Method Article

القياس الكمي لنشاط نظام إفراز اليرسينيا الكاذب من النوع الثالث بعد تجويع الحديد والنمو اللاهوائي

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستعمر البكتيريا الأنسجة المضيفة التي تختلف في التوافر البيولوجي للأكسجين والحديد ، ومع ذلك فإن معظم طرق دراسة البكتيريا تستخدم وسائط غنية بالهواء يصف هذا البروتوكول استزراع العامل الممرض البشري Yersinia pseudotuberculosis تحت تركيزات متفاوتة من الحديد وتوتر الأكسجين ، وتحديد نشاط نظام إفراز Yersinia من النوع الثالث ، وهو عامل ضراوة مهم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

آلية الفوعة الرئيسية للعديد من مسببات الأمراض سالبة الجرام هي نظام الإفراز من النوع الثالث (T3SS) ، وهو ملحق يشبه الإبرة ينقل بروتينات المستجيبة السامة للخلايا أو المناعية إلى الخلايا المضيفة. يعد T3SS هدفا لحملات اكتشاف مضادات الميكروبات لأنه يمكن الوصول إليه خارج الخلية وغائب إلى حد كبير عن البكتيريا غير المسببة للأمراض. أظهرت الدراسات الحديثة أن T3SS من يرسينيا والسالمونيلا يتم تنظيمها بواسطة عوامل تستجيب للحديد والأكسجين ، وهي إشارات مهمة خاصة بمتخصصة تتم مواجهتها أثناء عدوى الثدييات. الموصوفة هنا هي طريقة لتجويع الحديد من مرض اليرسينيا الكاذب ، مع مكملات اختيارية لاحقة من الحديد غير العضوي. لتقييم تأثير توافر الأكسجين ، يتم عرض عملية تجويع الحديد هذه في كل من الظروف الهوائية واللاهوائية. أخيرا ، يؤدي احتضان الثقافات عند درجة حرارة مضيف الثدييات البالغة 37 درجة مئوية إلى تحفيز تعبير T3SS ويسمح بالقياس الكمي لنشاط Yersinia T3SS عن طريق تصور بروتينات المستجيب التي يتم إطلاقها في المادة الطافية. تقدم الخطوات المفصلة هنا ميزة على استخدام مخلبات الحديد في حالة عدم وجود تجويع للحديد ، وهو أمر غير كاف لإحداث تجويع قوي للحديد ، ويفترض أن يكون ذلك بسبب أنظمة امتصاص الحديد والكسح الفعالة Yersinia . وبالمثل ، يتم تفصيل الأواني الزجاجية المختبرية لغسل الأحماض لضمان إزالة الحديد المتبقي ، وهو أمر ضروري لإحداث تجويع قوي للحديد. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف استخدام عامل مخلب لإزالة الحديد المتبقي من الوسائط ، وزراعة البكتيريا لعدة أجيال في حالة عدم وجود الحديد لاستنفاد مخازن الحديد البكتيرية. من خلال دمج البروتوكولات القياسية لترسيب البروتين الناجم عن حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، و SDS-PAGE ، وتلوين الفضة ، يوضح هذا الإجراء طرقا يمكن الوصول إليها لقياس نشاط T3SS. في حين أن هذا الإجراء محسن ل Y. pseudotuberculosis ، فإنه يوفر إطارا للدراسات في مسببات الأمراض ذات أنظمة امتصاص الحديد القوية المماثلة. في عصر مقاومة المضادات الحيوية ، يمكن توسيع هذه الطرق لتقييم فعالية المركبات المضادة للميكروبات التي تستهدف T3SS في ظل الظروف ذات الصلة بالمضيف.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقوم العديد من مسببات الأمراض سالبة الجرام ذات الصلة سريريا مثل اليرسينيا والفيبريو والإشريكية والسودوموناس والشيغيلا بتشفير نظام إفراز النوع الثالث (T3SS) لحقن بروتينات المستجيب في الخلاياالمضيفة 1. في العديد من الأنواع البكتيرية ، يخضع T3SS لرقابة تنظيمية صارمة2. على سبيل المثال ، يعد نقل بروتينات المستجيب Yersinia T3SS إلى الخلايا المضيفة المستهدفة أمرا بالغ الأهمية لتخريب آليات دفاع المضيف وتمكين الاستعمار البكتيري للأنسجة المضيفة. ومع ذلك ، فإن نشاط Yersinia T3SS مرهق من الناحية الأيضية ويمكن أن يؤدي إلى التعرف على المستقبلات المناعية للمضيف3. وفقا لذلك ، يتحكم المنظمون الذين يستشعرون إشارات بيئية محددة في التعبير عن جينات T3SS في العديد من الأنواع البكتيرية. نظرا لأن مسببات الأمراض مثل يرسينيا تتعرض لتغيرات بيئية خلال دورة العدوى التي تؤثر على التعبير عن عوامل الفوعة الحرجة ، فمن المهم تطوير ظروف معملية تحاكي السمات البارزة لمنافذ المضيف التي تشغلها مسببات الأمراض البكتيرية. على وجه التحديد ، يختلف توتر الأكسجين وتوافر الحديد بين مواقع الأنسجة المختلفة بطريقة زمانية مكانية ويؤثران على التعبير عن جينات الفوعة مثل T3SS4،5،6. لذلك ، فإن الهدف من هذه الطريقة هو تقييم كيفية تأثير الأكسجين والحديد على التعبير عن Yersinia T3SS. سيوفر هذا نظرة ثاقبة لديناميكيات التفاعل بين المضلع والممرض.

