يصف البروتوكول الحالي نموذج الفئران لانسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط الذي يحافظ على البنية التشريحية للأوعية الدماغية دون التسبب في ضرر.
مقالة منهجية
يصف البروتوكول الحالي نموذج الفئران لانسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط الذي يحافظ على البنية التشريحية للأوعية الدماغية دون التسبب في ضرر.
تعتبر السكتة الدماغية الإقفارية السبب الرئيسي للإعاقة والوفيات طويلة الأمد بين البالغين في جميع أنحاء العالم. ساهمت النماذج الحيوانية للسكتة الدماغية الإقفارية بشكل كبير في فهمنا لآلياتها المرضية وتطوير العلاجات المحتملة. في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان شائعتان تتضمنان تقنيات الخيوط (خياطة داخل الأوعية الدموية) للحث على نماذج حيوانية لنقص التروية الدماغية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قيود متأصلة ، مثل انخفاض نضح الدم في الدماغ ، وتلف نظام الشريان السباتي الخارجي ، وضعف تناول الطعام و / أو الماء ، والخلل الحسي في الوجه. تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتحفيز نموذج السكتة الدماغية الإقفارية للفئران دون المساس بتشريح الأوعية الدموية الدماغية. في هذه الدراسة ، تم الكشف عن الشريان السباتي المشترك (CCA) لفئران Sprague-Dawley ، وتم إجراء شق. ثم تم إدخال خيوط من خلال شق في الشريان السباتي الداخلي لإغلاق الشريان الدماغي الأوسط. بعد 1.5 ساعة من نقص التروية المستحث ، تمت إزالة خيوط الانسداد بالكامل من كل من الشريان السباتي الداخلي و CCA. تم خياطة الشق في CCA لاحقا باستخدام 11-0 خيوط جراحية مجهرية تحت المجهر (تكبير 4x). من خلال استخدام تقنيات الجراحة المجهرية لإصلاح CCA ، نجحت هذه الدراسة في تطوير طريقة فريدة للحث على نموذج السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران مع الحفاظ على السلامة التشريحية للأوعية الدموية الدماغية.
السكتة الدماغية ، السبب الرئيسي للوفاة والخلل الوظيفي العصبي طويل الأمد لدى البالغين في جميع أنحاء العالم ، تشمل أنواعا مختلفة ، حيث تمثل السكتة الدماغية حوالي 81.9٪ من الحالات ، بينما يمثل النزيف الدماغي والنزيف تحت العنكبوتية 14.9٪ و 3.1٪ على التوالي< فئة الدعم = 'xref'>1. غالبا ما تنتج السكتة الدماغية الإقفارية عن تصلب الشرايين أو انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) ، مما يؤدي إلى انخفاض تدفق الدم الدماغي الموضعي وتلف الدماغ اللاحق. يؤدي هذا الانخفاض في إمدادات المغذيات للخلايا الإقفارية إلى استنفاد الطاقة ، مما يتسبب في فقدان سلامة الغشاء وتورم الخلايا والتحلل في نهاية المطاف. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم عوامل مثل زيادة الكالسيوم داخل الخلايا ، وإطلاق الأحماض الأمينية المثيرة ، وزيادة إنتاج الجذور الحرة ، وتنشيط الخلايا الالتهابية في إصابة أنسجة المخ بعد السكتة الدماغية < فئة sup = 'xref'>2.
أهداف علاج السكتة الدماغية الإقفارية متعددة الأوجه: تقليل الضرر العصبي المستمر وتقليل الوفيات والإعاقة طويلة الأمد ؛ منع المضاعفات الناشئة عن عدم الحركة والخلل العصبي ؛ وتقليل خطر تكرار السكتة الدماغية. نظرا لتعقيد الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية ، فإن نموذج السكتة الدماغية القوي ضروري للبحث والتطوير للعلاجات التي تستهدف السكتة الدماغية الإقفارية.
