يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج فئران لانسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط دون الإضرار بالتركيب التشريحي للأوعية الدماغية

1.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66635

⸱

مايو 17, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

في هذه المقالة

ملخص

يصف البروتوكول الحالي نموذج الفئران لانسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط الذي يحافظ على البنية التشريحية للأوعية الدماغية دون التسبب في ضرر.

الملخص

تعتبر السكتة الدماغية الإقفارية السبب الرئيسي للإعاقة والوفيات طويلة الأمد بين البالغين في جميع أنحاء العالم. ساهمت النماذج الحيوانية للسكتة الدماغية الإقفارية بشكل كبير في فهمنا لآلياتها المرضية وتطوير العلاجات المحتملة. في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان شائعتان تتضمنان تقنيات الخيوط (خياطة داخل الأوعية الدموية) للحث على نماذج حيوانية لنقص التروية الدماغية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لها قيود متأصلة ، مثل انخفاض نضح الدم في الدماغ ، وتلف نظام الشريان السباتي الخارجي ، وضعف تناول الطعام و / أو الماء ، والخلل الحسي في الوجه. تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتحفيز نموذج السكتة الدماغية الإقفارية للفئران دون المساس بتشريح الأوعية الدموية الدماغية. في هذه الدراسة ، تم الكشف عن الشريان السباتي المشترك (CCA) لفئران Sprague-Dawley ، وتم إجراء شق. ثم تم إدخال خيوط من خلال شق في الشريان السباتي الداخلي لإغلاق الشريان الدماغي الأوسط. بعد 1.5 ساعة من نقص التروية المستحث ، تمت إزالة خيوط الانسداد بالكامل من كل من الشريان السباتي الداخلي و CCA. تم خياطة الشق في CCA لاحقا باستخدام 11-0 خيوط جراحية مجهرية تحت المجهر (تكبير 4x). من خلال استخدام تقنيات الجراحة المجهرية لإصلاح CCA ، نجحت هذه الدراسة في تطوير طريقة فريدة للحث على نموذج السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران مع الحفاظ على السلامة التشريحية للأوعية الدموية الدماغية.

المقدمة

السكتة الدماغية ، السبب الرئيسي للوفاة والخلل الوظيفي العصبي طويل الأمد لدى البالغين في جميع أنحاء العالم ، تشمل أنواعا مختلفة ، حيث تمثل السكتة الدماغية حوالي 81.9٪ من الحالات ، بينما يمثل النزيف الدماغي والنزيف تحت العنكبوتية 14.9٪ و 3.1٪ على التوالي< فئة الدعم = 'xref'>1. غالبا ما تنتج السكتة الدماغية الإقفارية عن تصلب الشرايين أو انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCA) ، مما يؤدي إلى انخفاض تدفق الدم الدماغي الموضعي وتلف الدماغ اللاحق. يؤدي هذا الانخفاض في إمدادات المغذيات للخلايا الإقفارية إلى استنفاد الطاقة ، مما يتسبب في فقدان سلامة الغشاء وتورم الخلايا والتحلل في نهاية المطاف. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم عوامل مثل زيادة الكالسيوم داخل الخلايا ، وإطلاق الأحماض الأمينية المثيرة ، وزيادة إنتاج الجذور الحرة ، وتنشيط الخلايا الالتهابية في إصابة أنسجة المخ بعد السكتة الدماغية < فئة sup = 'xref'>2.

أهداف علاج السكتة الدماغية الإقفارية متعددة الأوجه: تقليل الضرر العصبي المستمر وتقليل الوفيات والإعاقة طويلة الأمد ؛ منع المضاعفات الناشئة عن عدم الحركة والخلل العصبي ؛ وتقليل خطر تكرار السكتة الدماغية. نظرا لتعقيد الفيزيولوجيا المرضية للسكتة الدماغية الإقفارية ، فإن نموذج السكتة الدماغية القوي ضروري للبحث والتطوير للعلاجات التي تستهدف السكتة الدماغية الإقفارية.

