مقالة منهجية

التصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية الخلوية في عضويات الورم المشتقة من المريض

DOI:

10.3791/66680

⸱

أبريل 5, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نوضح بالتفصيل نهجا مباشرا للتصوير المباشر لتحديد حساسية عضويات الورم المشتقة من المريض للإشعاع المؤين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج الإشعاعي (RT) هو أحد الدعائم الأساسية لإدارة السرطان السريرية الحديثة. ومع ذلك ، ليست كل أنواع السرطان حساسة بنفس القدر للإشعاع ، غالبا (ولكن ليس دائما) بسبب الاختلافات في قدرة الخلايا الخبيثة على إصلاح تلف الحمض النووي التأكسدي كما تثيره الأشعة المؤينة. تم استخدام المقايسات المستنسخة لعقود من الزمن لتقييم حساسية الخلايا السرطانية المستزرعة للإشعاع المؤين ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن الخلايا السرطانية المشععة غالبا ما تموت بطريقة متأخرة يصعب تحديدها كميا باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي على المدى القصير أو تقنيات الفحص المجهري. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام المقايسات المستنسخة على هذا النحو لنماذج الورم الأكثر تعقيدا ، مثل عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs). في الواقع ، قد لا يؤدي تشعيع PDTOs الراسخة بالضرورة إلى إلغاء نموها كوحدات متعددة الخلايا ، ما لم يتم القضاء تماما على جزءها الشبيه بالجذع. علاوة على ذلك ، فإن تشعيع معلقات الخلية المفردة المشتقة من PDTO قد لا يلخص بشكل صحيح حساسية الخلايا الخبيثة ل RT في سياق PDTOs المنشأة. هنا ، نقوم بتفصيل تكييف المقايسات الاستنساخية التقليدية التي تنطوي على تعرض PDTOs الراسخة للإشعاع المؤين ، يليه تفكك الخلية الواحدة ، وإعادة الطلاء في ظروف الثقافة المناسبة والتصوير الحي. تعمل الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المشتقة من PDTO غير المشععة (الضابطة) على إصلاح PDTOs المتنامية بكفاءة خاصة ب PDTO ، والتي تتأثر سلبا بالإشعاع بطريقة تعتمد على الجرعة. في هذه الظروف ، يمكن قياس كفاءة تشكيل PDTO ومعدل النمو كمقياس للحساسية الإشعاعية على صور الفاصل الزمني التي تم جمعها حتى تحقق PDTOs التحكم إشغال مساحة محددة مسبقا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد العلاج الإشعاعي الخارجي (RT) أحد الدعائم الأساسية لعلم الأورام الحديث ، حيث لا يعكس فقط نشاطا واضحا مضادا للسرطان مرتبطا بمجموعة محددة جيدا من الآثار الجانبية التي يمكن التحكم فيها بشكل عام1 ، ولكن أيضا التوافر السريري على نطاق واسع بشكل استثنائي (معظم مراكز السرطان في البلدان المتقدمة مجهزة بمسرعات خطية حديثة للشعاع الخارجي RT)2. تماشيا مع هذه الفكرة ، يتم استخدام RT عالميا بنجاح لكل من الأغراض العلاجية ، بشكل عام في سياق المرض في المرحلة المبكرة 3,4 ، والتطبيقات الملطفة ، لاحتواء الأعراض (مثل الألم) من الأورام النقيلية5. ومع ذلك ، ليست كل الأورام الخبيثة حساسة بنفس القدر ل RT ، مما يعكس عددا من السمات الجوهرية للخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة6،7،8،9. كمثال مستقل ، ارتبطت العديد من التغيرات الجينية واللاجينية المرتبطة بالسرطان والتي تؤثر على إصلاح الحمض النووي وتوازن الأكسدة والاختزال بزيادة أو نقصان الحساسية الإشعاعية الجوهرية ، مما يعكس إلى حد كبير قدرة RT على قتل الخلايا السرطانية عن طريق التسبب في أضرار مباشرة وتفاعلية تعتمد على أنواع الأكسجين (ROS) للحمض النووي والجزيئات الكبيرة الأخرى10،11،12،13.