حاليا ، انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) هو نموذج حيواني شائع للسكتة الدماغية الإقفارية < sup class = 'xref'>3. عادة ما يتم إجراء MCAo عن طريق إدخال خيوط أحادية ذات رأس من السيليكون أو مخففة باللهب من خلال الأوعية العنقية حتى تصل إلى أصل الشريان الدماغي الأوسط (MCA). في عام 1986 ، طور كويزومي وزملاؤه تقنية تنطوي على إدخال خيوط أحادية ذات رأس من السيليكون من خلال شق في الشريان السباتي المشترك (CCA) ، مما يسمح لها بالوصول إلى مدخل MCA ومنع تدفق الدم < فئة sup = 'xref'>4. في عام 1989 ، أبلغت مجموعة لونجا عن طريقة MCAo أخرى تضمنت إدخال خيوط أحادية من خلال شق في الشريان السباتي الخارجي (ECA). ثم يجتاز الشعيرات الأحادية تشعب الشريان السباتي الداخلي (ICA) و ECA قبل الوصول إلى نقطة البداية لفئة MCA5.
قيود الطريقتين الحاليتين لحث MCAo واضحة. تتطلب طريقة Koizumi انسدادا دائما ل CCA المماثل ، مما يؤدي إلى تقليل نضح MCA لأن إعادة التروية تعتمد فقط على دائرة Willis4. على العكس من ذلك ، تتضمن طريقة Longa قطع ECA ، مما يؤدي إلى تلف نظام ECA وضعف لاحق في وظيفة عضلات الوجه< فئة sup = 'xref'>5. يمكن أن يؤثر هذا الضرر على تناول الطعام والماء ، وكذلك يسبب خللا حسيا للوجه ، مما يؤثر على إعادة التأهيل وتقييم الوظيفة العصبية بعد السكتة الدماغية الإقفارية < فئة الدعم = 'xref'>6.
يسعى البروتوكول الحالي إلى معالجة هذه القيود من خلال تطوير طريقة جديدة للحث على نموذج السكتة الدماغية الإقفارية دون الإضرار بالبنية التشريحية للأوعية الدماغية. يستخدم هذا النهج الجديد تقنيات الجراحة المجهرية لإصلاح CCA ، وبالتالي تجنب العيوب المرتبطة بالطرق السابقة.
حصل الإجراء التجريبي على موافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة يانتاي (رقم الموافقة: YTDX20230410) والتزم بإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley التي يتراوح وزنها بين 300-350 جم في هذه الدراسة. يتم توفير قائمة شاملة بالحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
< p class = "jove_title" >1. تحضير4. خياطة الجراحة المجهرية ل CCA
ملاحظة: تم تقييم الوظيفة العصبية باستخدام اختبار Garcia ، بعد تقرير سابق < sup class = "xref" >9.
عملية الخياطة المجهرية
سُحب الخيط بالقرب من شق الشريان السباتي المشترك (CCA) حتى ظهر طرف الخيط الأبيض (الشكل 1A). بعد ذلك، وُضعت ملاقط مجهرية على الشريان السباتي المشترك (CCA) (الشكل 1B). وتحت المجهر بتكبير 4x، تمت خياطة شق الشريان السباتي المشترك (CCA) باستخدام خيوط جراحية مجهرية بنمط الغرز المتقطعة (الشكل 1C). لاحقاً، أُزيلت الملاقط المجهرية من الشريان السباتي المشترك (CCA)، مما أدى إلى استعادة البنية التشريحية وتدفق الدم (الشكل 1D).
تلوين TTC ومعدل الوفيات
تم تقسيم ما مجموعه 12 من ذكور الجرذان البالغة عشوائياً إلى مجموعتين: مجموعة وهمية (sham) ومجموعة نموذجية (model) (العدد = 6 في كل مجموعة). ولسوء الحظ، نفق حيوان واحد في المجموعة الوهمية بسبب جرعة زائدة من التخدير، ونفق حيوان واحد في المجموعة النموذجية خلال 24 h. وقد لوحظت الاحتشاءات الناتجة عن نقص التروية الدماغية في كل من الجسم المخطط والقشرة المخية (الشكل 2A). وبعد 3 أيام من السكتة الدماغية الإقفارية، تم قياس إجمالي نسبة الاحتشاء وكانت 29.3% ± 1.6% من نصف الكرة المخية (الشكل 2B)، مع معدل وفيات بلغ 16.7% بعد الجراحة.