حاليا ، انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAo) هو نموذج حيواني شائع للسكتة الدماغية الإقفارية < sup class = 'xref'>3. عادة ما يتم إجراء MCAo عن طريق إدخال خيوط أحادية ذات رأس من السيليكون أو مخففة باللهب من خلال الأوعية العنقية حتى تصل إلى أصل الشريان الدماغي الأوسط (MCA). في عام 1986 ، طور كويزومي وزملاؤه تقنية تنطوي على إدخال خيوط أحادية ذات رأس من السيليكون من خلال شق في الشريان السباتي المشترك (CCA) ، مما يسمح لها بالوصول إلى مدخل MCA ومنع تدفق الدم < فئة sup = 'xref'>4. في عام 1989 ، أبلغت مجموعة لونجا عن طريقة MCAo أخرى تضمنت إدخال خيوط أحادية من خلال شق في الشريان السباتي الخارجي (ECA). ثم يجتاز الشعيرات الأحادية تشعب الشريان السباتي الداخلي (ICA) و ECA قبل الوصول إلى نقطة البداية لفئة MCA5.

قيود الطريقتين الحاليتين لحث MCAo واضحة. تتطلب طريقة Koizumi انسدادا دائما ل CCA المماثل ، مما يؤدي إلى تقليل نضح MCA لأن إعادة التروية تعتمد فقط على دائرة Willis4. على العكس من ذلك ، تتضمن طريقة Longa قطع ECA ، مما يؤدي إلى تلف نظام ECA وضعف لاحق في وظيفة عضلات الوجه< فئة sup = 'xref'>5. يمكن أن يؤثر هذا الضرر على تناول الطعام والماء ، وكذلك يسبب خللا حسيا للوجه ، مما يؤثر على إعادة التأهيل وتقييم الوظيفة العصبية بعد السكتة الدماغية الإقفارية < فئة الدعم = 'xref'>6.

يسعى البروتوكول الحالي إلى معالجة هذه القيود من خلال تطوير طريقة جديدة للحث على نموذج السكتة الدماغية الإقفارية دون الإضرار بالبنية التشريحية للأوعية الدماغية. يستخدم هذا النهج الجديد تقنيات الجراحة المجهرية لإصلاح CCA ، وبالتالي تجنب العيوب المرتبطة بالطرق السابقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

حصل الإجراء التجريبي على موافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة يانتاي (رقم الموافقة: YTDX20230410) والتزم بإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تم استخدام ذكور فئران Sprague-Dawley التي يتراوح وزنها بين 300-350 جم في هذه الدراسة. يتم توفير قائمة شاملة بالحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير

  1. ضع في بيئة تحافظ على دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ، ودرجة حرارة ورطوبة مضبوطة ضمان حصولهم على الغذاء والماء دون قيود.
< ص الفئة = "jove_title" >2. التخدير

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بخليط يحتوي على الكيتامين (80 مجم / كجم) والزيلازين (20 مجم / كجم).
    ملاحظة: قم بإمالة رأس وجسم الفئران لأسفل. يقع موقع الحقن في الربع الأيمن السفلي من البطن للحيوان. اسحب المكبس للخلف قبل الحقن. متوسط حجم الحقن 0.4 مل.
  2. تأكيد تحريض التخدير من خلال تقييم منعكس الانسحاب للمخلب الخلفي وانعكاس الوميض. إذا لم يتم تحقيق عمق كاف للتخدير ، استكمل مع الأيزوفلوران أثناء العملية الجراحية.
< p class = "jove_title" >3. إجراء النمذجة الإقفارية

  1. تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف. تطهير طاولات التشغيل والمعدات ذات الصلة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  2. جهز موقع الجراحة عن طريق حلق الفراء حول موقع الشق المتوقع. تطهير الجلد في موقع الجراحة ثلاث مرات بالبيتادين و 70٪ الإيثانول.
  3. قم بعمل شق خط الوسط على الجانب البطني ، بطول 1.5 سم تقريبا ، وافتح اللفافة السطحية.
  4. قم بإجراء تشريح حاد وغير حاد لفضح الشريان السباتي الخارجي (ECA) والشريان السباتي الداخلي (ICA) والشريان السباتي المشترك (CCA) وفقا للطريقة الموضحة سابقا< فئة sup = "xref">7.
  5. ضع ثلاث خيوط حريرية 4-0 حول CCA وخياطة حريرية أخرى من خلال ECA بالقرب من تشعب ICA. اربط عقدة انزلاق قابلة للإطلاق على CCA القريب. شد الخيط على CCA البعيد باستخدام hemostat لمنع تدفق الدم. اربط عقدة انزلاق أخرى بشكل غير محكم حول CCA أثناء الخياطة لضمان عدم انسداد الوعاء.
    ملاحظة: تأكد من أن عقدة الانزلاق ليست ضيقة بشكل مفرط ، وكافية فقط لمنع تدفق الدم ، حيث ستحتاج إلى إطلاقها أثناء خياطة الأوعية الدموية.
  6. قم بعمل شق 0.5 مم بين خياطة الحرير القريبة والخياطة الوسطى على CCA باستخدام المقص.
    ملاحظة: تأكد من أن الشق يسمح للفتيل (الطرف المطلي بالسيليكون) بالدخول إلى CCA.
  7. أدخل خيوطا بطول 3 سم من 4-0 (طرف مطلي بالسيليكون) في CCA. شد خيوط الحرير حول CCA لتأمين الفتيل داخل اللمعة ومنع النزيف ؛ ثم قم بإزالة الخيط من CCA البعيد.
  8. استمر في إدخال الفتيل في تجويف MCA ، والتحكم في الغرز حول ECA لضمان عدم دخول الفتيل إلى ECA. عادة ما يتراوح طول الإدخال من 18 مم إلى 20 مم.
  9. ابدأ مؤقتا وسجل الوقت الذي يبدأ فيه الانسداد. قم بخياطة شق الرقبة ب 3-0 خيوط حريرية وضع بعناية في قفص الاسترداد. تطبيق 0.5 مل من المحلول الملحي العادي داخل الصفاق.
فئة