على مدى العقود الماضية ، تم استخدام المقايسات المستنسخة بشكل روتيني لتقييم الحساسية الإشعاعية للخلايا السرطانية البشرية والفئران المستزرعة14،15،16. في الواقع ، في حين أن العلاج الكيميائي والضغوطات الأخرى غالبا ما تقتل الخلايا الخبيثة بطريقة سريعة إلى حد ما ، فإن RT المستخدمة في الجرعات ذات الصلة سريريا غالبا ما تثير شكلا متأخرا من موت الخلايا لا يمكن قياسه ببساطة باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي على المدى القصير أو تقنيات الفحص المجهري ، مثل قياس الامتصاص الخلوي للأصباغ الحيوية (التي تلطخ الخلايا الميتة بشكل انتقائي) بعد 24-72 ساعة من التعرض لمحفز سام للخلايا17. إلى جانب كونها مباشرة وتعتمد على كواشف غير مكلفة إلى حد ما ، كانت المقايسات المستنسخة مريحة بشكل خاص لأنها تسمح بتنفيذ ما يسمى بالنموذج "التربيعي الخطي" ، وهو أداة رياضية بسيطة إلى حد ما للتحليل الكمي لاستجابة جرعة RT18,19. على نفس المنوال ، وفرت الخلايا السرطانية المستزرعة (بما في ذلك خطوط الخلايا الراسخة وكذلك الخلايا الأولية المشتقة من المريض) منصة ملائمة لاختبار جوانب مختلفة من بيولوجيا السرطان ، بما في ذلك (على سبيل المثال لا الحصر) الحساسية للعلاج بطريقة مباشرة إلى حد ما ولكنها مبسطة ، أحد القيود الرئيسية هو عدم وجود بيئة دقيقة منظمة للورم (TME) 20 ، 21. في الواقع ، فإن ثقافات الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد غير قادرة جوهريا على تلخيص اتصالات الخلايا الخلوية والتفاعلات مع المصفوفة خارج الخلية وكما تحدث في السرطان22,23. ظهرت عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs) كنماذج للورم تتحايل جزئيا على الأقل على هذا الحد24،25،26.

لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام المقايسات الاستنساخية التقليدية لتقييم الحساسية الإشعاعية ل PDTOs. من ناحية ، قد لا يؤدي تشعيع PDTOs المنشأة بالضرورة إلى الإضرار بنموها كوحدة متعددة الخلايا ، ما لم يتم القضاء تماما على حجرتها الشبيهة بالساق - المسؤولة عن تكوين ونضج PDTOs ولكنها تظهر مقاومة متزايدة لتلف الحمض النووي مقارنة بالخلايا المكونة ل PDTO الأكثر تمايزا27. من ناحية أخرى ، قد لا يلخص تشعيع معلقات الخلية المفردة المشتقة من PDTO بشكل صحيح الحساسية الإشعاعية للخلايا المكونة ل PDTO (بما في ذلك الخلايا الشبيهة بالجذعية) كما هو موضح في سياق PDTOs المشكلة. هنا ، نوضح بالتفصيل تقنية تسخر التصوير الحي لسرطان الثدي PDTOs لمراقبة فعالية تكوين PDTO ومعدل نمو الخلايا المشتقة من PDTO التي تعرضت سابقا للإشعاع المؤين مقارنة بنظيراتها غير المشععة. مع الاختلافات المطلوبة التي تعكس إلى حد كبير البيولوجيا التفاضلية ل PDTOs الفردية (على سبيل المثال ، متطلبات وسائط الاستزراع ، ومعدل النمو) ، نتوقع أن يكون هذا البروتوكول مناسبا لدراسة الحساسية للإشعاع في لوحة واسعة من PTDOs من أصل ثديي وغير ثديي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. الثقافة العضوية

