مقالة منهجية

الكشف عن تفاعل البروتين والأمبيليفيرون CD40 عن طريق مضان المسح التفاضلي

DOI:

10.3791/66610

⸱

مارس 1, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Tibetan Medicine, University of Tibetan Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy / Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة للكشف عن الارتباط بين المركبات وجزيئات البروتين ، مما يوفر مزايا الحد الأدنى من فقدان عينة البروتين ودقة البيانات العالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التحقيق في التفاعلات بين الجزيئات المختلفة جانبا حاسما لفهم التسبب في المرض وفحص أهداف الأدوية. Umbelliferone ، وهو عنصر نشط في الطب التبتي Vicatia thibetica ، يظهر تأثير مناعي مع آلية غير معروفة. بروتين CD40 هو هدف رئيسي في الاستجابة المناعية. لذلك ، تستخدم هذه الدراسة مبدأ تقنية مضان المسح التفاضلي لتحليل التفاعلات بين بروتين CD40 و umbelliferone باستخدام علامات الإنزيم الفلوريسنت. في البداية ، تم التحقق تجريبيا من استقرار صبغة البروتين البرتقالية الفلورية ، وتم تحديد نسبة التخفيف المثلى البالغة 1: 500. في وقت لاحق ، لوحظ أن قيمة ذوبان درجة الحرارة (Tm) لبروتين CD40 تميل إلى الانخفاض مع زيادة التركيز. ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على التفاعل بين بروتين CD40 و umbelliferone لتعزيز الاستقرار الحراري لبروتين CD40. تمثل هذه الدراسة المحاولة الأولى للكشف عن إمكانات الارتباط لمركبات الجزيئات الصغيرة والبروتينات باستخدام الصفائح الدقيقة الفلورية والأصباغ الفلورية. تتميز هذه التقنية بحساسية ودقة عالية ، وتطورات واعدة في مجالات استقرار البروتين ، وبنية البروتين ، وتفاعلات البروتين والليجند ، مما يسهل المزيد من البحث والاستكشاف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vicatia thibetica H. Boissieu ، نبات في عائلة السرة ، يستخدم بشكل شائع في الطب التبتي ويمثل أحد المكونات الأساسية للمكونات الأساسية الخمسة (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute ، Asparagus cochinchinensis (Lour.) مير ، فيكاتيا ثيبتيكا إتش بواسيو ، أوكسيبافوس هيماليكوس إدجو ، وجيمنادينيا كونوبسي (L.) R. Br.) 1. موزعة بشكل رئيسي في جنوب غرب الصين ، مثل شمال غرب يونان ، غرب سيتشوان ، التبت ، ومناطق أخرى ، يعمل جذرها المجفف كبديل محلي لأنجليكا1. غالبا ما يستخدم الجذر ، المعروف برائحته ، كتوابل للحساء ، وتساهم الأوراق ، التي يشار إليها باسم الكرفس التبتي ، في الأطباق اللذيذة. وبالتالي ، فإن Vicatia thibetica لها أهمية ليس فقط كنبات طبي فريد ولكن أيضا كمصدر للغذاء في التبت.

تشير الأبحاث المحلية والدولية إلى أن Vicatia thibetica تمتلك خصائص تنشيط الدم و qi (الطاقة أو الطاقة) ، وهي مفيدة لتنظيم الحيض. يتم استخدامه لمعالجة أعراض عسر الطمث غير المنتظم الناجم عن الخفقان ونقص الدم ، ويظهر تأثيرات دوائية مثل تنظيم مضادات الأكسدة لمناعة الجسم2. أظهر مستخلص الكحول من Vicatia thibetica القدرة على استعادة كتلة الجسم ومؤشر الأعضاء في الفئران التي تعاني من نقص المناعة الناجم عن سيكلوفوسفاميد. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يزيد من نشاط ديسموتاز الفائق في المصل ويقلل من محتوى malondialdehyde ، مما يشير إلى تحسن في قدرة مضادات الأكسدة وتأثير متوازن على بيروكسيد الدهون 2,3. في الوقت نفسه ، فإنه يعزز عدد خلايا الدم والهيموجلوبين ، والذي لا يعكس بشكل موضوعي وظيفة المكونة للدم في الجسم فحسب ، بل يلعب أيضا دورا مهما في جهاز المناعة 2,3.