توضح الطريقة الموضحة هنا بالتفصيل كيفية استزراع مرض اليرسينيا الكاذب الهوائية واللاهوائية ، بالإضافة إلى كيفية استنفاد مخازن الحديد في اليرسينيا أثناء النمو الهوائي أو اللاهوائي. هناك بعض الاعتبارات المهمة التي تم تسليط الضوء عليها هنا فيما يتعلق بزراعة البكتيريا بنجاح في ظل هذه الظروف المتغيرة. أولا ، تتطلب الزراعة اللاهوائية مكملات إضافية للجلوكوز ، وهو تعديل ملاحظ في وصفة الوسائط. ثانيا ، نظرا لأن Y. pseudotuberculosis يستخدم siderophores وأنظمة امتصاص الحديد الأخرى التي يمكنها استخراج الحديد بقوة من البيئة ، يتم تكريس اهتمام خاص لضمان خلو وسائط الاستزراع والأواني الزجاجية المختبرية من الحديد قدر الإمكان7. استخدمت الدراسات السابقة مخلبات الحديد مثل ديبيريديل لاستنفاد الحديد من المزارع البكتيرية الغنية بالوسائط لتقليد تجويع الحديد8،9. ومع ذلك ، فإن استنفاد مخازن الحديد اليرسينيا للحث على تجويع الحديد يتطلب إزالة الحديد المتبقي في الأواني الزجاجية والوسائط بالإضافة إلى النمو المطول في حالة عدم وجود الحديد. يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية غسل الأواني الزجاجية بالحمض ووسائط المخلب لإزالة الحديد المتبقي ، بالإضافة إلى زراعة البكتيريا لعدة أجيال لضمان تجويع الحديد الشامل. يمكن ضمان تجويع الحديد عن طريق قياس مستويات النسخ النسبية للجينات المستجيبة للحديد المميزة جيدا عبر الظروف ، كما هو موضح هنا مع yfeA و bfd.

يوضح تتويج هذا البروتوكول كيفية ترسيب بروتينات المستجيب T3SS المفرزة من كل حالة من هذه الحالات عن طريق معالجة المادة الطافية المزروعة بحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) وتصور البروتينات المفرزة من خلال SDS-PAGE. أخيرا ، يتم تقييم نشاط T3SS النسبي من خلال تصور البروتينات المفرزة عن طريق تلطيخ الفضة وتحديد المستويات النسبية لبروتينات المستجيب T3SS ، والتي يشار إليها باسم بروتينات Yersinia الخارجية (Yops) 10.

تستخدم فحوصات نشاط T3SS عموما أجساما مضادة محددة للكشف عن مستويات بروتين المستجيب T3SS في المادة الطافية للثقافة. ومع ذلك ، غالبا ما تكون الأجسام المضادة الغربية للنشاف لبروتينات المستجيب T3SS غير متوفرة تجاريا. لذلك ، تم إيلاء اهتمام خاص للتأكد من أن التصور النهائي لنشاط T3SS في هذه الطريقة لا يتطلب أجساما مضادة محددة ، وبدلا من ذلك يمكن الاستفادة من تلطيخ الفضة ، مما يسمح بتصور جميع البروتينات المفرزة. في حين أن هذه الطريقة مصممة خصيصا ومحسنة ل Y. pseudotuberculosis ، إلا أنه يمكن تكييفها مع الأنواع البكتيرية الأخرى ، على الرغم من أن ظروف الوسائط الدقيقة وأوقات الحضانة ستختلف.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد تفاصيل الكواشف وتكوين الوسائط وتسلسلات التمهيدي والمعدات في جدول المواد. يوضح الشكل 1 سير العمل التجريبي الشامل.