ملاحظة: تم إنشاء TNBC # 1 PDTOs في مختبرنا بناء على أنسجة الورم التي تمت إزالتها جراحيا من مريض مصاب بسرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) الذي قدم موافقة مستنيرة للمشاركة في بروتوكول البنوك الحيوية (IRB21-06023682). بعد التحقق من صحة الأنسجة وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) ، يتم استزراع TNBC # 1 PDTOs في 66٪ قطرات matrigel (ما يسمى "القباب") في وسط استزراع DMEM / F12 المخصب (الجدول 1) ويتم تمريرها كل 2-3 أسابيع بنسبة 1: 2-1: 1028.

  1. بذور PDTOs بنسبة 1: 2-1: 10 قبل حوالي أسبوعين من التشعيع في ألواح منفصلة غير ملتصقة من 6 آبار ، واحدة لكل جرعة إشعاعية تم اختبارها (بالإضافة إلى الضوابط السلبية ، والتي سيتم توفيرها بواسطة PDTOs غير المعرضة للإشعاع المؤين).
  2. أضف 3 مل من وسط الاستزراع DMEM / F12 المخصب الطازج إلى PDTOs كل 3-4 أيام.
    ملاحظة: قد تتطلب ظروف البذر والاستزراع بعض التكيف لمنع PDTOs من الحصول على مظهر يشبه الحلقة يمكن التعرف عليه للغاية والذي يدل على نخر القلب تحت المجهر ولضمان الصلاحية المثلى عند التشعيع.

2. الإشعاع

  1. تكون PDTOs جاهزة للإشعاع بمجرد وصولها إلى متوسط الحجم (حوالي 100 ميكرومتر ، كما هو محدد مبدئيا تحت المجهر المجهري للمجال الساطع مع مرجع مقياس) وإشغال القبة (حوالي 80٪). تمرير PDTOs في هذه المرحلة لتجنب الاكتظاظ.
  2. قم بإشعاع القباب المحتوية على PDTO باستخدام جهاز تشعيع منصة إشعاع أبحاث الصغيرة (SARRP) (أو جهاز تشعيع بديل للتطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي ) في وضع المجال المفتوح (بدون ميزاء) ، مما يوفر جرعات مفردة من 2 Gy و 4 Gy و 6 Gy و 8 Gy و 10 Gy. توفر PDTOs غير المشععة ظروف تحكم سلبية مناسبة.
    ملاحظة: يجب إجراء معايرة اختبار قياس الجرعات قبل كل تجربة لضمان تلقي PDTOs المغلقة ب Matrigel جرعة الإشعاع المخطط لها. تم اختيار هذه الجرعات بناء على التقييمات الأولية للحساسية الإشعاعية ل TNBC # 1 PDTOs ، وبالتالي ، قد تتطلب تعديلات على PDTOs الأخرى.

3. التفكك

  1. بعد التشعيع مباشرة ، اغسل كل قبة تحتوي على مادة مثقلة تحتوي على PDTO ب 2 مل من وسط الاستزراع DMEM / F12 المخصب وأعد تعليقها في 1-3 مل من TrypL-E باستخدام ماصة ميكروية p1000. كرر حوالي 30 مرة لكل بئر.
  2. جمع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل واحتضان لمدة ~ 5 دقائق في حمام مائي في 37 °C.
  3. قم بتجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإزالة TrypL-E الزائد لترك ~ 1 مل في الأنبوب وإضافة 3 أضعاف حجم الإنزيم الأصلي (انظر الخطوة 3.1) من وسط DMEM / F12 المخصب لغسل الخلايا.
  5. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح شبكي 40 ميكرومتر. تضمن هذه الخطوة عدم بقاء أي مجموعات خلايا عند الطلاء وأن كل PDTO جديد ينشأ من خلية واحدة.
  6. عد الخلايا في عداد الخلايا الآلي عند تلطيخها بنسبة 10٪ من التريبان الأزرق في PBS ، وأعد تعليقها لتحتوي على 800 خلية في 50 ميكرولتر من وسط DMEM / F12 المخصب بالإضافة إلى 66٪ matrigel عند 4 درجات مئوية (شروط قبة واحدة).
  7. ضع كل قبة في بئر فردي من لوحة استزراع 48 بئرا متوافقة مع التصوير الحي مع تجنب تكوين الفقاعات. يوصى باستخدام ثلاث نسخ تقنية لكل جرعة إشعاعية.
  8. ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة لتصلب matrigel.
  9. أضف 0.5-1 مل من وسط DMEM / F12 المخصب ، وقم بإزالة الفقاعات المحتملة ، وضع الألواح في نظام التصوير المباشر داخل حاضنة زراعة الخلايا. دع اللوحة تتوازن مع درجة الحرارة المحددة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير.
    ملاحظة: يتجمد Matrigel عند درجات حرارة >4 درجة مئوية ، مما يعني أنه يجب الحفاظ على درجة الحرارة هذه حتى يلزم التصلب.