Umbelliferone ، الذي يتميز بالبلورات الدائرية والطعم المر ، يمتلك وزنا جزيئيا صغيرا ، وهو متقلب ، ويمكن تقطيره بالبخار. يتسامى بسهولة ، وله قابلية ذوبان منخفضة في الماء ، وقابلية عالية للذوبان في المواد العضوية. كأحد المكونات الكيميائية الرئيسية ل Vicatia thibetica ، يظهر umbelliferone تأثيرات مناعية على المناعة الخلوية ، والمناعة الخلطية ، والمناعة غير المحددة في نماذج الفئران المثبطة للمناعة التي يسببها الهيدروكورتيزون 4,5.

يتم التعبير عن جزيء سطح الخلية CD40 ، وهو عضو في عائلة مستقبلات عامل نخر الورم ، على نطاق واسع في الخلايا المناعية6. ليجنده المتماثل ، CD154 ، المعروف أيضا باسم CD40L ، هو بروتين عبر غشائي من النوع الثاني يتم التعبير عنه بواسطة الخلايا الليمفاوية التائية المنشطة. تنشيط CD40 لديه القدرة على تنظيم التعبير عن جزيئات التحفيز المشترك على سطح الخلايا المتغصنة (DC) والوحيدات. تعزز هذه العملية وظيفة عرض المستضد لجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) وتنشط خلايا CD8 + T7.

تلعب البلاعم دورا مهما في تكوين وتنظيم البيئة المكروية للورم ، ويمكن أن يعزز تنشيط CD40 إعادة تشكيل البيئة المكروية للورم بواسطة البلاعم8. يؤثر تنشيط إشارة CD40 بشكل كبير على تكاثر الخلايا البائية وتنشيطها. يمكن للخلايا البائية، عند تنشيطها بواسطة CD40، أن تعمل كخلايا فعالة لمولد الضد. أنها تقدم المستضدات ، وتوليد نشاط الخلايا التائية المستجيبة ، وبالتالي المساهمة في الآثار المضادة للورم9. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تنشيط CD40 في الخلايا السرطانية إلى موت الخلايا المبرمج ويمنع نمو الورم10. يقوم CD40 في المقام الأول بتحويل الإشارات عن طريق التحكم في نشاط كينازات بروتين التيروزين غير المستقبلة ، بما في ذلك Lyn و Fyn و Syk وغيرها. بالإضافة إلى ذلك ، لديه القدرة على تحفيز بروتينات Bcl-xL و Cdk4 و Cdk6 ، وتنشيط عوامل النسخ Rel / NF-kB ، وفسفرة CG-2 و PI3K10.

تستخدم طريقة مضان المسح التفاضلي (DSF) على نطاق واسع لتقييم تأثير الظروف البيئية المختلفة ، مثل تكوين المخزن المؤقت ودرجة الحرارة وروابط الجزيئات الصغيرة ، على الاستقرار الحراري لهياكل البروتين. الصبغة شائعة الاستخدام ل DSF هي صبغة برتقالية حساسة للبيئة وكارهة للماء. في ظل الظروف العادية ، يتم طي بنية البروتين ، وإخفاء الجزء الكارهة للماء داخليا. مع ارتفاع درجة الحرارة ، تصبح المنطقة الكارهة للماء في البروتين أكثر تعرضا ، مما يؤدي إلى انهيار تدريجي لبنية البروتين الطبيعي. ترتبط الصبغة بشكل انتقائي بهذا الجزء المكشوف من البروتين ، مما يؤدي إلى تضخيم مضانها. ثم يتم حساب قيم Tm من خلال مراقبة التغيرات في اكتشاف إشارة التألق11. إلى حد ما ، يمكن للاختلافات في قيم Tm قياس التحولات في استقرار البروتين بسبب الطفرات أو التغيرات في المخازن المؤقتة أو ربط الرباط. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشير إلى تغييرات هيكلية أثناء عملية طي البروتين12. يقدم هذا النهج بيانات دقيقة ، ونطاق واسع لدرجة الحرارة ، وحساسية عالية ، والحد الأدنى من فقدان عينة البروتين13.

