تشخيصات قائمة على تقنية كريسبر في نقاط الرعاية مع كواشف مخلوطة مسبقا ومجففة بالتجميد

Rodjarin Kongkaew; Chayasith Uttamapinant; Maturada Patchsung

doi:10.3791/66703

مقالة منهجية

تشخيصات قائمة على تقنية كريسبر في نقاط الرعاية مع كواشف مخلوطة مسبقا ومجففة بالتجميد

DOI:

10.3791/66703

⸱

أغسطس 16, 2024

Rodjarin Kongkaew¹ , Chayasith Uttamapinant¹ , Maturada Patchsung¹

¹School of Biomolecular Science and Engineering, Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم التحضير خطوة بخطوة للتضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والتعقيم بالتجميد والتفاعلات القائمة على التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لمسببات الأمراض المعدية أو العلامات الجينية الأخرى ذات الأهمية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز التشخيصات الجزيئية عن طريق الكشف القائم على التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام (CRISPR) بدقة تشخيصية عالية وسمات مناسبة للاستخدام في إعدادات نقاط الرعاية مثل أوقات الاستجابة السريعة للنتائج ، والقراءات البسيطة المريحة ، وعدم الحاجة إلى أدوات معقدة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون ردود الفعل مرهقة في نقطة الرعاية بسبب مكوناتها العديدة وخطوات المناولة اليدوية. هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة للكشف القوي عن مسببات الأمراض والعلامات الجينية من خلال التضخيم متساوي الحرارة القائم على إعادة التركيب والكواشف القائمة على كريسبر ، والتي يتم خلطها مسبقا ثم تجفيفها بالتجميد بتنسيقات سهلة التخزين وجاهزة للاستخدام. يمكن إعادة ترطيب الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للاستخدام الفوري والاحتفاظ بكفاءة عالية في التضخيم والكشف. نقدم أيضا دليلا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للمشكلات الشائعة عند إعداد واستخدام الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد للتشخيصات المستندة إلى كريسبر ، لجعل منصة الكشف أكثر سهولة لمجتمعات التشخيص / الاختبارات الجينية الأوسع.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الإبلاغ عن التشخيصات المستندة إلى كريسبر للكشف عن المؤشرات الحيوية للحمض النووي لأول مرة في عام 2017¹^،²^،³^،⁴ ، ومنذ ذلك الحين ، تم إثبات أنها تشخيصات من الجيل التالي من خلال الاختبارات المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء (FDA) ، خاصة للكشف عن الحمض النووي الريبي المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) ، في بلدان^{متعددة 5}^،⁶^،⁷^،⁸. بالإضافة إلى مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، أثبتت التقنيات فعاليتها في الكشف عن الفيروسات والبكتيريا المتنوعة⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹²^،¹³ ، والطفرات والحذف في الأمراض الوراثية ، ويمكن تصميمها للكشف عن البروتين والمؤشرات الحيوية للجزيئات الصغيرة²^،¹². غالبا ما تجمع التشخيصات المستندة إلى كريسبر بين طرق التضخيم متساوي الحرارة - مثل تضخيم البوليميراز المدمج (RPA) أو التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) ¹⁴^،¹⁵ - مع الكشف المستند إلى CRISPR باستخدام الإنزيمات المرتبطة ب CRISPR (Cas) الموجهة بالحمض النووي الريبي مع نشاط نوكلياز داخلي "جانبي" بعد التعرف على الهدف³. يمنح الاستخدام المزدوج للتضخيم متساوي الحرارة والكشف المستند إلى CRISPR العديد من السمات المرغوبة للتقنيات ، لا سيما دقة التشخيص العالية التي تقترب من تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي الذهبي (PCR) ، والقدرة على تعدد الإرسال واكتشاف اختلافات التسلسل الصغيرة ، بما في ذلك تعدد أشكال النوكليوتيدات^{المفردة 1}^،⁹.

ومع ذلك ، تحتوي الإصدارات الأكثر دقة من التشخيصات المستندة إلى كريسبر على مكونات وخطوات متعددة ويمكن أن تكون معقدة لتنفيذها مع غير الخبراء أو في نقطة الرعاية (POC). لمواجهة هذا التحدي المتمثل في توسيع نطاق استخدام التشخيصات عالية الدقة المستندة إلى CRISPR إلى إعدادات POC ، قمنا بتطوير بروتوكولات لإعداد التضخيم متساوي الحرارة القائم على الخلط مسبقا ، والمجفف بالتجميد ، وإعادة التركيب ، وتفاعلات الكشف القائمة على CRISPR ، والتي يسهل استخدامها^{وتخزينها.} يجب أن تكمل هذه البروتوكولات البروتوكولات الممتازة الحالية بشأن التشخيص المستند إلى كريسبر¹⁴ ، والتي تحتوي على معلومات إضافية حول إنتاج المكونات الكيميائية الحيوية اللازمة للتشخيص المستند^{إلى كريسبر 7} ، وإرشادات التصميم¹ ، والتركيبات التي تستخدم تقنيات التضخيم متساوي الحرارة^{البديلة 2} ^، ¹⁴ ^، ¹⁵ ^، ¹⁶ وإنزيمات كاس¹². في النهاية ، نأمل أن تساعد التشخيصات المستندة إلى كريسبر في تحقيق الكشف النووي السريع وغير المكلف والحساس في الأماكن التي تتطلب تحليلات محمولة وخالية من الأدوات¹^،⁹^،¹⁷.

