مقالة منهجية

عزل نخاع عظم الفأر الوليدي وإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم

DOI:

10.3791/66613

⸱

مايو 24, 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة غير إنزيمية ومباشرة لعزل خلايا نخاع عظم الفأر الوليدي البالغة من العمر 7-9 أيام وتوليد بلاعم متباينة باستخدام طاف من خلايا L929 كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة المحببات (M-CSF). تم تحليل الضامة المشتقة من نخاع العظم بشكل أكبر للمستضدات السطحية F4 / 80 و CD206 و CD11b والكفاءة الوظيفية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تأسيس تقنيات مختلفة لعزل نخاع العظم عن الفئران البالغة. ومع ذلك ، فإن عزل نخاع العظم عن الفئران الوليدية يمثل تحديا ويستغرق وقتا طويلا ، ولكن بالنسبة لبعض النماذج ، فهو مناسب وضروري من الناحية الانتقالية. يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة ومباشرة لإعداد خلايا نخاع العظم من الجراء البالغة من العمر 7-9 أيام. يمكن بعد ذلك عزل هذه الخلايا أو تمايزها إلى أنواع معينة من الخلايا ذات الأهمية. البلاعم هي خلايا مناعية حاسمة تلعب دورا رئيسيا في الالتهاب والعدوى. أثناء التطور ، تساهم البلاعم الوليدية بشكل كبير في إعادة تشكيل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يختلف النمط الظاهري ووظائف الضامة الوليدية عن نظيراتها البالغة. يحدد هذا البروتوكول أيضا تمايز البلاعم الوليدية عن خلايا نخاع العظم المعزولة في وجود وسط مكيف L929. تم تقييم الواسمات السطحية للبلاعم الوليدية المتمايزة باستخدام تحليل التدفق الخلوي. لإثبات الوظيفة ، تم اختبار كفاءة البلعمة أيضا باستخدام الإشريكية القولونية المقترنة الحساسة للصبغة ذات الأس الهيدروجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحيط نخاع العظم بمجموعات الخلايا الجذعية المكونة للدم واللحمة المتوسطة التي تكون ذاتية التجدد ويمكن تمييزها إلى سلالات خلايا مختلفة. تؤدي الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظم إلى ظهور سلالات نخاعية ولمفاوية1. تنتج الخلايا الجذعية الوسيطة بانيات العظم (العظام) أو الخلايا الشحمية (الدهون) أو الخلايا الغضروفية (الغضروف)2. هذه الخلايا لها تطبيقات متعددة في مجال بيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة ، بما في ذلك العلاج الجيني 3,4. تتمايز الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظم إلى أنواع معينة من الخلايا في وجود عوامل نمو خاصة بالنسب. يعزز الإريثروبويتين تكاثر الخلايا السلفية للكريات الحمر ، ويحفز عامل تحفيز مستعمرة المحببات (G-CSF) نمو مستعمرات العدلات ، وينظم الثرومبوبويتين إنتاج الصفائح الدموية كأمثلة قليلة على عوامل النمو الخاصة بالنسب5. مستضد سطح الخلية المسمى FACS وفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) هي طرق راسخة لعزل وتنقية أنواع الخلايا المشتقة من نخاع العظم6.

على الرغم من أن دراسات حديثي الولادة تتقدم نحو إيجاد أسباب وفيات الأطفال حديثي الولادة ومعالجة المضاعفات أثناء الولادات المبكرة ، إلا أن التطوير العلاجي المباشر لا يزال حاجة طبية غير ملباة. صرح سميث وديفيس ، "يظل مرضى الأطفال أيتاما علاجيين"7. هناك العديد من التحديات ، مثل العينات الصغيرة ، والآثار مدى الحياة للنتيجة ، والقضايا الأخلاقية في الحصول على الموافقة في الدراسات السريرية لحديثي الولادة8. وبالتالي ، هناك طلب كبير على نماذج الدراسة في الجسم الحي وفي المختبر الخاصة بحديثي الولادة لتحقيق أهمية متعدية. بسبب أوجه التشابه بين المستويات التشريحية والأنسجة ، وفترات الحمل القصيرة ، وأحجام القمامة ، فإن القوارض هي أكثر أنظمة نماذج الثدييات التي تمت دراستها.