في هذه الدراسة ، تم إجراء تحديد التألق باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية بدلا من جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري (PCR). يتيح هذا التعديل اكتشاف DSF في المختبرات التي تفتقر إلى أداة PCR الكمية الفلورية ، مما يجعل الطريقة أقل تعقيدا ويقلل من الخطوات المطلوبة لإعداد الجهاز ، وبالتالي تبسيط العملية التجريبية. ومع ذلك ، هناك بعض العيوب لهذا النهج. بينما يتم تقليل التعقيد ، يصبح الإجراء أكثر تعقيدا. يعد الكشف اليدوي عن التألق في درجات حرارة مختلفة أمرا ضروريا ، ولا يمكن تحقيق التجميع التلقائي والمستمر للتألق من النظام. وهكذا ، استخدمت هذه الدراسة تقنية DSF لاستكشاف التفاعل بين بروتين CD40 وأومبيليفيرون ، مما يوفر رؤى جديدة حول الآليات الجزيئية للطب التبتي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إدخال المحلول المركب ومحلول البروتين والصبغة في محلول PBS. بعد ذلك ، خضعت العينات للتسخين التدريجي باستخدام حمام جاف يهز التدفئة الرقمية ، وتم تقييم الاستقرار الحراري للبروتينات عن طريق قياس التغير في شدة التألق داخل النظام المعقد. الخطوات التفصيلية موضحة أدناه ، ويوضح الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول.

1. إعداد الحل

  1. قم بإعداد محلول أومبيليفيرون 1 مللي متر بإضافة 0.1 مجم من أومبيليفيرون إلى 616.75 ميكرولتر من محلول DMSO (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد محلول بروتين CD40 200 ميكروغرام / مل بإضافة 0.1 مجم من CD40 إلى 500 ميكرولتر من محلول ddH2O (انظر جدول المواد).
  3. قم بإعداد محلول صبغة برتقالية 500x بإضافة 1 ميكرولتر من صبغة برتقالية 5000x إلى 9 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قم بإجراء العمليات المذكورة أعلاه على الجليد ، وبما أن الماصة لها نطاق لا يقل عن 0.1 ميكرولتر ، قم في البداية بتخفيف صبغة البروتين البرتقالي بعامل 10 لتسهيل الاستخدام اللاحق.

2. اختبار أداء الصبغة

  1. أضف صبغة برتقالية 500x إلى محلول PBS وقم بتخفيفها لتحقيق صبغة: نسب PBS 1: 500 و 1: 1000 و 1: 2000 و 1: 4000.
    ملاحظة: تأكد من أن التركيز النهائي ل DMSO لا يتجاوز 2٪ (v / v).
  2. قم بتشغيل قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية وقم بتسخينه لمدة 10 دقائق.
  3. افتح الكمبيوتر وبرنامج الحصول على البيانات بالتسلسل (انظر جدول المواد).
  4. انقر فوق الأداة ، واختر نموذج الصفيحة الدقيقة الفلورية المقابلة ، وحدد موافق في برنامج الحصول على البيانات.
    ملاحظة: انتظر حتى تنتهي الصفيحة الدقيقة الفلورية من التسخين المسبق واعرض درجة الحرارة على اللوحة قبل فتح برنامج الحصول على البيانات لضمان اتصال ناجح بين الجهاز والبرنامج.
  5. انقر فوق إعدادات الاستحواذ وحدد مضان في برنامج الحصول على البيانات.
  6. قم بتحرير البرنامج في واجهة الأطوال الموجية : Lm1 = 470 نانومتر ، 570 نانومتر ، ثم حدد موافق.
    ملاحظة: يمكن إثارة الصبغة البرتقالية بضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 300 نانومتر أو الضوء المرئي عند 470 نانومتر ، ويمكن قياس الانبعاثات عند 570 نانومتر.
  7. أضف تركيزات مختلفة من صبغة البرتقال (1: 500 ، 1: 1000 ، 1: 2000 ، و 1: 4000) و PBS إلى 96 لوحة بئر عند 100 ميكرولتر / بئر.
    ملاحظة: قم بإذابة المحلول في DMSO قبل إضافته إلى PBS ، وقم بدوامة عند 2000 × جم جيدا أثناء عملية التحضير لضمان الذوبان الكامل بسبب ميل الصبغة إلى الترسيب.
  8. ضع لوحة 96 بئرا في مرحلة الكشف عن الجهاز ، وانقر فوق الزر "قراءة " في برنامج الحصول على البيانات ، وقم بقياس مضان كل تركيز صبغة 13 مرة في درجة حرارة الغرفة ، مع فاصل زمني قدره 2 دقيقة في كل مرة.
  9. انقر فوق الزر تصدير بعد كل تحديد ، وحدد تصدير إلى XML XLS TXT ، واختر كل اللوحات ، ثم حدد لوحة بتنسيق الإخراج ، وأخيرا انقر فوق "موافق " لحفظ البيانات في مجلد بتنسيق "XLS" لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: تساعد هذه الخطوات في تحديد تأثير القياس المستمر على التألق الذاتي للصبغة البرتقالية في درجة حرارة الغرفة وتحديد تركيز التلوين الأمثل.
  10. قم بتشغيل الحمام الجاف للتدفئة الرقمية ، واضبط درجة حرارة التسخين على 35 °C ، ووقت التسخين على 2 دقيقة.
  11. قم بإعداد نسبة التخفيف المثلى للصبغة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وضعه في حمام جاف يهز التدفئة الرقمية لمدة 2 دقيقة.
  12. أضف محلول PBS ومحلول التلوين ، المسخن عند 35 درجة مئوية ، إلى لوحة 96 بئرا بحجم 100 ميكرولتر لكل بئر.
  13. ضع لوحة 96 بئرا في مرحلة الكشف عن الأداة ، وانقر فوق الزر "قراءة " في برنامج الحصول على البيانات.
  14. اضبط درجة حرارة التسخين على 40 درجة مئوية ووقت التسخين على 2 دقيقة.
  15. ماصة محلول الصبغة في لوحة 96 بئر مرة أخرى في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل وتسخينه في الجهاز لمدة 2 دقيقة.
  16. كرر عمليات الخطوات 2.12-2.15 والخطوة 2.9 لاختبار امتصاص محلول الصبغة عند 35 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 45 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 65 درجة مئوية و 70 درجة مئوية و 75 درجة مئوية و 80 درجة مئوية و 85 درجة مئوية و 90 درجة مئوية و 95 درجة مئوية على التوالي.
    ملاحظة: تساعد هذه الخطوات في تحديد استقرار التألق الذاتي للصبغة البرتقالية تحت التسخين المستمر في تدرج من 35 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية. من الأهمية بمكان العمل بسرعة لتجنب الانخفاض السريع في درجات الحرارة أو إضافة السائل الخطأ ، مما قد يؤدي إلى أخطاء تجريبية.

