العدوى المشتركة في الالتهاب الرئوي حيث تؤدي العدوى الفيروسية للخلايا الظهارية إلى استجابة التهابية كبيرة ، مما يسبب أضرارا كبيرة للخلايا البطانية ، مما يؤدي إلى فقدان وظيفة الحاجز. في دراسة أخرى ، تم استخدام النموذج لإثبات أن عدوى S. aureus تقلل من المستويات خارج الخلية من البروتين الخافض للتوتر السطحي A (SP-A) ، وهو مكون دفاعي مناعي حاسم في الرئتين ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى البروتيازالبكتيري 6. في حين أن التعبير عن SP-A لا يتأثر بشكل مباشر بالمكورات العنقودية الذهبية أو فيروس الأنفلونزا A ، إلا أنه يتم تنظيمه بشكل كبير بواسطة TNF-α ، وهو سيتوكين ينتج بشكل كبير استجابة للعدوى البكتيرية ، خاصة في وجود البلاعم. تشير هذه النتائج إلى أن العدوى البكتيرية الأحادية والفائقة يمكن أن تخفض مستويات SP-A في الرئة ، مما قد يؤدي إلى تفاقم نتائج الالتهاب الرئوي الجرثومي6. علاوة على ذلك ، تم استخدام نموذج الحويصلات الهوائية لدراسة العدوى الفطرية للحويصلات الهوائية مع Aspergillus fumigatus وفعالية الأدوية المضادة للفطريات من خلال الاستفادة من الفحص المجهري عالي الدقة وتحليل الصور القائم على الخوارزمية بالاشتراك مع المقايسات البيولوجية الجزيئية ، بما في ذلك تلطيخ التألق المناعي وتنميط السيتوكين7. كشفت نمذجة داء الرشاشيات الرئوي الغازي في الحويصلات الهوائية على الرقاقة عن الوظائف الرئيسية للبلاعم البشرية التي يمكن أن تمنع نمو الفطريات جزئيا. كانت البلاعم مركزية في إطلاق السيتوكينات المسببة للالتهابات والكيموكينات ، والتي ارتبطت بزيادة عدد الخيوط الفطرية الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، أكدت الدراسة أن عقار caspofungin الفطري يحد بشكل فعال من نمو الفطريات ويحفز التغيرات المورفولوجية في البنية الفطرية ، بما يتماشى مع نتائج الدراسات الأخرى. تؤكد هذه الدراسات إمكانات المنصة النموذجية لتحديد الأهداف الخلوية للعدوى واختبار الأدوية بتركيزات ذات صلة سريريا.
هناك العديد من الجوانب التي يجب مراعاتها أثناء إنشاء الحويصلات الهوائية على الرقاقة. يعد البذر الدقيق للخلايا أمرا بالغ الأهمية لتحقيق توزيع موحد للخلايا وتكوين الطبقة. تأكد من زرع الخلايا بالكثافة المناسبة لتحقيق التقاء دون نمو بعضها البعض ، مما قد يضر بسلامة طبقات الخلية ووظائفها. أثناء عملية إنشاء ALI ، قم بإزالة الوسيط بعناية من الجانب القمي وأغلق المنافذ لمنع التلوث. يعد الحفاظ على ظروف الثقافة المشتركة المثلى ، مثل درجة الحرارة ومستويات CO2 والتكوين المتوسط أمرا بالغ الأهمية لبقاء وتفاعل كل من الخلايا البطانية والظهارية. قم دائما بإجراء تغييرات متوسطة بعناية لتجنب إزعاج طبقات الخلايا أو إدخال فقاعات الهواء. ماصة بلطف والتأكد من أن جميع المعدات المستخدمة معقمة لتقليل مخاطر التلوث. لمنع فقاعات الهواء ، قم بإمالة الماصة ببطء وقم بإمالة الشريحة أثناء التغييرات المتوسطة للسماح للفقاعات بالهروب. العمل في بيئة نظيفة ومعقمة وخاضعة للرقابة لتقليل التلوث. النظر في التعقيد والدقة المطلوبة لإنشاء وصيانة نموذج 3D للتجارب اللاحقة مع النموذج. إذا لم تتشكل طبقات الخلايا بشكل صحيح ، ففكر في تحسين كثافة الخلايا ودفعات الخلايا ، حيث يمكن أن تحدث اختلافات في نمو الخلايا اعتمادا على المتبرع والدفعة.
