مقالة منهجية

عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

يونيو 21, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا البطانية للفأر عن البنكرياس الكامل.

الملخص

البنكرياس هو عضو حيوي للحفاظ على التوازن الأيضي داخل الجسم ، ويرجع ذلك جزئيا إلى إنتاجه للهرمونات الأيضية مثل الأنسولين والجلوكاجون ، وكذلك الإنزيمات الهاضمة. البنكرياس هو أيضا عضو شديد الأوعية الدموية ، وهي ميزة تسهلها الشبكة المعقدة للشعيرات الدموية في البنكرياس. تتكون هذه الشبكة الشعرية الواسعة من خلايا بطانية عالية الدقة (ECs) مهمة لنمو البنكرياس ووظيفته. وفقا لذلك ، يمكن أن يساهم الخلل الوظيفي في ECs في مرض البنكرياس في أمراض مثل مرض السكري والسرطان. وبالتالي ، فإن البحث في وظيفة ECs البنكرياس (pECs) مهم ليس فقط لفهم بيولوجيا البنكرياس ولكن أيضا لتطوير أمراضه. نماذج الفئران هي أدوات قيمة لدراسة أمراض التمثيل الغذائي والقلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لم يكن هناك بروتوكول محدد يحتوي على تفاصيل كافية موصوفة لعزل pECs للفأر بسبب قلة عدد السكان نسبيا من ECs والإنزيمات الهاضمة الوفيرة التي يحتمل أن يتم إطلاقها من الأنسجة الأسينار والتي يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا ، وبالتالي انخفاض الإنتاجية. لمواجهة هذه التحديات ، ابتكرنا بروتوكولا لإثراء واستعادة pECs للفأر ، يجمع بين التفكك الفيزيائي والكيميائي اللطيف والاختيار بوساطة الأجسام المضادة. يوفر البروتوكول المقدم هنا طريقة قوية لاستخراج ECs سليمة وقابلة للحياة من بنكرياس الفأر بأكمله. هذا البروتوكول مناسب لفحوصات المصب المتعددة ويمكن تطبيقه على نماذج الماوس المختلفة.

المقدمة

البنكرياس ، مفتاح التحكم في التمثيل الغذائي والتوازن ، هو عضو شديد الأوعية الدموية. يحتوي البنكرياس على وظائف الغدد الصماء والإفرازات ، مما يتحكم في تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم والإنزيمات الهاضمة ، على التوالي. ترتبط هاتان الجزءان معا من خلال شبكة واسعة من الأوعية الدموية في البنكرياس ، مما يسهل تبادل ونقل الأكسجين والهرمونات والإنزيمات. بشكل حاسم ، تخترق هذه الشبكة الشعرية الكثيفة جزيرة لانجرهانز ، وهي مجموعة من الخلايا المنظمة للهرمونات داخل البنكرياس المسؤولة عن وظيفة الغدد الصماء ، وتتكون من خلايا ألفا (α) التي تفرز الجلوكاجون ، وخلايا بيتا (β) التي تفرز الأنسولين وخلايا دلتا (δ) التي تفرز السوماتوستاتين1،2. على الرغم من أن الجزر تشكل 1-2٪ فقط من كتلة البنكرياس ، إلا أنها تتلقى 20٪ من إجمالي تدفق الدم3 ، مما يسلط الضوء على أهمية الأوعية الدموية في الجزيرة. تتكون الشعيرات الدموية البنكرياس بشكل أساسي من خلايا بطانية عالية الكثافة (ECs) ، محاطة بخلايا محيطية جدارية تلعب هذه المحيطات الشعرية دورا حيويا في تطور الجزيرة ، والنضج ، ووظيفة (dys) وتشكل أحاديث متبادلة حميمة مع العديد من الخلايا الداخلية والخارجية4 (الشكل 1).

لوحظ الخلل البطاني في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 ، وهي الحالات الأكثر شيوعا التي يسببها خلل في جزيرة البنكرياس5،6. يمكن تغيير كل من كثافة الأوعية الدموية الدقيقة والتشكل في مرض السكري7. علاوة على ذلك ، يتميز سرطان البنكرياس ، وهو ورم شديد العدوانية يمكن أن يتجلى أيضا في مرض السكري ، بكثافة عالية للأوعية الدموية الدقيقة مع ضعف التروية8. بالنظر إلى الأدوار الهيكلية والوظيفية المحورية ل ECs في كل من أنسجة البنكرياس الطبيعية والمريضة ، هناك حاجة ذات صلة لدراسة pECs في التطور وعلم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض للكشف عن الآليات التي تقود الصحة أو الأمراض.