1. تحضير الأواني الزجاجية المغسولة بالحمض ووسائط M9 المخلبة

ملاحظة: قبل البدء ، راجع قسم المواد للحصول على الكواشف والوصفات الدقيقة التي سيتم استخدامها. تم استخدام وسائط M9 لأول مرة في فحوصات Yersinia T3SS في Cheng et al.11.

  1. صب 100 مل من 6 نيوتروكلوريك حمض الهيدروكلوريك في قارورة زجاجية سعة 250 مل.
    تنبيه: حمض الهيدروكلوريك خطير للغاية. تأكد من اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع هذه المادة.
  2. أغلق فم الحاوية الزجاجية بسدادة زجاجية وقم بتدوير القارورة بعناية لمدة 1 دقيقة لتوزيع حمض الهيدروكلوريك جيدا ، مع تغيير الاتجاهات في بعض الأحيان.
  3. تخلص من 6 N HCl بشكل مناسب.
  4. اشطف الوعاء الزجاجي بإضافة 100 مل من H2O منزوع الأيونات ، وإغلاق الفم ، ورجها لمدة 20 ثانية ، ثم تفريغ الماء.
  5. كرر خطوة الشطف لمدة 3 مرات.
  6. دع الهواء يجف. الأوتوكلاف للتعقيم.
  7. لاستخلاص الوسائط ، امزج مكونات M9 مع الكاشف المخلب وحركها بقضيب تحريك مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 18 ساعة. قم بتصفية وتعقيم وإضافة MgSO4 إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملليمتر.

2. زراعة Y. الكاذب تحت مستويات متفاوتة من الحديد وتوتر الأكسجين

  1. Streak Y. pseudotuberculosis (يستخدم سلالة IP2666pIB1 في هذه الدراسة) على ألواح أجار Lysogeny Broth (LB) وتحتضن في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يؤدي احتضان اليرسينيا عند 37 درجة مئوية ، خاصة في وسط الكالسيوم المنخفض ، إلى نشاط T3SS ، وتوقف النمو ، ويختار في النهاية فقدان البلازميد ل Yersinia virulence (pYV) الذي يشفر T3SS12. لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول حضانة 26 درجة مئوية من اليرسينيا حتى يحتاج نشاط T3SS إلى القياس.
  2. بعد 48 ساعة ، بمجرد تشكيل مستعمرات مرئية ، قم بتلقيح 4 مل من وسائط M9 التي تحتوي على 0.2٪ جلوكوز ، 1 مجم / لتر FeSO4.7H 2O ، واستكمالها بأحماض الكازامينو (يشار إليها هنا باسم M9 media) من مستعمرة واحدة معزولة ومزرعة بين عشية وضحاها عند 26 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة تقريبا.
    ملاحظة: استخدم الأواني الزجاجية المغسولة بالحمض بدءا من الخطوة التالية والمضي قدما.
  3. الثقافة الفرعية في وسائط M9 المخلبة باتباع الخطوات أدناه.
    ملاحظة: بالنسبة لجميع الخطوات اللاحقة ، يتم استخدام وسائط M9 التي تحتوي على 0.9٪ جلوكوز بدلا من الجلوكوز القياسي 0.2٪.
    1. باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بقياس الكثافة البصرية (OD600) للثقافة الليلية.
    2. تمييع المزرعة الليلية إلى قيمةOD 600 البالغة 0.1 في المجموع 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة التي تحتوي على 0.9٪ غلوكوز وبدون FeSO 4.7H 2O في قارورة مغسولة بالحمض سعة 250 مل بدون مكملات الحديد.
    3. احتضن لمدة 8 ساعات عند 26 درجة مئوية مع تهوية عند 250 دورة في الدقيقة.
  4. الاستزراع الفرعي في الثقافات الهوائية واللاهوائية بالتوازي.
    1. قم بقياس OD600 للثقافات المتنامية.
    2. لاستمرار الحضانة الهوائية، استزراع المزارع المتنامية إلى قيمة OD600 بقيمة 0.1 في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة التي تحتوي على 0.9٪ غلوكوز وبدون FeSO4.7H 2O في قارورة مغسولة بالحمض سعة 250 مل وزراعتها مع التهوية عند 26 درجة مئوية لمدة 12 ساعة دون التكملة بالحديد.
    3. للاستزراع اللاهوائي ، استزراع فرعي إلى قيمة OD600 تبلغ 0.1 في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة في أنبوبين زجاجيين مغسولين بالحمض. في الأنبوب الأول ، أضف معقما بالترشيح (باستخدام غشاء بولي إيثر سلفون 0.22 ميكرومتر) FeSO4.7H 2O للحصول على تركيز نهائي قدره 1 مجم / لتر (يشار إليه باسم "الحديد العالي"). في الأنبوب الثاني ، أضف FeSO4.7H 2O للحصول على تركيز نهائي قدره 0.01 مجم / لتر (يشار إليه باسم "الحديد المنخفض"). يمكن القيام بذلك باستخدام محلول مخزون 10 مجم / مل FeSO 4.7H 2O. احتضان كلا الأنبوبين بشكل لاهوائي في غرفة لاهوائية في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
      ملاحظة: يوفر 1 ملغم / لتر FeSO4.7H 2O ظروفا مليئة بالحديد لنمو يرسينيا قويا. على العكس من ذلك ، فإن إضافة 0.01 مجم / لتر فقط من FeSO4.7H 2O إلى المزارع اللاهوائية يضمن نموا كافيا في ظل الظروف اللاهوائية ولكنه لا يزال يتيح استجابات تجويع الحديد ، بينما تزرع المزارع الهوائية لمدة 12 ساعة في حالة عدم وجود أي حديد مضاف لتحفيز استجابات تجويع الحديد قبل تحفيز نشاط T3SS.
  5. تحفيز نشاط نظام الإفراز من النوع الثالث.
    1. قم بتحويل المزارع اللاهوائية إلى 37 درجة مئوية واستمر في الحضانة اللاهوائية لمدة 4 ساعات لتحفيز T3SS.
    2. قم بقياس OD600 لثقافة النمو الهوائي.
    3. في قواريرتين مغسولتين بالحمض ، قم بزراعة الثقافات التي تنمو هوائية إلى قيمة OD600 البالغة 0.2 في 14 مل من وسائط M9 المخلبة المعقمة. في القارورة الأولى ، أضف FeSO4.7H 2O المعقم بالترشيح للحصول على تركيز نهائي يبلغ 1 مجم / لتر. في القارورة الثانية ، أضف FeSO 4.7H 2O للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.01 مجم / لتر. احتضان كلا القارورتين بالتهوية عند 26 درجة مئوية عند 250 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين.
    4. بعد ساعتين ، قم بتحويل المزارع الهوائية إلى 37 درجة مئوية مع التهوية عند 250 دورة في الدقيقة واحتضانها لمدة 4 ساعات لتحفيز T3SS.