3. الكشف عن ذوبان درجة الحرارة (Tm) للبروتين

  1. اجمع بروتين CD40 وصبغة البرتقال مع محلول PBS لتحقيق تركيزات نهائية تبلغ 5 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 15 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل ، و 1: 500 ، على التوالي.
  2. كرر العمليات الموضحة في الخطوات 2.2-2.6 والخطوات 2.10-2.16 لتقييم امتصاص محلول البروتين CD40 عند درجات حرارة 35 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 45 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 65 درجة مئوية و 70 درجة مئوية و 75 درجة مئوية و 80 درجة مئوية و 85 درجة مئوية و 90 درجة مئوية و 95 درجة مئوية على التوالي.
  3. كرر الخطوة 2.9 لحفظ البيانات وتحليلها ، ثم احسب قيمة Tm باستخدام برنامج تحليل البيانات (انظر جدول المواد).
  4. أضف بروتين CD40 وأومبيليفيرون وصبغة برتقالية إلى محلول PBS للحصول على تركيزات نهائية تبلغ 5 ميكروغرام / مل ، و 10 ميكروغرام / مل ، و 15 ميكروغرام / مل ، و 20 ميكروغرام / مل ، و 10 ميكرومتر ، و 1: 500 ، على التوالي.
    ملاحظة: الدوامة القوية أثناء تحضير المحلول ضرورية لضمان التوزيع المتساوي للصبغة وبروتين CD40 والأمبيليفيرون في برنامج تلفزيوني.
  5. كرر عمليات الخطوات 3.2-3.3 لقياس امتصاص محلول معقدات CD40-umbelliferone عند درجات حرارة 35 درجة مئوية و 40 درجة مئوية و 45 درجة مئوية و 50 درجة مئوية و 55 درجة مئوية و 60 درجة مئوية و 65 درجة مئوية و 70 درجة مئوية و 75 درجة مئوية و 80 درجة مئوية و 85 درجة مئوية و 90 درجة مئوية و 95 درجة مئوية على التوالي.
    ملاحظة: تم إجراء هذه الخطوات لتحديد قيم Tm لبروتين CD40 ومجمعات CD40-umbelliferone ، بهدف تحديد التركيز الأمثل لربط بروتين CD40 بالأمبيليفيرون.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت الصبغة البرتقالية باستمرار إثارة مضان مستقرة عند Ex = 470 نانومتر و Em = 570 نانومتر ، سواء في درجة حرارة الغرفة أو درجات الحرارة المرتفعة. تم تحديد نسبة التخفيف المثلى 1: 500 (الشكل 2 أ ، ب). ثبت أن الكشف عن قيمة Tm يمثل تحديا عندما كان تركيز بروتين CD40 أقل من 15 ميكروغرام / مل (الشكل 3 أ ، ب). ومع ذلك ، عند تركيز 15 ميكروغرام / مل ، كان من الممكن اكتشاف قيمة Tm مستقرة تبلغ 51.82 درجة مئوية ، والتي انخفضت إلى 45.79 درجة مئوية مع زيادة تركيز بروتين CD40 (الشكل 3C ، D).