تم تطوير العديد من البروتوكولات لعزل ECs عن الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، الدماغ9،10 ، الرئة11 ، القلب12 ، الكبد13 ، عضلات الهيكلالعظمي 14 ، والأنسجة الدهنية15) والإنسان (على سبيل المثال ، الدماغ16 ، والأنسجة الدهنية الحشوية17،18 ، والأعصاب الطرفية19 ، والرئة20،21،22 ، والشريان المساريقي23) الأنسجة. تتضمن هذه البروتوكولات عادة استخدام عمليات الهضم الأنزيمية (على سبيل المثال ، عن طريق الكولاجيناز ، والتربسين24 ، والتباين24 ، 25 ، وليبيراز26) ، متبوعة بخطوة تخصيب قائمة على الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، تميل هذه البروتوكولات إلى الاعتماد على فترات طويلة من الهضم بتركيزات عالية من الإنزيمات مع تحريض قوي عند 37 درجة مئوية (الجدول 1). نظرا للسمات الفريدة للبنكرياس ، بما في ذلك أنه يضم عددا كبيرا من الإنزيمات الهاضمة الذاتية ، لا يمكن تطبيق هذه البروتوكولات الحالية مباشرة لعزل pECs. أولا ، يختلف تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) للبنكرياس عن الأنسجة الأخرى. بينما يستخدم الكولاجيناز بشكل شائع لعزل EC ، إلا أن هناك أنواعا فرعية متعددة ذات قدرات تفكك مختلفة خاصة بالأنسجة ، مما يتطلب التحسين. ثانيا ، وأمر بالغ الأهمية لعزل pEC ، يمكن أن يؤدي إطلاق وتنشيط الإنزيمات الداخلية للبنكرياس إلى إعاقة عملية العزل بشكل كبير. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب توخي الحذر لتقليل تمزق خلايا الأسينار الخارجية (المصدر الأساسي للزيموجين والبروتياز و RNase27) ، والتي يمكن أن تسبب مزيدا من تلف الخلايا وتؤدي إلى انخفاض قابلية الخلايا للحياة وتؤثر بشكل عام على التعافي27،28،29.

لمواجهة هذه التحديات ، قمنا بتكييف طرق من بروتوكولات عزل EC الحالية وأنشأنا بروتوكولا جديدا مناسبا لعزل EC عن بنكرياس الفئران. على وجه التحديد ، نصف هنا سير عمل (الشكل 2) باستخدام الكولاجيناز من النوع الأول (يتم تنفيذه عادة لعزل الرئة EC) ، وانخفاض درجات حرارة الهضم وعدم الإثارة (لمنع تنشيط زيموجين البنكرياس) ، ومكملات DNase30،31،32 (لمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن الحمض النووي وتحسين صلاحية الخلية ، وجسم مضاد ل CD3133 (PECAM1 ، علامة عموم EC). ينتج البروتوكول الموصوف مجموعات EC معزولة من بنكرياس الفأر والتي يمكن استخدامها في توصيف التعبير الجيني ومقايسات البروتين.

البروتوكول

تم إجراء عزل الأنسجة بموجب بروتوكول الدراسة المعتمد # 17010 من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي (IACUC) التابعة لمعهد أبحاث بيكمان ، مدينة الأمل (دوارتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). هنا ، نستخدم Tie-2CreERT2 ؛ خط فأر Rosa26-TdTomato في خلفية C57BL / 6 في عمر 8-12 أسبوعا. في هذا الخط ، يتم تصنيف ECs ب TdTomato عند تحفيزها بعقار تاموكسيفين كما هو موضحسابقا 34. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لجميع أعمار الفئران البالغة ذات الأنماط الجينية والخلفيات الوراثية المختلفة.

1. جمع الأنسجة (الوقت المقدر: 1-2 ساعة)

ملاحظة: تقدير الوقت هو 15 دقيقة / ، بحد أقصى موصى به 3 مجمعة لكل عينات تفكك.

