مقالة منهجية

تطبيقات قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في أبحاث المنتجات الطبيعية: قلويدات التروبان كدراسة حالة

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66620

⸱

مارس 8, 2024

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة للتعليق التوضيحي القائم على قياس الطيف الكتلي السريع (MS) / قياس الطيف الكتلي (MS) وتصنيف قلويدات التروبان ، وهي مفيدة لكل من التكرار الأولي للعينات المحتوية على التروبان واكتشاف قلويدات جديدة للعزل.

الملخص

على الرغم من أن العديد من الأدوية المستخدمة اليوم اصطناعية في الأصل ، إلا أن المنتجات الطبيعية لا تزال توفر مصدرا غنيا للتنوع الكيميائي الجديد والنشاط البيولوجي ، ويمكن أن تسفر عن خيوط واعدة للأمراض المقاومة أو الناشئة. ومع ذلك، فإن التحدي ذو شقين: لا يجب على الباحثين العثور على المنتجات الطبيعية وتوضيح هياكلها فحسب، بل يجب عليهم أيضا تحديد ما يستحق العزل والفحص (وما هو معروف بالفعل - وهي عملية تعرف باسم إزالة التكرار). مع ظهور الأجهزة التحليلية الحديثة ، تسارعت وتيرة اكتشاف المنتجات الطبيعية وإلغاء تكرارها. أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) تقنية ذات قيمة خاصة لتحديد وتصنيف الهياكل الكيميائية. قلويدات التروبان (TAs) هي مركبات مشتقة من النباتات ذات أهمية طبية وسمية كبيرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير سير عمل فحص قائم على LC-MS / MS باستخدام تكوينات MS / MS المتعددة المتاحة على مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي (QQQ) للتعليق على هياكل TA وتصنيفها بناء على أنماط التجزئة المميزة الخاصة بها. باستخدام مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتج المعتمدة على البيانات (DD) ، ومسح أيون السلائف (PrIS) ، ومسح الخسارة المحايدة (NLS) ، قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مقتطفات غنية ب TA من الباذنجان Datura stramonium و Datura metel. هذه الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم استخدامها بنجاح لكل من التكرار الأولي للعينات المعقدة المحتوية على TA ولاكتشاف مرشح جديد للعزل والتنقية (والمقايسة الحيوية في نهاية المطاف).

المقدمة

على الرغم من أن الجزيئات الاصطناعية بالكامل أصبحت أكثر بروزا في اكتشاف الأدوية في العقود الأخيرة، إلا أن ما يقرب من ثلثي جميع الأدوية المعتمدة من السنوات ال 39 الماضية هي منتجات طبيعية أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية،1،2 مما يؤكد الأهمية المستمرة لأبحاث المنتجات الطبيعية. قلويدات ، بعض المنتجات الطبيعية المحتوية على النيتروجين ، تحظى بتقدير خاص لخصائصها الطبية. قلويدات التروبان (TAs) التي تحتوي على [3.2.1.]- نظام يحتوي على النيتروجين ثنائي الحلقات ، يتم إنتاجه في الغالب بواسطة النباتات في عائلات الباذنجانيات (الباذنجان) ، و Erythroxylaceae ، و Convolvulaceae. ومن الأمثلة على ذلك الأتروبين والسكوبولامين والكوكايين. كما تستخدم العديد من التروبان شبه الاصطناعية أو الاصطناعية سريريا3. تستخدم TAs ومشتقاتها لعلاج العديد من الحالات 3,4 ويظهر العديد من هذه الأدوية في قائمة منظمة الصحة العالمية لعام 2023 للأدوية الأساسية5. بسبب أنشطتها القوية ، تستخدم TAs أيضا بشكل ترفيهي (كمنشطات أو هذيان) ويمكن أن تسبب التسمم عند تناول النباتات (أو المستحضرات) التي تحتوي عليها 6,7. TAs غير مرغوب فيها في الأغذية البشرية والحيوانية8 ويمكن أن تلوث الشاي والتوابل والحبوب والعسل والمكملات العشبية 9,10. نظرا لوعدها الطبي وقدرتها على السم ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تساعد في اكتشاف TAs جديدة (وتحديد TAs المعروفة) مفيدة.

في قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) ، يتم إقران "مرشحات الكتلة" (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب ، وأنابيب وقت الطيران) معا فيزيائيا ("في الفضاء") ، أو يستخدم الجهاز خطوات تفاعل / فصل إضافية "في الوقت المناسب". يستخدم MS / MS في الفضاء طرقا مختلفة لتحديد وتجزئة أيونات مختلفة عند مرشحات الكتلة المختلفة (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب لجهاز ثلاثي الأقطاب أو QQQ). يمكن استخدام هذه الأنماط المختلفة لتحديد الأجزاء المحددة التي يتم تصنيعها بواسطة أيون معين (مسح أيون المنتج) ، أو الأيونات الموجودة في العينة التي تنتج شظايا معينة (مسح أيون السلائف أو PrIS) أو تتعرض لخسائر كتلة مميزة (مسح الخسارة المحايدة أو NLS) ، أو المركبات المحددة التي تمتلك شظايا محددة (مراقبة التفاعل المتعدد). لذلك ، يوفر MS / MS شظايا مفيدة لاقتراح هياكل لمركبات جديدة أو تأكيد وجود مركب موجود. يستخدم MS / MS بشكل متزايد في اكتشاف الأدوية ، وكيمياء المنتجات الطبيعية ، ومجالات الأيض11،12 ، وقد تم استخدامه لتحديد الأنواع المحتوية على قلويدات (للتوصيف الكيميائي النباتي أو التحليل الكيميائي التصنيفي) وللكشف عن قلويدات معينة وتحديدها في الأغذية أو النباتات الطبية10،13،14،15،16.

على الرغم من العديد من تقنيات قياس الطيف الكتلي المتاحة ، هناك تحديات في العثور على قلويدات جديدة. بالإضافة إلى العثور على كائن حي مرشح لفحصه ، فإن التأكيد الهيكلي الكامل للقلويد هو عملية شاقة قد تتضمن العديد من التقنيات التحليلية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين عزل مركب معروف بالفعل ، مما يهدر العمل والوقت والموارد. هذا صعب بشكل خاص على TAs ، حيث يتم الإبلاغ عن المئات ، إن لم يكن الآلاف من TAs ، وكثير منها متساوي مع بعضها البعض. تعرف عملية "تحديد المعروفين وتمييزهم عن المجهولين" باسم dereplication. يتم نشر قواعد بيانات أوقات الاحتفاظ (r.t.s) وشظايا الكتلة من TAs المختلفة والمركبات الأخرى للمساعدة في هذه العملية17,18. ومع ذلك ، فإن إلغاء النسخ أمر شاق. مجرد التعليق التوضيحي (أي تعيين الهياكل المفترضة) على القلويدات في مخطط كروماتوجرام LC-MS / MS بالكامل للعينة يستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام كل من الشبكات الجزيئية19،20 و dereplicationاليدوي 18،21،22 لبنزيل إيزوكينولين ، إندول مونوتربين ، وقلويدات التروبان ، وتم استخدام PrISs "للترشيح الهيكلي" للأطياف لتحديد قلويدات بيروليزيدين والسولانين23,24. لا توجد طرق أو مهام سير عمل محددة متاحة للتكرار السريع القائم على LC-MS / MS للعينات المحتوية على TA ، على الرغم من أن TAs تمتلك شظايا شائعة يسهل التعرف عليها (الشكل 1). تستخدم الطريقة الموصوفة هنا مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتجات المعتمدة على البيانات (DD) ، و PrISs ، و NLSs لشرح وتصنيف هياكل TA في النباتات بناء على كل من أنماط التجزئة المميزة للتروبان أحادي وثنائي وثلاثي الاستبدال (الشكل 1 أ) وفقدان مجموعات الإستر الشائعة الموجودة في هذه القلويدات (الشكل 1 ب). الكائنات الحية للدراسة هي عدة أنواع في جنس الباذنجان الداتورة. مصدر غني للتنوع TAs ، تم استخدام الداتورة عبر تاريخ العالم للأغراض الطبية والثقافية17- وهي مصفوفة صعبة لإلغاء تكرارها بسبب العديد من TAs المتشابهة هيكليا ، مما يوفر لنا عينات جذابة لاختبار طريقتنا.

البروتوكول

تنبيه: يرجى الرجوع إلى جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل استخدام المواد الكيميائية المدرجة.

1. إعداد العينة

تنبيه: يمكن أن يسبب النيتروجين السائل حروقا بالتبريد . استخدم قفازات التبريد وحماية العين في منطقة جيدة التهوية. يمكن أن تكون عينات النباتات المحتوية على قلويد مزعجة للجلد. تعامل معهم دائما بالقفازات. الميثانول سام وقابل للاشتعال ويجب التعامل معه في غطاء دخان بعيدا عن مصادر الاشتعال المحتملة.

ملاحظة: من الناحية النظرية ، يمكن استخدام الأنسجة النباتية المزروعة أو البرية (المجففة أو المطحونة طازجة) ؛ الإجراء أدناه هو فقط الإجراء المستخدم أثناء تطوير الطريقة.

  1. إذا كانت الأنسجة النباتية ذات الأهمية طازجة ، فقم بتجميدها عن طريق وضعها في أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين وغمرها في النيتروجين السائل لمدة 2-3 دقائق.
  2. ضع الأنسجة النباتية المجمدة في ملاط مبرد مسبقا (في مبرد بوليسترين مع نيتروجين سائل) ، وباستخدام مدقة مبردة مسبقا ، قم بطحن الأنسجة إلى مسحوق موحد.
  3. قم بوزن الكمية المطلوبة من الأنسجة بسرعة في أنبوب طرد مركزي دقيق من مادة البولي بروبيلين باستخدام ملعقة مبردة مسبقا ، وأضف على الفور 20٪ ميثانول (في درجة حرارة الغرفة [RT]) بتركيز 1 مل لكل 100 ملغ من الأنسجة.
    ملاحظة: يستخدم الميثانول (20٪) بشكل شائع لاستخراج TAs25. في بعض الأحيان ، يتم إضافة 0.1 ٪ حمض الفورميك ، على الرغم من عدم ملاحظة أي اختلاف في كفاءة الاستخراج أثناء تطوير هذه الطريقة وغيرها.
  4. ضع الأنابيب المغطاة على شاكر هزاز (سرعة متوسطة) لمدة لا تقل عن 3 ساعات في RT.
  5. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 9464 × ز لمدة 10 دقائق. ماصة من المادة الطافية إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية LC-MS ، أو ، إذا كانت لا تزال غائمة ، قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر أولا.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، على الرغم من أنه يجب تخزين عينات ومستخلصات النباتات الطازجة المعالجة في مجمد -80 درجة مئوية قبل التحليل لتجنب أي تدهور قلويد محتمل.

2. تكوين أداة LC-MS وجمع البيانات

تنبيه: الأسيتونيتريل سام وقابل للاشتعال. الابتعاد عن مصادر الاشتعال والتحكم في الأبخرة باستخدام غطاء الدخان. حمض الفورميك أكالة. تجنب ملامسة الجلد والعين وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.

  1. استخدم أداة LC-MS مع مصدر تأين بالرش الكهربائي (ESI) وعمود HPLC عكسي الطور (C18 ، 4.6 × 100 مم).
  2. بالنسبة ل HPLC ، استخدم 0.1٪ حمض الفورميك في H2O كمذيب A و 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل كمذيب B ؛ قم بموازنة العمود مع 99٪ A و 1٪ B. قم بتكوين تدرج 30 دقيقة من 1٪ -50٪ B على مدار 26 دقيقة ، والعودة إلى 1٪ B عند 26.01 دقيقة ، مع الاستمرار عند 1٪ B لمدة 4 دقائق. استخدم فرن عمودي بدرجة حرارة 45 درجة مئوية ومعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة.
  3. في طريقة LC-MS ، استخدم معلمات التشغيل التالية لمطياف الكتلة: جهد الواجهة: 4.0 كيلو فولت ، تدفق غاز البخاخات: 3 لتر / دقيقة ، تدفق غاز التسخين: 10 لتر / دقيقة ، درجة حرارة DL: 250 درجة مئوية ، درجة حرارة كتلة الحرارة: 400 درجة مئوية ، درجة حرارة الواجهة: 300 درجة مئوية ، تدفق غاز التجفيف: 10 لتر / دقيقة ، وضغط غاز التفكك الناجم عن الاصطدام (CID) (الأرجون) 17 كيلو باسكال.
  4. قم ببناء طريقة MS في الوضع الإيجابي ESI الذي يتضمن كلا من فحص Q3 وفحص Q1 (100-1000 Da) الذي يعمل كحدث مسح (مضبوط على طول طريقة LC) ، مع تمكين استبعاد النظائر التلقائي. قم بتضمين مسح أيون المنتج كحدث تابع لمسح Q1 (تحليل DD) ، مع نافذة كتلة من 50-1000 Da ، وطاقة خلية تصادم تبلغ -20 فولت ، وزمن حدث يبلغ <0.2 ثانية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون حد العد لتشغيل الفحص الأيوني لمنتج DD في Q1 متغيرا ، ولكن عادة ما يتم استخدام مستوى 7000-10000 عدد. في بعض الأدوات ، مثل تلك المستخدمة لتطوير الطريقة ، يوفر مسح Q3 دقة وحساسية أكبر للكتلة من Q1 ويتم تضمينه لتأكيد الأيونات التي لوحظت في مسح Q1 ، على الرغم من أنه يمكن حذفه من الخطوة 2.4 دون مشكلة.
  5. إلى طريقة MS المذكورة أعلاه ، أضف PrISs ذات الوضع الإيجابي مساوية لطول طريقة LC مع طاقات خلايا التصادم -20 V وأوقات الأحداث 0.75 ثانية. تأكد في جميع الحالات من تمكين وظائف الاستبعاد التلقائي للنظائر أو إزالة النظائر . تأكد من أن قيم m / z ذات الأهمية لشظايا TA (في Da ، انظر الشكل 1A) هي 124.1 (ل TAs أحادية الاستبدال ، نافذة الكتلة من 125-1000 Da) ، 122.1 و 140.1 (ل TAs ثنائية الاستبدال ، نوافذ الكتلة التي تبدأ من 123 و 141 Da ، على التوالي) ، و 156.1 و 138.1 (ل TAs ثلاثية الاستبدال ، نوافذ الكتلة تبدأ من 157 و 139 Da ، على التوالي).
    ملاحظة: أثناء تطوير الطريقة ، تم تقسيم PrIS على طريقتين مختلفتين ، واحدة ل TAs أحادية وثنائية الاستبدال والأخرى ل TAs ثلاثية الاستبدال ، على الرغم من أنه يمكن تقسيمها أو دمجها بأي طريقة.
  6. إنشاء أسلوب MS ثان يتضمن المعلمات في الخطوة 2.4.
    1. إلى طريقة MS / MS هذه ، أضف NLS في الوضع الإيجابي يساوي طول طريقة LC ، مع طاقات خلايا التصادم -20 فولت وأوقات الحدث 0.75 ثانية. تأكد في جميع الحالات من تمكين وظائف استبعاد النظائر التلقائي أو إزالة النظائر .
    2. تأكد من أن كتل الخسارة المحايدة ذات الأهمية للإسترات على TAs (في Da ، انظر الشكل 1B) هي 100.05 (للإسترات المشتقة من حمض tiglic ، نافذة الكتلة 110-1000 Da) ، 60.03 (لمجموعات الأسيتيل ، نافذة الكتلة 100-1000 Da) ، و 166.06 (استرات حمض الفينيل أو حمض المدارات ، نافذة الكتلة 170-1000 Da).
  7. قم بتنزيل طريقة LC-MS وإنشاء ملفات بيانات للعينات ذات الأهمية. بمجرد موازنة عمود HPLC عند 45 درجة مئوية ، قم بتشغيل العينات ذات الأهمية في دفعة أو ملف مشروع مع فراغات مذيب الاستخراج المناسبة بين الأنواع أو أنواع الأنسجة المختلفة. حجم الحقن النموذجي هو 10-20 ميكرولتر.
    ملاحظة: في الأحجام الكبيرة بشكل خاص ، قد يكون كاشف مطياف الكتلة مشبعا. في حالة تشغيل عينات مركزة للغاية ، تأكد من تنظيف مصدر ESI وضبط الجهاز بانتظام. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا بعد جمع جميع البيانات.

3. تحليل البيانات

  1. افحص مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي لعمليات المسح Q1 و Q3 (والمسح الأيوني لمنتج DD) ، ولاحظ الكتلة الأصلية لأي أيونات وفيرة لها ميزات تشبه TA: أ) الكتلة <500 Da لأيون [M + H] + ، عادة ما تكون كتلة زوجية ، ب) r.t.s نموذجي بين 2-22 دقيقة باستخدام طريقة LC أعلاه ، و ج) شظايا من القائمة التالية: م / ض 93 ، 124 ، 142 ، 140 ، 122 ، 138 ، 156 ، 174 ، 110 ، أو 128 دا.
  2. افحص مخطط كروماتوجرام / قناة PrIS ل m / z 124 ، ولاحظ القمم / الأيونات التي ينتج عندها r.t.s (المسجل في الخطوة 3.1) هذا الجزء. انقر فوق المسح الضوئي من خلال الكروماتوجرام بالإضافة إلى فحص أطياف MS / MS الكاملة التي تم الحصول عليها في المسح الأيوني لمنتج DD ، خاصة بالنسبة للأنواع الأقل وفرة.
    ملاحظة: سيكون هناك نوع حقيقي يحتوي على هذا الجزء لإجراء عمليات مسح متعددة ويظهر في كل من عمليات المسح Q1 و Q3 (إذا تم استخدام الأخير). يتم إرفاق جدول بيانات في المعلومات الداعمة (الملف التكميلي 1) للمساعدة في التعليقات التوضيحية.
  3. كرر الخطوة 3.2 مع كروماتوجرام PrIS الأخرى. نظرا لأن كلا من m / z 122 و 140 يشيران إلى TAs ثنائية الاستبدال وكلاهما m / z 138 و 156 يشيران إلى TAs ثلاثية الاستبدال ، افحص هذه الكروماتوجرام / القنوات معا.
  4. افحص مخطط كروماتوجرام / قنوات NLS ل m / z 100 و 60 و 166 ، ولاحظ القمم / الأيونات التي ينتج عندها r.t.s (المسجلة في الخطوة 3.1) هذه الخسائر المحايدة. كما هو الحال مع Pris ، انقر فوق المسح الضوئي عن طريق المسح من خلال مخطط الكروماتوجرام وقارن مع التجزئة التي تم الحصول عليها في المسح الأيوني لمنتج DD ، خاصة بالنسبة للأنواع الأقل وفرة.
  5. باستخدام مزيج من بيانات PrIS و NLS ، بدعم من نتائج المسح الأيوني لمنتج DD ، قم بعمل تعليقات توضيحية مفترضة للقلويدات المرصودة عن طريق إضافة أصغر كتلة تروبان (على سبيل المثال ، 124 أو 122 أو 138) والخسارة المحايدة ثم حساب الكتلة المتبقية المتبقية.
    ملاحظة: المجموعات النموذجية التي تحل محل TAs (وكتلها في Da) هي الهيدروكسيل (18) ، الأسيتيل (60) ، البروبيونيل (74) ، الأيزوبوتيريل (88) ، التيغلويل (100) ، المشبعة tigloyl / 2-methylbutyryl (102) ، أو حمض الفينيل لاكتات / حمض تروبيك (166).
  6. قارن التعليقات التوضيحية للقلويدات بتلك المبلغ عنها في الأدبيات17 وقواعد البيانات (على سبيل المثال ، MoNA)26 لتحديد أنماط استبدال TA التي تم الإبلاغ عنها (والتي يحتمل أن تكون جديدة). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم معايير بعض قلويدات التروبان الشائعة (مثل الأتروبين والليتورين والسكوبولامين) المتاحة تجاريا للتأكيد.
  7. للحصول على معلومات هيكلية إضافية للعينات منخفضة الوفرة (قد يلتقط PrIS و NLS أيونات أقل من عتبات الحدث التابع) ، اجمع مسحا أيونيا محددا للمنتج (باستخدام كتلة الاهتمام كأيون سلائف) على عينة أكثر تركيزا.
    ملاحظة: تم تطوير هذه الطريقة على أداة QQQ منخفضة الدقة. بالنسبة لجميع المركبات الجديدة المفترضة ، يجب استخدام أداة MS عالية الدقة للحصول على أطياف كتلة دقيقة.