كما هو موضح في الشكل 3 ، من الواضح أن ارتباط بروتين CD40 ب umbelliferone يؤثر على قيمة Tm لبروتين CD40. على وجه التحديد ، زادت قيم Tm لبروتين CD40 بتركيزات 15 ميكروغرام / مل و 20 ميكروغرام / مل ، وكذلك 10 ميكرومتر أمبيليفيرون ، إلى 62.08 درجة مئوية و 65.27 درجة مئوية ، على التوالي.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول. مخطط انسيابي لعملية تسجيل قدرة ربط بروتين CD40 بالأمبيليفيرون بناء على مبدأ DSF باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: فحص نسب تخفيف الصبغة البرتقالية واختبارات الثبات. (أ) ثبات الأصباغ ذات التوابع المختلفة عند درجة حرارة الغرفة. (ب) استقرار مضان الأصباغ مع نسبة تخفيف 1: 500 عند 35-95 درجة مئوية. تشير أشرطة الخطأ إلى ± SEM ، n = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مخططات النتائج لاستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية لتسجيل قدرة ربط بروتين CD40 بالأمبيليفيرون وفقا لمبدأ DSF. (أ-د) ملامح Tm من 5 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 15 ميكروغرام / مل ، 20 ميكروغرام / مل CD40 بروتين و CD40 + 10 ميكرومتر أمبيليفيرون ، على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى ± SEM ، n = 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSF ، المعروف أيضا باسم مقايسة التحول الحراري أو مقايسة التألق الحراري ، هو تقنية تستخدم للكشف عن عملية تمسخ البروتينات الحرارية في العينات من خلال مراقبة التغيرات في إشارة التألق لعينة الاختبار أو الصبغة أثناء زيادة درجة الحرارة البطيئة والمبرمجة. تم إنشاء DSF في البداية بواسطة Pantoliano14 ، وهو بمثابة طريقة عالية الإنتاجية. يتضمن الإجراء الرئيسي رفع درجة الحرارة على لوحة ساخنة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، وانبعاث ضوء الإثارة باستخدام مصباح فوق بنفسجي طويل الطول الموجي ، والتقاط التغيرات في شدة إشارة الفلورسنت الناتجة عن ربط الأصباغ الفلورية بالبروتينات من خلال كاميرا تشكيل طور جهاز مقترن بالشحنة.

تمثل قيمة Tm ، وهي مؤشر حاسم يميز البنية ذات المستوى الأعلى للبروتينات ، درجة الحرارة المقابلة لنصف تمسخ دواء البروتين أثناء زيادة درجة الحرارة. تشير قيم Tm الأعلى إلى متطلبات درجة حرارة أكبر لتمسخ البروتين ، مما يشير إلى بنية بروتين أكثر استقرارا. الطريقة المعترف بها حاليا للكشف عن قيم Tm هي كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (DSC) ، والذي بدأ في ستينيات القرن العشرين15. يقيس كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (DSC) الفرق في القدرة التي يتم توصيلها إلى الجسم قيد الاختبار والكائن المرجعي كدالة لدرجة الحرارة تحت التحكم المبرمج في درجة الحرارة للحصول على كمية الحرارة الممتصة والمفرغة. إنه المعيار الذهبي لتحليل الاستقرار الحراري16,17.