  1. القتل الرحيم للحيوانات عن طريق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون (CO2) ، يليه تأكيد ثانوي للوفاة. قبل التشريح ، رش الجسم كله بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) ، مما يؤدي إلى تطهير منطقة التشغيل تماما.
  2. مد الأطراف وتأمينها باستخدام المسامير. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط عبر الجلد والصفاق بدءا من منطقة أسفل البطن ويمتد نحو منطقة الصدر.
  3. كشف القفص الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز ورفع القفص الصدري لكشف القلب.
  4. أدخل إبرة (25G-30G) متصلة بحقنة تحتوي على PBS معقم مثلج ، في البطين الأيسر للقلب.
  5. ابدأ التروية عن طريق حقن PBS عبر القلب بمعدل 5 - 10 مل / دقيقة. توقف بعد حقن 10 مل ، أو حتى يتغير لون الكبد والكلى.
  6. بعد التروية ، حدد موقع البنكرياس (أسفل المعدة والمتصل بالاثني عشر)35 (الشكل 3 أ) وقم بإزالته بعناية باستخدام مقص تشريح وملقط.
  7. بمجرد عزله ، انقل البنكرياس إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من مثبط PBS المثلج + 0.2 مجم / مل مثبط التربسين ، واستمر في وضع الثلج (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: يمكن تجميع البنكرياس من 3 فئران كحد أقصى في هذه الخطوة ونقله إلى أنبوب واحد. يمكن حفظ العينات على الجليد لمدة أقصاها 2 ساعة.

2. تحضير الكولاجيناز (الوقت المقدر: 15-30 دقيقة)

  1. قم بإعداد الحلول والمخازن المؤقتة كما هو موضح أدناه.
    1. محلول التفكك: أضف الكولاجيناز من النوع الأول إلى أنبوب سعة 50 مل إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS 1x (Ca2+ ، Mg2+ ؛ انظر جدول المواد) و 0.001 U / mL DNase I + 0.2 مجم / مل مثبط التربسين.
    2. محلول إيقاف التفكك: أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS 1x ، بدون Ca2+ ،Mg 2+ ؛ نفس الشيء لجميع PBS المتبقية في هذا البروتوكول ؛ انظر جدول المواد) ، 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.001 U / مل DNase I أو DMEM + 10٪ FBS + 0.001 MU / مل DNase I.
    3. محلول الغسيل: أضف PBS 1x ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.001 وحدة / مل DNase I + 0.05 مجم / مل مثبط التربسين.
  2. قم بإذابة المخازن المؤقتة تماما وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. توضع جانبا وتترك على الثلج.

3. الهضم (الوقت المقدر: 40 دقيقة - 1 ساعة)

  1. يرفع البنكرياس من PBS المثلج ويوضع على طبق بتري فوق الثلج. قم بإزالة الأنسجة الزائدة بعناية (مثل الطحال والدهون والحطام) باستخدام المقص الجراحي والملاقط (الشكل 3 ج).
    ملاحظة: من الضروري إزالة الدهون ، لأن الدهون الزائدة يمكن أن تتداخل مع هضم الأنسجة.
  2. انقل بنكرياس الفأر المشذب إلى أنبوب سعة 5 مل يحتوي على 1 مل من محلول التفكك.
  3. احتفظ بالأنبوب على الجليد وافرم أنسجة البنكرياس بمقص تشريح إلى قطع دقيقة قابلة للسحب ، على سبيل المثال 0.5 مم أو 1 مم. انقل المحللة إلى أنبوب سعة 50 مل واحتفظ به على الثلج.
  4. أضف بنكرياس إضافيا إلى أنبوب 5 مل المستخدم لفرم أنسجة البنكرياس في البداية وإضافة 1 مل إضافي من الكولاجيناز. كرر حسب الضرورة لمستحضرات البنكرياس المتعددة.
  5. أضف 2 مل من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب 5 مل لإزالة أي أنسجة بنكرياس متبقية ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. يجب أن يكون إجمالي حجم الكولاجيناز 5 مل ل 3 بنكرياس أو 3 مل لبنكرياس واحد.
  6. بمجرد أن تخضع جميع العينات للتفكك الميكانيكي ، انقل الأنابيب سعة 50 مل التي تحتوي على محللات الأنسجة المتجانسة إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: لا تقم بتحريك خليط الأنسجة أو دوامته بقوة أثناء هذه العملية لأن ذلك قد يتسبب في تمزق أنسجة الأسينار وإطلاق إنزيمات داخلية وفيرة والحمض النووي.
  7. قم بإزالة الأنابيب من الحمام المائي ولفها برفق حتى تمتزج جيدا ، واتركها في حمام مائي لمدة 10 دقائق أخرى (الوقت الإجمالي: 20 دقيقة).
    ملاحظة: لا تتجاوز 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية لتجنب الإفراط في الهضم.
  8. ضع الأنابيب على الجليد ، واترك المتجانس يستقر عن طريق الجاذبية. بمجرد تسويته ، انقل المادة الطافية من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وأضف 5 مل من محلول إيقاف التفكك.
  9. أضف 1 مل إضافي من محلول التفكك إلى الحبيبات المتبقية وقم بترتيتورها بإبرة 18G.
  10. مرر المتجانس المتبقي عبر الفلتر واغسله ب 5 مل إضافي من محلول إيقاف التفكك.
  11. تعليق خلية الدوران عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق الشفط واحتفظ بحبيبات الخلية على الجليد.
  12. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من عازلة الغسيل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  13. خذ كمية صغيرة من حبيبات الخلية المعلقة (10 ميكرولتر) واخلطها مع التريبان الأزرق بنسبة 1: 1 لحساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا وقياس الجدوى.