نحن نستخدم بشكل أساسي مجموعة من الكشف المستند إلى RPA و Cas13 في بروتوكولاتنا. تعمل تقنية RPA في درجات حرارة قريبة من البيئة المحيطة (37-42 درجة مئوية) ، وبالتالي ، لديها متطلبات منخفضة للطاقة والمعدات. تتطلب تفاعلات التضخيم متساوية الحرارة الأخرى درجات حرارة أعلى (LAMP ، 60-65 درجة مئوية ؛ تضخيم إزاحة الخيوط (SDA) ، 60 درجة مئوية ؛ تفاعل التضخيم الأسي (EXPAR) ، 55 درجة مئوية ؛ والتضخيم المعتمد على الهليكياز (HDA) ، 65 درجة مئوية) ². كما أن تصميم بادئات RPA ليس معقدا ، على عكس بادئات LAMP ، ويمكن تمديده إلى تضخيم متعدد^{الإرسال 7}^،⁹^،¹⁴. على الرغم من أن تعدد الإرسال إلى ما بعد هدفين باستخدام تقنية RPA أمر صعب من الناحية العملية، إلا أن هناك إرشادات واضحة حول كيفية تصميم بادئات RPA متعددة الإرسال لتقليل التداخل¹⁸.

في حين أن التلوث المرحل لا يزال يمثل مشكلة كبيرة في سير العمل المكون من خطوتين ، فإن amplicons التي تم إنشاؤها من RPA صغيرة الحجم وأقل عرضة للتسبب في تلوث ترحيل مقارنة بالأمبليكونات المتسلسلة الكبيرة من LAMP¹⁴. يمكن تصميم بادئات RPA وفقا للإرشادات القياسية¹⁴: فهي بشكل عام 25-35 نيوكليوتيدات مع درجات حرارة انصهار تتراوح من 54 إلى 67 درجة مئوية. يجب أن يكون حجم الأمبليكون أصغر من 200 زوج أساسي. يمكن إضافة إنزيم النسخ العكسي (RT) إلى RPA لتمكين التضخيم من الحمض النووي الريبي ، وفي النسخ العكسي - RPA (RT-RPA) ، عادة ما تتم إضافة إنزيم آخر Ribonuclease H (RNase H) بكميات صغيرة للمساعدة في حل الحمض النووي الريبي الناتج: هجين الحمض النووي وتعزيز تفاعل التضخيم⁵^،¹⁹. للسماح بنسخ T7 للكشف المستند إلى Cas13 ، يمكن وضع محفز بوليميراز T7 RNA في نهاية 5 'من برايمر RPA الأمامي.

بعد إنشاء الأمبليكونات من RPA ، يمكن اكتشافها باستخدام إنزيمات Cas المبرمجة بواسطة crRNA. من بين إنزيمات Cas المختلفة التي يمكن استخدامها للكشف عن Amplicon ، نفضل متغيرات Cas13 التي تستهدف الحمض النووي الريبي نظرا لنشاط الانقسام العالي¹ وتفضيلات انقسام عديد النوكليوتيدات المميزة^{جيدا 7}^،⁹ ، والتي يمكن استخدام الأخيرة للكشف عن الإرسال المتعدد. تم تصميم تسلسل crRNA ل Cas13 ليكون مكملا (مكملا عكسيا) للموقع المستهدف في الحمض النووي الريبي المنتج مع تسلسل فاصل وتكرار مباشر (DR). يجب ألا يتداخل تسلسل crRNA وبادئات RPA ، لتجنب الكشف غير المرغوب فيه المستند إلى Cas لمنتجات التضخيم خارج الهدف ، مما يزيد من الخلفية والإيجابيات الخاطئة¹⁴.

يعتمد الكشف المستند إلى Cas على طرق الكشف المختلفة لمراقبة انقسام جزيئات الحمض النووي المراسل (مراسلو الحمض النووي الريبي للتفاعلات المستندة إلى Cas13) ¹^،²^،¹⁴. تشمل طرق الكشف المختلفة قياس الألوان ، والقراءات الكهروكيميائية ، والتألق ، وقراءات التسلسل ، وشرائط التدفق الجانبي². نحن نركز على قراءة التألق بالنظر إلى مجموعة متنوعة من الفلوروفورات والمراسلين مثل السيانين 5 (Cy5) ، والرودامين X (ROX) ، والكربوكسي فلورسين (FAM) ، والتي يمكن إثارتها بشكل فعال باستخدام مصدر ضوء LED أزرق واحد ، ويتم تحليل تألقها بواسطة قارئ صفيحة دقيقة أو جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي⁷^،¹⁴. بالإضافة إلى ذلك ، من السهل إعداد قراءة التألق وتسمح بالمراقبة المستمرة ، مما يتيح القياس الكمي في الوقت الفعلي. يمكن دمج التضخيم المسبق ل RPA متعدد الإرسال والكشف المتعدد المستند إلى Cas13 باستخدام إنزيمات Cas مع قراءات مضان متعددة الألوان للكشف المتزامن عن الأهداف الجينية المتعددة²^،⁷.