النتائج

لإثبات فعالية الطريقة ، تم تحليل مزيج قياسي من TAs (10 ميكروغرام / مل لكل من مزيج أسيتيل تروبين / أسيتيل سودوتروبين [أحادي الاستبدال] ، 10 ميكروغرام / مل لكل خليط من اثنين من أيزومرات أنيسودامين [ثنائي الاستبدال] ، جنبا إلى جنب مع هيوسيامين [أحادي الاستبدال] ، ليتورين [أحادي الاستبدال] ، وسكوبولامين [ثلاثي الاستبدال]) كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 2). يظهر مخطط كروماتوجرام مسح Q1 كامل (معروض في عرض كروماتوجرام الذروة الأساسي) في الشكل 2A ، مع الإشارة إلى الهياكل القياسية TA من خلال القمم المقابلة لها. يعرض PrIS ل m / z 124 (الشكل 2B) قمم في الكروماتوجرام الخاص به ل TAs أحادية الاستبدال. يتم عرض Ergo ، مزيج الأسيتيل تروبين / السودوتروبين ، الهيوسيامين ، والليتورين. القمم المقابلة للأسيتيل تروبين والسودوتروبين في كروماتوجرام m / z 124 صغيرة (ربما لأنها بتركيز أقل من المعايير الأخرى وربما لأنها قد تنتج جزءا أقل وفرة m / z 124 من TAs أحادية الاستبدال الأخرى). ومع ذلك ، لا يزال من الممكن اكتشافها في كل من هذا الكروماتوجرام وفي قناة PrIS المقابلة. الشكل 2C والشكل 2D هما كروماتوجرام PrIS ل m / z 122 و 140 ، على التوالي. عند الكشف عن شظايا TA ثنائية الاستبدال ، يقوم كلاهما بتمييز أيزومرين أنيسودامين ، مع ظهور إشارة أقوى على قناة m / z 140. نظرا لأن TAs المختلفة قد تحتوي على شظايا ذات شدة مختلفة ، يجب فحص القنوات m / z 122 و 140 معا. أخيرا ، تعرض قنوات m / z 156 (الشكل 2E) و m / z 138 (الشكل 2F) ، التشخيصية ل TAs ثلاثية الاستبدال ، ذروة واحدة للسكوبولامين (TA ثلاثي الاستبدال الوحيد في المزيج القياسي).

ثم تم استخدام مخططات كروماتوجرام NLS لتعيين مجموعات الإستر الموجودة. يوضح الشكل 2G مخطط كروماتوجرام NLS ل 60 Da (فقدان حمض الأسيتيك من استرات الأسيتات): أيزومرات TA أحادية الاستبدال الأسيتيل مرئية. يحدد كروماتوجرام NLS ل 166 Da (الشكل 2I) ، الذي يهدف إلى تحديد استرات فينيل لاكتيك أو استوائية ، بشكل صحيح جميع القلويدات التي تحتوي على أي من هذه المجموعات (هيوسيامين ، ليتورين ، أيزومرات أنيسودامين ، وسكوبولامين). أخيرا ، كما هو متوقع ، فإن الكروماتوجرام (الشكل 2H) لفقدان 100 Da (تشخيص استرات tigloyl) فارغ باستثناء شوائب طفيفة عند r.t. 1.75 دقيقة ، حيث لا تحتوي أي من قلويدات القياسية على هذه المجموعة.

ثم تم اختبار الطريقة بحثا عن إيجابيات كاذبة. كان مستخلص الماء / الميثانول من أوراق الطماطم (Solanum lycopersicum) بمثابة عنصر تحكم سلبي. على الرغم من كونها الباذنجان ، إلا أن الطماطم لا تنتج TAs. يظهر مخطط كروماتوجرام ذروة قاعدة المسح Q1 الكامل في الشكل 3A. يكون PrIS ل m / z 124 (الشكل 3B) فارغا في الغالب ، مع تقلبات خط الأساس الصغيرة التي من المحتمل أن تكون ضوضاء كاشف (لا توجد إشارات تطابق تلك الكتل في عمليات المسح Q1 أو Q3). هناك ميزتان مع r.t.s من 2.6 و 3.4 دقيقة تنتج 124 جزء ، لكن فحص مسح أيون منتج DD يكشف أن هذه الميزات لا تنتج أي شظايا تروبان أخرى أحادية الاستبدال (m / z 93 أو 142) ، مما يشير إلى أنها ليست TAs. يسلط هذا المثال الضوء أيضا على فائدة تضمين المسح الأيوني لمنتج DD في هذه الطريقة لاستبعاد الإيجابيات الخاطئة. وبالمثل ، فإن قناة m / z 122 ل TAs ثنائية الاستبدال (الشكل 3C) تظهر أيضا ضوضاء فقط. يتم عرض كروماتوجرام PrIS ل m / z 140 و m / z 138 و m / z 156 ، و NLSs الثلاثة ، والتي تشير فقط إلى ميزات غير TA في عمليات مسح DD ، في الشكل التكميلي 1A-F.

لتوضيح استخدامات هذه الطريقة في إلغاء تكرار عينة تحتوي على TA ، تم تحليل مستخلص من D. metel var. جذر "fastuosa". الجذور هي الموقع الرئيسي للتخليق الحيوي TA في الباذنجان ، وكان من المتوقع وجود العديد من TAs المتنوعة. يظهر مخطط كروماتوجرام المسح الضوئي Q1 الكامل في الشكل 4A. وكما هو متوقع، تم الكشف عن العديد من السمات ذات الوفرة المتفاوتة في مؤشرات pris ل m/z 124 (الشكل 4B) وm/z 122 (الشكل 4C) وm/z 140 (الشكل 4D) وm/z 156 (الشكل 4E) وm/z 138 (الشكل 4F). العديد من هذه TAs كانت أيضا أسيتيل أو tigloylated ، أو مشتقة من حمض فينيل لاكتيك / تروبيك ، كما هو موضح في الإشارات العديدة في كروماتوجرام NLS في الشكل 4G-I ، على التوالي.

تم استخدام جدول بيانات ، تم توفيره كملف .xls (ورقة فارغة لاستخدام القارئ هي الملف التكميلي 1 ، D. metel root موجود في الملف التكميلي 2) ، لأول مرة للمستند الذي ظهرت فيه الميزات (الجماهير أو r.t.s) مثل TA (باستخدام المعايير في الخطوة 3.1). بعد ذلك ، لوحظت شظايا وخسائر محايدة تنتمي إلى هذه الميزات. هذه الطريقة حساسة للغاية: حتى أن قنوات PrIS اكتشفت بسهولة TAs منخفضة الوفرة التي لم تسفر عن قمم مرئية على الكروماتوجرام المقابلة. باستخدام الشظايا والخسائر المحايدة ، يمكن بعد ذلك اقتراح هيكل للقلويد باتباع الخطوة 3.5.

ويرد مثال على استخدام البيانات الطيفية لشرح قلويدات في الشكل 5. الرسم البياني الكامل للمسح Q1 لجذر D. metel موجود في الشكل 5A. تم اختيار ميزة في 14.4 دقيقة. يظهر طيف المسح Q1 (الشكل 5B) كتلة أصل تبلغ m / z 224 لهذه الذروة. يظهر طيف المسح الأيوني لمنتج DD في الشكل 5C. تشير قناة PrIS ل m / z 124 (الشكل 5D) إلى أن أيون 224 ينتج هذا الجزء (مرئي أيضا في المسح الأيوني لمنتج DD). تشير قناة NLS ل 100 Da (للكشف عن TAs tigloylated) أيضا إلى m / z 224 (تم تأكيده أيضا بواسطة المسح الأيوني لمنتج DD). جمع الخسارة المحايدة والجزء TA الأقل كتلة (100 + 124 Da) يساوي الكتلة الأم ، 224 ، مما يؤكد أن مجموعة tigloyl هي البديل الوحيد ؛ يشار إلى التركيب المحتمل لهذا القلويد في الشكل 5C. بالنسبة ل TAs ثنائية وثلاثية الاستبدال ، تمت إضافة كتل الخسارة المحايدة المرصودة إلى أدنى كتلة TA ، ثم تم اقتراح بديل آخر لحساب الكتلة المتبقية: على سبيل المثال ، m / z 222 ، مع شظايا TA ثنائية الاستبدال من 140 و 122 وخسارة محايدة من 100 Da ، لها كتلة متبقية من 100 (222-122 = 100) ، من المحتمل أن تكون مجموعة تيجلويل ثانية. يمكن استخدام سير العمل هذا بشكل حدسي لعملية الإزالة: من غير المرجح أن تكون الميزة التي تفتقر إلى شظايا التروبان (حتى لو فقدت 60 أو 100 أو 166 دا) TA. في مثال على التكرار الشامل والسريع باستخدام سير العمل هذا ، تم تحديد 71 TAs متميزة متفاوتة الوفرة والقطبية في جذر D. metel ، بما في ذلك مركبات الأيزومرية المتعددة (الملف التكميلي 2). تحتوي بعض هذه المركبات على مجموعات إستر لا يمكن تعيينها بسهولة ، وتم وضع علامة على بعض المركبات الإضافية على أنها TAs محتملة ، ولكن لا يمكن شرحها بثقة عالية.

كما تم تحليل مستخلص الميثانول / الماء من بذور D. stramonium المطحونة. يظهر الرسم البياني الكامل لذروة قاعدة المسح Q1 لجذر D. metel في الشكل 6A. ويبين الشكل 6B PrIS ل m/z 124 ويظهر PrIS ل m/z 122 في الشكل 6C؛ الكروماتوجرام الأخرى موضحة في الشكل التكميلي 2A-F. يشير الشكل 6B إلى قلويد تروبان أحادي الاستبدال وفير جدا عند r.t. = 12.6 دقيقة ، من المحتمل أن يكون هيوسيامين. يتم تضمين جدول البيانات الذي يعرض التعليقات التوضيحية TA الأولية في الملف التكميلي 3. بدا أداء الطريقة أقل مع هذه العينة بالذات: اثنتان من السمات الوفيرة للغاية مع m / z من 259 في r.t.s من 8.5 و 10.2 دقيقة أسفرت عن قمم على كروماتوجرام NLS ل 60 و 100 Da (الشكل التكميلي 2 D ، E) مع كتلة m / z 260 (نظير M + 1) المشار إليها في الأطياف المقابلة. هذه المركبات ليست TAs ، ولكنها بدلا من ذلك شكلت شظايا تتفق مع قلويدات بيتا كاربولين27. فهي ليست أسيتيل أو تيغلولوليت، ولكنها تفقد 60 أو 100 من نظيرها M + 1، مما يجعل ظهورها على هاتين القناتين NLS غير صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، أنتج سكوبولامين (r.t. = 10.5 دقيقة) جزءا m / z 122 من ذروة نظيره m / z 305 M + 1 ، وهو نظير لجزء سكوبولامين المتوقع m / z 121. على الرغم من أن هذه الطرق تستخدم وظائف إزالة النظائر ، إلا أن بعض "تسرب" النظائر ممكن عند تركيزات العينات العالية هذه. في حين أن هذا قد يكون حدثا فريدا للأداة المستخدمة في هذه الدراسة أو هذه العينة ، إلا أنه من الجدير بالذكر.

تم شرح أربعين TAs في بذور D. stramonium باستخدام هذه الطريقة ، بما في ذلك العديد من التي يبدو أنها جليكوزيلاتي ، وفقدت كتل 162 (سداسي) ، 146 (deoxyhexose) ، أو 132 Da (زيلوز أو سكر مشابه). بينما تم الإبلاغ عن TAs المحتوية على السداسي في Merremia (Convolvulaceae)28 و Duboisia29 و Atropa25 ، فإن هذا هو أول تقرير عن TAs المحتوية على deoxyhexose أو xylose. كان لدى TA واحد r.t. من 13.8 دقيقة (الشكل 7A) وكتلة m / z 436 (مسح Q1 في الشكل 7B). أنتجت هذه الميزة إشارة على قناة m / z 124 ، مما يشير إلى TA أحادي الاستبدال (الشكل 7D) ، لكنها لم تنتج إشارات على أي قناة PrIS أو NLS أخرى. أشار المسح الأيوني لمنتج DD (الشكل 7C) إلى m / z 124 المتوقع ، خسارة 312 Da ، وربما 166 + 146 Da ، من الأيون الأم. تم الحصول على MS / MS عالي الاستبانة على أداة رباعية الأقطاب لوقت الطيران (الطيف في الشكل 7E) ، والتي أشارت إلى جزء m / z 290 ، مما يشير إلى هيوسيامين أو غليكوزيل الليتورين على جزء هيدروكسيل الإستر مع رامنوز أو سكر مشابه ؛ كانت الكتلة الدقيقة المقاسة أيضا قريبة جدا من الكتلة الدقيقة المحسوبة لرامنوسيل-هيوسيامين أو الليتورين (الهيكل في الشكل 7E). بسبب هيكله ووفرته غير المسبوقين ، يستحق هذا القلويد العزلة عن بذور D. stramonium ، وهو مثال يوضح استخدام هذه الطريقة في اكتشاف قلويد جديد.

figure-results-1
الشكل 1: الشظايا والخسائر ذات الصلة التي لوحظت في MS من TAs. (أ) الشظايا المميزة (وكتلها التشخيصية) المكونة من TAs أحادية الاستبدال وثنائية الاستبدال وثلاثية الموضع ، بالإضافة إلى أمثلة تمثيلية للقلويدات في كل فئة. (ب) الخسائر المحايدة الشائعة التي لوحظت من مجموعات الإستر في TAs (وكتلها التشخيصية). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أيون سلائف التحكم الإيجابي ومسح الخسارة المحايدة. بالنسبة لجميع الكروماتوجرامات ، يكون المحور X هو وقت الاحتفاظ ، والمحور Y هو التهم (وفرة الأيونات). (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي، في عرض مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسية، للمزيج القياسي القلوي. يشار إلى هياكل المعايير ؛ يشار إلى القمم المقابلة بأسهم حمراء. (B-F) هي كروماتوجرام PrIS ل (B) m / z 124 و (C) 122 و (D) 140 و (E) 156 و (F) 138. (ز-ط) كروماتوجرام NLS ل 60 Da (acetyl ، G) ، 100 Da (tigloyl ، H) ، و 166 Da (حمض فينيل لاكتيك / تروبيك ، I). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أيون سلائف التحكم السلبي ومسح الخسارة المحايدة. بالنسبة لجميع الكروماتوجرامات ، يكون المحور X هو وقت الاحتفاظ ، والمحور Y هو التهم (وفرة الأيونات). (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي، في عرض مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسية، لمستخلص ميثانول/ماء من ورقة S. lycopersicum . (B) يظهر مخطط كروماتوجرام PrIS ل m / z 124 خاصتين فقط غير التروبان عند r.t. 2.6 و 3.4 دقيقة. (C) مخطط كروماتوجرام PrIS ل m / z 122 ، فارغ باستثناء ضوضاء الكاشف. المقاييس المستخدمة كما في الشكل 2 ؛ الكروماتوجرام المتبقية موجودة في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تطبيق طريقة MS / MS على جذور D. metel var. "fastuosa". بالنسبة لجميع الكروماتوجرامات ، يكون المحور X هو وقت الاحتفاظ ، والمحور Y هو التهم (وفرة الأيونات). (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي ، في عرض كروماتوجرام الذروة الأساسية ، لمستخلص ميثانول / ماء من جذور D. metel var. "fastuosa". (B-F) هي كروماتوجرام PrIS ل m / z (B) 124 و (C) 122 و (D) 140 و (E) 156 و (F) 138. (G-I) عبارة عن كروماتوجرام NLS ل 60 Da (acetyl ، G) ، 100 Da (tigloyl ، H) ، و 166 Da (حمض فينيل لاكتيك / تروبيك ، I). لاحظ الإشارات الوفيرة على كل كروماتوجرام يتوافق مع العديد من TAs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تطبيق المسح الأيوني لمنتج DD المدمج ، ومسح أيون السلائف ، وطريقة مسح الخسارة المحايدة لاقتراح هيكل TA. (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي ، في عرض كروماتوجرام الذروة الأساسية ، لمستخلص الميثانول / الماء من جذور D. metel var. "fastuosa ". يشار إلى الذروة عند r.t. = 14.4 دقيقة بسهم أحمر. (ب) Q1 (مسح المسح)، بكتلة وفيرة تبلغ m/z 224 لهذه القمة. بالنسبة لجميع الأطياف ، يكون المحور X كتلة ، والمحور Y هو الشدة. (ج) المسح الأيوني لناتج DD، الذي يوضح تجزئة أيون m/z 224، مما يشير إلى فقدان 100 Da وجزء m/z 124 (أسهم حمراء). يظهر هذا المركب على كل من قناة (D) m / z 124 PrIS و (E) قناة 100 Da NLS ، مما يشير إلى أنه أحادي الاستبدال و tigloylated (الهيكل في اللوحة C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تطبيق طريقة MS / MS على بذور D. stramonium . بالنسبة لجميع الكروماتوجرامات ، يكون المحور X هو وقت الاحتفاظ ، والمحور Y هو التهم (وفرة الأيونات). (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي، في عرض مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسية، لمستخلص ميثانول/ماء من بذور D. stramonium. (ب) مخطط كروماتوجرام PrIS ل m/z 124؛ (C) يصور مخطط كروماتوجرام PrIS ل m / z 140. الكروماتوجرام المتبقية موجودة في الشكل التكميلي 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الشكل 7: شرح قلويد جديد في بذور D. stramonium . بالنسبة لجميع الكروماتوجرامات ، يكون المحور X هو وقت الاحتفاظ ، والمحور Y هو التهم (وفرة الأيونات). (أ) مخطط كروماتوجرام الأيونات الكلي، في عرض مخطط كروماتوجرام الذروة الأساسية، لمستخلص ميثانول/ماء من بذور د. سترامونيوم. يشار إلى ميزة في r.t. = 13.7 دقيقة. (ب) Q1 (مسح المسح) يوضح كتلة m/z 436 لهذه القمة. بالنسبة لجميع الأطياف ، يكون المحور X كتلة ، والمحور Y هو الشدة. (ج) المسح الأيوني الناتج DD الذي يوضح تجزئة أيون m/z 436. (د) يظهر مركب TA الأحادي الاستبدال هذا على قناة m/z 124 PrIS. (ه) طيف MS / MS عالي الدقة لهذا TA الجديد ، جنبا إلى جنب مع الهياكل المقترحة والكتلة الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: عمليات مسح إضافية لسلائف التحكم السلبي والخسارة المحايدة. (أ-ج) مخططات كروماتوجرام PrIS ل m / z (A) 140 و (B) 156 و (C) 138. (مد-واو) كروماتوجرام NLS ل 60 Da (أسيتيل ، D) ، 100 Da (tigloyl ، E) ، و 166 Da (حمض فينيل لاكتيك / تروبيك ، F). المقاييس المستخدمة هي نفسها كما في الشكل 2. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: تطبيق طريقة MS / MS على بذور D. stramonium ؛ كروماتوجرام إضافي. (A-C) هي كروماتوجرام PrIS ل m / z (A) 140 و (B) 156 و (C) 138. (مد-واو) كروماتوجرام NLS ل 60 Da (أسيتيل ، D) ، 100 Da (tigloyl ، E) ، و 166 Da (حمض فينيل لاكتيك / تروبيك ، F). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: جدول بيانات فارغ يستخدم للتعليقات التوضيحية القلوية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: جدول بيانات للشروح والهياكل القلوية لجذور D. metel var. "fastuosa ". الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: جدول بيانات للشروح والهياكل القلوية لبذور D. stramonium. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

وعلى الرغم من أن بارامترات الأجهزة المنصوص عليها في البروتوكول تسمح بأداء مرض، فإن الاستخدام الناجح لهذه الطريقة قد يتطلب اهتماما دقيقا بعدة خطوات حاسمة أو تحسينها إلى المستوى الأمثل. في حين أن تدرج مذيب HPLC المقدم في الخطوة 2.2 مناسب بشكل عام لقلويدات التروبان ، فقد يحتاج إلى تعديل اعتمادا على ملف قلويد التروبان للعينة أو الأنواع النباتية التي يتم فحصها. يمكن أيضا تغيير حجم حقن العينة اعتمادا على حساسية الأداة وكيفية استخدام الطريقة. يجب أن يستخدم التنميط الأيضي "العميق" أو إزالة التكرار حجم حقن أكبر (تم استخدام 15-20 ميكرولتر في هذه الدراسة) ، في حين أن الكشف البسيط عن قلويدات يمكن أن يستخدم كميات أصغر. يجب توخي الحذر عند استخدام أحجام عينات كبيرة من أجل (أ) الحفاظ على مصدر الأيونات نظيفا بانتظام ، (ب) مراقبة عمود HPLC بحثا عن تغيرات الضغط أو الانسدادات (يجب دائما استخدام عمود حماية مناسب) ، (ج) منع الترحيل بين العينات ، و (د) فحص الكروماتوجرام بحثا عن "تسرب النظائر" المحتمل كما هو موضح أعلاه. يجب عدم تغيير درجات حرارة الواجهة والفولتية بشكل كبير عن تلك المحددة في الطريقة لتجنب التجزئة المبكرة في المصدر. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أنه يوصى بجهد خلية تصادم يبلغ 20 فولت ، إلا أنه قد لا يوفر إشارة كروماتوجرام مثالية (أو شظايا مسح أيون منتج DD التشخيصية) لجميع TAs. تحتوي بعض أدوات ووظائف MS على ميزة "زيادة طاقة الاصطدام" ، أو القدرة على جمع عمليات المسح في طاقات تصادم متعددة أو محسنة ، والتي يمكن أن تجد أيضا فائدة في طريقة مثل هذه30.

طريقة MS نفسها قابلة للتعديل بسهولة: في حين أن استرات حمض tiglic و acetic و phenyllactic / tropic شائعة في أنواع الداتورة ، قد تكون أنماط استبدال إستر TA مختلفة في النباتات أو العينات الأخرى. يمكن تغيير كتل NLS للكشف عن مجموعات استر أخرى (على سبيل المثال ، فقدان 74 Da لإسترات البروبيونيك) أو يحتمل اكتشاف الجليكوزيل (على سبيل المثال ، فقدان 162 Da للسداسيات). يمكن أيضا تغيير كتل PrIS. على سبيل المثال ، تم شرح TA في كلتا عينتي الداتورة (r.t. = 12.5 دقيقة ؛ انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2) على أنه نورهيوسيامين أو نورليتورين (هيوسيامين / ليتورين مطروحا منه مجموعة التروبان N-methyl) بناء على شظايا المسح الأيوني لمنتج DD (m / z 110 و 93) وتتطابق مع أطياف الأدبيات31; لم يظهر هذا TA على أي من قنوات PrIS لجزء التروبان. يمكن إضافة قناة لهاتين الكتلتين للكشف عن النورتروبان. جزء m / z 93 موجود أيضا في معظم TAs أحادية الاستبدال17 ؛ يمكن أن توفر إضافة هذه القناة تأكيدا إضافيا لوجود TA أحادي الاستبدال وتساعد في تقليل الإيجابيات الخاطئة.

بالإضافة إلى قدرته على التكيف مع أنواع مختلفة من TAs ، فإن إحدى المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول (على طرق التعليقات التوضيحية القلوية الحالية) هي سرعته. اعتمادا على كيفية تكوين طريقة MS (ووقت تشغيل HPLC المستخدم) ، يمكن جمع جميع بيانات MS / MS للعينة في غضون 60-90 دقيقة. على سبيل المثال ، خلال دراستنا ، تم دمج TA PrISs أحادية وثنائية الاستبدال في طريقة واحدة ، وكانت TA PrISs ثلاثية الاستبدال في طريقة أخرى ، وكانت NLSs في طريقة ثالثة (احتوت جميع الطرق على المسح الأيوني لمنتج DD) ، لما مجموعه ثلاث حقن في ثلاثين دقيقة لكل منهما. يعد التعليق التوضيحي الكامل للعينة باستخدام بيانات MS / MS المدمجة أسرع بكثير من الفحص اليدوي لكل ذروة أو جمع عمليات مسح أيون المنتج الفردية للعديد من قمم الاهتمام. يمكن إجراء هذه الطريقة على أي أداة باستخدام أوضاع المسح الأيوني للمنتج و Pris و NLS ويمكن استخدامها للتقييم النوعي السريع (على سبيل المثال ، هل TAs موجودة أم غير موجودة؟) ، لتمييز أو "بصمات" الأجناس النباتية المختلفة أو الأنواع أو الأصناف أو الأصناف أو الأعضاء أو مراحل النمو ، ولمقارنة TAs المرصودة بتلك المبلغ عنها (كجزء من سير عمل إلغاء التكرار). كما هو موضح ، يمكن أيضا استخدام البروتوكول لاكتشاف TAs جديدة كخيوط للعزل أو التنقية أو المقايسة الحيوية ، بالإضافة إلى تحديد الأنواع والأنسجة المرشحة لعزلها عنها. يمكن استخدام هذه الطريقة في مجالات المنتجات الطبيعية والأيض ، بما في ذلك المساعدة في فهم الكيمياء الحيوية النباتية والتحقيق في اكتشاف الأدوية في المراحل المبكرة. يمكن العثور على تطبيقات إضافية في سلامة الأغذية أو الطب الشرعي (على سبيل المثال ، الكشف عن TAs في الأغذية أو المكملات الغذائية أو السوائل الحيوية).

تحتوي الطريقة على العديد من العيوب التي تستحق المناقشة. أولا ، اعتمادا على الأداة المستخدمة والغرض من استخدام البروتوكول ، قد تكون هناك حاجة إلى حجم حقن عينة كبير ، مما قد يتسبب في حدوث مشكلات في أداء الأداة واحتمال حدوث نتائج إيجابية خاطئة في بعض الحالات (كما هو موضح أعلاه). ثانيا ، تم تطوير هذه الطريقة على أداة QQQ منخفضة الدقة ، ويمكن أن تنتج الإيجابيات الخاطئة عن الدقة المنخفضة (على سبيل المثال ، الميزة التي تحتوي على جزء m / z 124 في عنصر التحكم السلبي الذي ليس TA). ومن شأن أداة عالية الاستبانة أن توفر قدرة تشخيصية أفضل، وينبغي الحصول على أطياف MS/MS دقيقة الكتلة لأي قلويد جديد مقترح. العيوب الإضافية لهذه الطريقة هي ببساطة عيوب تحليل MS / MS ككل. في حين أن MS / MS مفيد لاقتراح الهياكل ("التعليق التوضيحي" على النحو المحدد في مبادرة معايير الأيض32) ، فإنه لا يوفر تخصيصات ملموسة للاتصال الجزيئي ("تحديد الهوية"). على سبيل المثال ، في كلتا عينتي الداتورة ، وجدنا العديد من أيزومرات m / z 306 TA ، والتي يبدو أنها تحتوي على كل من m / z 124 و m / z 140 جزءا (الملف التكميلي 2) ، مما يجعل التعيين النهائي لنمط الاستبدال أمرا صعبا. يمكن أن يمثل هذا آلية تجزئة غير مكتشفة بعد ، وقد تكون تقنية أخرى (مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي) مفيدة في حل الغموض. كثيرا ما تكافح الطرق القائمة على MS / MS مع الأيزومريزم: يصعب تمييز إستر حمض الفينيل اللاكتيك ليتورين (أو مشتقاته) عن الهيوسيامين (إستر حمض الاستوبيك) ، وتحتوي النباتات الباذنجانية الأخرى على TAs المستبدلة بمجموعات tigloyl الأيزومرية و senecioyl و angeloyl33,34 ؛ في غياب المعايير ، قد يكون من الصعب ، إن لم يكن من المستحيل ، التمييز بين هذه المركبات. لن تفرق الطريقة أيضا بين enantiomers (على سبيل المثال ، 3،6- مقابل 3،7-dihydroxytropane ؛ انظر الشكل 1 للترقيم) أو regioisomers (على سبيل المثال ، التمييز بين 3-acetyl و 7-acetyl بدون معيار). لقد قمنا بتعيين معظم التروبان أحادي الاستبدال على أنه 3 مستبدل بناء على الأنماط السابقة المبلغ عنها في جنس الداتورة والنباتات الباذنجانية الأخرى17,35. Ergo ، يجب دائما الرجوع إلى أي معرفة أو أدبيات كيميائية حيوية حول الكائن الحي الذي تمت دراسته (إن وجد) جنبا إلى جنب مع أي تحليل فعال.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس (جامعة ميشيغان الشمالية ، الممنوحة ل MAC) ، وزمالة بحثية جامعية (جامعة شمال ميشيغان ، منحت ل JC) ، وقسم الكيمياء. يود المؤلفون أن يشكروا جون بيرغر (NMU) على المساعدة في تحضير الأنسجة النباتية ، وهانا هوكينز (NMU) على صيانة LC-MS والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والدكتور ريان فورنوالد وطلابه CH 495 (تخليق المنتجات الطبيعية) على إعدادهم لمزيج الأسيتيل تروبين. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور دانيال جونز (جامعة ولاية ميشيغان) على حصوله على أطياف MS/MS عالية الاستبانة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأسيتونيتريل ، بالنسبة ل UHPLC ، مناسبة لقياس الطيف الكتليSigma-Aldrich900667HPLC مذيب
الأرجونAirGasAR UHP300CID غاز
فورميك حمض الفورميك ، 99٪ للتحليلThermo ScientificAC270480010HPLC المضافة
حامل عمود الحرسRestek25812
HPLC ، Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58عمود HPLC
LCMS ، Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44مطياف الكتلة ؛ قمنا بتشغيل برنامج LabSolutions ، وهو معيار لأدوات Shimadzu
النيتروجين السائلAirGasNI 180LT22
الميثانول ، ل HPLC / UHPLC / LCMSVWRBDH 85800.400لصنع مذيب
الطرد المركزي الدقيق   ؛VWR2400-37
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.5 ملفيشر Scientific05-408-129
Mortar   ؛فيشر العلميFB961Cلطحن الأنسجة النباتية
PestleFisher ScientificFB961Mلطحن الأنسجة النباتية
ماصة 1000 ملGilson & nbsp ؛F144059M
طرف الماصة 1000 ملفيشر العلمي02-707-404
الأنسجة النباتيةمصادر مختلفةغير متوفر / أيمكن أن يكون أي شيء بري أو مزروع
أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبلين ، 15 ملفيشر سيانتيفيك05-539-4
مبرد البوليسترينULINES-18312نوع المبردات التي يتم شحن الكواشف للبيولوجيا الجزيئية مناسب
Roc C18 3 & micro; م ، 100 مم × 4.6 ممRestek9534315عمود HPLC
Roc C18 ، 10 مم × 4 ممعمود Restek953450210Guard
شاكر هزازThemo Scientific11-676-680
طقم راحة قارورة الخيط اللولبي (9 مم)حقنةقوارير أخذ العينات الأوتوماتيكية من فيشر13-622-190
LCMS ، 3 ملفيشر ساينتفيك03-377-27
فلتر الحقنة 0.45 & مايكرو; m Avantor / VWR76479-008
الماء ، للاستخدام في الكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتليJT Baker9831-03لصنع محلول الماء للاستخلاص
، يحتوي على 0.1٪ v / v حمض الفورميك ، بالنسبة ل UHPLC ، مناسب لقياس الطيف الكتليSigma-Aldrich900687-1Lمذيب HPLC
غاز الاستخراج سيكون العلمية

المراجع

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796(2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407(2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Prasain, J. , InTech. London. (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650(2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629(2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157(2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270(2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. MassBank of North America. , Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024).
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , Academic Press. New York, NY. (1993).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

LC MS MS Datura Stramonium Datura Metel
تطبيقات قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في أبحاث المنتجات الطبيعية: قلويدات التروبان كدراسة حالة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.