4. إثراء الخلايا البطانية (EC) (الوقت المقدر: 2-3 ساعات)

  1. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للبيوتين CD31 لكل 1 × 107 خلايا يتم عدها واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية على دوار (حوالي 5 ميكرولتر لكل 3 بنكرياس).
  2. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين واحتضانها لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية على دوار أنبوبي.
  3. قم بإعداد حامل مغناطيسي مع حامل فاصل العمود وقم بتطبيق العمود. توازن العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
  4. أضف عينة إلى العمود واغسلها بإجمالي 9 مل من محلول الغسيل.
    ملاحظة: إذا كان تركيز الخلية مرتفعا ، فقم بتخفيف الخلايا بسعة 2 مل إضافية من محلول الغسيل في أنبوب منفصل. أضف 1 مل من العينة في كل مرة إلى العمود لمنع انسداد العمود.
  5. قم بإزالة العمود من حامل العمود وضعه في أنبوب سعة 15 مل. أضف 5 مل من مخزن الغسيل إلى العمود. استخدم المكبس لدفع الخلايا الموجودة في العمود لأسفل وجمع الشطف (الذي يحتوي على EC المخصب).
  6. قم بالدوران لأسفل التدفق والشطف / جزء EC عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. عد الخلايا وقياس الجدوى كما في الخطوة 3.13.
  7. التحقق من صحة تخصيب EC عبر qPCR لكسور التدفق والإي سي. استخدم NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) كعلامة عامة لخلايا الغدد الصماء وجزيء التصاق الصفائح الدموية والخلايا البطانية (Pecam1) كعلامة ل EC33. استخدم 36B4 (Rplp0 ، البروتين الفوسفوسي الريبوزومي الحمضي p0) كعنصر تحكم داخلي لتطبيع التعبير الجيني.
    ملاحظة: يمكن استخدام العينات التي تم جمعها لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة.

5. زراعة pECs

  1. تحضير M199 متوسط. مكمل M199 بتركيز متوسط إلى نهائي من 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 0.1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. قم بتغطية صفيحة زراعة الخلايا مقاس 60 مم بالكولاجين من النوع الأول (1 مجم / مل في 0.1 مولار من حمض الخليك) واتركها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة الكولاجين من النوع الأول واشطف الطبق باستخدام 1X PBS مرتين. أضف 2 مل من وسائط M199 المحضرة وضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا القياسية (5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  4. بمجرد عزل الخلايا ، أضف الخلايا المعزولة إلى لوحة زراعة الخلايا M199 الدافئة مسبقا. احتفظ بالخلايا في ظروف المزرعة لمدة 14 يوما تقريبا وقم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على ما يقرب من 2 × 106 خلايا حية عند تجميع 3 بنكرياس فأر و 750,000 خلية من بنكرياس فأر واحد. للتحقق من صحة تخصيب EC ، أجرينا التحليلات التالية: 1) تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي: مقارنة بعينات التدفق (FT) (أي الكسور المرتبطة بالأجسام المضادة غير CD31) ، كان لدى كسور EC مستويات أعلى بكثير من Pecam1 (ترميز CD31) و Kdr (ترميز VEGFR2) ، وجينان لعلامة EC33 ، ومستويات أقل من NK6 homeobox 1 (Nkx6.1) ، وهو عامل نسخ في خلايا الغدد الصماء في البنكرياس (الشكل 4 أ)); 2) النشاف الغربي: أظهرت العينات المخصبة ب EC من ثلاثة مستحضرات (pEC-1-3) إشارات قوية ل CD31 بالحجم المتوقع (~ 130 كيلو دالتون). وبالمقارنة ، أظهرت عينات المدخلات و FT إشارة CD31 ضئيلة. كعنصر تحكم إيجابي ، أظهرت محللات خلايا MS1 ، وهي خط خلية pEC ، إشارة CD31 قوية (الشكل 4 ب) ؛ 3) تلطيخ التريبان الأزرق: وجدنا أن صلاحية الخلايا المعزولة كانت حوالي 50٪ (الشكل 4 ج) ؛ 4) قياس التدفق الخلوي باتباع بروتوكول منشور15 : من خلال البوابات على مجموعة الخلايا الحية (الشكل 4D) ، وجدنا أن خلايا CD31 + كانت في 88٪ وخلايا TdTomato+ كانت في 76٪. وتجدر الإشارة إلى أن غالبية الخلايا المعزولة تشارك في التعبير عن CD31 و TdTomato (الشكل 4E). كعناصر تحكم سلبية ، لم تظهر خلايا MS1 غير الملوثة و MS1 المحتضنة ب IgG أي خلايا حية كما هو موضح ب CD31. كعنصر تحكم إيجابي ، أي أظهرت خلايا MS1 الملطخة ب CD31 ما يقرب من 100٪ خلايا CD31 + حية (الشكل 4F). قمنا أيضا بزراعة الخلايا المعزولة ، وأجرينا تلطيخا مناعيا من PECAM1 باتباع بروتوكول منشور36 ، وقمنا بتصوير TdTomato، الذي أظهر إشارات قوية لكلتا العلامتين في الخلايا المعزولة ، مما يشير إلى وجود ECs (الشكل 4G).