هنا ، نصف إجراء مفصلا وممكنا للغاية وقابلا للتكرار لعزل نخاع العظم من جراء الفئران البالغة من العمر 7-9 أيام وقدرتها على التمايز إلى البلاعم. ومع ذلك ، يمكن تحقيق مجموعة متنوعة من سلالات الخلايا باستخدام إشارات تمايز متميزة. نظهر أيضا وجود علامات سطح الخلية ووجود نشاط البلعمة في المختبر المتوقع للبلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية في ولاية فرجينيا الغربية وتم تنفيذها وفقا لتوصيات دليل رعاية واستخدام المختبر من قبل المجلس الوطني للبحوث. تم استخدام الماوس C57BL / 6J لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. تحضير 3 مل من وسائط زراعة MEM مكملة ب 10٪ FBS ، 2 mM الجلوتامين ، 25 mM HEPES ، والبنسلين (100 U / mL) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) في أنبوب طرد مركزي 5 مل ، والاحتفاظ بها على الجليد.
  2. إذا لزم الأمر لتخزين أسلاف نخاع العظم في النيتروجين السائل ، قم بإعداد وسائط تجميد تحتوي على 10٪ DMEM و 80٪ FBS و 10٪ DMSO.
  3. للحصول على DMEM الكامل ، يتم تحضير DMEM المكمل ب 10٪ FBS ، 2 mM الجلوتامين ، 25 mM HEPES ، والبنسلين (100 U / mL) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).
  4. لتمايز البلاعم ، قم بإعداد DMEM المكمل ب 10٪ FBS ، 2 mM الجلوتامين ، البنسلين (100 U / mL) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، و 10٪ L929-خلية طافية9،10،11.

2. L929- خلية طافية إعداد

  1. ذوبان خلايا L929 المخزنة في النيتروجين السائل ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل يحتوي على 5 مل من DMEM الكامل. أجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من وسائط DMEM الكاملة وزرعها في دورق زراعة الأنسجة T25 بكثافة 2×105 خلايا. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي باستخدام 0.4٪ تريبان أزرق. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل إلى التقاء 70٪.
  3. لفصل الخلايا ، اغسلها أولا ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). نضح برنامج تلفزيوني واستبداله ب 2.5 مل 0.05٪ تربسين-EDTA.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق وإضافة 5 مل من DMEM الكامل.
  5. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من وسائط DMEM الكاملة وانقلها إلى قارورة T75.
  7. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، ثم اجمع الوسط وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بتصفية الوسائط التي تحتوي على M-CSF من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية في 5 مل من القسامة.

3. إعداد

  1. تحت خزانة السلامة البيولوجية ، افصل بعناية جراء الفأر C57BL / 6J البالغة من العمر 7-9 أيام (فضلات من 6 جراء) عن السد وضعها في قفص منفصل.
  2. انقع كرة قطنية في 2 مل من الأيزوفلوران البيطري في جرة جرس أو غرفة احتواء أخرى.
  3. ضع جروا في الغرفة وأغلق الغطاء. مراقبة حديث الولادة لمدة 90 ثانية تقريبا للتأكد من أنه يصبح بلا حراك وفاقدا للوعي.
  4. قم بإزالة الجرو بسرعة وقطع رأسه بمقص حاد (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) قبل أن يتمكن الجرو من استعادة وعيه.
    ملاحظة: لا يتنفس حديثو الولادة بعمق كاف للقتل الرحيم عن طريق استنشاق الأيزوفلوران وحده.
  5. تأكد من إغلاق غطاء الحاوية بعد إزالة كل جرو. يمكن استخدام نفس كرة القطن لمدة 5-7 جراء.