في بروتوكولاتنا ، نقوم أولا بتضخيم الحمض النووي الريبي متساوي الحرارة باستخدام RT-RPA عن طريق إضافة عينة الحمض النووي الريبي إلى الشكل المجفف بالتجميد لكاشف RT-RPA (الشكل 1). أثناء RT-RPA ، تتم إضافة محفز T7 إلى مضخم الحمض النووي مزدوج الشريطة. بعد ذلك ، يتم نقل منتجات RPA إلى الكشف القائم على Cas13 المجفف بالتجميد ، والذي يحتوي أيضا على بوليميراز T7 RNA. سيقوم تفاعل الكشف هذا بتحويل أمبليكونات الحمض النووي إلى حمض نوال أربي (عبر بوليميراز الحمض النووي الريبي T7) ، والذي يمكن اكتشافه بسهولة باستخدام Cas13 المبرمج بواسطة crRNA. سوف يشق Cas13 الذي يتم تنشيطه الهدف جزيئات المراسل لإنتاج إشارة مضان قابلة للاكتشاف²^،⁷^،¹⁴. في حين أن البروتوكولات هنا تتعلق بالكشف بواسطة Leptotrichia wadei (LwaCas13a) ، يمكن توسيعها إلى الكشف المتزامن ومضاعف الإرسال لما يصل إلى أربعة أهداف باستخدام إنزيمات Cas13 و Cas12 المتعامدة⁷^،⁹. يمكن أيضا دمج تفاعلات الكشف المستندة إلى RPA و Cas في أنبوب واحد ، وإن كان ذلك مع فقدان الحساسية¹⁴.

figure-introduction-1
الشكل 1: سير عمل الكشف المستند إلى CRISPR. يوضح سير العمل اكتشاف جينين مستهدفين. أولا ، يتم تضخيم مناطق الأهمية داخل هدف الحمض النووي متساوي الحرارة باستخدام RPA. يمكن إجراء التفاعل باستخدام النسخ العكسي (RT-RPA) عند اكتشاف أهداف الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، يقوم نسخ T7 بتحويل أمبليكونات dsDNA إلى RNAs ، والتي بدورها يتم التعرف عليها بواسطة مجمعات Cas13-crRNA القادرة على استنباط نشاط RNase الجانبي عند الارتباط المستهدف. ينتج عن انقسام مراسلي التألق المروي إشارات مضان يمكن مراقبتها باستخدام قارئ صفيحة دقيقة ، أو يتم تصورها بواسطة مصباح إضاءة LED ، أو استخدامها مع جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي. الاختصارات: كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ RT = النسخ العكسي ؛ RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كاس = البروتين المرتبط بكريسبر. LED = الصمام الثنائي الباعث للضوء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

السمات الرئيسية للبروتوكولات المعروضة هنا هي تركيبات الخلط المسبق للتجميد بالتجميد. يعمل الخلط المسبق على تبسيط استخدام التفاعل ويعزز قابلية التكاثر ، ولكن العديد من المكونات داخل RPA والكشف المستند إلى Cas - وخاصة النسخ العكسي وبعض العوامل المساعدة القابلة للتغيير مثل ATP ليست مستقرة في المحلول. لذلك ، نقوم بصياغة الحلول المخلوطة مسبقا بحيث يمكن تجفيفها بالتجميد للتخزين طويل الأجل وسهولة النقل والنشر¹^،⁹^،²⁰. تساعد الكواشف المخلوطة مسبقا والمجففة بالتجميد أيضا على تحسين حساسية الكشف ، حيث يمكن إضافة حجم عينة أعلى (وبالتالي ، مدخلات أعلى للحمض النووي / الحمض النووي الريبي) لإعادة تكوين التفاعل¹⁰. في تركيباتنا ، نستخدم في المقام الأول تريهالوز²¹ كمادة ساخنة بالتبريد في تفاعلات الكشف عن RPA المجففة بالتجميد وتفاعلات الكشف المستندة^{إلى Cas 7}. بالإضافة إلى الحفاظ على الكاشف ، يعزز التريهالوز أيضا التفاعلات عن طريق زيادة استقرار الإنزيم¹⁶^،²²^،²³^،²⁴ وتقليل درجات حرارة انصهار dsDNA²³. قد ينتج عن استكشاف مثبتات أخرى⁵^،⁷^،²¹^،²⁵^،²⁶ خارج تريهالوز تركيبات أكثر مثالية لسيناريوهات الاستخدام المختلفة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الكواشف المخلوطة مسبقا RT-RPA المجففة بالتجميد