3. ترسيب حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) لبروتينات المستجيب T3SS

  1. بمجرد اكتمال الحضانة اللاهوائية ، قم بقياس OD600 من الثقافات.
  2. تطبيع جميع العينات اللاهوائية لتحقيق كتلة خلية متساوية (راجع المثال الوارد في الجدول 1). بالنسبة للزراعة اللاهوائية ، توقع عموما قيمة OD600 ~ 0.5 في الثقافات المتعطشة للحديد و ~ 1 للثقافات المليئة بالحديد. في هذه الحالة ، استخدم 6 مل من الثقافات المتعطشة للحديد و 3 مل من الثقافات المليئة بالحديد.
    ملاحظة: يمكن استخدام الثقافة المتبقية لأغراض أخرى ، مثل حصاد الحمض النووي الريبي الكلي واستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لقياس مستويات الحالة المستقرة من الرنا المرسال المستهدف (غير موصوف هنا).
  3. انقل الأحجام الطبيعية لكل ثقافة إلى أنابيب سعة 15 مل.
  4. للتحكم في كفاءة ترسيب البروتين المفرز ، أضف 4 ميكرولتر من 0.5 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) في كل أنبوب.
  5. مزارع الحبيبات عند 3200 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. قم بتوصيل مرشح PVDF 0.22 ميكرومتر بحقنة سعة 10 مل ، وقم بتصفية المادة الطافية لكل ثقافة حبيبية في أنبوب جديد سعة 15 مل.
    ملاحظة: تقلل خطوة الترشيح هذه من فرص نقل الخلايا البكتيرية الكاملة ، مما قد يؤدي إلى بروتينات سيتوبلازمية غير مرغوب فيها في العينة.
  7. أضف 10٪ من حجم المادة الطافية البالغة 6.1 N TCA إلى كل عينة.
  8. دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة. احتضان الأنابيب على الجليد في غرفة باردة 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يمكن تحسين مدة الحضانة بناء على الحاجة. يمكن أن تعمل الحضانة لمدة ساعة في الظروف أو السلالات التي يكون فيها الإفراز قويا.
  9. كرر جمع الحبيبات وخطوات هطول الأمطار TCA مع المزارع الهوائية بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: تطبيع المزارع الهوائية عن طريق تكوير الأحجام ذات كتلة الخلية المكافئة.
  10. أضف 2 مل من كل عينة إلى أنبوب جديد سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي عند 21,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  11. قم بشفط المادة المطفية باستخدام ملحق فراغ ، واحرص على عدم لمس الجزء السفلي أو جوانب الأنبوب.
    ملاحظة: قد يكون من الصعب تصور الحبيبات وقد تظهر على شكل ضباب على طول الأنبوب.
  12. كرر الخطوتين 3.10 و 3.11 حتى يتم ترسيب جميع محتويات كل تفاعل ترسيب في أنبوب واحد سعة 2 مل. قد يستغرق هذا ثلاث أو أربع خطوات متسلسلة للطرد المركزي ولكنه يسمح بتركيز جميع البروتينات المفرزة من كل عينة في أنبوب سعة 2 مل.
  13. لغسل الكريات ، أضف برفق 1 مل من الأسيتون المثلج بنسبة 100٪ في كل أنبوب. لتجنب فقدان العينة ، لا تقم بإعادة التعليق ولا تلمس جوانب الأنبوب.
  14. الطرد المركزي للعينات عند 21,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  15. استنشق المادة المطفية واحرص على عدم لمس الجزء السفلي أو جوانبو الأنبوب.
  16. كرر خطوتي غسيل الأسيتون المثلج 3.13 و 3.14.
  17. بعد شفط المادة الطافية للمرة الأخيرة ، افتح الأنابيب واترك الحبيبات تجف تماما على المقعد لمدة 1 ساعة تقريبا.
  18. أضف 50 ميكرولتر من FSB: محلول DTT إلى كل عينة مجففة. لتجنب فقدان البروتين ، لا تقم بتعليقه.
  19. قم بتدوير كل عينة جيدا لمدة 1 دقيقة ، مما يضمن أن محلول FSB: DTT يغطي جدران الأنبوب بأكمله. يمكن تحسين ذلك باستخدام ملحق دوامة قادر على حمل أنابيب متعددة في وقت واحد.
  20. اغلي العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  21. الطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة.
  22. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام المستقبلي.

4. SDS-PAGE وتلوين الفضة لتصور بروتينات المستجيب T3SS

  1. قم بتحميل 15 ميكرولتر من كل عينة لاهوائية و 10 ميكرولتر من كل عينة هوائية في هلام SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ ، جنبا إلى جنب مع 3 ميكرولتر من معيار غير ملوث متاح تجاريا كسلم.
  2. قم بتشغيل الجل لمدة 90 دقيقة عند 100 فولت. يمكن أن تختلف هذه الإعدادات حسب الجهاز المستخدم.
  3. اتبع بروتوكول تلطيخ الفضة باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، مما ينتج عنه هلام ، كما هو موضح في الشكل 2.

5. تحديد نشاط T3SS النسبي

  1. ضع الجل في نظام التصوير ، مع التأكد من أن جميع الأشرطة المخصصة للقياس الكمي موجودة في إطار الصورة.
    ملاحظة: الوزن الجزيئي ل BSA هو ~ 66 كيلو دالتون ، في حين أن الوزن الجزيئي لبروتين المستجيب T3SS YopE هو ~ 23 كيلو دالتون.
  2. في البرنامج ، حدد جميع نطاقات YopE عبر جميع الآبار.
  3. اضبط نطاق YopE المرجعي على العينة المناسبة.
  4. تصدير قيم القياس الكمي النسبية المحسوبة بواسطة البرنامج لجميع نطاقات YopE.
  5. بالعودة إلى البرنامج ، حدد جميع نطاقات BSA عبر جميع الآبار.
  6. قم بتعيين نطاق BSA المرجعي للتأكد من أنه من نفس العينة مثل نطاق YopE المرجعي.
  7. تصدير قيم القياس الكمي النسبية المحسوبة بواسطة البرنامج لجميع نطاقات BSA.
  8. لحساب مستويات تعبير YopE النسبية، اقسم قيمة الكمية النسبية YopE على قيمة الكمية النسبية ل BSA لكل عينة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح هذه الطريقة بالمقارنة النسبية ل Yops المفرز عبر ظروف مختلفة بالنسبة للحالة المرجعية ذات الاهتمام. يتم تصوير سير العمل التجريبي العام في الشكل 1. يصور الجدول 1 تمثيلا لكيفية حدوث تطبيع زراعة الخلية عادة في حالة كل حالة مزرعة وحجم TCA الذي سيتم إضافته إلى كل طاف. هنا ، يتم عرض النتائج التمثيلية باستخدام النوع البري (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 بالإضافة إلى اثنين من الطفرات المنشأة ، ΔyscNU و ΔyopE. يتم استخدام طفرة ΔyopE كعنصر تحكم يفتقر إلى YopE ، بينما يتم استخدام متحولة ΔyscNU كعنصر تحكم سلبي كامل في T3SS لأنه غير قادر على تجميع T3SS وظيفي13،14. تم تصوير صورة تمثيلية لجل SDS-PAGE مصبوغ بالفضة بنسبة 12.5٪ يحتوي على البروتينات المفرزة في الشكل 2. كما هو موضح أعلاه ، احتوت كل عينة على BSA مسنن كعنصر تحكم في كفاءة ترسيب البروتين. عند تحليل البيانات ، يجب التعامل مع مجموعات البيانات اللاهوائية والهوائية كمجموعات بيانات مستقلة حيث تم تطبيع كل منها على حدة. في العينات اللاهوائية ، كان هناك ~ 38 ضعفا أكثر من YopE في عينات الحديد المنخفضة بالنسبة لعينات الحديد العالية ، بما يتفق مع النتائج السابقة15،16. في العينات الهوائية ، لوحظت كمية مماثلة من YopE المفرز في عينات الحديد المنخفضة والعالية ، بما يتفق مع النتائج السابقة16. بشكل عام ، يتم استخدام ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل حالة لإثبات الدلالة الإحصائية.

للتأكد من أن هذا البروتوكول يؤدي إلى تجويع الحديد الكافي ، تم إجراء تحليل qPCR على الجينات المستجيبة للحديد yfeA و bfd في سلالة النوع البري في جميع الظروف. YfeA هو بروتين الربط المحيط بالبلازمي لنظام نقل ABC المسؤول عن نقل الحديد ، في حين أن Bfd عبارة عن فيريدوكسين مرتبط بالبكتيريا يشارك في تعبئة مخازن الحديد17،18،19،20. تم عزل الحمض النووي الريبي كما هو موضح سابقا21 ، وكما هو متوقع ، تم تنظيم yfeA و bfd بشكل كبير في الظروف المستنفدة للحديد بالنسبة للظروف المليئة بالحديد ، سواء الهوائية أو اللاهوائية ، كما هو موضح في الشكل 3. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بقياس مستويات الحالة المستقرة yopE mRNA باستخدام qPCR لتأكيد أن النتائج المرصودة ل YopE النسبي على مستوى البروتين كانت متوافقة مع مستويات نسخة yopE (انظر الشكل 3).

أخيرا ، نظرا لأن البكتيريا عرضة للتحلل في ظروف الاستزراع المجهدة ، فقد كان من المهم إظهار أن الخطوات الواردة في هذا البروتوكول لا تؤدي إلى تحلل بكتيري يمكن أن يربك النتائج. لتأكيد ذلك ، خضعت عينات الطاف المترسبة من TCA للنشاف الغربي وتم فحصها من أجل YopE و RpoA ، وهي وحدة فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي وبروتين سيتوبلازمي. كما هو موضح في الشكل 4 ، بينما اتبع نمط تعبير YopE ما هو موضح في الشكل 3 ، لم يكن هناك دليل على وجود RpoA في عينة الطاف ، مما يشير إلى عدم وجود تحلل ملحوظ من شأنه أن يطلق RpoA السيتوبلازمي في المادة الطافية.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل التجريبي لزراعة مرض اليرسينيا الكاذب في ظل توافر الحديد والأكسجين المتفاوت. تمثيل رسومي لخطوات الاستزراع. لاحظ أنه يجب استخدام الأواني الزجاجية المغسولة بالحمض بدءا من اليوم 4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: نتائج جل SDS-PAGE الملون بالفضة بنسبة 12.5٪ من البروتين المترسب ب TCA من المواد الطفية المزروعة. تم تحميل المواد الطافية المترسبة على جل SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ وملطخ بالفضة. (أ) ملف إفراز سلالات WT و ΔyscNU و ΔyopE التي نمت بشكل لاهوائي تم تطبيع القيم النسبية التمثيلية ل YopE إلى عينة WT اللاهوائية المليئة بالحديد. (ب) ملف إفراز سلالات WT و ΔyscNU و ΔyopE التي تنمو بهوائيا. تم تطبيع القيم النسبية التمثيلية ل YopE إلى عينة WT الهوائية المليئة بالحديد. تشير الأسهم البيضاء إلى YopE (~ 23 كيلو دالتون). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تظهر مستويات mRNA النسبية للجينات المستجيبة للحديد تجويع الحديد. تم عزل الحمض النووي الريبي من WT Y. داء كاذب مزروع في الظروف الموضحة في الشكل 1. تم استخدام qPCR لقياس التعبير النسبي لمستويات yfeA و bfd و yopE التي تم تطبيعها إلى 16S rRNA في الظروف اللاهوائية (A-C) والهوائية (D-F). **** ص < 0.0001 كما هو محدد بواسطة اختبار t غير متزاوج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: يوضح نقص RpoA السيتوبلازمي في عينات الطاف عدم وجود تحلل الخلايا في ظروف الاستزراع. تم تشغيل 5 ميكرولتر من المواد الطافية المترسبة للعينات اللاهوائية (أ) اللاهوائية و (ب) من الشكل 3 على هلام SDS-PAGE بنسبة 12.5٪ جنبا إلى جنب مع التحكم في الحبيبات. تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF للنشاف الغربي. تم قطع الغشاء ، وتم فحص النصف العلوي بحثا عن RpoA باستخدام جسم مضاد مضاد ل RpoA ، وتم فحص النصف السفلي بحثا عن YopE باستخدام جسم مضاد مضاد ل YopE. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