4. التصوير المباشر

  1. في برنامج Incucyte، حدد جدولة إلى اكتساب.
  2. انقر فوق علامة الجمع في الزاوية اليسرى العليا من إطلاق إضافة سفينة.
  3. للمسح الضوئي بشكل متكرر أو مرة واحدة ، حدد المسح الضوئي في الجدول ، ثم انقر فوق التالي.
  4. لإنشاء سفينة أو استعادتها ، حدد إنشاء سفينة جديدة ، ثم انقر فوق التالي.
  5. لتحديد نوع الفحص ، حدد عضوي ، ثم انقر فوق التالي.
  6. إعدادات المسح الضوئي: اختر QC < 'Phase + قنوات صورة Brightfield. يتم تحديد "هدف 4x" تلقائيا. ثم انقر فوق التالي.
  7. اختيار السفينة: اختر اللوحة المناسبة التي تم التحقق من صحتها من قبل البرنامج وفقا لرقم الكتالوج.
  8. موقع السفينة: حدد موقع اللوحة على الجهاز وفقا للتخطيط ، ثم انقر فوق التالي.
  9. نمط المسح الضوئي: حدد الآبار وفقا لتخطيط اللوحة ، ثم انقر فوق التالي.
  10. دفتر السفينة: لوحة الاسم (اختياري: اسم نوع الخلية والممر). قم بإنشاء خريطة لوحة من خلال النقر على علامة الجمع في الزاوية اليمنى العليا من تخطيط اللوحة ، "إنشاء خريطة لوحة".
  11. في محرر خريطة اللوحة ، أشر إلى نوع الخلية بالنقر فوق رمز إنشاء خلية جديدة في قسم الخلايا ، وقم بتطبيقه على الآبار المناسبة بالنقر فوق رمز علامة الجمع ، وحدد الآبار المناسبة. اختياري: يمكن الإشارة إلى عدد الخلايا والممرات المصنفة. كرر لكل سطر خلية.
  12. أشر إلى العلاج بالنقر فوق رمز إنشاء خلية جديدة في قسم ظروف النمو ، وتقدم بطلب إلى الآبار المناسبة بالنقر فوق رمز علامة الجمع ، وحدد الآبار المناسبة. كرر لكل حالة تجريبية. بعد ذلك ، انقر فوق حسنا > التالي.
  13. إعداد التحليل: يتم تحديد "تأجيل التحليل إلى وقت لاحق" تلقائيا ؛ انقر فوق التالي.
  14. جدول المسح الضوئي: اختر المسح الضوئي مرتين في اليوم ، إلى أجل غير مسمى. انقر فوق التالي. راقب ظلام PDTOs للتحكم للحصول على نقطة نهاية مثالية ، لأنها تميل إلى الانهيار عند النمو.
  15. ملخص: تحقق من الملخص وانقر على إضافة إلى الجدولة.
    ملاحظة: يمكن تصور خصائص المسح الضوئي ، ويمكن تحرير الجدول إذا لزم الأمر عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على المخطط الزمني للمسح.

