هنا ، نوضح بالتفصيل نهجا مباشرا للتصوير المباشر لتحديد حساسية عضويات الورم المشتقة من المريض للإشعاع المؤين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية الخلوية في عضويات الورم المشتقة من المريض
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العلاج الإشعاعي (RT) هو أحد الدعائم الأساسية لإدارة السرطان السريرية الحديثة. ومع ذلك ، ليست كل أنواع السرطان حساسة بنفس القدر للإشعاع ، غالبا (ولكن ليس دائما) بسبب الاختلافات في قدرة الخلايا الخبيثة على إصلاح تلف الحمض النووي التأكسدي كما تثيره الأشعة المؤينة. تم استخدام المقايسات المستنسخة لعقود من الزمن لتقييم حساسية الخلايا السرطانية المستزرعة للإشعاع المؤين ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن الخلايا السرطانية المشععة غالبا ما تموت بطريقة متأخرة يصعب تحديدها كميا باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي على المدى القصير أو تقنيات الفحص المجهري. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام المقايسات المستنسخة على هذا النحو لنماذج الورم الأكثر تعقيدا ، مثل عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs). في الواقع ، قد لا يؤدي تشعيع PDTOs الراسخة بالضرورة إلى إلغاء نموها كوحدات متعددة الخلايا ، ما لم يتم القضاء تماما على جزءها الشبيه بالجذع. علاوة على ذلك ، فإن تشعيع معلقات الخلية المفردة المشتقة من PDTO قد لا يلخص بشكل صحيح حساسية الخلايا الخبيثة ل RT في سياق PDTOs المنشأة. هنا ، نقوم بتفصيل تكييف المقايسات الاستنساخية التقليدية التي تنطوي على تعرض PDTOs الراسخة للإشعاع المؤين ، يليه تفكك الخلية الواحدة ، وإعادة الطلاء في ظروف الثقافة المناسبة والتصوير الحي. تعمل الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المشتقة من PDTO غير المشععة (الضابطة) على إصلاح PDTOs المتنامية بكفاءة خاصة ب PDTO ، والتي تتأثر سلبا بالإشعاع بطريقة تعتمد على الجرعة. في هذه الظروف ، يمكن قياس كفاءة تشكيل PDTO ومعدل النمو كمقياس للحساسية الإشعاعية على صور الفاصل الزمني التي تم جمعها حتى تحقق PDTOs التحكم إشغال مساحة محددة مسبقا.
المقدمة
يعد العلاج الإشعاعي الخارجي (RT) أحد الدعائم الأساسية لعلم الأورام الحديث ، حيث لا يعكس فقط نشاطا واضحا مضادا للسرطان مرتبطا بمجموعة محددة جيدا من الآثار الجانبية التي يمكن التحكم فيها بشكل عام1 ، ولكن أيضا التوافر السريري على نطاق واسع بشكل استثنائي (معظم مراكز السرطان في البلدان المتقدمة مجهزة بمسرعات خطية حديثة للشعاع الخارجي RT)2. تماشيا مع هذه الفكرة ، يتم استخدام RT عالميا بنجاح لكل من الأغراض العلاجية ، بشكل عام في سياق المرض في المرحلة المبكرة 3,4 ، والتطبيقات الملطفة ، لاحتواء الأعراض (مثل الألم) من الأورام النقيلية5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.
1. الثقافة العضوية
ملاحظة: تم إنشاء TNBC # 1 PDTOs في مختبرنا بناء على أنسجة الورم التي تمت إزالتها جراحيا من مريض مصاب بسرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) الذي قدم موافقة مستنيرة للمشاركة في بروتوكول البنوك الحيوية (IRB21-06023682). بعد التحقق من صحة الأنسجة وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) ، يتم استزراع TNBC # 1 PDTOs في 66٪ قطرات matrigel (ما يسمى "القباب") في وسط استزراع DMEM / F12 المخصب (الجدول 1) ويتم تمريرها كل 2-3 أسابيع بنسبة 1: 2-1: 1028
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعرضت TNBC # 1 PDTOs لجرعة إشعاعية واحدة من 0 (عناصر تحكم غير مشععة) ، 2 Gy ، 4 Gy ، 6 Gy ، 8 Gy ، أو 10 Gy في اليوم 0. بعد ذلك مباشرة ، تم فصل PDTOs للحصول على تعليق خلية واحدة لكل حالة تجريبية. تم بعد ذلك زرع الخلايا المشتقة من PDTO في 48 صفيحة بئر داخل قباب ماتريجل بنسبة 66٪ (50 ميكرولتر لكل منها) مودعة في وسط الآبار ، في 3 نسخ تقنية لكل حالة. تم وضع اللوحات في نظام تصوير مباشر وتصويرها كل 6 ساعات باستخدام هدف الوحدة العضوية 4X لمدة 30 يوما. أدى تشعيع TNBC # 1 PDTOs مع RT بجرعة واحدة من 2 Gy إلى تأخير كبير في إعادة نم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا ، نصف تكيفا للمقايسات التقليدية المستنسخة التي تسخر PDTOs لسرطان الثدي والتصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية ل PDTO بناء على (1) استمرار الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المكونة ل PTDO عند تشعيع PDTO في المختبر ، و (2) معدل نمو PDTOs التي (قد) تولدها هذه الخلايا. وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول ما يلي: (1) إنشاء محطات PDTO لشغل قبة تمكن من الصلاحية الجيدة ، (2) التعرض ل PDTO للإشعاع المؤين بجرعات مختلفة ، بما في ذلك ظروف التحكم المشععة الوهمية ؛ (3) تفكك PDTO إلى خلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وبغض النظر عن هذا العمل، فإن SCF لديها عقود بحثية مع ميرك، فاريان، بريستول مايرز سكويب ، سيلدكس، ريجينرون، إيساي، وإيلي ليلي، وحصلت على أتعاب استشارية / استشارية من باير، بريستول مايرز سكويب ، فاريان، إليكتا، ريجينرون، إيساي، أسترازينيكا، ميد إميون، ميرك يو إس ، إي إم دي سيرونو، أكوراي، بوهرنجر إنجلهايم، روش، جينينتيك، أسترازينيكا، فيو راي ونانوبيوتيكس. وبغض النظر عن هذا العمل، تلقت SD أتعابا استشارية من Lytix Biopharma و EMD Serono و Ono Pharmaceutical و Genentech و Johnson and Johnson Enterprise Innovation Inc. ، وهي / كانت تحمل عقودا بحثية مع Lytix Biopharma و Nanobiotix و Boehringer-Ingelheim. وبغض النظر عن هذا العمل، فإن إل جي تعقد عقودا بحثية مع Lytix Biopharma و Promontory و Onxeo، وقد تلقت أتعابا استشارية من Boehringer Ingelheim و AstraZeneca و OmniSEQ و Onxeo و The Longevity Labs و Inzen و Imvax و Sotio و Promontory و Noxopharm و EduCom ومؤسسة Luke Heller TECPR2 Foundation، وتمتلك خيارات أسهم Promontory.
شكر وتقدير
نشكر ريموند بريونيس وون إتش شين (كلية طب وايل كورنيل ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منحة اتحاد سرطان الثدي التحويلي من وزارة الدفاع الأمريكية BCRP (#W81XWH2120034 ، PI: Formenti).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 40 وميكرو ؛ مرشح شبكة | m Thomas Scientific | 1164H35 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| مقياس cellometer تلقائي T4 عداد خلية المجال الساطع | Nexcelom | ||
| DMEM F / 12 | Corning & nbsp ؛ | 12634-010 | |
| عامل نمو البشرة hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| EVOS FL مجهر فلوري مقلوب رقمي | ثيرمو فيشر العلمي | 12-563-460 | |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| FGF7 | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050061 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630-080 | |
| برنامج IncuCyte 2021A | Sartorius | : 2021A | |
| Incucyte SX1 | Sartorius | model SX1 | |
| Incucyte تم التحقق من صحة 48 لوحة بئر | Corning | 3548 | |
| Matrigel | Discovery Labware | 354230 | |
| nAc | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
| نيكوتيناميد | سيجما-ألدريتش | N0636 | |
| Noggin | تم شراؤها من معهد إنجلاندر للطب الدقيق ، وايل كورنيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية غير | ||
| المعالجة 6 ألواح | آبار Cellstar | 657 185 | |
| NR (Heregulin) | Peprotech | 100-03 | |
| p38 مثبط MAP p38i SB202190 | Sigma Aldrich & nbsp ؛ | S7067 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Rspondin Media | تم شراؤها من معهد إنجلاندر للطب الدقيق ، وايل كورنيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| منصة أبحاث إشعاع الصغيرة (SARRP) ؛ | Xstrahl Ltd | ||
| TGFbeta مثبط مستقبلات A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4٪) | Gibco | 15250-61 | |
| TrypLE | Gibco | 112605-028 | |
| Y-27632 (RhoKi) | Selleck | S1049 |
المراجع
- De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
- Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radi....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