اكتسب DSF استخداما واسع النطاق بسبب ثلاث مزايا مقارنة بكالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي: (1) استهلاك أقل للعينة: يتطلب DSC عادة حجم عينة يبلغ 400 ميكرولتر، بينما يتطلب DSF 20-25 ميكرولتر فقط. (2) نطاق تركيز أكبر: يتطلب DSC عموما تركيزات بروتين تبلغ 0.2-2 ملغم/مل للحصول على ذروة تمسخ كبيرة، في حين يمكن ل DSF تحليل العينات في نطاق 0.005-200 ملغم/مل. (3) إنتاجية أعلى للعينة: يمكن لكالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (DSC) تحليل عينة واحدة فقط في كل مرة، بينما يمكن لDSF مسح ما يصل إلى 96 عينة أو أكثر18 عينة في وقت واحد. بسبب هذه المزايا ، يستخدم DSF على نطاق واسع في دراسة استقرار البروتين ، وهيكل البروتين وتشكيله ، وتفاعلات البروتين والليجند ، وتأثيرات مثبتات البروتين ، والمثبطات ، والعوامل المساعدة ، وأكثر من ذلك.

بالإضافة إلى DSF و DSC ، توجد العديد من تقنيات التفاعل الجزيئي الأخرى. رنين البلازمون السطحي (SPR) هو ظاهرة بصرية تحدث عند واجهة وسيطين ويمكن أن تسببها الفوتونات أو الإلكترونات. إنه ينطوي على انعكاس كلي عندما ينبعث الضوء من وسط كثيف بصريا إلى وسط متناثر بصريا. تعرف الزاوية التي يحدث عندها رنين البلازمون السطحي بزاوية SPR. تستخدم المستشعرات الحيوية SPR التغييرات في زوايا SPR لمراقبة التفاعلات بين الجزيئات في الوقت الفعلي19,20. MicroScale thermophoresis (MST) هي تقنية لتحليل التفاعلات الجزيئية الحيوية عن طريق اكتشاف التغيرات في حجم وشحنة وطبقة ترطيب الجزيئات الحيوية الناتجة عن الارتباط. يسجل تغيرات التألق في المنطقة المشععة بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء داخل العينة قبل وأثناء وبعد تشغيل الليزر ، مما يسمح بتحديدات سريعة نسبيا21. يقيس قياس التداخل للطبقة الحيوية (BLI) تفاعلات سطح المستشعر من خلال تتبع تغيرات الإزاحة في طيف قياس التداخل. في تجارب BLI ، يتم تجميد جزيء واحد على سطح مستشعر غاطس لاكتشاف جزيء آخر يمكن أن يرتبط به. يؤدي تفاعل الربط إلى إزاحة التداخل ، ويؤدي الرصد في الوقت الفعلي لهذا التغيير في الإزاحة إلى منحنى الربط22. يحدد كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) التفاعلات الجزيئية الحيوية عن طريق القياس المباشر للحرارة المنبعثة أو الممتصة أثناء الارتباط الجزيئي الحيوي. يوفر معلومات ديناميكية حرارية شاملة حول التفاعلات الجزيئية23. بالمقارنة مع تقنيات التفاعل الجزيئي هذه ، فإن DSF لديها متطلبات أقل للأدوات والمواد الاستهلاكية وتقنيات التشغيل. يمكنه اكتشاف التفاعلات بين المركبات والبروتينات بكفاءة في معظم المختبرات.

الإجراء التشغيلي لتقنية DSF واضح نسبيا. في البداية ، يتم دمج عينات المادة البيضاء ، ومخازن التفاعل ، والأصباغ الفلورية ، والروابط المرشحة في نظام تفاعل. ثم يتم نقل هذا النظام إلى أداة PCR مضان حيث يتم إعداد ظروف التسخين والكشف لتحديد التألق24,25. صبغة البروتين الأكثر استخداما ل DSF هي الصبغة البرتقالية حاليا ، وعادة ما تكون أداة الكشف عبارة عن أداة PCR كمية مضان26. ومع ذلك ، نظرا لأن الطول الموجي للإثارة للصبغة البرتقالية يبلغ 470 نانومتر وطول موجة الانبعاث 570 نانومتر ، فليست كل أدوات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري في السوق مطابقة تماما. لذلك ، تعتمد هذه الدراسة على قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية كأداة كشف جديدة لاستكشاف تفاعلات البروتين واليجند.