في حين أن النموذج يقدم تحسينات كبيرة على الأساليب الحالية ، فمن الضروري أيضا الاعتراف بضرورة مراعاة بعض القيود. أحد هذه القيود هو التعقيد والتكلفة المرتبطة بتشغيل جهاز الموائع الدقيقة. يتطلب تشغيل نماذج الأعضاء على الرقاقة معدات متخصصة وخبرة في علم الموائع الدقيقة لاعتماد نموذج الحويصلات الهوائية على الرقاقة. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن هذا النموذج يمكنه تكرار العديد من الميزات الرئيسية للبيئة السنخية بنجاح ، إلا أنه لا يمكنه تكرار جميع التفاعلات الخلوية والقوى الميكانيكية الموجودة في الجسم الحي بشكل كامل. على سبيل المثال ، لا يحتوي النموذج على نظام مناعي شامل أو مجموعة كاملة من أنواع الخلايا في الرئة البشرية ، مما قد يؤثر على دقة دراسات التفاعل بين العامل الممرض والمضيف.
على الرغم من هذه القيود ، يقدم نموذج الرئة على الرقاقة تطورات مقارنة بثقافات الخلايا 2D التقليدية مثل أنظمة Transwell. من خلال دمج واجهة الهواء والسائل ، والخلايا البطانية والظهارية ، والمكونات المناعية في نسيج متعدد الطبقات داخل بيئة ديناميكية ومعطوبة ، يمثل النموذج نهجا أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية لدراسة فسيولوجيا الرئة والأمراض واستجابات العلاج في المختبر. هذا أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا لالتهابات الجهاز التنفسي البشرية وتطوير علاجات أكثر فعالية. تمثل قدرة النموذج على التعامل بدقة مع الإشارات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية ميزة مهمة لتشريح آليات تطور المرض وعمل الدواء. يمكن أن يؤدي استخدام مادة الخلايا البشرية إلى تقليل الاختلافات المرتبطة بالأنواع التي تظهر في التجارب على. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دمج تحليلات العلامات الحيوية المتعددة يعزز عمق واتساع البيانات التي يمكن الحصول عليها من تجربة واحدة ، مما يساهم في تقليل تكاليف التجارب في المختبر. مع الاعتراف بحدوده ، يمثل نموذج الرئة على الرقاقة خطوة مهمة إلى الأمام في أبحاث أمراض الجهاز التنفسي ، حيث يقدم بديلا أكثر دقة وأخلاقية وكفاءة للطرق التقليدية.
الإفصاحات
KR هو الرئيس التنفيذي لشركة Dynamic42 GmbH ويمتلك أسهما في الشركة. A.S.M. هو مستشار علمي لشركة Dynamic 42 GmbH ويمتلك أسهما في الشركة. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يقر H.K. و A.S.M. بالتمويل المقدم من Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena ، بتمويل من خط التمويل الشبكات الاستراتيجية لجمعية Leibniz. تم دعم MA و A.S.M. من قبل مشروع IMPROVE لمنتدى إدارة الإنترنت بتمويل من الوزارة الاتحادية للشؤون الاقتصادية والطاقة على أساس قرار من البوندستاغ الألماني. كما تقر A.S.M بالدعم المالي المقدم من مجموعة توازن التميز في Microverse في إطار استراتيجية التميز الألمانية - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية >مستهلكات< / قوية > | |||
| غرفة العد الخلوي (الكونتيسة) ألواح | لزراعة الخلايا Invitrogen | C10283 | |
| ، 24 بئر ، ألواح متعددة | لزراعة الخلايا Greiner Bio-One | 662 160 | |
| ، 6 بئر ، معقم | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Coverslips (24x40mm ؛ # 1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| مناديل مبللة صديقة للبيئة | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15 مل | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50 مل | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| مسحة شاش | Noba | PZN 2417767 | |
| قفازات Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Microscope Slides | Menzel-Gl & auml; ser | AAAA000001 # #12E | |
| ألواح Multiwell 24 Well ، معقمة | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| ماصات باستور (زجاج) 150 مم | ماصات | باستور 40567001 | |
| المساعدة (زجاج) 230 مم | 40567002 | ||
| مساعد أنابيب مستديرة القاع (PS ، 5 مل | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set ، 20 جم ، 200 مم | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| مشارط | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| ماصات مصلية 10 مل | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| ماصات مصلية 25 مل | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| ماصات مصلية 2 مل | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| ماصات مصلية 50 مل | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| ماصات مصلية 5 مل | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette ، 7,5 مل Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette ، 9,0 مل K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| قارورة Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| نصائح معقمة 10 & مايكرو; L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| نصائح معقمة 1250 & micro; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| نصائح معقمة 300 & micro; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| نصائح غير معقمة 10 & مايكرو; L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| نصائح غير معقمة 1000 & مايكرو; L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| نصائح غير معقمة 200 & مايكرو; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| ملاقط (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08 ، 5/45 ، 0,06 مم) | Roth | K343.1 | |