4. عزل نخاع العظم الوليدي

  1. تعقيم جسم حديث الولادة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. "باستخدام ملقط ومقص جراحي دقيق ، قم بعمل شق بين
    البطن والساقين الخلفيتين. إزالة الجلد عن طريق سحب نحو سفح الأطراف الخلفية.
  3. اكشط النسيج الضام والعضلات المرتبطة بالعظام باستخدام ملقط حاد الحواف.
  4. قطع الساق وعظم الفخذ ، كما هو موضح في الشكل 1 ، بمقص لفصله وإزالته. باستخدام الملقط ، ضع هذه العظام في أنبوب الوسائط على الثلج. كرر العملية لكل جرو.
  5. نقل العظام بمساعدة ملقط إلى مصفاة 40 ميكرومتر مع أنبوب جمع. سحق العظام وحرر النخاع بالضغط بمكبس حقنة سعة 3 مل على المصفاة.
  6. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا عن طريق ماصة لطيفة في 0.2 ٪ كلوريد الصوديوم ، وهو حل منخفض التوتر لتحلل كريات الدم الحمراء. أضف على الفور حجما متساويا من 1.6٪ كلوريد الصوديوم لإحضار الحل إلى متساوي التوتر.
  8. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة محلول التحلل.
  9. أعد التعليق في DMEM الكامل للاستخدام الفوري أو تجميد الوسائط للتخزين وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، أسفرت هذه الطريقة عن 6.55 (± 1.44) × 106 خلايا نخاع عظمي / جرو (الشكل 1E).
  10. قم بتخزين الخلايا في درجة حرارة -80 درجة مئوية في وسائط التجميد أو استخدمها على الفور كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: بسبب العمر ، تكون العظام شفافة وواضحة بما يكفي لتصور النخاع من خلالها. من المهم توخي الحذر أثناء سحب العظام لأن الضغط الطفيف عليها قد يكون كافيا لتحرير النخاع. النخاع في عظام حديثي الولادة هو في شكل سائل بدلا من خيط سليم موجود في عظام البالغين. من الصعب جمع النخاع إذا هرب أثناء جمع العظام.

5. تمايز البلاعم المشتقة من نخاع العظم الوليدي

  1. البذور 2 × 107 خلايا نخاع العظم لكل قارورة T75 في 10 مل من DMEM الكامل الذي يحتوي على 10٪ L929-cell طاف (2.5 مل) كمصدر ل M-CSF. احتضان أطباق الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 5 أيام. أضف 2 مل من الوسائط المكيفة L929 في اليوم 3 من التمايز.
  2. راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر يوميا باستخدام مجهر مقلوب ونظام تصوير بتكبير 20x. عند التمايز ، يجب أن تظهر البلاعم ملتصقة وممدودة وغير متجانسة (الشكل 2).
  3. لحصاد البلاعم لمقايسات المصب ، قم باستنشاق وسائط التمايز.
  4. اغسل الخلايا ب 5 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا غير الملتصقة وبروتينات المصل التي تتداخل مع الانفصال. نضح برنامج تلفزيوني.
  5. احصد الخلايا بإضافة 5 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA إلى القارورة. ضع دورق الاستزراع على حرارة 37 درجة مئوية مع حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 5 دقائق وأضف 5 مل من DMEM.
  6. ماصة الخلايا لفصلها وأجهزة الطرد المركزي في 350 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. افصل حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM الكامل ، وعد وتحقق من صلاحية الخلية باستخدام التريبان الأزرق. BMDMs المعزولة باستخدام هذه الطريقة هي 7.05 (± 2.52) ×105 خلايا / جرو (الشكل 1E).
    ملاحظة: لاحظ وجود خلايا على شكل مغزل تبدأ في الظهور في اليوم الثاني من التمايز (الشكل 1B ، الأسهم الحمراء). إذا تحول لون الوسائط إلى اللون الأصفر ، مما يشير إلى إنفاقها ، أضف المزيد من الوسائط المكيفة L929 في اليوم 4 من التمايز ؛ لا ينصح بالاستبدال الكامل للوسائط.

6. وضع العلامات المناعية وتحليل التدفق الخلوي

  1. منع وضع العلامات غير المحددة على الأجسام المضادة ل BMDMs (2x105 / label) عن طريق المعالجة بخلايا 10 μL / 107 من كاشف حظر FcR وفقا لتوصيات الشركة المصنعة بحجم 100 ميكرولتر / المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي (PBS مكمل ب 2 mM EDTA و 0.5٪ ألبومين مصل بقري). يحفظ على الثلج لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يمكن سد الخلايا بكميات كبيرة أو في آبار أو أنابيب فردية. تشير جميع الخطوات اللاحقة إلى الكميات والأحجام لكل ملصق علامة خلية فردية بحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
  2. اغسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي وأجهزة الطرد المركزي عند 525 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة المادة الطافية وزرع الخلايا في صفيحة بئر U-bottom 96 بكثافة 5 × 105 خلايا لكل بئر. قم بتلطيخ الخلايا عن طريق إضافة صبغة عد الخلايا الحية / الميتة FVS780 المخففة إلى 3000 ضعف و 0.625 ميكرولتر من BV786-CD11b و PE-F4 / 80 و AlexaFluor488-CD206 في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي إما بشكل فردي أو مجتمعة12،13،14،15. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة على الجليد المغطى بورق الألمنيوم.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي واغسل الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 525 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نضح طاف وطوامة بيليه الخلية بلطف. أضف 100 ميكرولتر من 0.4٪ بارافورمالدهايد إلى كل بئر واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  6. اغسل الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي والحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 525 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي وقم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

7. الفحص في المختبر لتقييم الفعالية البلعمية للبلاعم المشتقة من نخاع العظم الوليدي

  1. أعد تعليق BMDMs في DMEM الكامل بدون الفينول الأحمر أو المضادات الحيوية وزرعها بكثافة 2 × 105 / ربع في طبق رباعي 35 مم بحجم 500 ميكرولتر.
  2. لتحضير اللقاح البكتيري عند تعدد العدوى (MOI) من 25 أو أي MOI مرغوب فيه ، قم بإزالة مخزون محسوب مسبقا من الإشريكية القولونية O1: K1: H7 المخزنة عند -80 درجة مئوية.
  3. قسمة الحجم المطلوب من البكتيريا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. اغسل البكتيريا بإضافة PBS إلى حجم إجمالي قدره 1 مل. قم بتكوير البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل.
  4. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 50 ميكرولتر من PBS وأضف صبغة الفلورسنت الخضراء الحساسة لدرجة الحموضة إلى تركيز نهائي يبلغ 500 ميكرومتر. هذه صبغة حساسة للأس الهيدروجيني ولا تحتوي على إشارة فلورية عند الأس الهيدروجيني المحايد وتتألق بشكل ساطع في البيئات الحمضية ، مثل البلعمات المحمضة ، أثناء عملية البلعمة.
  5. احتضان الخلايا البكتيرية لمدة 20 دقيقة في الظلام لاقتران الصبغة.
  6. اغسل البكتيريا أربع مرات باستخدام 1 مل من PBS عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. أعد تعليق البكتيريا في 500 ميكرولتر من DMEM الكامل بدون الفينول الأحمر وأضفه إلى مزارع BMDM.
  8. احتضان BMDMs عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 4 ساعات ثم أضف 200 نانوغرام من صبغة الفلورسنت الحمراء المنفذة للخلايا التي تلطخ الليزوزومات.
    ملاحظة: يمكن تصور البكتيريا البلعمية بواسطة المجهر الفلوري.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الطريقة الموضحة في هذه الدراسة ، يمكن عزل 25 إلى 37 مليون خلية نخاع عظمي بنجاح من حجم فضلات خمسة جرو فأر C57BL / 6. تم التحقق من صحة هذه الطريقة بأحجام قمامة تتراوح من 5 إلى 7 جراء. كان الحد الأدنى لسن العزلة في تجاربنا هو 7 أيام. اعتمادا على حجم القمامة وعدد الخلايا المطلوبة للتجربة أقل من مليون ، يمكن للباحثين تجربة هذا البروتوكول للفئران التي يقل عمرها عن 7 أيام. في وجود طاف الخلية L929 كمصدر ل M-CSF ، تم تمييز خلايا نخاع العظم إلى بلاعم في 5 أيام (الشكل 2). لوحظ تكوين خلايا على شكل مغزل في اليوم الثاني من التمايز (الشكل 2 ب) ، وأظهر ما يقرب من نصف الخلايا شكل مغزل في اليوم الثالث (الشكل 2 ج) ، والتقت معظم الخلايا وشكلت أشكال مغزل ممدودة في اليوم الخامس من التمايز (الشكل 2 د). كان إنتاج البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMDMs) بهذه الطريقة 2.5-5 مليون خلية من 5 جرو من عمر 7 أيام.

لتوصيف BMDMs المتمايزة ظاهريا ، تم تصنيف الخلايا من الثقافات لمدة 5 أيام مناعية ل CD11b و CD206 و F4 / 80. يمكن رؤية مخططات بوابات التشتت الأمامي / الجانبي وبوابات أحادية العلامة في الشكل التكميلي 1. أظهرت نتائج تحليل قياس التدفق الخلوي أن 76.4٪ من BMDMs إيجابية لكل من CD11b و F4 / 80 (الشكل 3A). يتوافق مجتمع F480-CD11b + مع العدد التقريبي للخلايا الموجبة ل CD206 (الشكل 3B). يعتبر هذا الأخير عموما علامة متسقة مع الضامة الشبيهة ب M2 ، وعلى الرغم من أن وفرة وضع العلامات CD206 يمكن أن تتراوح بين ضعفين أكثر ، فإن نسبة أعلى من وضع العلامات F4 / 80 تتوافق مع قدرة M-CSF على تعزيز التمايز إلى النمط الظاهري الشبيه ب M116,17 (الشكل 3).

كما قمنا بتقييم قدرة أجهزة BMDM المتمايزة لحديثي الولادة على بكتيريا البلعمة ونقلها إلى المقصورات المحمضة كإجراء وظيفي. يجب أن تتألق البكتيريا الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني باللون الأخضر فقط عند البلعمة وتهريبها إلى مقصورات محمضة. تم الكشف عن بكتيريا الفلورسنت الخضراء الوفيرة البلعمة داخل BMDMs بعد الإصابة (الشكل 4 أ). تتمركز الفلورة الخضراء أيضا مع مضان أحمر يدل على الليزوزومات المحمضة (الشكل 4B ، C). كما لوحظت البلعمة وظهور BMDMs لحديثي الولادة الخضراء الحساسة للصبغة والحساسة للحموضة طوال فترة الإصابة لمدة 4 ساعات (الشكل 4D والفيديو التكميلي). يتوافق النشاط الوظيفي المعروض هنا مع نشاط البلاعم الالتهابية الشبيهة ب M1.

figure-results-1
الشكل 1: عزل نخاع عظم جرو الفأر C57BL / 6J البالغ من العمر 7 أيام. (أ) عظام الأطراف الخلفية لجراء عمرها 7 أيام في طبق 100 مم. (ب) الطرف الخلفي لجرو يبلغ من العمر 7 أيام بعد إزالة الجلد والأنسجة تحت الجلد ؛ تشير الخطوط السوداء المنقطة إلى مكان القطع لاستخراج نخاع العظم. (ج) عالج الطرف الخلفي الوليدي العظام بالنخاع قبل سحقها. د: يعالج الطرف الخلفي الوليدي العظام بعد سحقها باستخدام مكبس حقنة في مصفاة. ه: متوسط عدد الأخطاء المعيارية لنخاع العظم (BM) وخلايا البلاعم المشتقة ±من نخاع العظم التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تمايز BMDMs عن خلايا نخاع العظم الوليدي البالغة من العمر 7 أيام. خلايا نخاع العظم في اليوم 1 (أ) واليوم 2 (ب) واليوم 3 (ج) واليوم 5 من التمايز (د). تشير الأسهم الحمراء على اللوحة B إلى خلايا ملتصقة على شكل مغزل في اليوم 2 من التمايز. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الكشف عن علامات البلاعم في الفئران باستخدام التحليل الخلوي للتدفق. البلاعم المتمايزة المشتقة من نخاع العظم الوليدي تظهر تعبير المستضدات السطحية F4 / 80 و CD11b (A) أو CD206 و CD11b (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: البلعمة للإشريكية القولونية الحساسة للحموضة بواسطة BMDMs الوليدية. (أ) البلعمة المشتقة من نخاع العظم التي تظهر الإشريكية القولونية (الخضراء) الحساسة للأس الهيدروجيني بعد 4 ساعات من الإصابة. (ب) BMDMs المسمى بصبغة للجسيمات المحلولة المحمضة (الحمراء). (ج) صورة مدمجة للوحتين (أ) و (ب). قضبان المقياس: 20 ميكرومتر. (د) تراكب من البكتيريا الفلورية الخضراء على البلاعم الموضحة في تباين الطور. التكبير في (د) هو نفسه في (أ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو تكميلي. فيديو مدته 4 ساعات لتصوير الخلايا الحية للبكتيريا الفلورية الخضراء بواسطة BMDMs الوليدية كما في الشكل 4 اللوحة أ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الشكل التكميلي 1: تحليل التدفق الخلوي ل BMDMs. (أ) تم إدخال BMDMs أولا على FSC و SSC لإزالة الحطام والزوجي. يظهر تلطيخ واحد ل F4 / 80 (B) و CD11b (C) و CD206 (D). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تمثل الأبحاث التي تتضمن نماذج الفئران الوليدية عددا من التحديات. يتمتع حديثو الولادة بجهاز مناعي متطور فريد من نوعه مقارنة بالبالغين8. على هذا النحو ، لا ينبغي افتراض أن البيانات الناتجة عن نماذج البالغة تنطبق على الأطفال حديثي الولادة ، وقد أوضحت العديد من الأعمال المنشورة هذه الفكرة جيدا18،19. لذلك ، فإن النماذج ومصادر الخلايا الخاصة بحديثي الولادة ضرورية لدراسة تعقيدات الاستجابة المناعية المبكرة في الحياة. ومع ذلك ، نظرا لحجم الفئران الوليدية وحساسيتها وطبيعتها الحساسة ، يمكن أن تكون كمية العينات البيولوجية محدودة ، ويمكن أن تستغرق عملية الجمع وقتا طويلا. يحدد هذا البروتوكول إجراء بسيطا وفعالا من حيث الوقت لاستخراج نخاع العظم من الفئران حديثي الولادة.

عظام الفأر البالغة كبيرة بما يكفي لإدخال إبرة وطرد النخاع بسهولة. على العكس من ذلك ، فإن الوصول إلى نخاع العظم الوليدي بإبرة يمثل تحديا بسبب حجمه وهشاشته. استخدمت بعض الدراسات الهضم الأنزيمي مع الكولاجين من النوع الثاني و dispase20. هنا ، نظرا للطبيعة الناعمة والصغيرة لعظام الأطفال حديثي الولادة ، اعتمدنا طريقة سحق لتحرير نخاع العظام. بعد التنقية ، اعتمادا على التطبيق البحثي للاهتمام ، يمكن تمييز هذه الخلايا إلى أنواع خلايا محددة.

يظهر حديثو الولادة مجموعات بلاعم مميزةمن النمط الظاهري 21. أوضحت هذه الدراسة تمايز BMDMs من خلايا نخاع العظم للجراء الذين تتراوح أعمارهم بين 7-9 أيام دون استخدام الإنزيمات. تشمل الخطوات الحاسمة التي تتضمنها المنهجية الطبيعة الدقيقة الشاملة لصغار الفئران حديثي الولادة ، وجمع العظام الصغيرة بطريقة لا تسمح بإطلاق نخاع العظام ، وتحديد المكان المناسب في الساق وعظم الفخذ لعمل جروح مقصية. لاحظنا أن BMDMs لحديثي الولادة أكثر حساسية من BMDMs للبالغين في الزراعة ، وفترة أطول من عزل نخاع العظم من حديثي الولادة منعت قدرتها على التمايز. وبالتالي ، لا يقترح الاستخراج من أكثر من 7 جراء في وقت واحد. بالإضافة إلى ذلك ، أدت إضافة وسائط تمايز BMDM في اليوم الثاني من التمايز أيضا إلى نتائج سيئة مثل ضعف التمايز وانخفاض قابلية البقاء.