4. خياطة الجراحة المجهرية ل CCA

  1. إعادة تخدير الفئران بعد 1.5 ساعة من نقص التروية. تطهير موقع الشق ثلاث مرات باستخدام 70٪ من الإيثانول وأعد فتح الشق.
  2. اسحب خيوط الانسداد برفق حتى يظهر الطرف الأبيض بوضوح بالقرب من شق CCA. ضع مشبكا صغيرا أفقيا بالقرب من عقدة الخياطة داخل اللمعة الآمنة بالقرب من تشعب CCA.
    ملاحظة: تجنب تثبيت طرف الفتيل الأبيض لمنع انفصال السيليكون والتخثر اللاحق.
  3. حرر عقدة الخياطة المؤمنة داخل اللمعة وقم بإزالة الفتيل تماما.
  4. ضع مشبك صغير آخر بالقرب من جانب نهاية القلب من عقدة CCA القريبة. بعد ذلك ، قم بإزالة عقدة الخياطة حول CCA القريب.
    ملاحظة: يعد الوضع الصحيح للمشابك أمرا بالغ الأهمية لرفع الأوعية الثابتة في خطوات لاحقة لتسهيل خياطة الأوعية الدموية الدقيقة. ضع المشابك أفقيا على العضلات المحيطة لمنع الانزلاق.
  5. اشطف موقع الشق بمحلول ملحي عادي وجفف المنطقة بكرة قطنية معقمة لإزالة الدم وتحقيق مجال جراحي واضح.
  6. تحت المجهر (تكبير 4x) ، قم بخياطة شق CCA باستخدام 11-0 خيوط جراحية مجهرية بنمط متقطع ، وعادة ما تتطلب غرزتين اعتمادا على حجم الشق.
  7. بعد الخياطة ، قم بإزالة المشابك الدقيقة من طرفي CCA لاستعادة تدفق الدم.
  8. ضع الضغط بكرة قطنية معقمة على موقع خياطة CCA لمدة 30 ثانية. راقب CCA لمدة دقيقتين لضمان عدم حدوث نزيف. قم بخياطة شق رقبة الفئران وضع في صندوق رعاية بدرجة حرارة 35 درجة مئوية لاستعادة التخدير قبل إعادته إلى القفص.
    ملاحظة: يتم تطبيق ميلوكسيكام داخل الصفاق بجرعة 2 ملغ/كغ لتسكين الألم التالي للجراحة.
فئة < ص = "jove_title" >5. تلطيخ بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيلترازوليوم (TTC)

  1. بعد ثلاثة أيام من نقص التروية وإعادة التروية ، قم بالقتل الرحيم للحيوانات تحت التخدير العميق باستخدام 4٪ من الأيزوفلوران وخلع عنق الرحم.
  2. قم بإزالة الأدمغة وتقطيعها إلى أقسام إكليلية بسمك 2 مم باستخدام شفرة مشرط < فئة sup = "xref" >8.
  3. احتضان أقسام الدماغ بنسبة 2٪ TTC لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. اشطف أقسام الدماغ مرتين بالفورمالين بنسبة 10٪ ، ثم ثبتها بالفورمالين بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. التقط صورا رقمية للشرائح المتتالية وقم بقياس مناطق الاحتشاء كميا باستخدام برنامج Image J.
< p class = "jove_title" >6. اختبار الوظيفة العصبية

ملاحظة: تم تقييم الوظيفة العصبية باستخدام اختبار Garcia ، بعد تقرير سابق < sup class = "xref" >9.