تقييم الوظائف العصبية
في اليومين الأول والثالث بعد السكتة الدماغية الإقفارية، انخفضت درجات مجموعات النموذج بشكل ملحوظ مقارنة بدرجات مجموعات الشام (17.8 ± 0.4 مقابل. 8.2 ± 1.5, الشكل 3أ; 17.6 ± 0.9 مقابل. 9.6 ± 1.3, الشكل 3B، على التوالي).

الشكل 1: عملية الخياطة المجهرية. (A) سحب الفتيلة من الشريان السباتي المشترك (CCA). تشير الأسهم الزرقاء إلى الملاقط الوعائية المجهرية. (B) يشير السهم الأسود إلى الشق بعد إزالة الفتيلة تماماً. تشير الأسهم الزرقاء إلى الملاقط الوعائية المجهرية. (C) تحت المجهر (تكبير 4x)، تمت خياطة شق الشريان السباتي المشترك (CCA) باستخدام خيوط جراحية مجهرية من قياس 11-0 بنمط غرز متقطعة. تشير الأسهم الزرقاء إلى الملاقط الوعائية المجهرية. يشير السهم الأسود إلى الشق المخيط. (D) إزالة الملاقط المجهرية واستعادة تدفق الدم في الشريان السباتي المشترك (CCA). يشير السهم الأسود إلى موقع الخياطة في الشريان السباتي المشترك (CCA). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: نتائج صبغ TTC لنموذج نقص التروية. (A) صور تمثيلية لشرائح دماغية مصبوغة بـ 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) بعد نقص التروية الدماغية. في الأنسجة الحية، يتم اختزال TTC إنزيمياً بواسطة نزع الهيدروجين (dehydrogenases) إلى 1,3,5-triphenylformazan، والذي يتميز بلون أحمر. تظل الأنسجة في المناطق المنخورة بيضاء بسبب غياب هذا النشاط الإنزيمي. (B) النسبة المئوية لمنطقة نقص التروية في الجرذان بعد 3 أيام من نقص التروية الدماغية. مقارنة بمجموعة Sham، كانت قيمة **P < 0.01. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. كان هناك خمسة جرذان في كل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تقييم الوظائف العصبية. (A) درجات Garcia بعد يوم واحد من نقص تروية الدماغ. (B) درجات Garcia بعد 3 أيام من نقص تروية الدماغ. مقارنة بمجموعة Sham، كانت قيمة **P < 0.01. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. كان هناك خمسة جرذان في كل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
MCAo هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لإنشاء نماذج حيوانية للسكتة الدماغية ، وتكرار عملية السكتة الدماغية التي لوحظت بشكل فعال في المرضى عن طريق استعادة تدفق الدم بعد نقص تروية10،11،12. طور مختبرنا نموذجا للسكتة الدماغية الإقفارية يتيح إعادة التروية من CCA دون التسبب في تلف ECA. بعد تحريض نقص التروية ، يتم إجراء إصلاح جراحي مجهري ل CCA. على الرغم من عدم إجراء القياس المباشر لتدفق الدم CCA ، لاحظ المجربون نبضات الأوعية الدموية في CCA قبل الشروع في إعادة التروية. تحافظ هذه التقنية على السلامة التشريحية لأوعية الرقبة بينما تشبه إلى حد كبير عملية السكتة الدماغية لدى المرضى. علاوة على ذلك ، أكدت تقييمات الوظيفة العصبية ومنطقة نقص تروية الدماغ صحة السكتة الدماغية الناجمة عن هذا النهج الجراحي.
يمكن أن تتأثر نماذج السكتة الدماغية الإقفارية الموصوفة سابقا بعوامل مختلفة. في طريقة Koizumi et al.4 ، يعتمد إعادة تروية الدم بشكل كبير على دائرة ويليس بسبب ربط CCA. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الاختلافات في الأوعية الدموية الدماغية على حجم الاحتشاء الدماغي النهائي ، مما قد يزيد من معدل الوفيات في نموذج السكتة الدماغية بسبب انخفاض نضح الدم13،14. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يضعف نقص تروية ECA وظيفة عضلات الوجه والأعصاب ، مما يؤثر على تقييم الوظائف العصبية المختلفة15،16.
