يصف هذا البروتوكول أخذ عينات الدم والبول لقياس مستويات البروجسترون / استراديول وموجهة الغدد التناسلية المشيمية لتحديد مرحلة دورة المبيض. تستخدم مستويات الهرمون للتنبؤ بتحديد توقيت الإباضة ويتم حقن الهرمونات لتنظيم دورة المبيض ونمو البويضة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يصف هذا البروتوكول أخذ عينات الدم والبول لقياس مستويات البروجسترون / استراديول وموجهة الغدد التناسلية المشيمية لتحديد مرحلة دورة المبيض. تستخدم مستويات الهرمون للتنبؤ بتحديد توقيت الإباضة ويتم حقن الهرمونات لتنظيم دورة المبيض ونمو البويضة.
marmosets المشتركة هي العالم الجديد الصغيرة. نظرا لأن العديد من آلياتها البيولوجية تشبه آليات البشر ، فمن المحتمل أن تكون المرموسيت مفيدة لأبحاث البيولوجيا الطبية والبشرية عبر مجموعة من المجالات ، مثل علم الأعصاب والطب التجديدي والتنمية. ومع ذلك ، هناك نقص في الأدبيات التي تصف طرق العديد من التجارب والإجراءات الأساسية. هنا ، يتم وصف طرق مفصلة لتحديد مستويات الهرمونات الجنسية (البروجسترون ، استراديول ، وموجهة الغدد التناسلية المشيمية) في marmosets. يتيح قياس هذه الهرمونات التنبؤ بالمرحلة في دورة المبيض ، والتي عادة ما تكون 26-30 يوما في marmosets. التحديد الدقيق ضروري لحصاد البويضات / الزيجوت في النقطة الزمنية الصحيحة ولإعداد الإناث المضيفة لتوليد marmosets المعدلة وراثيا.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن قياس مستويات هرمون الجنس مفيد لدراسات الغدد الصماء ، وعلم السلوك ، والتطور المبكر ، ودراسات البيولوجيا الإنجابية. يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لطرق أخذ عينات الدم من الوريد الفخذي ، وفصل البلازما لقياس الهرمونات ، وقياس مستويات موجهة الغدد التناسلية المشيمية باستخدام البول والبلازما ، وإعادة ضبط دورة المبيض باستخدام حقن البروستاجلاندين F2α التناظرية لتقصير ومزامنة الدورة ، وتعزيز نمو الجريبات والإباضة عن طريق حقن الهرمون المنبه للجريب وموجهة الغدد التناسلية المشيمية. باستخدام هذه البروتوكولات ، يمكن تحديد المراحل في دورة المبيض لجمع البويضات / الزيجوت في الوقت المناسب.
المرموسيت الشائع (Callithrix jacchus) هو صغير من العالم الجديد له العديد من الخصائص المشابهة لتلك الخاصة بالبشر ، ومدة دورة المبيض هي 26-30 يوما 1,2. تتطلب الدراسات حول التطور المبكر وتوليد القردة المعدلة وراثيا حصاد البويضات والزيجوتات في مراحل محددة من دورة المبيض. وبالتالي ، فإن التحديد الدقيق للمرحلة أمر بالغ الأهمية ويمكن تقديره عن طريق قياس مستويات الدم من هرمونات البروجسترون (P4) والإستراديول (E2) 2,3. هذه الهرمونات تعزز نمو بطانة الرحم ، وهو أمر ضروري للزرع. يتم إنتاج P4 من الجسم الأصفر ، الذي يتشكل في المبايض مباشرة بعد الإباضة. يتم إفراز E2 بواسطة بصيلات المبيض استجابة للهرمون المنبه للجريب (FSH) من مجمع ما تحت المهاد والغدة النخامية في الدماغ. تزداد مستويات E2 مع نضوج الجريب ، وتبلغ ذروتها قبل الإباضة3. مستويات عالية E2 تسبب الإفراج النبضي من هرمون اللوتين (LH) عن طريق مجمع ما تحت المهاد والغدة النخامية في البشر. هذا التدفق LH يحفز الإباضة. ومع ذلك ، في marmosets ، خضع جين LH للانحطاط أثناء التطور ، وبدلا من ذلك يتم تحفيز الإباضة عن طريق إطلاق موجهة الغدد التناسلية المشيمية (CG) ، والتي لها بنية مماثلة ل LH ، من الغدة النخامية 4,5.
يمكن التحكم في دورة المبيض عن طريق حقن الهرمونات. تعمل حقن FSH ، في البشر ، على مستقبلات هرمون FSH المبيض وتستخدم لتعزيز تخليق هرمون الاستروجين ونمو الجريب6. يستخدم حقن CG البشري (hCG) كبديل ل LH في نهاية المرحلة الجرابية لتحفيز الإباضة لدى البشر7. تستخدم حقن CG أيضا لعلاج العقم البشري لأن CG يحفز الجسم الأصفر في الحمل المبكر ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج P4. حقن البروستاجلاندين F2α (PGF2α) تعيد ضبط دورة المبيض8. في الماشية المنزلية ، يتم استخدام حقن PGF2α لتقصير المرحلة الصفراء ومزامنة دورة الشبق لإدارة الإنجاب.
على الرغم من أن والبشر لديهم آليات بيولوجية متشابهة ، مما يجعلها نموذجية مثالية ، إلا أن هناك نقصا في الأدبيات التي تصف الطرق الأساسية للعديد من التقنيات المستخدمة في كثير من الأحيان. أخذ عينات الدم هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمةفي كثير من الأحيان 9،10،11،12. ومع ذلك ، يواجه المبتدئين أحيانا صعوبة في العثور على الوريد. ومن ثم ، أجرت هذه الدراسة تحليلات تشريحية لمنطقة الوريد الفخذي. استنادا إلى الملاحظات التشريحية ، يقدم هذا البروتوكول المنطقة القريبة من المثلث الفخذي كموقع سهل لبزل الوريد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
استخدمت جميع الطرق التي تنطوي على marmosets معايير أخلاقية ورفاهية عالية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في المركز الوطني لصحة الطفل والتنمية. كانت المستخدمة هنا ذات منزل واحد أو منزل مزدوج (أنثى واحدة وذكر) مع 12 ساعة من الضوء يوميا.
1. أخذ عينات الدم من الوريد الفخذي
2. فصل البلازما وتحديد المستويات الهرمونية
3. قياس CG البول للكشف عن الإباضة والحمل
ملاحظة: يمكن قياس مستويات CG في marmosets باستخدام اختبار مجموعة الكروماتوغرافيا المناعية لكل من الإباضة والحمل. في حالة الإباضة ، يمكن الحصول على نتيجة إيجابية قبل 0-2 أيام من الإباضة. في حالة الحمل ، يتم الكشف عن نتيجة إيجابية من 15-20 إلى يوم 100 تقريبا من الحمل. يتطلب الاختبار كمية صغيرة (90 ميكرولتر) من البول (قطرة واحدة من البول ~ 30 ميكرولتر).
4. ضبط وتحديد مرحلة دورة المبيض لجمع البويضات والزيجوتات والأجنة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
التفاصيل المتعلقة بالحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة مذكورة في الجدول 1.
التحاليل التشريحية للوريد الفخذي
تم إجراء التحليلات التشريحية للوريد الفخذي باستخدام ذكر من الذكور يبلغ من العمر 2 (I 7713M) يخضع للقتل الرحيم. تقع الأوردة والشرايين الفخذية في مثلث الفخذ. يتكون المثلث الفخذي عند الحدود بين جدار البطن وعضلات الفخذ (الشكل 1B-D). عند قاعدة الفخذ ، يمر الوريد الكبير عبر مركز المثلث المقلوب ،...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تحديد موقع الوريد هو الخطوة الأكثر أهمية في جمع الدم. استنادا إلى الملاحظات التشريحية ، يقدم هذا البروتوكول المنطقة القريبة في مثلث الفخذ كموقع سهل لجمع الدم في المرموسيت. باستخدام هذه المنطقة ، يمكن إجراء أخذ عينات الدم من الوريد الكبير بسهولة. ومع ذلك ، حتى باستخدام هذا البروتوكول ، تحدث إصابة الشريان في بعض الأحيان. عند إصابة الشريان ، يقترح التوقف التام للنزيف عن طريق الضغط لمدة >5 دقيقة لمنع الورم الدموي. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء الضغط ، يكون تبريد موقع التنقيط باستخدام مكعب ثلج فعا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
نود أن نشكر تشونشين شين ، هيروكو أكوتسو ، فوميو سوجيكي ، يونا هاشيموتو ، هينا ناريتومي ، يوكي ساكاموتو ، وميكيكو هوريغومي على دعمهم في إنشاء هذا البروتوكول وفي الرعاية اليومية للمارموسيت. تاكايوكي مينيشيغي للتعليق على المخطوطة؛ يوكيكو آبي وأعضاء مختبر أيبا لتقاسم تقنيات جمع الزيجوت؛ CIEA لتبادل المعلومات حول مساكن marmosets والتجارب التي زرعوها على مدى 40 عاما. تم دعم هذا البحث من قبل AMED و JST و KAKENHI بموجب أرقام المنحة JP19gm6310010 و JP20gm6310010 و JP21gm6310010 و JP22gm6310010 (AMED) و JPMJPR228B (JST) و 20H05764 و 20H03177 و 22K18356 (KAKENHI).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| AIA-360 | Tosoh Corporation | 0019945 | قياس الهرمونات (P4 / E2) مركز |
| التخفيف AIA-pack | Tosoh Corporation | 0020956 | قياس الهرمونات (P4 / E2) مجموعة |
| الركيزة AIA-pack II | Tosoh Corporation | 0020968 | قياس الهرمونات (P4 / E2) |
| AIA-PACK WASH CONCENTRATE | TOSOH CORPORATION | 0020955 | الهرمونات (P4 / E2) |
| CMS-1 | CLEA اليابان | Marmoset food | |
| Estrumate | MSD صحة | PGF2alpha التناظرية (كلوبروستنول) | |
| Gonal-f الحقن تحت الجلد 150 | Merck Biopharma Co.، Ltd. | FSH | |
| Gonatropin للحقن العضلي 1000 | ASKA Pharmaceutical Co.، Ltd. | 872413 | hCG |
| محلول حقن الصوديوم الهيبارين 5,000 وحدة / 5 مل | Mochida Pharmaceutical Co.، Ltd. | 224122458 | |
| مجموعة اختبار الكروماتوجرافي المناعي لجمع الدم للكشف عن موجهة الغدد التناسلية المشيمية الشائعة (المدقق المزدوج) | CLEA Japan، Inc. | تحديد مستوى CG | |
| إضاءة مجهر مزدوج الذراع منخفض المستوى LPF-SD | SHIOKAZE GIKEN | مصباح مكتبي لجمع الدم | |
| الدم Marmoset | JIC Japan | JM-1006 | جمع الدم http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html البريد الإلكتروني: vi@jic-japan.jp |
| Metacam 0.05٪ | Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co. ، المحدوده. | لعلاج الورم | |
| الدموي ، 3 مل ، PS ، لقياس الهرمونات Tosoh 360 و AIA-600 II ، 1000 / كيس | Globe Scientific | 110913 قياس الهرمونات (P4 / E2) | |
| ST AIA-PACK iE2 | Tosoh Corporation | 0025224 | قياس الهرمونات (P4 / E2) |
| ST AIA-PACK iE2 مجموعة معاير | Tosoh | Corporation 0025324 | الهرمونات (P4 / E2) |
| محلول تخفيف العينة ST AIA-PACK iE2 | 0025524 | شركة توسوه | (P4 / E2) |
| ST AIA-PACK PROGIII | Tosoh Corporation | 0025240 قياس الهرمونات (P4 / E2) مجموعة | |
| معايرة ST AIA-PACK PROGIII | الهرمونات Tosoh Corporation | 0025340 | (P4 / E2) |
| ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE FILATING SOLUTION | Tosoh Corporation | ؛ 0025540 | قياس الهرمونات (P4 / E2) |
| حقنة بإبرة 25 جم (0.50 × 25 مم) | TERUMO | SS-01T2525 | جمع الدم |
| Tensolvet 5.000 IE gel. | Dechra Pharmaceuticals | 14033492 | علاج الورم |
| الدموي مجموعة Tosoh متعددة الضوابط | Tosoh Corporation | قياس الهرمونات 0015965 | (P4 / E2) |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.