  1. تقييم النشاط التلقائي ، والتناسق في حركة الأطراف الأربعة ، وتمدد القدم الأمامي ، والتسلق ، واستقبال الجسم ، والاستجابة للمس الاهتزاز. قم بتعيين الدرجات بناء على معايير اختبار جارسيا ، بحد أقصى 18 نقطة تشير إلى الوظيفة العصبية الطبيعية.
< p class = "jove_title" >7. التحليل الإحصائي

  1. استخدم GraphPad Prism لإجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار Student's t. عبر عن البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري. ضع في اعتبارك الاختلافات بين المتوسطات ذات دلالة إحصائية إذا < P 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عملية الخياطة المجهرية
سُحب الخيط من بالقرب من شق الشريان السباتي المشترك (CCA) حتى ظهر طرف الخيط الأبيض (الشكل 1A). ثم وُضعت ملاقط مجهرية على الشريان السباتي المشترك (CCA) (الشكل 1B). وتحت المجهر بتكبير 4x، خُيط شق الشريان السباتي المشترك (CCA) باستخدام خيوط جراحية مجهرية وفق نمط الغرز المتقطعة (الشكل 1C). بعد ذلك، أُزيلت الملاقط المجهرية من الشريان السباتي المشترك (CCA)، مما أدى إلى استعادة البنية التشريحية وت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

MCAo هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لإنشاء نماذج حيوانية للسكتة الدماغية ، وتكرار عملية السكتة الدماغية التي لوحظت بشكل فعال في المرضى عن طريق استعادة تدفق الدم بعد نقص تروية10،11،12. طور مختبرنا نموذجا للسكتة الدماغية الإقفارية يتيح إعادة التروية من CCA دون التسبب في تلف ECA. بعد تحريض نقص التروية ، يتم إجراء إصلاح جراحي مجهري ل CCA. على الرغم من عدم إجراء القياس المباشر لتدفق الدم CCA ، لاحظ المجربون نبضات الأوعية الدموية في C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي مصالح متضاربة محتملة للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع إدخال الاستخبارات الأجنبية في مقاطعة خبي في عام 2023. نشكر ليزا كرينر ، دكتوراه ، من Liwen Bianji ، (Edanz) (www.liwenbianji.cn) ، على تحرير النص الإنجليزي لمسودة هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 ٪ formalinبكين Labgic التكنولوجيا المحدودةBL913A
11-0 خيوط جراحية مجهريةنينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة3/8 1 & مرات ؛ 5
2،3،5-ثلاثي فينيلترازوليوم كلوريد (TTC)SIGMAT8877
3-0 خياطة الحريرنينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة.3-0
4٪ إيزوفلوران    تيانجين Ringpu التكنولوجيا الحيوية المحدودة20221102
6-0 خياطة الحريرنينغبو الطبية خياطة إبرة المحدودة6-0
70 ٪ الإيثانولشاندونغ ليركانج التكنولوجيا الطبية المحدودة20230408
خيوطشينونج تكنولوجيز المحدودة2838-A5
الكيتامين   جيانغسو Hengrui الصيدلانية المحدودة230613BL
ذكور Sprague Dawley الفئرانجينان Pengyue التجريبية تربية المحدودةSCXK (Lu) 20190003
MicroclipsShanghai Jinzhong مصنع الأجهزة الطبيةW40150
مجهرZEISSS100 OPMI بيكو
صندوق التمريضBeijing Fuyi Electrical Appliance Co.، Ltd.FYL-YS-100L
زيلازينسيجماPHR3263

المراجع

  1. Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
  2. Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
  3. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  7. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
  8. Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
  9. Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
  10. Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
  11. Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
  12. Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
  13. Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
  14. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  15. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  16. Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج السكتة الدماغية الإقفاريةنموذج السكتة الدماغية في الجرذانسلامة الأوعية الدماغيةنقص التروية المستحث بالخيطتقنيات الجراحة المجهريةالشريان السباتي المشتركإصابة إعادة الترويةصبغ TTCقياس حجم الاحتشاء
نموذج فئران لانسداد / إعادة تروية الشريان الدماغي الأوسط دون الإضرار بالتركيب التشريحي للأوعية الدماغية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.