إعداد المعدات
1. قم بإعداد ديوار أو صينية من النيتروجين السائل للتجميد السريع للتفاعلات. املأ الديوار أو الصينية بالنيتروجين السائل.
2. مجفف التجميد
  1. تحقق من وجود ماء مكثف في أنابيب التصريف وداخل الغرفة ؛ قم بإزالة الماء إذا لزم الأمر.
  2. قم بتنظيف الجزء الداخلي من الغرفة والرف المعدني لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل بمحلول إزالة التلوث RNase ، متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  3. أغلق باب الغرفة وصمام تحرير الفراغ.
  4. قم بتشغيل مجفف التجميد.
  5. اضبط درجة حرارة الرف يدويا على -30 درجة مئوية.
3. معدات البيولوجيا الجزيئية
  1. قم بتنظيف ما يلي باستخدام محلول إزالة التلوث RNase: الماصات ورفوف أطراف الماصة وخلاط دوامة وجهاز طرد مركزي صغير دوار لأسفل وعلامة دائمة.
  2. نظف ما يلي بماء الصنبور ، ثم امسحه بورق تنظيف مناديل: رفوف بلاستيكية لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة وصندوق رغوي للثلج.
  3. قم بإعداد كتلة تسخين (تستخدم لإذابة / إذابة محلول الدهون الثلاثية) عن طريق تنظيفها بمحلول إزالة التلوث RNase و 70٪ من الإيثانول. ثم قم بتشغيله واضبط درجة الحرارة على 60 درجة مئوية.
تحضير تفاعلات RPA المختلطة مسبقا
ملاحظة: هذه الصيغة مخصصة ل 10 تفاعلات (باستخدام ثلاث كريات RPA).
1. تحقق مما إذا كان هناك أي راسب في محلول الدهون الثلاثية قبل الاستخدام. إذا كانت هناك رواسب ، فقم بإذابتها عن طريق احتضانها عند 60 درجة مئوية وخلطها جيدا قبل الاستخدام. قم بتبريد محلول الدهون الثلاثية قبل إضافة الكواشف الأخرى الحساسة للحرارة.
  ملاحظة: يمكن أن تتشكل الرواسب بسهولة إذا ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة.
2. قم بإزالة ثلاثة أنابيب شريط بيليه RPA من الفريزر ؛ اضغط على أنابيب الشريط عن طريق طرقها برفق على مقعد المختبر لإخراج الكريات البيضاء.
3. انقل جميع الكريات الثلاثة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل A.
4. الماصة 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لشطف أي مسحوق RPA متبقي في الأنابيب الشريطية ونقل محلول الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل B.
5. أضف 10 ميكرولتر من محلول الدهون الثلاثية 0.57 M و 10 ميكرولتر من مزيج التمهيدي (10 ميكرومتر لكل منهما) إلى أنبوب Mastermix B.
6. أنبوب مزيج دوامة ب ؛ ثم قم بالدوران وضع الأنبوب على الجليد.
7. أضف 28.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x RPA (محضر من 500 ميكرولتر من 50٪ (وزن / حجم) PEG20000 ، و 250 ميكرولتر من 1 M Tris pH 7.4 ، و 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار dithiothreitol (DTT)) إلى أنبوب Mastermix B واخلطه جيدا عن طريق النقر القوي أو الاهتزاز عدة مرات.
  ملاحظة: نصنع الحل بهذه الطريقة للمساعدة في تخفيف / تقليل لزوجة PEG في أنبوب الماستر ميكس ، قبل إضافة كل شيء لإذابة كريات RPA.
8. انقل الكريات التي تم جمعها في الأنبوب A من الخطوة 1.2.3 إلى أنبوب الماستر ميكس B ثم اقلب أنبوب الماستر ميكس عدة مرات للخلط. لاحظ ما إذا كان المحلول يبدو متجانسا وأحادي الطور (سيبدو أيضا معتما قليلا) ثم ضع الأنبوب على الجليد.
  ملاحظة: إذا لم يكن الخلط شاملا ، يمكن أن يتسبب PEG في فصل المحلول / التعليق عن الطور.
9. أضف 0.71 ميكرولتر من 200 وحدة / ميكرولتر RT و 2.84 ميكرولتر من 5 وحدات / ميكرولتر RNase H إلى أنبوب الماسترمكس. اضغط برفق على أنبوب الماستر ميكس أو اقلبه لأعلى ولأسفل عدة مرات. قم بالدوران وضع الأنبوب على الجليد.
  ملاحظة: نضيف هذه الإنزيمات بعد الخلط الثقيل للخطوات السابقة لأن RT و RNase H حساسان للقص بسبب الخلط ؛ لا مزيد من الدوامة بعد إضافة RT / RNase H.
10. Aliquot 8.4 ميكرولتر من محلول mastermix إلى 10 أنابيب مبردة مسبقا سعة 1.5 مل ووضع الأنابيب على الجليد. للقيام بذلك، قم بغمر طرف الماصة في محلول الماستر ميكس واسحب محلول الماصة في الطرف ببطء وثبات لمنع تكون فقاعات الهواء ولضمان قياس الحجم بدقة. قم بتوزيع محلول الماستر ميكس في أنبوب مبرد مسبقا سعة 1.5 مل.
  ملاحظة: مع 8.4 ميكرولتر مقتبس ، في تجربتنا ، سيكون هناك ~ 1-2 ميكرولتر معلق متبقي في أنبوب الماسترميكس. يمكن للمجرب ضبط حجم الاقتباس قليلا لضمان كواشف كافية لجميع التفاعلات العشرة. استخدم تقنيات سحب العينات المناسبة عند التعامل مع المحاليل اللزجة.
11. بعد اكتمال الاقتباس ، ضع الأنابيب في رف معدني مغمور في النيتروجين السائل لإعدادها للتجميد بالتجميد. اترك الأنابيب مغمورة في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
  ملاحظة: نظرا لأن التجميد يزيل المحلول الزائد ، فإنه يسمح لنا بإضافة المزيد من مدخلات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ، مما يساعد على زيادة الحساسية. يمكن تخزين تفاعلات RPA المخلوطة مسبقا المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر. يساعد التجميد بالتجميد في قابلية التكاثر إذا تم إجراء تجربة معينة باستخدام خلطات RPA الرئيسية المعدة في نفس الدفعة ، لذا فإن صنع دفعة أكبر يساعد أيضا.
التجميد بالتجميد
1. في مجفف التجميد ، تحقق من درجات حرارة المجمع والرف. إذا لزم الأمر ، انتظر حتى تصل درجة حرارة المجمع إلى -75 ± 5 درجة مئوية وتصل درجة حرارة الرف إلى -30 ± 1 درجة مئوية.
2. قم بتغطية الأنابيب المفتوحة في الرف المعدني بورقة من ورق التنظيف ، ضع الرف المعدني مع الأنابيب المفتوحة في رف مجفف التجميد ، وأغلق باب الرف.
3. حدد البرنامج الموضح في الجدول 1 واضغط على ابدأ. بعد 30 دقيقة من خطوة التجفيف الثانوية (20 درجة مئوية ، <0.1 ملي بار ؛ يتم الاحتفاظ بدرجة الحرارة بلا حدود عن طريق ضبط وقت الخطوة على "لانهائي") ، اضغط على إيقاف البرنامج.
  ملاحظة: نترك الأنابيب تسخن في مجفف التجميد لمنع تكثيف الماء.
4. حرر الضغط عن طريق فتح صمام تحرير الفراغ ، ثم قم بإزالة الرف من الرف. قم بتغطية الأنابيب على الفور وقم بتخزين التفاعلات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية.
  ملاحظة: يمكن تخزين تفاعلات RPA المجففة بالتجميد و CRISPR-Cas13a مسبقا عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر.

2. تحضير كواشف الكشف CRISPR-Cas13a المجففة بالتجميد

ملاحظة: اتبع الخطوة 1.1 لإعداد المعدات.

تحضير تفاعل CRISPR-Cas13a مسبقا (10 تفاعلات)
1. قم بإزالة العناصر التالية من التخزين وضعها على الثلج: 10 ميكرولتر من LwaCas13a (يتم إنتاجه داخليا⁷^،⁸^،¹⁴) (2 مجم / مل) ، مخزن تخزين Cas ، 10 نانوغرام / ميكرولتر (225 نانومتر) crRNA ، 25 ملي مولار rNTP ، 50 وحدة / ميكرولتر T7 بوليميراز الحمض النووي الريبي ، 2 ميكرومتر من مراسل مضان FAM.
2. قم بإعداد محلول عملي ل LwaCas13a عند 126 ميكروغرام / مل (900 نانومتر) عن طريق إضافة 148.8 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتخزين Cas (50 ملي مولار Tris-HCl الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 0.6 م كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 2 ملي DTT) إلى 10 ميكرولتر من 2 مجم / مل LwaCas13a.
3. قم بإعداد تفاعل CRISPR-Cas13a mastermix على النحو التالي: 71 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، 20 ميكرولتر من 400 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 20 ميكرولتر من 60٪ (وزن / حجم) تريهالوز ، 10 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر (225 نانومتر) crRNA (هنا ، يستهدف جينات s و n من SARS-CoV-2) ، 8 ميكرولتر من مزيج 100 ملي مولار rNTP (25 ملي مولار لكل منهما) ، 6 ميكرولتر من 50 وحدة / ميكرولتر T7 بوليميراز الحمض النووي الريبي ، 25 ميكرولتر من 2 ميكرومتر من تقرير مضان FAM ، و 10 ميكرولتر من 126 ميكروغرام / مل (900 نانومتر) LwaCas13a. تخلط جيدا عن طريق عكس أنبوب الماسترميكس. ثم تدور لأسفل.
4. Aliquot 17 ميكرولتر من الماستر ميكس إلى 10 أنابيب 1.5 مل موضوعة على الجليد. ضع الأنابيب في رف مغمور في النيتروجين السائل واترك الأنابيب مغمورة في النيتروجين السائل لمدة 5 دقائق.
التجميد بالتجميد
1. في مجفف التجميد ، تحقق من درجات حرارة المجمع والرف وانتظر حتى تصل درجة حرارة المجمع إلى -75 ± 5 درجة مئوية وتصل درجة حرارة الرف إلى -30 ± 1 درجة مئوية.
2. ضع الأنابيب في مجفف التجميد. حدد البرنامج الموضح في الجدول 1 واضغط على ابدأ. بعد 30 دقيقة من خطوة التجفيف الثانوية (25 درجة مئوية ، <0.1 ملي بار ؛ يتم الاحتفاظ بدرجة الحرارة بشكل لا نهائي عن طريق ضبط وقت الخطوة على "لانهائي") ، أوقف البرنامج.
3. حرر الضغط عن طريق فتح صمام تحرير الفراغ وإزالة الرف من الرف. قم بتغطية الأنابيب على الفور وقم بتخزين التفاعلات المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية.
  ملاحظة: يمكن تخزين الكواشف المخلوطة مسبقا RPA و CRISPR-Cas13a المجففة بالتجميد عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر.

3. تضخيم الحمض النووي RT-RPA

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل، يجب فصل مناطق مكان العمل والماصات للتضخيم المسبق وإضافة العينة والتضخيم اللاحق. نوصي باستخدام أطراف الماصة المفلترة.

قم بتسخين حاضنة الاهتزاز الحراري عند 42 درجة مئوية.
أضف 1 ميكرولتر من خلات المغنيسيوم (Mg (OAc) ₂) ومزيج محلول أسيتات البوتاسيوم (KOAc) (يتكون من 196 ملي مولار مجم (OAc) ₂ و 1.5 م KOAc) إلى جانب الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات RT-RPA المجففة بالتجميد (من القسم 1).
ملاحظة: خدعة لإضافة مزيج Mg (OAc) ₂ و KOAc: يجب وضع القطرة عند علامة حجم 1 مل للأنبوب. هنا ، سيكون الانخفاض مرئيا بوضوح ومن غير المحتمل أن يضيع من إغلاق الأنبوب أو الإجراءات الأخرى. سيبدأ التضخيم بعد الدوران لأسفل لجمع القطرة في قاع الأنبوب. عند معالجة أكثر من تفاعل واحد في وقت واحد ، يمكن بدء التضخيم في وقت واحد.
أعد تعليق حبيبات RT-RPA بإضافة 12.4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (أو عينات التحكم).
ملاحظة: تسلسل الإضافة هو العينة السلبية / التحكم السلبي ، الحمض النووي الريبي / الحمض النووي المراد اختباره ، العينة الإيجابية / التحكم الإيجابي.
لبدء تفاعل RT-RPA ، قم بتدوير الحل المضاف لفترة وجيزة من الخطوتين 3.2 و 3.3 باستخدام جهاز طرد مركزي صغير دائري في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ثوان.
امزج عن طريق النقر بعناية على الأنبوب ثم قم بتدوير قصير آخر لمدة 3 ثوان.
احتضان التفاعل عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عن طريق وضعه في كتلة تسخين مسخنة مسبقا أو حاضنة اهتزاز حراري.
بعد نهاية التفاعل ، أخرج أنابيب التفاعل وضعها على الجليد قبل الانتقال إلى خطوة الكشف عن CRISPR-Cas (القسم 4).
ملاحظة: يمكن استخدام المنتج المضخم بتقنية RPA في تفاعل الكشف على الفور أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لعدة أيام أو عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.

4. كشف الحمض النووي CRISPR-Cas13

قم بتشغيل قارئ الألواح الدقيقة الفلورية ، واضبط درجة حرارة التسخين وقم بتسخينها مسبقا على 37 درجة مئوية ، وحدد البرنامج الموضح في الجدول 2.
ضع طبقا بسعة 384 بئرا على الثلج.
أعد تعليق تفاعل الكشف الممزوج مسبقا CRISPR-Cas المجفف بالتجميد (من القسم 2) بإضافة 17 ميكرولتر من محلول كلوريد المغنيسيوم 8 ملليمتر. امزج عن طريق النقر بعناية على الأنبوب. ثم قم بالدوران لفترة وجيزة لمدة 3 ثوان وضع الأنبوب على الجليد.
انقل 18 ميكرولتر من مزيج التفاعل المعلق إلى كل بئر من الصفيحة المبردة مسبقا المكونة من 384 بئرا على الجليد.
أضف 2 ميكرولتر من ناتج RPA المحضر في القسم 3 إلى كل تفاعل جيد.
قم بإزالة اللوحة من الجليد ، وضعها بسرعة في قارئ صفيحة مضان مسخن مسبقا ، واضغط على ابدأ.
ملاحظة: تم وضع صفيحة 384 بئرا على الجليد للسماح بمزامنة بدء التفاعل عند نقل اللوحة المكونة من 384 بئرا إلى قارئ صفيحة مضان مسخن مسبقا.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نسلط الضوء على حركية توليد إشارة مضان FAM من الكشف المشترك عن جينات s و n ل SARS-CoV-2 ، وكيف تم استخدام المعلومات لتحديد الظروف المثلى لتركيبات التفاعل المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا. في جميع الحالات ، قمنا بتضمين عينات ذات قيم C_t جيدا ضمن حد الكشف المحدد (LoD) (C_t ~ 31-33) ، بالإضافة إلى تلك التي تحتوي على C_t في LoD (C_t ~ 35-37) ⁷ ، للسماح بتمايز البروتوكولات بحساسية أفضل.

بالنسبة ل RT-RPA المجفف بالتجميد ، وجدنا أن إدراج KOAc في التفاعل الممزوج مسبقا أثر سلبا على حساسية التفاعل (الشكل 2 أ). لذلك حذفنا KOAc من التفاعل الممزوج مسبقا وأضفناه مع بادئ التفاعل ، Mg (OAc) ₂ ، بمجرد إضافة عينة الحمض النووي الريبي. استخدمنا أيضا فحوصات مماثلة لتحديد التركيز الأمثل لتريهالوز التبريد (الشكل 2 ب) وتأثيرات ثلاثي الجليسين⁷ في تفاعل RT-RPA المجفف بالتجميد (الشكل 2 ج). لذلك ، تم تحضير تفاعلات RT-RPA المجففة بالتجميد والمختلطة مسبقا بنسبة 6٪ تريهالوز ، بدون KOAc (ولكن تمت إضافتها لاحقا بعد عينة الحمض النووي الريبي) ، واستكمالها بثلاثي الجليسين ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 1.

figure-results-1
الشكل 2: تحسين تفاعلات RT-RPA المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا. تم إعداد تفاعل RT-RPA باستخدام بادئات تستهدف الجين n ل SAR-CoV-2. تم استبعاد Mg (OAc) ₂ من جميع التفاعلات المخلوطة مسبقا. تم تقييم تأثيرات (أ) KOAc و (B) تريهالوز و (ج) ثلاثي الجليسين المضاف إلى التفاعلات المخلوطة مسبقا. تم إجراء مراقبة التفاعل عبر مضان FAM المتولد باستخدام جهاز تدوير حراري في الوقت الفعلي أو قارئ صفيحة دقيقة فلورية. يتم عرض البيانات الفردية من القياسات الثلاثية. الاختصارات: RT = النسخ العكسي. RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ كاس = البروتين المرتبط بكريسبر. SAR-CoV-2 = فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 ؛ C_t = عتبة الدورة ؛ FAM = carboxyfluorescein. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالنسبة للتفاعلات المجففة بالتجميد والمختلطة مسبقا القائمة على Cas13a ، تحققنا من أهمية وجود مادة التبريد الصحيحة: إما 6٪ تريهالوز أو 2٪ سكروز¹⁹ يعمل بشكل جيد ، بينما لم يحافظ السكروز المنخفض عند 1٪ أو 5٪ وزن / حجم PEG20000 على كفاءة التفاعل بعد التجميد (الشكل 3). تم حذف MgCl₂ من جميع التفاعلات وأضيف في خطوة الإماهة. تم تحضير تفاعل الكشف الأمثل القائم على Cas13 المجفف بالتجميد بنسبة 6٪ من التريهالوز كما هو موضح في قسم البروتوكول 2.

figure-results-2
الشكل 3: تحسين تفاعلات الكشف المستندة إلى Cas13 المجففة بالتجميد والمختلطة مسبقا. تم إجراء تفاعل الكشف عند 37 درجة مئوية باستخدام منتج RPA من جين SARS-CoV-2 n. تم إجراء الاختبارات قبل وبعد التجميد بالتجميد. تم استبعاد MgCl₂ من جميع التفاعلات المخلوطة مسبقا. تم تقييم قدرات (أ) تريهالوز ، (ب) PEG20000 ، و (ج) السكروز في الحفاظ على كفاءة التفاعل بعد التجميد بالتجميد. تم إجراء مراقبة التفاعل عبر مضان FAM المتولد باستخدام دورة حرارية في الوقت الفعلي. يتم عرض بيانات فردية من قياسات ثلاثية لظروف "بعد التجفيف" وتكرار واحد من ظروف "قبل التجميد بالتجميد". الشكل 3 أ ، ب مأخوذ من باتشونغ ^{وآخرون 7}. الاختصارات: RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ SAR-CoV-2 = فيروس كورونا 2 ؛ FAM = carboxyfluorescein. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشف المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا للتفاعلات القائمة على RT-RPA و Cas13 مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة 8 أشهر على الأقل [الشكل 4].

figure-results-3
الشكل 4: اختبارات ثبات كواشف RPA و CRISPR-Cas13a المجففة بالتجميد والمخلوطة مسبقا عند -20 درجة مئوية. اختبار الثبات في (أ) 30 يوما ، (ب) 45 يوما ، (ج) 3 أشهر ، (د) 5 أشهر ، (ه) 8 أشهر. يتم عرض البيانات الفردية من القياسات الثلاثية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر في الشكل 5 LoD للتفاعلات المستندة إلى RT-RPA و Cas13 المجففة بالتجميد للكشف عن جينات s و n ل SARS-CoV-2. يمكن تحسين حركية توليد الإشارة عند اكتشاف الجين المزدوج مقارنة باكتشاف جين واحد فقط.

figure-results-4
الشكل 5: الحساسية التحليلية للكشف عن الجين الفردي مقابل الكشف عن الجين المزدوج. (أ) LoD للكشف المستند إلى RT-RPA أحادي التجميد المجفف بالتجميد والكشف المستند إلى Cas الذي يستهدف جين s من SAR-CoV-2. (ب) LoD للكشف المستند إلى RT-RPA المجفف بالتجميد والكشف المستند إلى Cas الذي يستهدف الجين n ل SAR-CoV-2. (ج) LoD للRT-RPA متعدد الإرسال المجفف بالتجميد والكشف المزدوج المستند إلى Cas الذي يستهدف الجينات s و n . تم تحديد LoD باستخدام الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 المخفف بشكل متسلسل ، والذي تم تحديد قيم C_t الخاصة به باستخدام اختبار RT-qPCR الذي يستهدف الجين n . يتم عرض البيانات الفردية من 3-6 قياسات مكررة. الاختصارات: LoD = حد الكشف. RT = النسخ العكسي ؛ RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ كاس = البروتين المرتبط بكريسبر. SAR-CoV-2 = فيروس كورونا المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 ؛ C_t = عتبة الدورة ؛ qPCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بالإضافة إلى اكتشاف الفيروس ، نعرض نموذجا أوليا لأداة التنميط الجيني POC بناء على تشخيصات كريسبر ، للمساعدة في تحديد أنواع الثعابين السامة المتوطنة في تايلاند (الشكل 6). يمكن أن يساعد التعرف الأسرع والدقيق على أنواع الثعابين من خلال عينات الحمض النووي التي تم جمعها من جروح اللدغة في الإدارة الفورية لمضادات السموم ، مما يحسن فرصة المريض في البقاء على قيد الحياة. لقد استهدفنا المناطق داخل جين السيتوكروم ب للميتوكوندريا (cytb) لثمانية أنواع من الثعابين بما في ذلك Ophiophagus hannah (King cobra) (الشكل 6 أ) وأظهرنا أن الكشف عن بدائل الحمض النووي الاصطناعي ل O. hannah cytb الجين يمكن أن يصل إلى مستوى الحساسية الجوي.

figure-results-5
الشكل 6: نموذج أولي للكشف المستند إلى كريسبر لتحديد أنواع الثعابين من تسمم لدغات الأفاعي. (أ) بادئات RPA وتصميم LwaCas13a crRNA للكشف عن جين cytb ل Ophiophagus hannah. تم وضع محرك T7 (T7 المتدلي) في نهاية 5 'من التمهيدي RPA الأمامي. (ب) حركية توليد إشارة FAM على مدى 60 دقيقة و (ج) مضان FAM لنقطة النهاية من الكشف بوساطة LwaCas13a لمدخلات dsDNA الاصطناعية المقابلة لمقاطع جين cytb من O. hannah. تم استخدام تركيزات مدخلات مختلفة (0 ، ^10-9 ، ^10-12 ، ^10-15 ، ^10-18 م). البيانات متوسطة ± sd من قياسات ثلاثية. الاختصارات: RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ كاس = البروتين المرتبط بكريسبر. FAM = carboxyfluorescein. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجميد كواشف الكشف CRISPR-Cas13a المخلوطة مسبقا
درج	معدل المنحدر	درجة حرارة الرف	الوقت (hh:mm)	فراغ
درج	(درجة مئوية / دقيقة)	(درجة مئوية)	الوقت (hh:mm)	(مبار)
تجميد 1	3	-30	قباله	-
جاف 1	3	-30	قباله	0
جاف 2	3	4	01:00	0
جاف 3	3	20	∞	0

الجدول 1: إعدادات مجفف التخلف لكواشف الكشف RT-RPA و CRISPR-Cas13a المختلطة مسبقا. الاختصارات: RT = النسخ العكسي. RPA = تضخيم البوليميراز المركب ؛ كريسبر = التكرارات المتجانسة القصيرة العنقودية المتباعدة بانتظام ؛ كاس = بروتين مرتبط ب CRISPR.