تعالج الطريقة الحالية هذه التحديات من خلال ثلاث خطوات رئيسية: (1) الحفاظ على شق CCA صغيرا قدر الإمكان ، وكبيرا بما يكفي فقط لإدخال الفتيل ، مما يقلل من الوقت والضرر المرتبط بخياطة الأوعية الدموية. (2) وضع مشابك الأوعية الدموية الدقيقة بالقرب من تشعب CCA قدر الإمكان عند تثبيت CCA البعيد لمنع تثبيت طرف الفتيل الأبيض ، مما قد يؤدي إلى انفصال السيليكون وتجلط الدم. (3) مراقبة CCA لاستئناف النبض وعدم وجود نزيف كبير قبل خياطة شق خط الوسط في الرقبة بعد إصلاح الأوعية الدموية.
الطريقة الحالية لها العديد من القيود. أولا ، هناك إمكانية لتكوين الصمات في موقع الخياطة ، مما قد يؤدي إلى مزيد من نقص تروية الدماغ إذا انفصلا. يجب النظر في هذا الخطر بعناية وإدارته في التجارب المستقبلية. ثانيا ، لم تراقب الدراسة وزن جسم الفئران ، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت الطريقة قد أثرت على تناولها للطعام. يعد تناول الطعام مؤشرا مباشرا على مزايا الطريقة ، ويمكن أن يوفر تقييمها رؤى قيمة. أخيرا ، تتطلب الطريقة الحالية الكفاءة الفنية في العمليات الجراحية المجهرية ، مما قد يحد من استخدامها على نطاق واسع دون التدريب والخبرة المناسبة.
باختصار ، في حين أن طريقة نمذجة MCAo توفر أهمية فسيولوجية عالية وسلامة هيكلية ، إلا أنها تأتي مع قيود يجب معالجتها من أجل تجربة أكثر قوة. يعد الحفاظ على السلامة التشريحية لأوعية الرقبة ومحاكاة عمليات السكتة الدماغية عن كثب لدى المرضى من نقاط القوة المهمة لهذه الطريقة. سيساهم هذا النهج بلا شك بشكل كبير في أبحاث السكتة الدماغية الإقفارية ، مما يحسن موثوقية ودقة النماذج التجريبية. في النهاية ، قد يؤدي هذا إلى عدد أقل من المجموعات التجريبية اللازمة لاختبار التأثيرات العلاجية ، مما يؤدي إلى نتائج تجريبية أكثر موثوقية.
ليس لدى المؤلفين أي مصالح متضاربة محتملة للإفصاح عنها.
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع إدخال الاستخبارات الأجنبية في مقاطعة خبي في عام 2023. نشكر ليزا كرينر ، دكتوراه ، من Liwen Bianji ، (Edanz) (www.liwenbianji.cn) ، على تحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 ٪ formalin | بكين Labgic التكنولوجيا المحدودة | BL913A | |
| 11-0 خيوط جراحية مجهرية | نينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة | 3/8 1 & مرات ؛ 5 | |
| 2،3،5-ثلاثي فينيلترازوليوم كلوريد (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 خياطة الحرير | نينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة. | 3-0 | |
| 4٪ إيزوفلوران | تيانجين Ringpu التكنولوجيا الحيوية المحدودة | 20221102 | |
| 6-0 خياطة الحرير | نينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة | 6-0 | |
| 70 ٪ الإيثانول | شاندونغ ليركانج التكنولوجيا الطبية المحدودة | 20230408 | |
| خيوط | شينونج تكنولوجيز المحدودة | 2838-A5 | |
| الكيتامين | جيانغسو Hengrui الصيدلانية المحدودة | 230613BL | |
| ذكور Sprague Dawley الفئران | جينان Pengyue التجريبية تربية المحدودة | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Microclips | Shanghai Jinzhong مصنع الأجهزة الطبية | W40150 | |
| مجهر | ZEISS | S100 OPMI بيكو | |
| صندوق التمريض | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co.، Ltd. | FYL-YS-100L | |
| زيلازين | سيجما | PHR3263 |
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن