مقالة منهجية

طرق بديلة للكشف عن توليد أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية

DOI:

10.3791/66647

⸱

مارس 29, 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توليد أنيون الأكسيد الفائق ضروريا لتحفيز الصفائح الدموية ، وإذا كان غير منظم ، فهو ضروري للأمراض الخثارية. هنا ، نقدم ثلاثة بروتوكولات للكشف الانتقائي عن أنيونات الأكسيد الفائق ودراسة تنظيم الصفائح الدموية المعتمدة على الأكسدة والاختزال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تحتوي على الأكسجين غير مستقرة للغاية. عدم استقرارها الكيميائي يجعلها شديدة التفاعل ويمنحها القدرة على التفاعل مع جزيئات حيوية مهمة مثل البروتينات والأحماض النووية والليبيدات. أنيونات الأكسيد الفائق هي أنواع الأكسجين التفاعلية المهمة الناتجة عن تقليل الأكسجين الجزيئي (أي الحصول على إلكترون واحد). على الرغم من آثارها الأولية حصريا في عمليات الشيخوخة والتنكسية والمسببة للأمراض ، إلا أن مشاركتها في الاستجابات الفسيولوجية المهمة أصبحت واضحة مؤخرا. في الجهاز الوعائي، ثبت أن الأنيونات فوق الأكسيد تعدل تمايز خلايا العضلات الملساء الوعائية ووظيفتها، وتكاثر الخلايا البطانية الوعائية وهجرتها في تكوين الأوعية، والاستجابة المناعية، وتنشيط الصفائح الدموية في الإرقاء. دور أنيونات الأكسيد الفائق مهم بشكل خاص في عدم تنظيم الصفائح الدموية ومضاعفات القلب والأوعية الدموية المرتبطة بعدد كبير من الحالات ، بما في ذلك السرطان والعدوى والالتهابات والسكري والسمنة. لذلك ، أصبح من المهم للغاية في أبحاث القلب والأوعية الدموية أن تكون قادرة على قياس توليد الأنيونات الفائقة الأكسيد بشكل فعال بواسطة الصفائح الدموية البشرية ، وفهم الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم التوازن بين الإرقاء والتخثر ، وفي النهاية ، تحديد أدوات دوائية جديدة لتعديل استجابات الصفائح الدموية التي تؤدي إلى تجلط الدم ومضاعفات القلب والأوعية الدموية. تقدم هذه الدراسة ثلاثة بروتوكولات تجريبية تم تبنيها بنجاح للكشف عن أنيونات الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية ودراسة الآليات المعتمدة على الأكسدة والاختزال التي تنظم الإرقاء والتخثر: 1) اكتشاف أنيون الأكسيد الفائق القائم على ثنائي هيدرويثيديوم (DHE) عن طريق قياس التدفق الخلوي. 2) تصور وتحليل أنيون الأكسيد الفائق القائم على DHE عن طريق تصوير الصفائح الدموية الفردية ؛ و 3) القياس الكمي القائم على المسبار المغزلي لإخراج أنيون الأكسيد الفائق في الصفائح الدموية بواسطة الرنين المغنطيسي للإلكترون (EPR).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنيون الأكسيد الفائق (O2 • -) هو أكثر أنواع الأكسجين التفاعلية ذات الصلة وظيفيا المتولدة في الصفائح الدموية1. O2 • - هو نتاج تقليل الأكسجين الجزيئي وسلائف العديد من أنواع ROS 2 المختلفة. يؤدي تفكك O2•- إلى توليد بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) عن طريق التفاعلات التلقائية في محلول مائي أو تفاعلات تحفزها ديسموتاز الأكسيد الفائق (SODs3). على الرغم من اقتراح مصادر إنزيمية مختلفة (على سبيل المثال ، أوكسيديز الزانثين4 ، وأكسيجينازالشحمي 5 ، وأنزيمات الأكسدة الحلقية6 ، وسينسيز أكسيد النيتريك7) ، فإن تنفس الميتوكوندريا8،9 ونيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات أوكسيديز (NOXs)10 هي أبرز مصادر أنيون الأكسيد الفائق في الخلايا حقيقية النواة. يبدو أن هذا هو الحال أيضا في الصفائح الدموية ، حيث تم وصف تسرب الإلكترون من تنفس الميتوكوندريا 11,12 والنشاط الأنزيمي لأكاسيد النيتروجين13,14 على أنهما المساهمان الرئيسيان في إخراج أنيون الأكسيد الفائق.

على الرغم من أن العديد من الدراسات قد ركزت على تنظيم الصفائح الدموية بواسطة O2 • - ، إلا أنه لا يوجد إجماع بشأن الآليات الجزيئية المسؤولة. تم اقتراح تعديل نشاط المستقبلات السطحية عن طريق الأكسدة المباشرة وتكوين رابطة ثاني كبريتيد لمستقبلات الصفائح الدموية المختلفة. تم اقتراح التنظيم الإيجابي للإنتغرين αIIbβ3 بواسطة أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق الأكسدة المباشرة لبقايا السيستين15،16،17. وبالمثل ، نظرا لأن استجابات الصفائح الدموية للكولاجين تعتمد على التحلل المعتمد على ثاني كبريتيد وما يترتب على ذلك من تثبيط البروتين السكري السادس (GPVI) 18 ، فقد تم اقتراح تقوية نشاط المستقبلات بواسطة الأكسدة المعتمدة على أنواع الأكسجينالتفاعلية 19 ، على الرغم من عدم إثباتها تجريبيا بشكل كامل. أخيرا ، تبين أن الأكسدة التي يسببها ROS لمجموعات سلفهيدريل من البروتين السكري Ib (GPIb) تعزز التصاق الصفائح الدموية وتفاعل الصفائح الدموية والكريات البيض أثناء الالتهاب20. على العكس من ذلك ، كنتيجة محتملة لانخفاض أكسدة مجموعة سلفهيدريل وتنشيط المستقبلات ، يتم تقليل سفك المجال الخارجي لكل من GPVI و GPIb عن طريق تقليل الظروف21.

كما تم اقتراح طرق عمل مستقلة عن الأكسدة المباشرة لمستقبلات سطح الصفائح الدموية. ثبت أن أنواع الأكسجين التفاعلية ، بما في ذلك O2 • - ، تعدل بشكل إيجابي مستقبلات الكولاجين GPVI عن طريق تخفيف نشاط منطقة التماثل Src 2 التي تحتوي على بروتين التيروزين الفوسفاتيز 2 (SHP-2) ، والذي ينظم سلبا سلسلة الإشارات لهذا المستقبل22. علاوة على ذلك ، يمكن أن يولد O2 • - ONOO- (بيروكسي نيتريت) عن طريق التفاعل السريع مع أكسيد النيتريك (NO) ، والذي يثبط عادة الصفائح الدموية من خلال سيكلاز غوانيليل غير الحساس (NO-GC) وتوليد منظم الصفائح الدموية السلبي الدوري GMP (cGMP) 23,24. يمكن أن يؤدي الانخفاض الناتج في مستويات NO إلى تقوية الصفائح الدموية. بدلا من ذلك ، تم اقتراح توليد O2 • - بواسطة NOX2 للمساهمة في بيروكسيد الدهون وتكوين الأيزوبروستان ، وهو أمر ضروري لتنشيط الصفائح الدموية والالتصاق25. أخيرا ، يتم تنشيط بروتين كيناز المنشط بالميتوجين (MAPK) كيناز 5 المنظم للإشارة خارج الخلية (ERK5) ، وهو بروتين كيناز مقترح كمستشعر إجهاد الأكسدة والاختزال في الصفائح الدموية26 ، بواسطة O2 • - ويحث على النمط الظاهري للتخثر في الصفائح الدموية (كما هو مقدر من خلال القياس القائم على قياس التدفق الخلوي للفوسفاتيديل سيرين الخارجي)27.

ارتبط عدم تنظيم O2 • - وتوليد ROS الآخر في الصفائح الدموية باستجابة مرقئ مبالغ فيها مما يؤدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية الخثارية المرتبطة بتصلب الشرايين والسكري وارتفاع ضغط الدم والسمنة والسرطان28,29. في هذه الإعدادات المرضية ، يتم زيادة إنتاج ROS بواسطة الصفائح الدموية ، مما يؤدي إلى تقوية استجاباتها اللاصقة والتجميعية. بالإضافة إلى التأثير على استجابات الصفائح الدموية ، قد يكون لإخراج الجذور الحرة للصفائح الدموية عواقب على خلايا الدم الأخرى والهياكل الوعائية ، وهي منطقة غير مفهومة بشكل جيد ولا يتم التحقيق فيها بشكل كاف في صحة القلب والأوعية الدموية30. على الرغم من فهمنا المحدود للآليات الجزيئية التي تربط الإجهاد التأكسدي بحالات التخثر ، فقد حظيت الأهمية السريرية لمضادات الأكسدة للحماية من أمراض القلب والأوعية الدموية باهتمام كبير. لقد ثبت أن مستويات مضادات الأكسدة في البلازما ترتبط عكسيا بخطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، وقد ثبت أن استهلاك مضادات الأكسدة الغذائية يحمي من مرض الشريان التاجي31,32. وبالتالي ، تمت الدعوة إلى استخدام مضادات الأكسدة الغذائية كنهج واعد للوقاية من أمراض القلب والأوعية الدموية33،34،35. من بين آثار توليد ROS في الصفائح الدموية ، يمكن أن يكون للزيادة في موت الخلايا المبرمج تأثيرات فسيولوجية مرضية مهمة36,37. بشكل عام ، فإن البروتوكولات الموثوقة للكشف عن إخراج O2 • - بواسطة الصفائح الدموية وقياسها ذات أهمية متزايدة في أبحاث القلب والأوعية الدموية.

حاليا ، التقنيات المتاحة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية لها قيود مهمة على الخصوصية (أي أن الطبيعة الكيميائية للجزيئات المؤكسدة المكتشفة غير معروفة) والموثوقية (أي أن التفاعل غير المرغوب فيه مع الجزيئات البيولوجية والكواشف التجريبية يؤدي إلى نتائج غير فسيولوجية متحيزة)38,39. يعتمد النهج الأكثر استخداما للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية في الصفائح الدموية على استخدام ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين ثنائي الأسيتات (DCFDA) ، والذي يتم تحويله إلى ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسئين (DCFH) بواسطة استرات داخل الخلايا وبالتالي إلى ثنائي كلورو فلوروريسئين عالي الفلورسنت (DCF) بواسطة المؤكسدات الخلوية ، بما في ذلك جذور الهيدروكسيل و peroxidase-H2O2 وسيطة40,41. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع ، فقد أثيرت أسئلة خطيرة بشأن موثوقية هذا النهج لقياس ROS38 داخل الخلايا. في الواقع ، يمكن أن تحدث أكسدة DCFH إلى DCF بواسطة أيونات المعادن الانتقالية (على سبيل المثال ، Fe2+) أو الإنزيمات المحتوية على الهيم (مثل السيتوكرومات) بدلا من ROS42. علاوة على ذلك ، يتم تحويل DCFDA بواسطة بيروكسيديز الخلية إلى شكل الجذور الحرة شبه الكينون (DCF • -) ، والذي يتأكسد بدوره إلى DCF عن طريق التفاعل مع الأكسجين الجزيئي (O2) مع إطلاق O2 • - ، مما يؤدي إلى التضخيم الاصطناعي للاستجابات المؤكسدة41،43،44. لذلك ، فإن اكتشاف أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا بواسطة DCFDA مفيد للحصول على رؤى أولية ولكنه يتطلب دراسة حذرة وضوابط تجريبية واسعةالنطاق 38,39.

تقدم هذه الدراسة ثلاث تقنيات بديلة للكشف عن وقياس المنظم الرئيسي لوظيفة الصفائح الدموية O2 • -1. التقنية الأولى هي الكشف باستخدام DHE وقياس التدفق الخلوي ، والذي يوفر مزايا الموثوقية والنوعية على DCFDA. تستخدم التقنية الثانية المقترحة هنا أيضا DHE ، لكن طريقة الكشف هي التصوير الفلوري للصفائح الدموية الحية ، والذي يسمح بدراسة توليد O2 • - عند إشارات الصفائح الدموية بحركية سريعة ودقة خلية واحدة. أخيرا ، يوفر بروتوكول يعتمد على استخدام مسبار الدوران هيدروكسيلامين 1-هيدروكسي-3-ميثوكسي كربونيل-2،2،5،5-رباعي ميثيل بيروليدين (CMH) في تجارب الرنين EPR إمكانية تحديد معدل O2 • - توليد بواسطة الصفائح الدموية ومقارنته في ظروف مختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم الموافقة على جمع الدم المحيطي من المتطوعين الموافقين من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية وهيئة البحوث الصحية التابعة للخدمات الصحية الوطنية (مرجع REC: 21/SC/0215; معرف IRAS: 283854).

1. الطريقة الأولى: الكشف عن أنيون الأكسيد الفائق باستخدام DHE عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. قم بالتسخين المسبق (37 درجة مئوية) بمحلول سترات الصوديوم (4٪ وزن / حجم) واستخدمه كمضاد للتخثر عن طريق إضافته مباشرة إلى الدم في وقت بزل الوريد بنسبة 1: 7 (0.5٪ وزن / فولت نهائي).
  2. سحب الدم البشري المحيطي من المتطوعين الأصحاء عن طريق البزل الوريدي المرفقي المتوسط.
  3. الحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من الدم الكامل عن طريق خطوة الطرد المركزي الأولية عند 200 × غرام لمدة 20 دقيقة.
  4. PRP للطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق مع مثبطات الصفائح الدموية القابلة للانعكاس إندوميتاسين (10 ميكرومتر) و PGE1 (40 نانوغرام / مل).
  5. إعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية الناتجة في المخزن المؤقت ل Tyrode المعدل (145 mM NaCl ، 2.9 mM KCl ، 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane sulfonic acid (HEPES) ، 1 mM MgCl2 ، 5 mM الجلوكوز ، درجة الحموضة 7.3) (37 درجة مئوية) بكثافة 2 × 108 صفائح دموية / مل.
  6. بعد العزل، استرخ الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. تحضير DHE في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بتركيز مخزون 5 مللي مول.
  8. أضف DHE إلى معلق الصفائح الدموية عند تركيز نهائي 5 ميكرومتر (قم بتخفيف محلول المخزون من 1 إلى 1000 ، مع تركيز DMSO النهائي 0.1٪ v / v) واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. عالج الصفائح الدموية بالعوامل الدوائية و / أو كاسحات ROS لمدة 15 دقيقة قبل التحفيز بالمحفزات الفسيولوجية والتركيزات المطلوبة (على سبيل المثال ، 0.1 وحدة / مل ثرومبين أو 3 ميكروغرام / مل كولاجين).
  10. بعد التحفيز ، قم بتخفيف معلقات الصفائح الدموية من 1 إلى 10 في محلول HEPES المعدل بالثلج البارد.
  11. بالنسبة لقياس التدفق الخلوي ، اضبط التشتت الجانبي (SSC) والتشتت الأمامي (FSC) على 40 مللي فولت و 220 مللي فولت ، على التوالي ، واستخدم مخططات التشتت اللوغاريتمية لتصور عدد الجسيمات في التعليق (مثال في الشكل 1 أ).
  12. (اختياري) Immunostain واحد من القسمة المعلقة للصفائح الدموية باستخدام جسم مضاد ل CD41 لتحديد عدد الأحداث المقابلة للصفائح الدموية (مثال في الشكل 1B).
  13. تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الإثارة عند 405 نانومتر (الليزر البنفسجي) والانبعاث عند الطول الموجي 580 نانومتر ، والذي يكتشف بشكل انتقائي المنتج الخاص بأنيون الأكسيد الفائق 2-هيدروكسي-إيثيديوم (2OH-Et +) (الشكل 2).
    ملاحظة: لا ينصح بالتثبيت باستخدام بارافورمالدهيد وتخزين العينات على المدى الطويل.

2. الطريقة 2: الكشف عن أنيون الأكسيد الفائق باستخدام DHE عن طريق التصوير الفلوري أحادي الصفائح الدموية

  1. قم بتغطية شريحة μ ذات 8 آبار في يوم التجربة ب 0.1 مجم / مل من الكولاجين الليفي I من أوتار الخيول (هرمون الكولاجين) ، أو 0.2 مجم / مل من الفيبرينوجين أو 1 مجم / مل بولي-إل-ليسين (PLL) في مخزن التيرود المؤقت المعدل لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. اغسل مرتين باستخدام المخزن المؤقت المعدل ل Tyrode (10 دقائق لكل منهما).
  3. إخماد الالتصاق غير النوعي عن طريق الحضانة في مخزن تيرود المعدل بالإضافة إلى 5 ملغ / مل من ألبومين مصل الأبقار (BSA) لمدة لا تقل عن 30 دقيقة (أو حتى التجربة).
  4. قم بالتسخين المسبق (37 درجة مئوية) بمحلول سترات الصوديوم (4٪ وزن / حجم) واستخدمه كمضاد للتخثر عن طريق إضافته مباشرة إلى الدم في وقت بزل الوريد بنسبة 1: 7 (0.5٪ وزن / فولت نهائي).
  5. سحب الدم البشري المحيطي من المتطوعين الأصحاء عن طريق البزل الوريدي المرفقي المتوسط.
  6. الحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من الدم الكامل عن طريق خطوة الطرد المركزي الأولية عند 200 × غرام لمدة 20 دقيقة.
  7. PRP للطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق مع مثبطات الصفائح الدموية القابلة للانعكاس إندوميتاسين (10 ميكرومتر) و PGE1 (40 نانوغرام / مل).
  8. إعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية الناتجة في المخزن المؤقت ل Tyrode المعدل (145 mM NaCl ، 2.9 mM KCl ، 10 mM HEPES ، 1 mM MgCl2 ، 5 mM glucose ، pH 7.3) (37 °C) بكثافة 4 × 107 صفائح دموية / مل.
  9. بعد العزل، استرخ الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  10. تحضير DHE في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بتركيز مخزون 10 مللي مول.
  11. أضف DHE عند تركيز نهائي 10 ميكرومتر إلى معلق الصفائح الدموية (قم بتخفيف محلول المخزون من 1 إلى 1000 ، مع تركيز DMSO النهائي 0.1٪ v / v) واحتضانه لمدة دقيقة واحدة (37 درجة مئوية).
  12. بعد 1 دقيقة من الحضانة مع DHE ، قم بإزالة محلول الحجب من الآبار المختارة ، وضع شريحة μ على مرحلة المجهر جاهزة للتصوير ، وصرف الصفائح الدموية برفق.
  13. راقب تحويل DHE إلى 2OH-Et + عن طريق التصوير البؤري المقلوب لمدة 10 دقائق (405/580 نانومتر ex / em) ، مع جمع الصور كل 10 ثوان باستخدام عدسة غمر الزيت 40x.
  14. (اختياري) بالنسبة للآبار المطلية ب PLL ، راقب توليد أنيون الأكسيد الفائق استجابة لناهض قابل للذوبان (على سبيل المثال ، 0.1 وحدة / مل ثرومبين أو 3 ميكروغرام / مل كولاجين) عن طريق إضافة الناهض بعد 10 دقائق من توزيع الصفائح الدموية وجمع الصور الفلورية لمدة 10 دقائق أخرى ، كما هو موضح في الخطوة 2.13.
  15. (اختياري) إذا لزم الأمر ، أضف كاسحات أنيون الأكسيد الفائق أو مثبطات انتقائية (على سبيل المثال ، مثبطات أكاسيد النيتروجين) عن طريق الاستغناء برفق على جانب البئر خلال الدورة الزمنية وجمع صور مضان كما هو موضح في 2.13 لمدة 10 دقائق أخرى.
  16. قم بقياس تحليل مضان الخلية الواحدة عن طريق تحديد منطقة الاهتمام (ROI) التي تحتوي على صفيحات مفردة تمثيلية وتحليل شدة التألق في إطارات مختلفة باستخدام أداة القياس لمجموعة التصوير ImageJ 1.53t.

3. الطريقة الثالثة: الكشف عن أنيون الأكسيد الفائق بواسطة الصفائح الدموية باستخدام الرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR)

  1. قم بالتسخين المسبق (37 درجة مئوية) بمحلول سترات الصوديوم (4٪ وزن / حجم) واستخدمه كمضاد للتخثر عن طريق إضافته مباشرة إلى الدم في وقت بزل الوريد بنسبة 1: 7 (0.5٪ وزن / فولت نهائي).
  2. سحب الدم البشري المحيطي من المتطوعين الأصحاء عن طريق البزل الوريدي المرفقي المتوسط.
  3. الحصول على البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) من الدم الكامل عن طريق خطوة الطرد المركزي الأولية عند 200 × غرام لمدة 20 دقيقة.
  4. PRP للطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق مع مثبطات الصفائح الدموية القابلة للانعكاس إندوميتاسين (10 ميكرومتر) و PGE1 (40 نانوغرام / مل).
  5. إعادة تعليق حبيبات الصفائح الدموية الناتجة في المخزن المؤقت ل Tyrode المعدل (145 mM NaCl ، 2.9 mM KCl ، 10 mM HEPES ، 1 mM MgCl2 ، 5 mM glucose ، pH 7.3) (37 °C) بكثافة 2 × 108 صفائح دموية / مل.
  6. بعد العزل، استرخ الصفائح الدموية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. أضف 5 ميكرومتر ثنائي إيثيل ديثيوكاربامات (DETC) و 25 ميكرومتر ديفيروكسامين إلى معلق الصفائح الدموية.
  8. بدون حضانة ، أضف 200 ميكرومتر 1-هيدروكسي-3-ميثوكسي كربونيل-2،2،5،5-رباعي ميثيل بيروليدين (CMH).
  9. قم بتحميل العينات على مقياس التجميع داخل أكواب التجميع (بما في ذلك مغناطيسات التحريك المطلية بالتفلون).
  10. بعد 1 دقيقة ، أضف المنبهات بالتركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 1 وحدة / مل ثرومبين أو 3 ميكروغرام / مل كولاجين). احتضان لمدة 10 دقائق.
  11. (اختياري) احصل على توليد أنيون الأكسيد الفائق في نقاط زمنية مختلفة بالانتقال إلى الخطوة 3.12 في الوقت المطلوب.
  12. انقل تعليق الصفائح الدموية من كوفيت التجميع إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وتدور بسرعة عند 6000 × جم لمدة 10 ثوان.
  13. قم بتحميل 50 ميكرولتر من المادة الطافية في ماصات دقيقة شعرية وختمها بشمع مانع للتسرب EPR.
  14. نقل العينات إلى الماسح الضوئي EPR.
  15. اضبط الماسح الضوئي EPR على النحو التالي: مجال المركز 3,492.5 جم ، مسح المجال 60 جم ، سعة التعديل 2 جم ، وقت المسح 10 ثوان ، عدد عمليات المسح 10 ، تردد الميكروويف 9.39 جيجاهرتز ، طاقة الميكروويف 20 ميجاوات ، وقت التحويل 327.68 مللي ثانية ، ثابت الوقت 5242.88 مللي ثانية.
  16. تقدير أكسدة CMH إلى CM ● كمنطقة تحت المنحنى (AUC) لقمم EPR المسجلة باستخدام المعلمات المذكورة أعلاه.
  17. قم ببناء منحنى معايرة يرسم شدة EPR المقاسة كما هو موضح في الخطوة 3.16 على المحور ص وتركيزات CM● المتاحة تجاريا على المحور السيني (على سبيل المثال ، 0 و 0.3 و 1 و 3 و 10 و 30 ميكرومتر).
  18. من تركيز CM● في العينات ، احصل على كمية أنيون الأكسيد الفائق الناتج عن الصفائح الدموية في العينات باستخدام الصيغ الموضحة في قسم النتائج التمثيلية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للكشف عن التدفق الخلوي لفلورة DHE ، نعرض نتائج تمثيلية للصفائح الدموية إما تستريح (الشكل 3 أ) أو يتم تحفيزها ب 0.1 وحدة / مل من الثرومبين (الشكل 3 ب). تم قياس ناتج O2 • - كشدة مضان متوسط الصفائح الدموية (MFI) ، كما هو موضح للتحفيز باستخدام 0.1 وحدة / مل من الثرومبين (الشكل 3C) أو 3 ميكروغرام / مل من الببتيد المرتبط بالكولاجين (CRP) (الشكل 3D). لوحظت زيادة بمقدار ضعفين / ثلاثة أضعاف في تلطيخ DHE نتيجة لتحفيز الصفائح الدموية. لتأكيد قياس O2 • - ، نقترح استخدام O2 • - ديسموتاز فائق أكسيد الزبال القابل للنفاذ (PEG-SOD ، 100 وحدة / مل) ، بينما لتحديد مصدر O2 • - استخدمنا مثبط أكاسيد النيتروجين VAS2870 (10 ميكرومتر). بالنسبة لكل من الكولاجين والثرومبين ، ألغى PEG-SOD و VAS2870 الزيادة في مضان DHE الناجم عن تنشيط الصفائح الدموية ، مما يؤكد أن القياس خاص ب O2 • - وأن مصادرها في هذه الظروف هي إنزيمات أكاسيد النيتروجين.

للكشف عن التصوير لفلورة DHE ، نقدم بيانات من التجارب التي تقيم توليد O2 • - في لحظة الالتصاق بالكولاجين أو الفيبرينوجين (و 10 دقائق التالية) (الشكل 4 أ) أو من التجارب التي تهدف إلى تقييم O2 • - جيل من الصفائح الدموية الملتصقة سابقا ب PLL عند التحفيز بالثرومبين (الشكل 4 ب). كما هو متوقع ، لا يؤدي الالتصاق ب PLL إلى إنتاج قوي ل O2 • -. على الأرجح لأن هذا الشكل من الالتصاق يعتمد على التفاعل الكهروستاتيكي دون بدء أي استجابة إشارة45 ، مما يجعل هذا النهج مناسبا لقياس إخراج O2 • - استجابة لإضافة ناهضات قابلة للذوبان. للتأكد من أن هذا البروتوكول يسمح بالكشف عن O2 • - ، يمكن استخدام إما الزبالين أو المثبطات الانتقائية. لقد أظهرنا في دراسات سابقة أن N-acetyl-cysteine (NAC) يمكنه التخلص من O2 • - وإلغاء مضان الصفائح الدموية في هذه التجارب46. هنا ، نظهر أن مثبط أكاسيد النيتروجين الانتقائي VAS2870 يخفف بشكل فعال وفوري من التألق في الصفائح الدموية الملتصقة بالكولاجين أو الفيبرينوجين (الشكل 4 أ) أو الاستجابة للثرومبين (الشكل 4 ب). هذا يشير إلى أن أكاسيد النيتروجين هي مصدر O2 • - في هذه الظروف التجريبية. يتم تضمين الأفلام التمثيلية لفلورة DHE (إثارة 405 نانومتر) استجابة للالتصاق بالكولاجين أو الفيبرينوجين أو التحفيز بواسطة الثرومبين للصفائح الدموية الملتصقة ب PLL كملف تكميلي 1 وملف تكميلي 2 وملف تكميلي 3 ، على التوالي. تجدر الإشارة إلى أن PEG-SOD ، الذي تم استخدامه بنجاح في الإعدادات التجريبية الأخرى كزبالO 2 • - ، ليس فعالا في هذا النوع من التجارب. ليس لدينا تفسير واضح لهذا في الوقت الحالي. يمكننا أن نفترض أن PEG-SOD يصل إلى المقصورات الخلوية التي يؤدي فيها O2 • - إلى زيادة التألق في المقايسات القائمة على التصوير إما بكفاءة ضعيفة أو حركية بطيئة. وقد يلزم إجراء مزيد من التحقيقات المركزة لتوضيح هذه النقطة.

طبقنا قياس O2 • - بواسطة EPR في الصفائح الدموية في دراسات مختلفة منشورة سابقا1،13،47،48،49،50. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لهذه التقنية في إعداد منحنى معايرة باستخدام CM ● المتاح تجاريا (أي ناتج التفاعل بين مسبار الدوران CMH و O2 • - والأنواع الرنانة المقاسة بواسطة EPR). يظهر تفاعل CMH و O2 • - في الشكل 5A ، وتظهر أمثلة تمثيلية لإشارة EPR المستحثة بتركيزات مختلفة من CM ● في الشكل 5B. تم استخدام البيانات من تركيزات CM ● المختلفة لبناء منحنى معايرة يصف الارتباط الخطي بين كمية CMH المؤكسدة وشدة إشارة EPR في العينات (الشكل 5C). تصف المعادلة أدناه العلاقة بين تركيز CM● وشدة إشارة EPR وهي نقطة البداية لحساب منحنى المعايرة للتجارب في هذه الدراسة (المعادلة 1):

figure-results-1

نظرا لأنه تم الحصول على كل من تركيزات CM ● وشدة EPR المقابلة لها تجريبيا ، يمكن حساب تقاطع المنحدر والمحور Y لمنحنى المعايرة. في المثال الموضح في الشكل 5C ، المنحدر = 1,002,169 والاعتراض = 596,383. لذلك ، يمكن إعادة كتابة معادلة منحنى المعايرة على النحو التالي:

figure-results-2

من خلال إعادة ترتيب المعادلة أعلاه ، من الممكن حساب تركيز CM ● لعينات مختلفة بناء على قيم كثافة EPR (المعادلة 2):

figure-results-3

بمجرد معرفة تركيز CM ● في العينات ، من الممكن حساب معدل توليده لكل صفيحة ووحدة زمنية بالمعادلة أدناه (المعادلة 3):

figure-results-4

باستخدام المعادلة 2 ، يمكن إعادة كتابة المعادلة 3 ك (المعادلة 4):

figure-results-5

والتي في المثال الموضح في الشكل 5C يمكن إعادة كتابتها على النحو التالي:

figure-results-6

سيتم التعبير عن معدل أكسدة CMH على شكل أتومولات CM● المتولدة لكل صفيحة في الدقيقة. يمكن استخدام هذه القيمة لمقارنة معدل توليد O2 • بين التجارب والمتبرعين ، وهو أمر غير ممكن مع مجسات الفلورسنت مثل DHE (أو DCFDA). تسمح مجسات الفلورسنت عموما فقط بتقدير تأثير الظروف المختلفة على توليد O2 • - كتغيرات في شدة التألق في نفس التجربة. بالنسبة لجميع التقنيات الموصوفة في هذه المقالة ، تم تأكيد خصوصية الكشف باستخدام كاسحات ROS (على سبيل المثال ، PEG-SOD ، NAC) أو مثبطات انتقائية للإنزيمات التي تولد أنيون فائق الأكسيد (على سبيل المثال ، VAS2870 تثبيط أكاسيد النيتروجين). هنا ، نقدم بيانات لتحفيز الصفائح الدموية (الشكل 6) مع الثرومبين (الشكل 6A ، C ، E) أو الكولاجين (الشكل 6B ، D ، F). بالنسبة لكلا الناهضين ، تم استخدام PEG-SOD لتأكيد اكتشاف O2 • - ، في حين أن عدم وجود تأثير ل pegylated-catalase (PEG-Cat.) يشير إلى أن بيروكسيد الهيدروجين لم يتم اكتشافه بواسطة هذه التقنية (الشكل 6C ، D ، على التوالي). VAS2870 يلغي إشارات الثرومبين (الشكل 6E) وإشارات EPR التي يسببها الكولاجين (الشكل 6F) ، مما يشير إلى أن أكاسيد النيتروجين هي المصدر الرئيسي للصفائح الدموية O2 • - استجابة لكل من هذه الناهضات.