| < قوي > كيماويات < / قوي > | |||
| Descosept AF | دكتور شوماخر | N-20338 | |
| الإيثانول 96٪ | نوردبراند نوردهاوزن | 410 | |
| فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) - ديكستران (3-5 كيلو دالتون) | سيجما ألدريتش | FD4-100 مجم | |
| الفلورسنت متوسط | Dako | S3023 | |
| الميثانول | VWR | 20847.295 | |
| Saponin | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| ثقافة الخلية< / قوي> | |||
| الكولاجين الرابع | سيجما-ألدريتش | C5533-5MG | |
| ديكساميتاسون | سيجما ألدريتش | D4902 | |
| DPBS (-/-) | لونزا | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| نمو الخلايا البطانية متوسط | Promocell | C-22020 | |
| مكمل متوسط نمو الخلايا البطانية | Promocell | C-39225 | |
| مصل الأبقار الجنيني | سيجما ألدريتش | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| مؤتلف بشري GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicillin-Streptomycin (10،000 U / mL) | Gibco | 15140-122 / -163 | |
| RPMI | Gibco | 72400047 | |
| صبغة زرقاء من التريبان 0.4٪ | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| <قوية > الأجسام المضادة الأولية < / قوية > | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (ماعز) | BD | 610252 | |
| CD68 (أرنب) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (ماعز) | R & D | AF748 | |
| SP-A (فأر) | Abcam | ab51891 | |
| <قوي >الأجسام المضادة الثانوية< / قوي> | |||
| AF488 (الحمار المضاد للفأر) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (الحمار المضاد للفأر) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (الحمار المضاد للأرانب) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (الحمار المضاد للماعز) | أبحاث جاكسون | 705-165-147 | |
| <قوي> ميكروفلويديك< / قوي> | |||
| رقاقة | ديناميكية 42 | BC002 | |
| ذكر قفل لور (صغير) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| مقابس لوير صغيرة للذكور ، صف من أربعة ، PP ، شيبس ميكروفلويديك الأخضر | 09-0558-0336-11 | ||
| مقابس لوير صغيرة للذكور ، صف من أربعة ، PP ، | مقابس رقائق Microfluidic | 09-0556-0336-09 | |
| مقابس لوير صغيرة للذكور ، صف من أربعة ، PP ، شيبس ميكروفلويديك أحمر | 09-0557-0336-10 | ||
| مقابس | كول بارمر | GZ-45555-56 | |
| خزان 4.5 مل | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| أنابيب | ديناميكية 42 | ST001 | |
| <قوي> المعدات< القوية> | |||
| الأوتوكلاف | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| جهاز الطرد المركزي | Eppendorf | 5424 | |
| حاضنة CO2 | Heracell | 150i | |
| الكونتيسة عداد الخلايا الآلي | Invitrogen | C10227 | |
| التدفق | BD | FACS Canto II | |
| فريزر (-20 درجة ؛ ج) | Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 درجة ؛ ج) | ثلاجة Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Liebherr | LCexv 4010 | ||
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| المجهر | Leica | DM IL LED | |
| شاكر مداري | Heidolph | Reax2000 | |
| تمعجية | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| الماصات 10 & مايكرو ؛ L | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
| Pipettes 100 & micro ؛ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipettes 1000 & micro; L | Eppendorf Research Plus | 3123000063 | |
| Pipettes 2.5 & micro; L | Eppendorf Research Plus | 3123000012 | |
| Pipettes 20 & micro; L | Eppendorf Research Plus | 3123000039 | |
| Pipettes 200 & micro ؛ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| مقعد معقم | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Waterbath | Julabo | SW-20C | |
| <قوي > إعداد مجهر مضان < / قوي> | |||
| Apotome.2 | جهاز إضاءة زايس | ||
| HXP 120 C | |||
| مجهر | زايس | أكسيو أوبزرفر 5 | |
| التقسيم البصري | Zeiss | ApoTome | |
| مجهر إمدادات الطاقة | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN الإصدار الأزرق | زايس |
المراجع
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