5. التحليل

  1. في البرنامج المتوافق، حدد عرض. يمكن أيضا تشغيل هذا من جهاز كمبيوتر متصل بالنظام عبر الإنترانت.
  2. حدد التجربة المطلوبة بالنقر المزدوج عليها.
  3. حدد أيقونة تحليل التشغيل .
  4. حدد تعريف إنشاء تحليل جديد ، ثم انقر فوق التالي.
  5. نوع التحليل: حدد عضوي ، وانقر فوق التالي.
  6. قنوات الصورة: يتم تحديد "المرحلة + برايتفيلد" افتراضيا ، انقر فوق "التالي".
  7. حدد مجموعة من الصور التمثيلية للتحليل. انقر فوق التالي. يوصى باختيار النقاط الزمنية المبكرة والمتأخرة وظروف العلاج المختلفة ، على سبيل المثال ، التحكم وجرعات الإشعاع المختلفة.
  8. قم بإجراء تعريف التحليل ل TNBC # 1 باتباع الخطوات التالية:
    1. على الصورة: حدد معاينة الحالية أو "معاينة الكل" لتصور القناع الافتراضي للصور الحالية أو المحددة. كرر كما يتم تغيير معلمات التحليل لتحديث القناع.
    2. التجزئة: اضبط نصف القطر على 300، وخلفية الحساسية على 80، وتقسيم الحافة على تشغيل، وحساسية الحافة على 70.
    3. التنظيف: اضبط ملء الفتحة على 5E + 05 ميكرومتر2 واضبط الحجم على 0 بكسل.
    4. مرشحات: اضبط لا يوجد حد أدنى أو أقصى للمساحة ، والحد الأدنى للانحراف المركزي مضبوطا على 0.19 ، ولا يوجد حد أقصى للانحراف. انقر فوق التالي.
  9. أوقات المسح والآبار: حدد جميع النقاط الزمنية والآبار المطلوبة للمسح. انقر فوق التالي. اختياري: حدد تحليل عمليات الفحص المستقبلية.
  10. حفظ وتطبيق تعريف التحليل: أدخل اسم التعريف ، وانقر فوق التالي.
  11. تصور الملخص ، وانقر فوق إنهاء.
  12. تظهر نافذة منبثقة لإعلام المستخدم بأن التحليل قد دخل في قائمة انتظار التحليل. انقر فوق موافق. بمجرد فتح نافذة قائمة انتظار التحليل، يمكن تصور المهام المتبقية.
  13. إذا لزم الأمر ، استرجع التحليل المكتمل في العرض عن طريق تحديد السهم الأزرق في عمود التحليلات ، بجوار اسم السفينة ، والنقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم تعريف التحليل. بعد ذلك ، إما تصور البيانات الأولية على البرنامج بالنقر فوق مقاييس تحليل الرسم البياني ، أو التصدير لمزيد من التحليل عن طريق تحديد تعريف تحليل التصدير.
    ملاحظة: يمكن تخصيص تصدير البيانات الأولية في نافذة مقاييس تحليل الرسم البياني . يمكن تصدير العدد العضوي والمساحة الإجمالية ومتوسط الانحراف والظلام بشكل منفصل ، وتنظيم البيانات في القائمة المنسدلة تحديد التجميع بالنقر فوق لا شيء أو أعمدة أو صفوف أو نسخ خريطة اللوحة. بالنسبة إلى TNBC # 1 ، لتصدير البيانات الأولية ، ومقاييس تحليل الرسم البياني ، ولخيار التدحرج تحديد التجميع ، تم اختيار الخيار بلا . تم اختيار معلمات الاستيراد هذه بناء على التقييمات الأولية مع TNBC # 1 PDTOs. وبالتالي قد تتطلب تعديلات على PDTOs الأخرى ، وهو أمر ممكن على البرنامج بناء على ميزات "المعاينة". نوصي بتكييف معلمات الاستيراد على (1) الصور المبكرة التي تحتوي في الغالب على خلايا مفردة أو PDTOs صغيرة ، و (2) الصور التي تم جمعها في نقاط زمنية متأخرة لضمان الحصول على PDTOs الكبيرة أيضا في كل من ظروف التحكم والمعالجة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرضت TNBC # 1 PDTOs لجرعة إشعاعية واحدة من 0 (عناصر تحكم غير مشععة) ، 2 Gy ، 4 Gy ، 6 Gy ، 8 Gy ، أو 10 Gy في اليوم 0. بعد ذلك مباشرة ، تم فصل PDTOs للحصول على تعليق خلية واحدة لكل حالة تجريبية. تم بعد ذلك زرع الخلايا المشتقة من PDTO في 48 صفيحة بئر داخل قباب ماتريجل بنسبة 66٪ (50 ميكرولتر لكل منها) مودعة في وسط الآبار ، في 3 نسخ تقنية لكل حالة. تم وضع اللوحات في نظام تصوير مباشر وتصويرها كل 6 ساعات باستخدام هدف الوحدة العضوية 4X لمدة 30 يوما. أدى تشعيع TNBC # 1 PDTOs مع RT بجرعة واحدة من 2 Gy إلى تأخير كبير في إعادة نمو PDTO ، بينما أدت جرعات الإشعاع ≥4 Gy (حتى 10 Gy) المكتملة إلى منع تجديد PDTOs المتنامية (الشكل 1).