figure-results-7
الشكل 1: تحليل التدفق الخلوي لمعلقات الصفائح الدموية. (أ) عرض نموذجي لمخططات التمدد الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) للصفائح الدموية المعزولة. (ب) يؤكد التلوين المناعي لمعلق الصفائح الدموية بجسم مضاد ل CD41 >98٪ من الجسيمات في التحضير على أنها صفائح دموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8
الشكل 2: التفاعل الكيميائي ل DHE مع أنيون الأكسيد الفائق وأنواع الأكسجين التفاعلية الأخرى والخصائص الطيفية لمنتجاته. التركيب والخصائص الطيفية ل DHE ومنتجي الأكسدة 2-هيدروكسي-إيثيديوم (2OH-Et+) ، الناتجة عن التفاعل مع أنيونات الأكسيد الفائق ، والإيثيديوم (Et+) ، الناتجة عن التفاعل مع أنواع أخرى من أنواع ROS (على سبيل المثال ، جذر الهيدروكسيل وبيروكسيد الهيدروجين). ذروة الإثارة عند 405 نانومتر ، والتي تم تمييزها بواسطة مستطيل أزرق متقطع في الشكل ، خاصة ب 2OH-Et + وبالتالي يمكن استخدامها للكشف عن / قياس O2 • -. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9
الشكل 3: توليد أنيون الأكسيد الفائق المعتمد على الثرومبين والكولاجين الذي تم اكتشافه بواسطة DHE وقياس التدفق الخلوي. الرسوم البيانية التمثيلية لتلطيخ DHE للصفائح الدموية (أ) الراحة و (ب) الصفائح الدموية المحفزة بالثرومبين. يشير الشريط إلى قيم تلطيخ DHE أقل من 500 ، وهي 70.7٪ و 16.1٪ للراحة والصفائح الدموية المحفزة بالثرومبين ، على التوالي. تم استخدام هذه التقنية لتقدير توليد أنيون الأكسيد الفائق في (C) 0.1 وحدة / مل ثرومبين و (D) 3 ميكروغرام / مل من الصفائح الدموية المحفزة بالكولاجين. تم استخدام PEG-SOD (100 وحدة / مل) لتأكيد قياس أنيونات الأكسيد الفائق في هذه التجربة ، بينما تم استخدام 10 ميكرومتر VAS2870 لتحديد إنزيمات أكاسيد النيتروجين كمصدر لأنيونات الأكسيد الفائق. تم حساب كل نقطة بيانات كمتوسط شدة مضان (MFI) من 50000 صفيحة ، وتكررت كل تجربة خمس مرات مستقلة (ن = 5) ، مع متوسط ± SEM الموضح في الرسوم البيانية. تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey البعدي للمقارنات الزوجية (** = p < 0.01 ، *** = p < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10
الشكل 4: توليد أنيون الأكسيد الفائق المعتمد على الكولاجين والفيبرينوجين والثرومبين الذي تم اكتشافه بواسطة التصوير الفلوري DHE. (أ) تم تقييم حركية توليد أنيون الأكسيد الفائق للصفائح الدموية الملتصقة إما بالكولاجين أو الفيبرينوجين. تم توزيع الصفائح الدموية على شرائح μ المطلية بعد دقيقة واحدة من بداية التصوير ، بينما تمت إضافة 10 ميكرومتر VAS2870 5 دقائق من بداية مجموعة الصور. ب: حركية توليد أنيون الأكسيد الفائق للصفائح الدموية عند التحفيز بالثرومبين. سمح للصفائح الدموية بالالتصاق بشرائح μ المغلفة ب PLL لمدة 10 دقائق قبل بداية جمع الصور. بعد 2 دقيقة ، تمت إضافة 0.1 وحدة / مل من الثرومبين ، وبعد 5 دقائق أخرى ، تمت إضافة 10 ميكرومتر VAS2870 (أي 7 دقائق من بداية التصوير). يتم تقديم المخطط التجريبي في الجزء العلوي من اللوحات ، بينما يتم عرض الصور التمثيلية من 0 دقيقة و 1 دقيقة و 3 دقائق و 6 دقائق و 9 دقائق في منتصف اللوحات. يظهر القياس الكمي لفلورة DHE أحادي الصفيحة في الجزء السفلي من الألواح وتم الحصول عليه عن طريق تحليل شدة التألق باستخدام ImageJ. البيانات هي متوسط ± SEM من 8-12 الصفائح الدموية لكل حالة في 4 تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-11
الشكل 5: منحنى المعايرة وحسابات معدل الأكسدة CMH. (أ) التركيب الكيميائي وخواص EPR ل CMH و CM ●. (ب) أمثلة تمثيلية لبيانات EPR لتركيزات مختلفة من CM● (100 نانومتر إلى 10 ميكرومتر). (ج) منحنى معايرة شدة EPR مقابل تركيز CM ● . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-12
الشكل 6: الكشف عن إنتاج أنيون الأكسيد الفائق بواسطة الصفائح الدموية عند تحفيز الثرومبين أو الكولاجين. تم قياس ناتج أنيون الأكسيد الفائق بواسطة EPR باستخدام مسبار الدوران CMH في الصفائح الدموية المحفزة إما ب (A) 0.1 وحدة / مل ثرومبين أو (B) 3 ميكروغرام / مل كولاجين. (ج، د) تم تضمين تركيز 100 وحدة / مل من كاسح أنيون الأكسيد الفائق PEG-SOD أو 100 وحدة / مل من الكاتالاز pegylated كاسح بيروكسيد الهيدروجين (PEG-Cat.) في الظروف التي تم اختبارها لكلا الناهضين. تم فحص مصدر أنيون الأكسيد الفائق عن طريق الحضانة المشتركة مع مثبط أكاسيد النيتروجين VAS2870 (10 ميكرومتر). يعتمد كل من (ه) الثرومبين والكولاجين (F) على نشاط أكاسيد النيتروجين لتوليد أنيون فائق الأكسيد. في جميع أنحاء الشكل ، تم حساب معدل تفاعل أنيون CMH / superoxide من آثار EPR ، كما هو موضح في المخطوطة (المعادلة 4). البيانات هي متوسط ± SEM من 5 (C ، D) و 4 تجارب مستقلة (E ، F). تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey البعدي للمقارنات الزوجية (** = p < 0.01 ، *** = p < 0.001). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: فيلم تمثيلي لتألق DHE (إثارة 405 نانومتر) استجابة للالتصاق بالكولاجين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: فيلم تمثيلي لفلورة DHE (إثارة 405 نانومتر) استجابة للالتصاق الفيبرينوجين. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: فيلم تمثيلي لفلورة DHE (إثارة 405 نانومتر) استجابة لتحفيز الثرومبين للصفائح الدموية الملتصقة ب PLL. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة ، نقدم ثلاث تقنيات مختلفة مع إمكانية تعزيز القدرة على التحقيق في التنظيم المعتمد على الأكسدة والاختزال لوظيفة الصفائح الدموية عن طريق الكشف الانتقائي عن O2 • -. الطريقتان الأوليان هما تحسين التقنيات الحالية بسبب مسبار الأكسدة والاختزال المستخدم (DHE بدلا من DCFDA الأكثر شيوعا ولكن الأقل موثوقية). وبالتالي ، يمكن الوصول إلى هذه التقنيات بسهولة ، ويمكن لمعظم المختبرات اعتمادها بفعالية دون معدات معينة أو تكاليف تدريب. تعتمد التقنية الثالثة على استخدام معدات متخصصة لتحليل أكسدة مسبار الدوران CMH بواسطة EPR. تتطلب هذه التقنية شراء معدات وكواشف متخصصة وتدريبا مخصصا لمستخدم المختبر. وبالتالي ، يبدو مناسبا للمختبرات التي تركز بشكل خاص على دراسة الأحداث المعتمدة على الأكسدة والاختزال في الصفائح الدموية (أو الخلايا الأخرى).

بالنسبة للتقنيات التي تستخدم DHE ، يعد اختيار الطول الموجي للإثارة أمرا بالغ الأهمية للحصول على الكشف المحدد عن O2 • -. 2-هيدروكسي إيثيديوم (2OH-Et+) الناتج عن تفاعل DHE مع O2 • - مثار عند 405 نانومتر ، في حين أن الإيثيديوم (Et+) الناتج عن التفاعل العام ل DHE مع ROS (على سبيل المثال ، جذر الهيدروكسيل وبيروكسيد الهيدروجين) له ذروة إثارة حوالي 520 نانومتر ولكن لا يوجد إثارة عند 405 نانومتر (الشكل 1)51. يحمي استخدام DHE بدلا من DCFDA من القطع الأثرية الناتجة عن التفاعل المباشر لهذا المسبار مع المكونات الخلوية مثل البيروكسيديز والإنزيمات الأخرى المحتوية على الهيم وعوامل تقليل أيونات المعادن42،43،44. تم اقتراح DHE كأداة أكثر أمانا لدراسات الأكسدة والاختزال الخلوي38,39. هنا ، نقترح استخدام DHE مع تقنيتين مختلفتين للقراءة: 1) قياس التدفق الخلوي و 2) التصوير الفلوري.

قياس التدفق الخلوي هو بشكل عام تقنية تسمح بالتعامل المعاصر مع عينات متعددة ذات إنتاجية منخفضة إلى متوسطة52. لسوء الحظ ، فإن النهج المستخدم في هذه الدراسة لا يسمح بتثبيت العينة. على الرغم من أن تخفيف العينات باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode المعدل على الجليد البارد يعمل على استقرار التألق في العينات لمدة تصل إلى 30 دقيقة ، إلا أنه يجب إجراء تحليل لجميع العينات في هذا الإطار الزمني. هذا يحد بشكل كبير من عدد العينات لكل تجربة. من الممكن إجراء العديد من التجارب التي يتم التحكم فيها داخليا في نفس اليوم واستخدام نفس تحضير الصفائح الدموية ، على الرغم من أنه يجب تطبيع النتائج مع الضوابط وعدم اعتبارها تجارب مستقلة. تم استخدام هذه التقنية من قبل مؤلفي هذه المخطوطة لتسليط الضوء على دور تعديل الصفائح الدموية المعتمد على الأكسدة والاختزال في الاستجابات لمختلف المنبهات والمعدلات46,50. يمكن تعديل هذه الطريقة من خلال اعتماد استخدام نسخة معدلة كيميائيا من DHE تسمح باستهداف الميتوكوندريا (أي Mitosox) 53 ، والتي تم استخدامها لدراسات الصفائح الدموية التي تركز على NOX254. هذه فرصة مثيرة للاهتمام لم تتبعها مختبراتنا بعد.

تتميز تقنية التصوير الفلوري باستخدام DHE المقترحة هنا بميزة تحديد المسار الزمني لتوليد O2 • - في الصفائح الدموية عند الالتصاق (ناهضات تمتص على سطح بئر التصوير) أو التحفيز (ناهضات في التعليق). وهذا يسمح بتفسير التفاعل بين المراحل المختلفة لعملية تنشيط الصفائح الدموية وتقييم مساهمة مصادر O2 • - المختلفة (على سبيل المثال ، الإنزيمات المختلفة المولدة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، على سبيل المثال ، أكاسيد النيتروجين). لا توجد تقنية حالية تسمح بهذا النوع من التحقيق. يأتي هذا بتكلفة من حيث إنتاجية الفحص ، حيث تستغرق كل حالة تم اختبارها 30 دقيقة (والتي تتضمن إعداد الشريحة μ ، والتركيز واختيار المجال ، والتصوير ، وتوفير البيانات). لذلك ، تسمح هذه التقنية باختبار عدد صغير من الحالات في يوم العمل (أي أقل من 10). على الرغم من استخدام مجهر متحد البؤر للبيانات الموضحة هنا ، فقد أكدنا أنه يمكن الحصول على نتائج جيدة بنفس القدر باستخدام مجهر التألق مع قدرة إثارة 405 نانومتر. هذا يقلل من متطلبات إعدادات الفحص المجهري متحد البؤر باهظة الثمن ويجعل هذه التقنية ميسورة التكلفة.

تم تطوير بروتوكول EPR بناء على دراسات سابقة في أنواع مختلفةمن الخلايا 55. تعرف هذه التقنية على نطاق واسع بأنها الأداة الأكثر موثوقية لدراسة توليد أنواع الأكسجين التفاعلية والتحقيق في الأحداث المعتمدة على الأكسدة والاختزال في الخلايا38. بالإضافة إلى الموثوقية الفائقة مقارنة بالتقنيات الأخرى نظرا لخصوصية تفاعل مجسات الدوران الهيدروكسيلامين مع الجذور الخالية من الأكسجين56 ، يسمح EPR بالقياس الكمي لمعدل توليد O 2 • ومقارنته بين الأفراد والتجارب المختلفة. هذا غير ممكن مع التقنيات القائمة على التألق ، والتي تسمح لنا فقط بتقدير تأثير الظروف المختارة على شدة التألق في تجربة واحدة وإعداد الصفائح الدموية. على الرغم من أن بروتوكول EPR هذا تم تطويره كتقنية للاندماج مع تراكم الصفائح الدموية للمراقبة المتوازية لتنشيط الصفائح الدموية و O2 • - الجيل1 ، يمكن إجراء هذه التجارب دون التحليل المتوازي للتجميع. حتى بدون تحليل مواز لتراكم الصفائح الدموية ، نقترح إجراء الحضانة في مقياس تجميع لضمان تحفيز فعال للصفائح الدموية ، الأمر الذي يتطلب إجهاد القص الذي يوفره التحريك المستمر. إذا كانت هناك حاجة لإجراء التجارب في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل دون تحريك ، فإن مستويات إنتاج O2 • - أقل بكثير. لذلك ، إذا تم اختيار هذا النهج التجريبي ، فإننا نقترح إجراء حضانة CMH على عجلة دوارة ومع صفائح دموية أكثر كثافة (أي 1 × 109 / مل) ، مما يؤدي إلى إشارة قوية بما يكفي للكشف بواسطة مطياف EPR.

باختصار ، نقدم هنا ثلاث تقنيات تم التحقق من صحتها للكشف عن O2 • - في الصفائح الدموية. أنها توفر مزايا مختلفة ويمكن اختيارها وفقا للأهداف والأولويات التجريبية. التقنية الأولى القائمة على استخدام DHE عن طريق قياس التدفق الخلوي هي الأقل شاقة وتستغرق وقتا طويلا ، وبالتالي يمكن اختيارها كتحليل للمبتدئين. التقنية الثانية ، القائمة على استخدام DHE بواسطة المجهر الفلوري ، تسمح بتقدير الحركية السريعة لتوليد O 2 • - ودراسة كيفية تأثير شلالات الإشارات المختلفة على الاستجابة المؤكسدة في مقياس زمني بالثواني (بينما تسمح التقنيات الأخرى فقط بالتحقيق في نقطة النهاية للأحداث التي تحدث في غضون دقائق من التحفيز). أخيرا ، يسمح EPR بالقياس الكمي لمعدل توليد O 2 • ومقارنته بين التجارب والأفراد. لهذا السبب ، فإن التقنية الأخيرة مفيدة بشكل خاص للدراسات السريرية التي تهدف إلى توصيف الاستجابة التأكسدية في الصفائح الدموية من أفراد مختلفين (على سبيل المثال ، مقارنة بين المرضى أو المرضى مقابل الضوابط الصحية). بشكل عام ، توفر هذه التقنيات الثلاث مزايا كبيرة على الطرق الحالية وتمثل تقدما كبيرا في الأدوات التجريبية المتاحة لنا لدراسة الأحداث المعتمدة على الأكسدة والاختزال في الصفائح الدموية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة القلب البريطانية (PG / 15/40/31522) ، وأبحاث الزهايمر في المملكة المتحدة (ARUK-PG2017A-3) ، ومنح مجلس البحوث الأوروبي (# 10102507) إلى G. Pula.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-هيدروكسي -3-ميثوكسي كربونيل -2،2،5،5-رباعي ميثيل بيروليدين (CMH)ناكسجين ساينس ترانسفير وتشخيص GmbHNOX-02.1-50mgكاشف ل EPR (مسبار تدوري)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAمقياس التدفق الخلوي
الأبقار مصل الألبومينMerck / SigmaA7030ل & -الشريحة طلاء
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH& nbsp ؛ NOX-E.11-BES مطياف EPR
كاتالازي– البولي إيثيلين جلايكول (PEG-Cat.)Merck / SigmaC4963كاسح بيروكسيد الهيدروجين (التحكم في الخصوصية)
ChronoLog موديل 490 + 4Labmedics / ChronologNAAggregometer
CM الجذريNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg   ؛كاشف EPR (التحكم في المعايرة)
ديفيروكسامين Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg  كاشف EPR
ثنائي إيثيل ديثيوكاربامات (DETC)   ؛Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g كاشف EPR
ثنائي هيدروإيثيديومثيرمو فيشر العلميD11347مسبار أنيون فائق أكسيد
ثنائي ميثيل سلفوكسيدميرك / سيجما34869لإعداد محلول المخزون   ؛
ألواح الشمع المانعة للتسرب EPR NoxygenScience trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMمستهلكة للمياه EPR
EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L & nbsp ؛كاشف EPR
Fibrinogen من البلازما البشريةMerck / SigmaF4883من أجل & mu - طلاء الشريحة
FITC المضاد للجسم المضاد CD41BioLegend303704تلطيخ الصفائح الدموية الخاص لقياس التدفق الخلوي
الكوفيت الزجاجي   ؛Labmedics / ChronologP / N 312مستهلكة للحضانة في مقياس
التجميع Horm CollagenLabmedics / ChronologP / N 385لتحفيز الصفائح
ImageJ & nbsp ؛المعاهد الوطنية للصحة (NIH) NAImageJ 1.53t (واين راسباند)
إندوميتاسينميرك / سيجماI7378لعزل الصفائح
الدموية الماصات الدقيقة DURAN 50 & micro ؛ لNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50 & micro ؛ Lمستهلكة ل EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck / SigmaP2658ل & mu - طلاء
الشريحة Prostaglandin E1 (PGE1) Merck/ SigmaP5515لعزل الصفائح
الدموية سترات الصوديوم (4٪ وزن / حجم محلول) Merck/ SigmaS5770لعزل الصفائح
الدموية قضبان التحريك (مطلية بالتفلون) Labmedics/ ChronologP / N 313مستهلكة للحضانة في مقياس التجميع
فائق أكسيد ديسموتاز &ndash ؛ البولي إيثيلين جلايكول (PEG-SOD) Merck/ SigmaS9549كاسح أنيون فائق أكسيد (التحكم في الخصوصية)
الثرومبين من البلازما البشريةMerck / SigmaT6884لتحفيز الصفائح الدموية وطلاء الشريحة
VAS2870مثبط أكاسيد النيتروجينEnzo Life ScienceBML-EI395
Zaiss 510 LSM مجهر متحد البؤرZeissNAمجهر متحد البؤر
الدموية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Superoxide Anion DetectionPlatelet FunctionReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryDihydroethidium ImagingElectron Paramagnetic ResonancePlatelet Rich PlasmaSpin Probe QuantificationPlatelet AdhesionNADPH Oxidases

مقالات ذات صلة