مخطط البنكرياس يوضح ECs داخل الجزيرة لدراسة بنية الأوعية الدموية وتحليل التفاعل الخلوي.
الشكل 1: رسم توضيحي للأوعية الدموية للبنكرياس وجزر البنكرياس. تصوير مصور للخلايا البطانية البنكرياسية (ECs) و ECs داخل الجزيرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط تحضير البنكرياس أحادي الخلية. الطرد المركزي ، وضع العلامات على البيوتين CD31 ، تحليل التدفق.
الشكل 2: نظرة عامة على سير العمل. 1) تشريح البنكرياس ، 2) الهضم الميكانيكي ، 3) حضانة الإنزيم ، 4) الطرد المركزي ، 5 أ) إزالة المواد الطافية و 5 ب) هضم الكولاجيناز الثانوي لحبيبات الخلية مع التريتوري للتصفية في 6) ، 7) ، و 8) إعادة تشكيل الحبيبات وربط الأجسام المضادة ، 9) حضانة الميكروبيدات ، 10) تخصيب عمود MACS ، 11) عد الخلايا من أجل الجدوى ، و 12) تحليل المصب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تشريح الأنسجة يظهر عملية حصاد البنكرياس وعزله وتشذيبه في البحوث البيولوجية.
الشكل 3: خطوات معالجة الأنسجة. صور (أ) تجويف البطن ، (ب) بنكرياس الفأر المعزول ، و (ج) بنكرياس الفأر المشذب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التعبير الجيني ، تحليل CD31 ، DAPI ، فرز الخلايا ، التألق ، ونتائج قياس التدفق الخلوي.
الشكل 4: التحقق من صحة كسور EC المعزولة من بنكرياس الفأر. (أ) qPCR لعينات FT وجزء EC المخصب ب CD31 للتخصيب. Pecam1 (CD31) و Kdr (VEGFR2) و Nkx6.1 (عامل النسخ الخاص بخلايا β البنكرياس) 33. * يشير إلى p <0.05 مقارنة ب FT بناء على اختبارات t . ن = 3-4 عينات مجمعة ، تتكون من 3 فئران لكل منها. (ب) النشاف الغربي ل CD31. يشير pEC-1-3 إلى ECs المخصبة من 3 عينات منفصلة من الماوس المجمع. تم تحميل محللات الخلايا بمقدار 30 مجم على كل حارة ، متبوعة بتلوين Ponceau S. (ج) عد الخلايا وتلوين الجرجير الأزرق ل pECs المخصبة لمقايسة الجدوى. (د) استراتيجية بوابات قياس التدفق الخلوي للفأر pECs الملطخة بالجسم المضاد 4 'و 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) و CD31. (ه) الرسوم البيانية لقياس التدفق الخلوي ل MS1 غير الملوثة (أعلى اليسار) ، MS1 ملطخ بالجسم المضاد الثانوي AlexaFluor-488 (التحكم في IgG ؛ أعلى اليمين) ، MS1 ملطخ ب CD31 (أسفل اليسار) ، و pECs المعزولة للفأر ملطخة ب CD31 (أسفل اليمين). (و) النسبة المئوية للخلايا الحية التي تم تحديدها كميا باستخدام قياس التدفق الخلوي. (ز) التألق المناعي لتعبير CD31 (أخضر) مع DAPI (أزرق) مضاد للبقع ومراسل الفلورسنت TdTomato الداخلي (أحمر). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفحص المجهري المناعي CD31 / CD144 / DAPI ، تحليل التعبير الجيني UMAP ل Cdh5 ، Pecam1.
الشكل 5: خصوصية CD31 و CD144 في بنكرياس الفأر. (أ) التألق المناعي لبنكرياس الفأر مع CD31 (أرجواني) و CD144 (سماوي) ، مع بقعة DAPI. تم التقاط الصورة باستخدام عدسة 10x تحت مجهر مقلوب فلوري واسع المجال. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. خطوط متقطعة تحدد منطقة الجزيرة. (ب) التقريب والإسقاط المنتظم للمشعب (UMAP) الذي يظهر تعبير Cdh5 و Pecam1 في ECs الجزیرية من الفئران C57BL6 التي تم اكتشافها بواسطة scRNA-seq (GSE128565)37. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