يوفر هذا النهج ميزتين رئيسيتين على DSF باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري. أولا ، يمكن تخصيص نطاق الطول الموجي لعلامة الإنزيم الفلوري ، مما يجعله أكثر توافقا مع نطاق الطول الموجي للصبغة وضمان اكتشاف مضان أكثر دقة. ثانيا ، لا يمكن إيقاف برنامج أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الفلوري بمجرد بدء تشغيله ، مما يجعل من الصعب استكشاف أي مشاكل أثناء عملية التسخين وإصلاحها. في المقابل ، يسمح قارئ الألواح الدقيقة الفلورية بإزالة التداخل عن طريق تعديل نسبة النظام وظروف الكشف بشكل متكرر طوال عملية الكشف. ومع ذلك ، فإن استخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية ل DSF يأتي أيضا مع بعض العيوب ، لا سيما الكمية الكبيرة نسبيا من العينة المطلوبة ، والتي تتراوح عادة من 50-200 ميكرولتر ، بينما يستخدم DSF التقليدي عادة 20-25 ميكرولتر من العينة.

في هذه المقالة ، تم إجراء التحقق من صحة DSF بناء على قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية للكشف عن Tm باستخدام بروتين CD40 وأومبيليفيرون ضمن نطاق تركيز 5-20 ميكروغرام / مل. أظهرت النتائج خصوصية الطريقة ودقتها العالية ، مما يؤكد ملاءمتها للكشف عن Tm. كشفت المقارنة اللاحقة لنتائج اكتشاف Tm بتركيزات عينات مختلفة عن اتجاه تنازلي في قيمة Tm لبروتين CD40 مع زيادة التركيز ، مما يشير إلى تأثير تركيز محتمل على اكتشاف Tm (الشكل 3). علاوة على ذلك ، اكتشفت الدراسة زيادة في قيمة Tm لبروتين CD40 بعد إضافة umbelliferone إلى النظام مقارنة بما قبل الإضافة. يشير هذا إلى أن umbelliferone يمتلك القدرة على الارتباط ببروتين CD40 ، مما يؤدي إلى تعزيز الاستقرار الحراري لبروتين CD40 عند مزيجهما (الشكل 3).

تم تحديد الخطوات الحاسمة في البروتوكول على أنها الخطوات من 2.7 إلى 2.16 ، والتي يؤثر إكمالها بنجاح بشكل مباشر على الكشف اللاحق عن مضان البروتين. باختصار ، أنشأت هذه الدراسة طريقة جديدة للكشف عن DSF تعتمد على مبادئ تقنية DSF ، باستخدام بروتين CD40 وأومبيليفيرون كمثال. حللت الطريقة بشكل فعال قوة الربط بين البروتينات والروابط باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة الفلورية. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذه التقنية لتحليل استقرار البروتين والبحث في بنية البروتين ، وتعميق تطبيق تقنية DSF في دراسة مسارات إشارات الخلية واستكشاف التسبب في المرض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن خالص تقديرنا للدعم المالي الذي تلقيناه من مشروع بناء الدلالة للخطة الخمسية الرابعة عشرة لجامعة الطب التبتي (2022ZYYGH12) ، والموضوعات المفتوحة لعام 2022 للمختبر الرئيسي للطب التبتي والتعليم الأساسي التابع لوزارة التعليم في جامعة الطب التبتي (ZYYJC-22-04) ، وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي في نينغشيا (2023BEG02012) ، ومشروع تعزيز أبحاث Xinglin Scholar التابع لجامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي (XKTD2022013).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CD40 بروتينMedChemExpressHY-P75408
DMSOBoster Biological Technology Co.، LtdPYG0040
FlexStation 3 قارئ صفيحة دقيقة متعددة الوظائفشنغهاي Meigu Molecular Instruments Co.، LTDFlexStation 3
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724 (B724)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ( 1x)Gibco8120485
SoftMax Pro 7.1Shanghai Meigu Molecular Instruments Co.، LtdSoftMax Pro 7.1
SSYPRO صبغة برتقاليةSigmaS5942
UmbelliferoneShanghai Yuanye Biotechnology Co.ب 21854

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
  2. Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
  3. Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
  4. Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
  5. Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
  6. Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
  7. Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
  8. Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
  9. He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471(2014).
  10. Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
  11. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  12. Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
  13. Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
  14. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  15. Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).
  16. Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
  17. Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238(2023).
  18. Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
  19. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).
  22. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  23. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  24. Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).
  25. Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).
  26. Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة