الكشف عن النمط الظاهري الحديدي للورم الأرومي النخاعي

Ferroptosis هو نوع من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تعتمد على السياق حديثا من موت الخلايا¹. إلى جانب أنواع الأكسجين التفاعلية ، يلعب الحديد دورا (أدوارا) حاسما في هذا النوع من موت الخلايا ، ومن هنا جاء الاسم². الخطوة الأخيرة والتنفيذية لداء الحديديات هي التراكم المحفز بالحديد للضرر التأكسدي للدهون في غشاء البلازما الذي يؤدي في النهاية إلى ضعف سلامة الغشاء والنفاذية الانتقائية ، وأخيرا موت الخلايا عن طريق الفقاعات. حدث هيدروبيروكسيد الدهون هو ظاهرة تحدث بشكل طبيعي. ومع ذلك ، يتم منع انتشاره في جميع أنحاء الغشاء الخلوي عن طريق الدفاع المضاد للأكسدة للخلية. اللاعب الرئيسي في هذا السياق هو Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4) ، والذي يمكنه الاقتراب من الغشاء وتحويل هيدروبيروكسيدات الدهون إلى مشتقات الكحول الأقل سمية³. يتم توفير الطاقة المختزلة ل GPx4 بشكل أساسي ، ولكن ليس حصريا ، بواسطة الجلوتاثيون (GSH) ، وهو ثلاثي الببتيد يتكون من الأحماض الأمينية غير الأساسية: الجلايسين والغلوتامات والسيستين. الأحماض الأمينية التي تحد من معدل التخليق الحيوي ل GSH هي السيستين⁴. على الرغم من تصنيف السيستين على أنه حمض أميني غير أساسي ، إلا أن متطلباته يمكن أن تتجاوز بسهولة إنتاجه الداخلي في الخلايا التكاثرية للغاية (مثل الخلايا السرطانية). وبالتالي تم إعادة تصنيفها في مجموعة الأحماض الأمينية شبه الأساسية. يحدث الاستيراد الضروري للسيستين بشكل رئيسي من خلال نظام Xc ، والذي يسمح باستيراد الشكل المؤكسد (المهيمن) من السيستين (المعروف أيضا باسم السيستين) على حساب تصدير الغلوتامات⁵. يتكون نظام Xc من وحدة نقل فرعية مستقلة Na + ، تعتمد على Cl ، تعرف باسم xCT ، ووحدة فرعية مرافقة ، تعرف باسم CD98. حتى وقت قريب ، كان ينظر إلى الخصائص المضادة للحديد لمحور xCT-GSH-GPx4 على أنها فريدة وغير قابلة للتكرار⁶. ومع ذلك ، في عام 2019 ، تم وصف مسار بديل مضاد للحديد ، يتكون من يوبيكوينول (الإنزيم المساعد Q10) وإنزيمه التجديدي - بروتين مثبط الحديدي 1 (FSP1) ، ^7,8. بعد ذلك بوقت قصير ، تم الإبلاغ عن نظام آخر لإزالة السموم من هيدرو بيروكسيد الدهون يتضمن GTP cyclohydrolase-1 / tetrahydrobiopterin (GCH1 / BH4)⁹. ومع ذلك ، يبدو أن الدور المركزي لمحور xCT-GSH-GPx4 في الوقاية من داء الحديديات لا يتم تحديه.

على مدى العقد الماضي ، تمت دراسة داء الحديديات على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من أنواع الأورام ، مما أظهر إمكانات كبيرة كاستراتيجية مضادة للسرطان (تمت مراجعته بواسطة Lei et ^al.10). علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن الخلايا السرطانية التي تظهر مقاومة عالية للعلاج الكيميائي التقليدي و / أو الميل إلى الانتقال حساسة بشكل مدهش لمحفزات داء الحديد ، مثل مثبطات GPx4^11،12،13. ومع ذلك ، في سياق أورام المخ ، لا تزال إمكانات المحرضات الحديدية غير مدروسة إلى حد كبير. في حين أن هذا النوع من موت الخلايا قد ارتبط ارتباطا وثيقا بإصابة نقص التروية الدماغية¹⁴والأمراض التنكسية العصبية¹⁵ ، فإن إمكاناته في سياق أورام المخ اقتصرت بشكل أساسي على الورم الأرومي الدبقي ، وهو الورم القحفي الدماغي الخبيث الأكثر شيوعا (تمت مراجعته بواسطة Zhuo et ^al.16). من ناحية أخرى ، لا تزال حساسية الورم الأرومي النخاعي ، وهو ورم الدماغ الخبيث الأكثر شيوعا لدى الأطفال والسبب الرئيسي لوفيات الأطفال ، لمحفزات داء الحديد غير مستكشفة إلى حد كبير. على حد علمنا ، هناك أدبيات نادرة تمت مراجعتها من قبل الأقران تربط بين داء الحديديات والورم الأرومي النخاعي. ومع ذلك ، فقد كشفت بعض الدراسات أن الحديد يلعب دورا حاسما في البقاء على قيد الحياة والانتشار والإمكانات السرطانية لكل من الخلايا الجذعية لسرطان الورم الأرومي النخاعي والورم الأرومي الدبقي (CSCs)^17,18 ، مما قد يجعلها أكثر عرضة لتحريض داء الحديديات. هذا مهم بشكل خاص لأن الورم الأرومي النخاعي يشتهر بسكانه الفرعيين من الخلايا الجذعية السرطانية ، أو الخلايا البادئة / المنتشرة للورم ، والتي يبدو أنها مسؤولة إلى حد كبير عن المقاومة الكيميائية للورم وانتشاره وانتكاسه¹⁹.

عادة ما يتم فحص الحساسية لتحريض داء الحديديات عن طريق قياس محتوى / تراكم هيدرو بيروكسيد الدهون ، والذي قد يؤدي أو لا يؤدي إلى موت الخلايا. محرضات داء الحديد الأكثر استخداما هي (1) ممحاة ، مثبط لناقل xCT²⁰ ، (2) RSL3 ، مثبط لإنزيم GPx4² ، و / أو (3) مانحون للحديد ، مثل سترات الأمونيوم الحديدية (FAC) ²¹. يتم تقييم محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون باستخدام المسبار الانتقائي BODIPY 581/591 C11²² ، والذي يحتوي على أقصى إثارة وانبعاث عند 581/591 نانومتر في حالته المنخفضة. عند التفاعل مع هيدروبيروكسيدات الدهون وأكسدتها ، يحول المسبار الحد الأقصى للإثارة والانبعاث إلى 488/510 نانومتر. عادة ، تسبق الزيادة الكبيرة في محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون موت الخلايا الحديدية. نظرا لأن داء الحديديات ليس موتا مبرمجا للخلايا ، فلا يوجد سلسلة إشارات جزيئية تؤدي إلى تنفيذه. لذلك ، فإن الطريقة الوحيدة لتأكيد ذلك هي مراقبة محتوى هيدروبيروكسيد الدهون واستخدام مثبطات محددة لهذا النوع من موت الخلايا ، مثل ferrostatin 1²³. Ferrostatin 1 هو أحد مضادات الأكسدة المحبة للدهون التي يمكن أن تخترق حجرة الدهون في الخلية وتزيل السموم من هيدروبيروكسيدات الدهون ، وبالتالي تمنع الأحداث الحديدية.

أجريت الدراسة الحالية باستخدام خطوط خلايا الورم الأرومي النخاعي من النوع البري DAOY (WT) ، والتي تم استزراعها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ في وسط DMEM مع 8٪ FBS. تم الحفاظ على خط الخلية المحذوف xCT في ظل نفس الظروف ، مع إجراء تجارب في وسائط مكملة ب 1 mM N-acetylcysteine (NAC). تم فحص الخلايا بانتظام بحثا عن الميكوبلازما باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن الميكوبلازما المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) وتم استزراعها^{حتى المقطع} 10.

1. حصاد وبذر الخلايا

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات باستخدام تقنيات معقمة معقمة في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة. خلايا الورم الأرومي النخاعي DAOY ملتصقة ، مما يعني أنه يمكن التخلص من جميع الخلايا غير المرتبطة عن طريق الغسيل بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون Ca²⁺ و Mg²⁺.

1. خذ طبق المرق (طبق بتري ، قطر 100 مم) مع الخلايا وقم بإزالة الخلايا العائمة والمتوسطة من اللوحة باستخدام شفاط.
2. أضف 5-10 مل من PBS إلى الطبق ، واغسل الجزء السفلي بحركات دائرية للطبق ، ثم أخرج PBS من اللوحة باستخدام شفاط.
3. أضف 1 مل من التربسين (تخفيف 10x) إلى الطبق. احتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. خذ 10 مل من وسط زراعة DMEM المكمل ب 8٪ FBS واحصد الخلايا ميكانيكيا من الطبق.
4. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل.
5. خذ 500 ميكرولتر من تعليق الخلية وضعه في كوفيت للعد. احسب عدد الخلايا لكل مل من تعليق الخلية. تم استخدام عداد خلية آلي لهذه الدراسة (انظر جدول المواد).
6. احسب الحجم اللازم لأخذه من معلق الخلية للحصول على 1،00،000 خلية.
7. خذ صفيحة من 6 آبار وأضف الحجم المحسوب لتعليق الخلية في كل بئر ، ثم أضف وسائط استزراع DMEM مكملة ب 8٪ FBS إلى 2 مل في كل بئر.

2. علاج الخلايا

ملاحظة: يتم إجراء السيطرة والعلاجات في ثلاث نسخ. المجموعات هي كما يلي: التحكم (DMSO) ، 1 ميكرومتر من إراستين ، 0.3 ميكرومتر من RSL3 ، 250 ميكرومتر من FAC ، 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 1 ميكرومتر من إراستين + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 0.3 ميكرومتر RSL3 + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1 ، 250 ميكرومتر من FAC + 2 ميكرومتر من فيروستاتين 1. هناك حاجة إلى أربع لوحات 6 آبار للتجربة ، كما هو موضح في الجدول 1). يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف اللازمة في جدول المواد.

1. بعد 24 ساعة من البذر ، أضف العلاج المقابل إلى البئر مع الخلايا.
2. اترك الأطباق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ في الحاضنة.

3. تلطيخ هيدروبيروكسيدات الدهون للخلايا المعالجة باستخدام مسبار BODIPY 581/591 C11

ملاحظة: يتم تحضير محلول المخزون للمسبار الخاص بهيدرو بيروكسيد الدهون في DMSO بتركيز 1 mM. يتم تخزين حصص محلول المخزون عند -20 درجة مئوية في أنابيب غير شفافة. للتلطيخ ، قم بإعداد حل عمل 2 ميكرومتر للمسبار في وسائط DMEM مكملا ب 8٪ FBS.

1. 6 ساعات بعد العلاج ، راقب الخلايا تحت المجهر الضوئي (يجب أن يكون تقريب الخلية مرئيا).
2. أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة.
   باستخدام شفاط ، قم بإزالة الوسائط والخلايا العائمة (الميتة).
3. أضف 2 مل من PBS برفق إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم قم بإزالة PBS من الآبار باستخدام شفاط.
4. أضف 2 مل من محلول عمل المسبار (تركيز نهائي 2 ميكرومتر في DMEM مكمل ب FBS).
5. اترك الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة في الظلام (يمكن لف الألواح بورق الألمنيوم).

4. تحليل التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في الخلايا المعالجة

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات التالية في الظلام (لا توجد أضواء في غطاء التدفق الصفحي).

1. أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة.
   باستخدام شفاط ، قم بإزالة محلول التلطيخ.
2. أضف 2 مل من PBS برفق إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم قم بإزالة PBS من الآبار باستخدام شفاط.
3. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى وقم بشفط أي برنامج تلفزيوني متبقي من البئر باستخدام شفاط.
4. أضف 150 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في قاع كل بئر واحتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. خذ 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS ، 2 mM EDTA ، 0.5٪ BSA) واحصد الخلايا ميكانيكيا من الآبار.
5. انقل الخلايا إلى أنبوب FACS المقابل (المحدد مسبقا) مع غطاء المرشح. ضع الأنبوب مع الخلايا على الجليد في الظلام حتى يتم إجراء التحليل (يجب إجراء التحليل في غضون ساعة بعد تلطيخ).
   ملاحظة: يعتمد إعداد ماكينة FACS ومعايرتها على الماكينة المستخدمة (انظر جدول المواد).
6. قم بإنشاء تجربة جديدة وأعطها اسما (Ferroptosis في DAOY - هيدروبيروكسيدات الدهون).
7. في تصميم التجربة ، اختر الليزر (488 نانومتر) والفلتر (FITC).
8. في عرض البيانات ، حدد حجم الخلية المناسب (>12 ميكرومتر) ، واضبط الفولتية PMT (يجب أن يظهر محتوى الخلية في الربع الأول من المخطط النقطي SSC-H / FSC-H) ، وقم ببوابة الرسم النقطي.
9. أضف مخططا جديدا - مدرجا تكراريا ، مع FITC-A على المحور ص والمقياس اللوغاريتمي.
10. دوامة العينات في أنبوب FACS ، ضعها في جهاز FACS وقم بتحميل العينة. سجل 10000 حدث فردي FSC وقم بتسمية الملف (على سبيل المثال ، DAOY WT CTL 6h). تصدير الملف بتنسيق .fcs.

5. تلطيخ يوديد البروبيديوم (PI) للخلايا الميتة عند العلاج

ملاحظة: تصميم التجربة هو نفسه تماما لقياس هيدرو بيروكسيد الدهون (انظر الخطوة 1 والخطوة 2).

1. بعد 24 ساعة من البذر ، أخرج الأطباق من الحاضنة وضعها في غطاء التدفق الصفحي.
2. جمع الوسائط (مع الخلايا الميتة) في أنبوب 15 مل.
3. أضف 1 مل من PBS إلى كل بئر ، واغسل القاع بحركات دائرية لألواح 6 آبار ، ثم اجمع PBS في الأنبوب باستخدام الوسائط المعنية.
4. أضف 200 ميكرولتر من التربسين (تخفيف 10x) في قاع كل بئر واحتضن اللوحة حتى يؤدي النقر اللطيف على اللوحة إلى إزاحة الخلايا. استخدم الوسائط المعنية + PBS لحصاد الخلايا من الآبار.
5. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 180 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط.
6. أعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وضعها على الثلج حتى التحليل.
7. قبل التحليل مباشرة ، أضف محلول PI (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 2 ميكروغرام / مل.

6. تحليل التدفق الخلوي للخلايا الميتة بعد 24 ساعة من العلاج

ملاحظة: تتم إعدادات ومعايرة ماكينة FACS كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 4).

1. قم بإنشاء تجربة جديدة وأعطها اسما (Ferroptosis في DAOY - موت الخلايا).
2. في تصميم التجربة ، اختر الليزر (488 نانومتر) والفلتر (PE).
3. في عرض البيانات ، حدد حجم الخلية المناسب (>12 ميكرومتر) ، واضبط الفولتية PMT (يجب أن يظهر محتوى الخلية في الربع الأول من المخطط النقطي SSC-H / FSC-H) ، وقم ببوابة الرسم النقطي.
4. أضف مخططا جديدا - مدرجا تكراريا ، مع PE-A على المحور ص والمقياس اللوغاريتمي.
5. دوامة العينات في أنبوب FACS ، ضعها في جهاز FACS وقم بتحميل العينة.
6. سجل 10000 حدث فردي FSC وقم بتسمية الملف (على سبيل المثال ، DAOY WT CTL 6h). تصدير الملف بتنسيق .fcs.

7. تحليل التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون في خلايا DAOY xCT / -

ملاحظة: تم إنشاء خلايا xCT^-/- كما هو موضح سابقا²⁴.

1. في هذه التجربة ، قم بزرع الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2 ، ولكن بدلا من العلاج ، استكمل الوسائط ب 1 mM NAC طوال الليل.
2. في اليوم التالي ، احتفظ ب NAC في مجموعة واحدة وقم بإزالته من المجموعة الأخرى.
3. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 6.

8. تحليل نتائج مقياس التدفق الخلوي

1. افتح مستند .fcs في برنامج FlowJo (انظر جدول المواد).
2. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الفردي لفتح جميع الأحداث (وليس فقط مفردات FCS) المسجلة في العينة الفردية (مخطط نقطة SSC-A / FSC-A). نظرا لأن الإعدادات لا يتم فيها الحفاظ على البوابة التي يتم إجراؤها على الجهاز ، فمن الضروري إنشاء البوابة مرة أخرى وتسمية السكان (على سبيل المثال ، DAOY WT).
3. انقر نقرا مزدوجا فوق السكان المسورة لفتح نافذة أخرى باستخدام الرسم البياني.
4. قم بتغيير المحور Y إلى مرشح الفلورسنت المستخدم (Comp-FITC / PE-A).
5. قم بتغيير المحور X إلى مشروط (تطبيع كل قمة إلى وضعها ، أي إلى٪ من الحد الأقصى لعدد الخلايا الموجودة في حاوية معينة).
6. انسخ الرسم البياني إلى محرر التخطيط. كرر هذا لجميع العينات ، وفي كل مرة يتم فيها لصق مدرج تكراري جديد في محرر التخطيط ، اسحبه فوق الرسم البياني السابق بحيث يتم تراكب الرسوم البيانية (نصف إزاحة).

تم استزراع خط خلايا الورم الأرومي النخاعي DAOY في وسط DMEM قياسي مكمل ب 8٪ FBS حتى وصل إلى التقاء 60٪ تقريبا. في يوم التجربة ، تم حصاد الخلايا ، وتم طلاء 1،00،000 خلية لكل بئر في ألواح من 6 آبار ، وفقا للجدول 1. في اليوم التالي ، عولجت الخلايا (في ثلاث نسخ) إما ب 1 ميكرومتر من الممحاة ، أو 0.3 ميكرومتر من RSL3 ، أو 250 ميكرومتر من FAC. ثم تم وضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. بعد 6 ساعات ، لوحظت الخلايا تحت المجهر للكشف عن الخلايا الفقاعية ، كما هو موضح في الأسهم في الشكل 1. كان هذا بمثابة مؤشر على أن الدواء كان فعالا في إحداث داء الحديديات قبل تحضير الخلايا لتلطيخ هيدرو بيروكسيد الدهون وتحليل FACS اللاحق.

للكشف عن محتوى هيدرو بيروكسيد الدهون ، تم استخدام الصبغة المحددة BODIPY 581/591 C11 بتركيز نهائي قدره 2 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة. نظرا لأن هذه الصبغة حساسة للأكسدة والاختزال ، كان من الضروري إزالة أي علاج من الخلايا وغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا. بعد نصف ساعة من التلوين ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وفصلها باستخدام محلول انفصال الخلايا ، وإعدادها لتحليل FACS. أظهرت البيانات التي تم الحصول عليها في هذه الخطوة زيادة مضان أخضر للصبغة في العينات المعالجة بالأدوية الثلاثة (الشكل 2). ومع ذلك ، لوحظ التأثير الأكثر فعالية مع 0.3 ميكرومتر من RSL3 (الشكل 2B) ، في حين أن 1 ميكرومتر من إراستين (الشكل 2A) و 250 ميكرومتر من FAC (الشكل 2C) أظهر تأثيرا أقل إلى حد ما بعد 6 ساعات من العلاج.

لإثبات أن تراكم هيدرو بيروكسيد الدهون المكتشف يؤدي إلى موت الخلايا ، وتحديدا داء الحديد ، تم تطبيق نفس العلاجات الموضحة في الجدول 1 لمدة 24 ساعة. لتحليل الخلايا الميتة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، تم حصاد كل من الخلايا والطاف. تم تكوير الخلايا الحية والميتة عن طريق الطرد المركزي ثم أعيد تعليقها في المخزن المؤقت FACS لتحليل التدفق الخلوي اللاحق. أظهرت البيانات الواردة في الشكل 3 أن جميع العلاجات الثلاثة تسببت في موت الخلايا على نطاق واسع، والذي تم منعه تماما باستخدام مثبط فيروساتين خاص بداء الحديديات، فيروستاتين-1. هذا يدعم بوضوح حدوث موت الخلايا الحديدية عند تثبيط xCT ، تثبيط GPx4 ، أو الحمل الزائد للحديد في خلايا الورم الأرومي النخاعي.

بالنظر إلى أن الأدوية الثلاثة أظهرت تأثيرات مختلفة إلى حد ما على تراكم هيدرو بيروكسيد الدهون ، على الأرجح بسبب الاختلافات في الفاعلية ، تم استخدام نهج وراثي للتحقيق في الفعالية الكاملة لمحفزات الحديديات. تم استزراع خلايا DAOY xCT / - التي تم الحصول عليها سابقا (الشكل التكميلي 1A) في نفس الوسائط مثل نظيراتها من WT ولكن مع مكملات NAC. سمح هذا الاختيار الإيجابي لخلايا xCT / - بالنمو في الثقافة. ومع ذلك ، بعد 6 ساعات من إزالة NAC من وسائط الاستزراع ، بدأت الخلايا في تجميع هيدروبيروكسيدات الدهون إلى نفس مستوى خلايا WT المعالجة ب RSL3 (الشكل 4). على غرار التثبيط الدوائي ، أدت إزالة NAC من الوسائط إلى حدوث فقاعات مميزة لخلايا xCT / - بعد 6 ساعات (الشكل التكميلي 1B).

الشكل 1: النمط الظاهري الحديدي لخلايا الورم الأرومي النخاعي. صور مجهرية تمثيلية لخلايا DAOY WT المعالجة (أو لا) لمدة 6 ساعات مع 1 ميكرومتر من إيراستين (ERA) ، 0.3 ميكرومتر من RSL3 أو 250 ميكرومتر من سترات الأمونيوم الحديدي (FAC) في وجود أو عدم وجود مثبط داء فيروستاتين -1 (فيرو -1). تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا مستديرة "فقاعية" ، مما يشير إلى نمط ظاهري حديدي مرئي تحت المجهر الضوئي. التكبير: 20x ، إدراج: 40x. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر ، الإدخالات: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: هيدرو بيروكسيد الليبيدات باعتباره العلامة الرئيسية للداء الحديدي في خلايا الورم الأرومي النخاعي. بيانات تمثيلية لتلطيخ هيدروبيروكسيد الدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي في الخلايا المعالجة لمدة 6 ساعات باستخدام (A ، B) 1 ميكرومتر من إراستين (ERA) ، (C ، D) 0.3 ميكرومتر من RSL3 ، أو (E ، F) 250 ميكرومتر من سترات فيروامونيوم (FAC) ، في وجود أو عدم وجود مثبط 2 ميكرومتر فيروستاتين -1 (فيرو -1). (أ ، ج ، ه) مؤامرات نقطية للأحداث المسجلة ؛ (ب، د، و) تمثيل الرسم البياني لمحتوى هيدرو بيروكسيد الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تحريض موت الخلايا الحديدية بالنهج الدوائي. مخططات نقطية لقياس التدفق الخلوي التمثيلي للخلايا الملطخة بيوديد البروبيديوم بعد 6 ساعات من العلاج ب 1 ميكرومتر من إراستين (ERA) ، 0.3 ميكرومتر من RSL3 ، أو 250 ميكرومتر من سترات فيروامونيوم (FAC) ، في وجود أو عدم وجود مثبط داء فيروستاتين -1 ميكرومتر (فيرو -1). تفصل البوابة بين السكان الأحياء (Q4) والميتين (Q3) من الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تحريض داء الحديد عن طريق النهج الوراثي. بيانات تمثيلية لتلطيخ هيدرو بيروكسيد الدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا DAOY WT و xCT / - بعد 6 ساعات في وجود أو عدم وجود مثبط داء فيروستاتين -1 2 ميكرومتر (فيرو -1). على اليسار يوجد تمثيل مدرج تكراري لمحتويات هيدرو بيروكسيد الدهون. على اليمين توجد المخططات النقطية للأحداث المسجلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تفاصيل العلاج للخلايا الضابطة والتجريبية.

الشكل التكميلي 1: موت الخلايا الحديدية لخلايا DAOY xCT / - . (أ) تحليل اللطخة الغربية لمستوى xCT في خلايا DAOY WT و xCT / - في وسائط DMEM المكملة أم لا ب 2 ميكرومتر من Ferrostatin-1. (B) صور مجهرية تمثيلية لخلايا DAOY xCT / - في وجود (يسار) وغياب (يمين) 1mM N-acetylcysteine لمدة 6 ساعات. تشير الأسهم البيضاء إلى خلايا مستديرة "فقاعية" ، مما يشير إلى نمط ظاهري حديدي مرئي تحت المجهر الضوئي. التكبير: 40x. قضبان المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

نعلن عدم وجود تضارب في المصالح في الدراسة المقدمة طيه.