استخدم هذا البروتوكول طافية الخلية L929 كمصدر ل M-CSF لتمايز خلايا نخاع العظم إلى البلاعم. خلايا L929 هي خلايا ليفية للفئران معروفة بإنتاج كميات عالية من M-CSF10. من المتوقع أن تتعرض البلاعم لمواد أخرى تفرز في المادة الطافية L929 ، جنبا إلى جنب مع M-CSF. يمكن أيضا استخدام M-CSF المنقى التجاري لتمايز البلاعم ؛ ومع ذلك ، لم نقارنها مباشرة باستخدام طاف الثقافة L929. من المهم أيضا ملاحظة أن L de Brito Monteiro et al. لاحظوا ملامح أيضية مميزة بين البلاعم المتولدة باستخدام L929 و M-CSF22 التجاري.

أنشأت هذه الطريقة نهجا اقتصاديا موفرا للوقت دون استخدام أي إنزيمات هضمية. أسفرت هذه التقنية عن عزل موثوق لنخاع العظم الوليدي مما أدى إلى تمايز واضح ل BMDMs لحديثي الولادة. يمكن استخدام BMDMs المعزولة لحديثي الولادة لدراسة ديناميكيات البلاعم الوليدية أثناء العدوى المختلفة وتنظيم الالتهاب بواسطة هذه الخلايا. تشمل قيود الطريقة منحنى التعلم للإنشاء الأولي والتكيف مع عملية سحب العظام الصغيرة ، والتي تتحسن في النهاية مع الخبرة وتقلل من مدة العملية مع زيادة صلاحية الخلايا. تعتبر أحجام القمامة من الجراء اعتبارا إضافيا لعدد البلاعم التي يمكن تمييزها حسب الحاجة التجريبية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح ذات صلة بهذه المقالة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01 AI163333] إلى CMR. نحن نقر بدعم التمويل الإضافي المقدم إلى مرفق قياس التدفق الخلوي بجامعة ويست فرجينيا ومرفق نواة الخلية الواحدة من خلال المنح التالية: منحة WV CTSI GM104942 ، ومنحة CoBRE للبيئة الدقيقة للورم GM121322 ومنحة المعاهد الوطنية للصحة OD016165.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40 وميكرو ؛ مصفاة mGreiner542040ثقافة الخلايا
96 بئر مستديرة (U) اللوحة السفليةThermo Scientific12-565-65زراعة الخلايا
المضادة للفأر CD11b-BV786BD Biosciences740861تحليل FACS
مكافحة الفأر CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709تحليل FACS
مكافحة الفأر F4 / 80-PEBD Biosciences565410تحليل FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCعداد الخلايا الآلي
DMEMHycloneSH30022.01ثقافة الخلية
DMSOVWRWN182ثقافة الخلية
DPBS ، 1xCorning21-031-CVثقافة
الخليةالإشريكية القولونية< م > O1: K1: H7ATCC11775العدوى
EVOS FL Invitrogen12-563-649نظام تصوير الخلايا  
FBSAvantor 76419-584زراعة الخلايا
FluoroBright BMDMThermo fisherA1896701الخالية من الصبغة
الجلوتامينCytivaSH30034.01زراعة الخلايا
HEPESCytivaSH30237.01ثقافة الخلية
L-929ATCCالتمايز
LSRFortessaBecton Dickinsonمقياس التدفق
Lysotracker أحمر DND 99InvitrogenL7528صبغة الفلورسنت
MEMCorning15-010-CVثقافة الخلية
البنسلين / الستربتومايسين   ؛HycloneSV30010ثقافة الخلية
pHrodo الأخضر STP ester InvitrogenP35369صبغة الفلورسنت
T75 قارورةنجمة الخلية658170ثقافة الخلية
Trypsin-EDTAGibco25300120زراعة الخلايا
Zeiss 710 & nbsp ؛زايسP20GM103434متحد البؤر
وسائل الزراعة العلمية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566(2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654(2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792(2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931(2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077(2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neonatal Bone MarrowBone Marrow IsolationBone Marrow Derived MacrophagesMacrophage DifferentiationFlow CytometryPhagocytosis AssayL929 Conditioned MediumHypotonic SolutionEscherichia Coli InfectionCell Counter

مقالات ذات صلة