figure-results-1
الشكل 1: التصوير الحي لعضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs). سرطان الثدي تركت عضويات الورم المشتقة من المريض TNBC # 1 (PDTOs) دون علاج أو تعرضت لجرعة الإشعاع المشار إليها ، تليها فترة وجيزة التفكك وإعادة الطلاء والتصوير باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية. يتم الإبلاغ عن الصور التمثيلية عند تعديل التباين (A) والتقييمات الكمية (B ، المتوسط ± SEM). مقياس الصورة: 1.19 × 1.16 مم (1.38 مم2). شريط المقياس: 400 ميكرومتر ؛ الإدخالات: 200 ميكرومتر. **** p < 0.001 (ANOVA ثنائي الاتجاه ، مقارنة ب 0 Gy) ؛ ####p < 0.001 (ANOVA ثنائي الاتجاه ، مقارنة ب 2 Gy). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكونتركيز
DMEM F/121X
جلوتاماكس1X
هيبس10 مللي متر
بنسترب100 وحدة / مل
ب 271X
1.25 مللي متر
نيكوتيناميد10 مللي متر
مثبط مستقبلات TGFbeta A83-010.5 ميكرومتر
مثبط p38 MAP p38i SB2021901 ميكرومتر
راس10%
رسبوندين ميديا10%
إف جي إف 1020 نانوغرام / مل
إف جي إف 75 نانوغرام / مل
NR (هيريجولين)5 نانومتر
بريموسين100 ميكروغرام / مل
Y-27632 (روكي)5 ميكرومتر
عامل نمو البشرة hEGF5 نانوغرام / مل

الجدول 1: تكوين وسط ثقافة PDTO.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف تكيفا للمقايسات التقليدية المستنسخة التي تسخر PDTOs لسرطان الثدي والتصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية ل PDTO بناء على (1) استمرار الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المكونة ل PTDO عند تشعيع PDTO في المختبر ، و (2) معدل نمو PDTOs التي (قد) تولدها هذه الخلايا. وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول ما يلي: (1) إنشاء محطات PDTO لشغل قبة تمكن من الصلاحية الجيدة ، (2) التعرض ل PDTO للإشعاع المؤين بجرعات مختلفة ، بما في ذلك ظروف التحكم المشععة الوهمية ؛ (3) تفكك PDTO إلى خلايا مفردة ؛ (4) إعادة طلاء الخلايا المفردة المشتقة من PDTO ؛ و (5) التصوير الحي حتى إشغال قبة محددة مسبقا في ظروف التحكم.