انزيماستخدامدرجة الحرارة والوقتمرجع
كولاجيناز الأولتفكك الخلية المفردة ، تخصيب البنكرياس الكامل EC37 درجة مئوية ، 20 دقيقةهذا البروتوكول
كولاجيناز الرابععزل الجزيرة والتفكك غير الأنزيمي37 درجة مئوية ، 20 دقيقة46
كولاجيناز + تربسينفحص الخلايا القنوية في بنكرياس الفأر37 درجة مئوية ، 30 دقيقة47
كولاجيناز بتعليق الخلية المفردة للبنكرياس37 درجة مئوية ، 30 دقيقة48
كولاجيناز NBIعزل الجزيرة37 درجة مئوية ، 30 دقيقة49
كولاجيناز فنظام تعليق Acinar قابل للتطبيق37 درجة مئوية ، 15 دقيقة45
كولاجيناز الحادي عشرعزل الجزيرة37 درجة مئوية ، 15 دقيقة35
متباينةتعليق خلية واحدة37 درجة مئوية ، 45 دقيقة24
ليبراستعليق خلية واحدة37 درجة مئوية ، 10 دقائق25, 48
التربسينتفكك خلية واحدة ، بنكرياس كامل4 درجة مئوية ، O / N28

الجدول 1: ملخص البروتوكولات المختلفة المستخدمة لمعالجة عينات البنكرياس من الفئران.

المناقشة

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لإثراء وعزل pECs. على غرار بروتوكولات عزل EC السابقة من الأنسجة أو الأعضاء الأخرى ، يتكون هذا البروتوكول من ثلاث عمليات رئيسية ، وهي التفكك الجسدي ، والهضم الأنزيمي ، وإثراء EC القائم على الأجسام المضادة. لمواجهة التحديات الفريدة في معالجة البنكرياس ، قدمنا العديد من التعديلات الرئيسية والخطوات الحاسمة في بروتوكولنا: 1) هضم الكولاجيناز اللطيف بخطوة واحدة مع وقت حضانة قصير ، 2) مكملات تركيز أعلى من DNase ومثبط التربسين لتقليل تلوث الحمض النووي وهضم الإنزيم الداخلي ، والذي يمكن أن يتداخل مع ارتباط الأجسام المضادة وبالتالي يقلل من إثراء EC وقابليته للحياة و 3) عد الخلايا بعد خطوة الهضم لضبط كيفية يضاف الكثير من الأجسام المضادة إلى العينة لتحسين تخصيب EC. في عملية تحسين هذا البروتوكول ، اختبرنا الإنزيمات الأخرى المستخدمة في الدراسات السابقة ، على سبيل المثال ، التربسين28 ، الكولاجيناز من النوع الرابع31 ، ودرجات حرارة الهضم الأخرى ، على سبيل المثال 4 درجات مئوية ، بالإضافة إلى أوقات الحضانة المختلفة (الجدول 1). وجدنا أن الكولاجيناز من النوع الأول ، 20 دقيقة ، عند 37 درجة مئوية هو الحالة المثلى لعزل الماوس pEC واستخدمناه هنا. في حين أن إضافة مضاد للتخثر أثناء التروية قد يحسن قابلية الخلية بشكل عام للبقاء ، إلا أن عامل مضاد التخثر النموذجي ، على سبيل المثال ، EDTA أو الهيبارين قد يتداخل مع نشاط بعض الإنزيمات ، على سبيل المثال ، الكولاجيناز لتفكك الخلايا والنسخ العكسي المستخدم في qPCR. لمنع التأثير غير المتوقع / غير المرغوب فيه لهذه مضادات التخثر ، يتم استخدام PBS (بدون Ca2+ و Mg2+) للتروية.