(أ)
اللاهوائيه
شرطODالحجم المراد جمعه (مل)تمت إضافة حجم 6.1 N TCA إلى Sup (مل)
WT منخفض الحديد0.560.6
WT عالية الحديد130.3
(ب)
الهوائيه
شرطODالحجم المراد جمعه (مل)تمت إضافة حجم 6.1N TCA إلى Sup (مل)
WT منخفض الحديد0.960.6
WT عالية الحديد1.43.8570.386

الجدول 1: سير عمل جمع العينات التمثيلية. في اليوم 5 ، (أ) بمجرد اكتمال الحضانة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية للعينات اللاهوائية ، تم جمع 6 مل من العينة بأقل قيمة OD600 وتم تطبيع باقي أحجام العينة وفقا لذلك. بعد تصفية المادة الطافية ، تمت إضافة 6.1 N TCA. (ب) بمجرد اكتمال الحضانات الهوائية (ساعتان عند 26 درجة مئوية و 4 ساعات عند 37 درجة مئوية) ، تم جمع 6 مل من العينة بأقل قيمة OD600 ، وتم تطبيع باقي أحجام العينة وفقا لذلك. بعد تصفية المادة الطافية ، تمت إضافة 6.1 N TCA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T3SS هو عامل ضراوة مهم في العديد من البكتيريا المسببة للأمراض. لذلك ، فإن تطوير تقنيات معملية لدراسة تنظيمها مهم لفهم التسبب في المرض وتطوير العلاجاتالمحتملة 1. من المعروف أن الحديد والأكسجين هما إشارات مضيف مهمة تستشعر بها مسببات الأمراض البكتيرية لتنظيم تعبير T3SS5 ؛ لذلك ، تقدم هذه الطريقة استراتيجية لزراعة Y. الكاذب الكاذب في ظل الظروف اللاهوائية أو الهوائية ، مع تجويع الحديد أو امتلائه ، وتوضح كيفية تحديد نشاط T3SS النسبي في ظل هذه الظروف المختلفة من خلال تقييم الكميات النسبية لمستويات بروتين المستجيب YopE T3SS المفرزة.

في حين أن سير العمل لهذه التجربة بسيط نسبيا ، إلا أن هناك بعض النقاط التي يجب مراعاتها عن كثب لتحسين النتائج. أثناء خطوة ترسيب البروتين بوساطة TCA, من المهم تجنب شفط حبيبات البروتين, والتي قد يكون من الصعب رؤيتها. يعد اتخاذ احتياطات إضافية لعدم السماح لطرف الشفاط بلمس الجدران أو قاع الأنبوب أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، عند التعامل مع السلالات الطافرة ذات المستوى المنخفض من نشاط T3SS ، ينصح بجمع عينة أكبر للمعالجة. أخيرا ، إذا بدت الممرات ملطخة بعد معالجة العينات وتلطيخ الهلام بدلا من إنتاج أشرطة مميزة ، فقد يكون هذا بسبب تحلل الخلية أثناء الاستزراع أو نقل البكتيريا الكاملة من الحبيبات إلى الجزء الطافي. في هذه الحالة ، يجب تكرار التجربة ، ويجب توخي المزيد من الحذر لتجنب تناول الحبيبات عند إزالة المادة الطافية. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول قد لا يكون حساسا بما يكفي للكشف عن البروتينات التي تفرز بكميات منخفضة جدا ، وفي هذه الحالة قد يلزم استخدام طرق الكشف الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن العديد من عوامل المخلبات ستزيل الكاتيونات ثنائية التكافؤ بخلاف الحديد والمغنيسيوم من الوسائط ، فقد تتم إضافة كاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى مرة أخرى إلى الوسائط بعد الخلب لتحديد تأثيرها على الإفراز.

نقطة أخرى مهمة يجب مراعاتها في هذه التجارب هي ميل الأملاح في وسائط M9 إلى الترسيب ، مما يؤدي إلى التباين بين الدفعات التجريبية. للتخفيف من هذه المشكلة ، من الممكن إضافة MgSO4 المعقم بالترشيح إلى الوسائط مباشرة قبل الزراعة.

بشكل عام ، توفر هذه الطرق إطارا قويا لقياس نشاط Yersinia T3SS النسبي عن طريق قياس مستويات البروتين. إلى جانب الأساليب المتوازية التي تهدف إلى تقييم تعبير T3SS ، تسمح الأساليب المعروضة هنا بفهم شامل لديناميكيات T3SS استجابة للإشارات البيئية ذات الصلة بالمضيف. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى التي يمكن زراعتها في وسط محدد حيث يمكن حذف مصدر الحديد وللتطبيقات التي يكون فيها قياس البروتينات المفرزة وثيق الصلة بالسؤال العلمي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصور الرسومية التي تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. تم دعم هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة (www.NIH.gov) R01AI119082.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 مل Luer-Lok تلميح حقنةBD301029
10x SDS تشغيل المخزن المؤقت  محلي الصنع0.25 M قاعدة تريس ، 1.92 م جلايسين ، 1٪ SDS في حجم 1 لتر
12.5٪ SDS-Page جلمحلي الصنع
15 مل أنابيب ثقافةFalcon352059للبين عشية وضحاها الأولية   ؛
15 مل أنابيبفالكون فالكوم352196 لجمع المواد الطافية
قارورة ثقافية 250 ملبيلكو251000250
500 مل نظام تصفيةكورنينج431097
6 نيوتن محلول حمض الهيدروكلوريكفيشر 7732185
الأسيتونفيشر الكيمياءA949-44 لتر
بيو راد ChemiDoc MP التصوير رقم الموديل Bio RadSystem: Universal Hood III
أنابيب زراعة زجاج البورسليكاتFisherbrand14-961-34للزراعة اللاهوائية
Chelex 100 ResinBio Rad142-1253
Chelex M9 + 0.9٪ وسائط الجلوكوزمحلية الصنع6 جم / لتر Na2HPO4 ، 3 جم / لتر KH2PO4 ، 0.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 1 جم / لتر NH 4< / sub>Cl ، 1٪ أحماض الكازامينو ، <قوي >0.9٪ سكر العنب < / قوي > ، 0.0005٪ ثيامين ، 5 جم / لتر راتنج Chelex 100. قم بتقليب الوسائط لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بالتصفية باستخدام وحدة ترشيح Corning سعة 500 مل ، ثم أضف MgSO4< / sub> ل 1 ملي مولار MgSO4 < / sub>final
محلول عازل العينة النهائي (FSB)محلي الصنع0.1 M Tris-HCl ، 4٪ SDS ، 20٪ جلسرين ، 0.2٪ من Bromophenol Blue
FSB: حل DTTمحلي الصنعFSB + 0.2M DTT
Image Lab SoftwareBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z
Isotemp Heat BlockFisher Scientific
LB Agar Platesمحلي الصنع10 جم من التربتون ، 5 جم مستخلص الخميرة ، 10 جم كلوريد الصوديوم ، 15 جم أجار في الحجم الإجمالي 1 لتر. معقم
M9 + 0.2٪ جلوكوز ميديامنزلي مصنوع6 جم / لتر Na 2 < / sub >HPO 4 < / sub > ، 3 جم / لتر KH 2 < / sub >PO 4< / sub > ، 0.5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 1 جم / لتر NH 4 < / sub >Cl ، 1 ملي مولار MgSO4< / sub> ، 1 مجم / لتر FeSO4< / sub>7H2< / sub>O ، 1٪ أحماض الكازامينو ، <قوي >0.2٪ سكر العنب < / قوي > ، 0.0005٪ ثيامين & nbsp ؛
مرفق مرشح Millex-GP PES 0.22um للحقنةMilliporeSLGPR33RSلترشيح FeSO47H2O
مرفق مرشح Millex-GV PVDF 0.22um للحقنةMilliporeSLGVR33RSللترشيح الطافي
Precision Plus Protein غير ملوثةقياسي Bio Rad1610363
SDS-PAGE Gel ApparatusBio Radرقم الموديل: خليةصغيرة PROTEAN Tetra
طقم تلطيخ الفضة SilverXpress InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI BDRAA1155
Scientific Trichloroacetic acid solution 6.1NSigma AldrichT0699
مختبراللاهوائية الفينيل
https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#detailsqPCR التسلسلات التمهيدية  < / قوي>
YFEA إلى الأمام - CAC AGT CAG ACC TTA TCT T
yfeA عكس - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A bfd
للأمام - ccagcatcagccccatacag
bfd عكس - tggcttgtcgggacttc
yopE إلى الأمام - CCATAAACCGGTGGTGGGGc
عكس yopE - CTTGGCATTGAGTGATACTG
88860021 منتجات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

Related Articles