مع الحد الأدنى من التعديلات ، المرتبطة في الغالب بكفاءة تشكيل PDTO ومعدل نمو PDTO في ظروف التحكم (والتي من المحتمل أن تختلف اختلافا كبيرا عبر PDTOs المختلفة) ، نتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتكيف مع العديد من منصات التصوير المباشر المتاحة تجاريا ، بالإضافة إلى العديد من PDTOs ، من كل من الاشتقاق الثديي وغير الثديي. من ناحية ، من المتوقع أن تؤثر كفاءة تشكيل PDTO الأساسية عند تشتت الخلية الواحدة على عدد الخلايا المفردة التي سيتم إعادة زرعها للحصول على PDTOs جديدة بكثافة لا تمكن فقط من القياس الكمي ل PDTO القائم على الصور ولكن أيضا النمو الطبيعي ل PDTOs غير المعالجة. من ناحية أخرى ، من المتوقع أن يؤثر معدل نمو PDTO على مدة الفحص ، حيث يجب تجنب دمج PDTOs المجاورة للحفاظ على القدرات التحليلية المثلى. وبالتالي ، فإن تحديد كفاءة تشكيل PDTO ومعدل نمو PDTO في ظروف التحكم لكل PDTO فردي أمر بالغ الأهمية للتنفيذ الصحيح لهذا البروتوكول.

بينما وجد أن هذه الطريقة واضحة إلى حد ما ، إلا أن لها بعض القيود. أولا ، قد يؤدي العدد المنخفض للغاية من الخلايا المكونة ل PDTO إلى إضعاف تجديد PDTOs التي تنمو بشكل طبيعي عند تفكك الخلية الواحدة. في الواقع ، في حين يمكن تحقيق تمرير PDTO الروتيني عن طريق التفكك غير الكامل ، تعتمد التقييمات الكمية ، كما هو منصوص عليه في هذا البروتوكول ، على توليد تعليق أحادي الخلية (والذي يمكن تأكيده بصريا أثناء العد). ثانيا، قد يؤدي معدل النمو البطيء بشكل مفرط إلى إطالة مدة الفحص بشكل كبير ويحتمل أن يؤدي إلى تقدير غير دقيق للحساسية الإشعاعية. من المتصور بالفعل أن وقت الاستزراع الممتد كما هو مطلوب ل PDTOs بطيئة النمو للوصول إلى حجم متوافق مع نقطة النهاية قد يوفر فرصا إضافية للخلايا المكونة ل PDTO المشععة تحت الإشعاع للتعافي من الإجهاد واستعادة PDTOs التي يمكن اكتشافها (على الرغم من أنها بطيئة النمو). أخيرا ، من المتوقع أن يؤدي فصل PDTOs بعد فترة وجيزة من التشعيع إلى فرض ضغط إضافي على الخلايا المكونة ل PDTO ، مما قد يزيد من الحساسية الإشعاعية نتيجة لاتصالات الخلايا الخلوية المتغيرة في المراحل المبكرة من التعافي. قد يوفر تأخير التفكك لمدة 24-72 ساعة نظرة ثاقبة للمساهمة النسبية لاتصالات الخلايا الخلوية المحفوظة في قدرة الخلايا المكونة ل PDTO على التعافي من الضرر الجزيئي الكبير كما يفرضه RT.

بينما توفر منصات التصوير المباشر طريقة ملائمة لمراقبة تكوين PDTO ونموه طوليا ، يمكن أيضا استخدام صور نقطة النهاية الفردية لنفس الهدف. في هذه الحالة ، يجب الانتباه لضمان عدم دمج PDTOs المجاورة قبل التصوير ، ويمكن تقييم معدل النمو كدالة لحجم PDTO الطبيعي لمدة الفحص.

في عصر طب السرطان الشخصي ، يعد تقييم حساسية الأورام الفردية للعلاج أمرا في غاية الأهمية لأنه يوفر بعض التلميحات لتصميم استراتيجيات علاجية فردية مع تحسين الفعالية29. يتناسب البروتوكول الموصوف هنا مع هذا المسعى من خلال توفير نهج مناسب لتقدير الحساسية الخلوية ل PDTOs الفردية للإشعاع المؤين (بمفرده أو جنبا إلى جنب مع طرق علاجية أخرى). ومع ذلك ، لا يزال يتعين إثبات ما إذا كان قياس الحساسية الإشعاعية للخلايا السرطانية من PDTOs يتنبأ بدقة باستجابة المرضى الفرديين المصابين بالسرطان ل RT البؤري. إن ربط الحساسية الإشعاعية ل PDTOs المتميزة بالإشعاع مع الاستجابة السريرية ل RT من الجهات المانحة المعنية سيوفر رؤى مهمة حول هذا الاحتمال.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وبغض النظر عن هذا العمل، فإن SCF لديها عقود بحثية مع ميرك، فاريان، بريستول مايرز سكويب ، سيلدكس، ريجينرون، إيساي، وإيلي ليلي، وحصلت على أتعاب استشارية / استشارية من باير، بريستول مايرز سكويب ، فاريان، إليكتا، ريجينرون، إيساي، أسترازينيكا، ميد إميون، ميرك يو إس ، إي إم دي سيرونو، أكوراي، بوهرنجر إنجلهايم، روش، جينينتيك، أسترازينيكا، فيو راي ونانوبيوتيكس. وبغض النظر عن هذا العمل، تلقت SD أتعابا استشارية من Lytix Biopharma و EMD Serono و Ono Pharmaceutical و Genentech و Johnson and Johnson Enterprise Innovation Inc. ، وهي / كانت تحمل عقودا بحثية مع Lytix Biopharma و Nanobiotix و Boehringer-Ingelheim. وبغض النظر عن هذا العمل، فإن إل جي تعقد عقودا بحثية مع Lytix Biopharma و Promontory و Onxeo، وقد تلقت أتعابا استشارية من Boehringer Ingelheim و AstraZeneca و OmniSEQ و Onxeo و The Longevity Labs و Inzen و Imvax و Sotio و Promontory و Noxopharm و EduCom ومؤسسة Luke Heller TECPR2 Foundation، وتمتلك خيارات أسهم Promontory.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ريموند بريونيس وون إتش شين (كلية طب وايل كورنيل ، نيويورك ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) على مساعدتهم في تطوير هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منحة اتحاد سرطان الثدي التحويلي من وزارة الدفاع الأمريكية BCRP (#W81XWH2120034 ، PI: Formenti).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
40 وميكرو ؛ مرشح شبكةm Thomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
مقياس cellometer تلقائي T4 عداد خلية المجال الساطعNexcelom
DMEM F / 12Corning & nbsp ؛12634-010
عامل نمو البشرة hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL مجهر فلوري مقلوب رقمي ثيرمو فيشر العلمي12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 35050061
HepesInvitrogen 15630-080
برنامج IncuCyte 2021ASartorius: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodel SX1
Incucyte تم التحقق من صحة 48 لوحة بئرCorning 3548
MatrigelDiscovery Labware354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
نيكوتيناميدسيجما-ألدريتشN0636
Nogginتم شراؤها من معهد إنجلاندر للطب الدقيق ، وايل كورنيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية غير
المعالجة 6 ألواحآبار Cellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 مثبط MAP p38i SB202190Sigma Aldrich & nbsp ؛S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin Mediaتم شراؤها من معهد إنجلاندر للطب الدقيق ، وايل كورنيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية
منصة أبحاث إشعاع الصغيرة (SARRP)   ؛Xstrahl Ltd
TGFbeta مثبط مستقبلات A83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4٪)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
إصدار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cellular RadiosensitivityTumor OrganoidsLive ImagingClonogenic AssayRadiation TherapyPatient Derived OrganoidsIonizing IrradiationOrganoid Growth RateStem Like CellsPersonalized Medicine

مقالات ذات صلة