ركزنا على تطوير بروتوكول لإثراء سكان EC من بنكرياس الفئران الكامل ، والذي سيشمل كلا من ECs داخل الجزيرة و ECs في الأنسجة الخارجية ، مما يؤدي إلى عائد أعلى. في البروتوكول الحالي ، قمنا بتجميع 3 معا أثناء خطوة التفكك وحققنا في المتوسط تعليقا أحادي الخلية مع ما يقرب من 2.0 × 106 خلايا قابلة للحياة. لقد اختبرنا أيضا عينات من بنكرياس فأر واحد ويمكن الحصول على حوالي 750,000 خلية. تجدر الإشارة إلى أنه عند التكيف مع معالجة واحد ، يجب استخدام محلول تفكك أقل (3 مل تفكك لكل بنكرياس). تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول في تقليم وإزالة أي دهون متبقية متصلة بالبنكرياس تماما (الشكل 3 ب). سوف يتداخل تلوث الأنسجة الدهنية في هضم الكولاجيناز مع خطوة تفكك الخلية المفردة في البنكرياس مما يقلل من صلاحية الخلية في خطوات التخصيب اللاحقة38. علاوة على ذلك ، لإثراء pECs ، استخدمنا علامة سطح عموم EC ، PECAM1 / CD31. باستخدام الجسم المضاد PECAM1 / CD31 ، تمكنا من إثراء كسور EC بشكل كبير ، وهو ما يتضح من تحليل التعبير الجيني. في تطوير هذا البروتوكول ، اختبرنا أيضا فائدة الجسم المضاد CD144 ، والذي تم استخدامه أيضا بشكل شائع لعزل ECs13. ومع ذلك ، لم نتمكن من إثراء pECs (البيانات غير معروضة). ومن المثير للاهتمام أن تلطيخ الفلورسنت المناعي كشف أنه في حين يتم التعبير عن CD31 في جميع ECs في أنسجة البنكرياس ، يبدو أن الجسم المضاد CD144 يلطخ فقط ECs داخل الجزيرة (الشكل 5 أ). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتحليل بيانات RNA-seq أحادية الخلية المتاحة للجمهور من الجزر المعزولة من C57BL / 6 الفئران (GSE128565) 37 ووجدنا أن ما يقرب من 50٪ من جزر ECs تظهر تعبيرا عن كل من Cdh5 (VE-Cad) و Pecam1 ، لكن بقية جزر ECs تعبر فقط عن Cdh5 أو Pecam1 (الشكل 5 ب). وبالتالي ، فإننا نتكهن بأن الأجسام المضادة CD31 أكثر ملاءمة لعزل pEC وأن فائدة الجسم المضاد CD144 لهذا الغرض تستدعي التحقيق في المستقبل. علاوة على ذلك ، هناك مضاد CD31 متاح تجاريا مترافقا بخرز مغناطيسي يمكنه تبسيط خطوة ربط الجسم المضاد المكونة من خطوتين إلى خطوة واحدة.

كما هو موضح ، أجرينا qPCR ، والتنشيف المناعي ، وقياس التدفق الخلوي ، والتلوين المناعي الفلوري للتحقق من صحة جزء EC المعزول. من المتصور أن هذه الكسور يمكن أن تخضع لمقايسات أخرى ، مثل (sc) RNA-seq وقياس الطيف الكتلي. أحد قيود هذا البروتوكول هو أننا لم نتمكن من تحقيق ثقافة فرعية قوية وإجراء فحوصات وظيفية. بالنظر إلى أن الثقافة الفرعية للفئران المعزولة قد ثبت أنها تمثل تحديا ، فهذا مجال يستدعي جهودا مستقبلية. قد تكون إحدى طرق معالجة هذا هو إدخال مستضد T كبير ، والذي تم استخدامه لتخليد الخلايا الأولية39.

أتاحت التطورات الحديثة وتطبيق تسلسل scRNA من التنميط عالي الدقة لخلايا البنكرياس40 وخاصة خلايا الجزر41. ومع ذلك ، فقد ركزت معظم الدراسات الحالية على مجموعات خلايا الغدد الصماء واستخدمت بروتوكولات تفكك الأنسجة التي لا تحتفظ بكفاءة ECs. نتيجة لذلك ، غالبا ما ينتهي الأمر بكسور EC إلى ندرة ، وتشكل 3٪ -5٪ فقط في إجمالي مجموعات الخلايا التي تم التقاطها42،43،44. يستخدم بروتوكول حديث الهضم الأنزيمي المكون من خطوتين وإلغاء التنشيط وخطوة فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت ويسترجع ECs بنسبة 12٪ من إجمالي خلايا البنكرياس45. مكملا لهذا البروتوكول ، يوفر بروتوكولنا سير عمل مبسطا ، والذي قد يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة وأقل تطلبا من الناحية الفنية إذا كانت ECs هي محور الدراسة. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم اختباره فقط في البنكرياس الفأر ، إلا أنه يمكن توسيع نطاقه وتكييفه لعزل ECs عن الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك البنكرياس البشري.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الدكتور بريان أرمسترونج في مدينة الأمل ، وميندي رودريغيز من جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد على المساعدة الفنية. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL145170 إلى ZBC) ، ومؤسسة Ella Fitzgerald (إلى ZBC) ، ومدينة الأمل (جائزة معهد آرثر ريجز لاستقلاب السكري ومعهد الأبحاث) ، ومنحة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي EDU4-12772 (إلى AT). تضمنت الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور العمل الذي تم إجراؤه في الفحص المجهري الضوئي والتصوير الرقمي بدعم من المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم P30CA033572. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.5 مل eppendorfالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1615-5500
طبق 10 سمGenesee Scientific25-202
25G إبرBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 مل eppendorfThermo Fisher   ؛14282300
لوحة 6 آبارGreiner Bio-One07-000-208
70 & micro ؛ مصفاة مفيشر22-363-548
مضاد CD31-البيوتينMiltenyi BiotechREA784
الأبقار الألبومين صدمة حرارية معالجةفيشرBP1600-100
CaCl2< / sub> فيشرBP510
جهاز طرد مركزيEppendorf
الكولاجين نوع 1 ، من جلد العجلSigma Aldrich & نب سب.C9791كاشف المرفق في البروتوكول
Collagenase Type 1  ورثينجتون بيوLS004197
كونتيسة عداد خليةأوتوماتيكي ثيرمو فيشر   ؛
DAPIThermo Fisher D1306المناعي التألق
المناعي مشارط السلامة المتاح MycoInstrumentation6008TR-10
DNAse I & nbsp ؛روش260913 
D-PBS (Ca2 + ، Mg2 +) ثيرموفيشر   ؛14080055
الإيثانولفيشرBP2818-4
مصل الأبقار الجنينيفيشر10437028
حاضنةالإبقاء عليها عند 37 درجة ؛ C 5٪ CO2< / sub>
LS الأعمدةMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand مع فاصل QuadroMACS   ؛Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Microbeads المضادة للبيوتينMiltenyi Biotech130-090-485
مجهرLeicaلتقييم مورفولوجيا الخلية
الجزيئية الصف المياهCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44 / 44R شاكر مداري   ؛Eppendorf
PECAM1 (CD31) الجسم المضادAbcamab56299التألق المناعي
PECAM1 (CD31) الأجسام المضادةR & D SystemsAF3628
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10X) (بدون Ca2 + ، لا Mg2 +)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse   ؛IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
التمهيدي Kdr الماوس الأمامي IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr الماوس العكسيIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
التمهيدي Nkx6.1 الماوس العكسي IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 الماوس الأماميIDTCTCTACTTTAGCCCAGCG
التمهيدي PECAM1 الماوس الأماميIDTACGCTGGTGCTATGCAAG
التمهيدي PECAM1 الماوس العكسيIDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher  AM9780
RNase ماء خالمن TakaraRR036B
معقم 12 بوصة ملقط طويلFST91100-16
ملقط ناعم معقمFST11050-10
مقص ناعم معقمFST14061-11
أطباق زراعة الأنسجة 2 سمGenesee Scientific25-260
كاشف TRIzolفيشر15596018
تريبان بلوكورنينجMT25900CI
مثبط التربسين روش10109886001
Tween-20
VE-Cadherin الأجسام المضادةAbcamab33168حوض مائي
مصل مناعي

المراجع

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بنكرياس الفأرعزل الخلايا البطانيةالفرز المغناطيسي للخلاياالتفكيك اللطيفعلامات سطح الخليةتسلسل الخلية الواحدةالأوعية الدموية البنكرياسيةجسم مضاد CD31لطخة ويسترن
عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.