البارامتر		اعداد
درجة الحرارة		37 درجة مئوية
الدورة الحركية	المدة الزمنية	02:00 (مم: SS)
الدورة الحركية	الفاصل الزمني	02:30 (مم: SS)
يهز	المدة الزمنية	1 ثانية
	طريقة	طولي
	السعه	1 ملم
شدة التألق	الطول الموجي للإثارة	488 نانومتر
	الطول الموجي للانبعاث	520 نانومتر
	طريقة	أعلى
	Z-الموقف	24470
	كسب	71
	وقت التكامل	20 ميكرو ثانية
	عدد الومضات	25

الجدول 2: برنامج قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية للكشف عن الحمض النووي.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. لفصل المنطقة ، يوصى باستخدام مساحات منفصلة لاستخراج الحمض النووي ، وإعداد الماستر ميكس (منطقة التضخيم المسبق) ، وإضافة العينة ، واكتشاف الamplicon (منطقة ما بعد التضخيم). يجب تعيين كل منطقة باستخدام مجموعة منفصلة من الأدوات والمعدات. لا تحضر الأدوات من منطقة إلى منطقة أخرى ، خاصة من منطقة ما بعد التضخيم إلى منطقة ما قبل التضخيم. تنظيف مناطق العمل ضروري: يجب على المرء تنظيف مناطق العمل والماصات والدوامات والعلامات الدائمة باستخدام محلول إزالة التلوث RNase / DNase / 3٪ Clorox متبوعا بنسبة 70٪ من الإيثانول أو الماء منزوع الأيونات المعقم. يلزم غسل أدوات المختبر الأساسية والأجزاء القابلة للإزالة من الأدوات ، مثل الرفوف البلاستيكية الأنبوبية سعة 1.5 مل ومحول الدوار لجهاز طرد مركزي صغير. تستخدم المياه الخالية من النكلياز كعنصر تحكم سلبي ومكون تفاعل ، وبالتالي فهي كاشف حساس يمكن أن يتلوث إذا لم يتم التعامل معه بعناية. لذلك ، نوصي بعمل كميات صغيرة من الماء لاستخدامها مرة واحدة فقط.

قم دائما بتشغيل تفاعل تحكم سلبي باستخدام بادئات الفحص للتحقق من التلوث. بالإضافة إلى ذلك ، لتجنب مشاكل التلوث ، نوصي بإعداد تفاعل التحكم السلبي عن طريق إضافة ماء خال من النوكلياز في منطقة ما قبل التضخيم بدلا من غرفة إضافة العينة. يجب أن يتم اقتباس خليط أسيتات المغنيسيوم وخلات البوتاسيوم بكميات صغيرة (~ 20 ميكرولتر / أنبوب) تستخدم مرة واحدة فقط لتجنب تلوث الكاشف بمكبرات الصوت المرحلة. عند إضافة خليط أسيتات المغنيسيوم والبوتاسيوم إلى تفاعلات RPA المجففة بالتجميد ، نوصي بتغيير طرف الماصة في كل مرة. بالنسبة لسير عمل التجارب، حافظ على سير العمل أحادي الاتجاه، من التضخيم المسبق إلى تجارب التضخيم اللاحقة. انتقل من مساحات العمل "الأنظف" (التضخيم المسبق) إلى مساحات العمل "الأكثر قذرة" (ما بعد التضخيم).

لإجراء تعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الطريقة لتجنب التلوث المرحلي لمكبرات الصوت ، نوصي بالفصل المكاني بين الخطوات الرئيسية الثلاث للتجربة: تحضير تفاعل RPA. إضافة عينة وخطوات التضخيم والكشف. يجب تحضير الماستر ميكس في منطقة خالية من القوالب في المختبر. عند تغيير الغرف ، قم أيضا بتغيير القفازات ومعاطف المختبر. العمل في اتجاه واحد من قبل التضخيم إلى ما بعده. تجنب استخدام نفس الماصة لخطوات مختلفة. من الأفضل ترتيب مجموعات مختلفة من الماصات لهذه الخطوات: تحضير المكسات الرئيسية ؛ إضافة قالب الحمض النووي / الحمض النووي الريبي ؛ ونقل المنتج المضخم. استخدم أطراف مفلترة ، وحاول منع تكوين الهباء الجوي قدر الإمكان ، وتجنب لمس الجزء الداخلي من الأنبوب عند فتحه. إذا أظهرت تجارب التضخيم تلوثا ، فيجب تغيير جميع الكواشف. إذا أمكن ، اذهب إلى مختبر آخر به كواشف جديدة وتحقق مما إذا كان التلوث مستمرا. بصرف النظر عن الكواشف ، لا تحضر أي شيء آخر بما في ذلك الماصات. جرب تعقيم الماصات إذا كانت قابلة للتعقيم.

لتحسين معدل التضخيم (تحسين الفحص) ، أولا ، راجع تعليمات الشركة المصنعة مثل دليل RPA من TwistDx لضمان التصميمات المثلى. بعد ذلك ، جرب التحسينات التجريبية للتفاعلات مثل إضافة إضافات التفاعل المعروفة بتعزيز تفاعلات RPA و CRISPR⁷ ؛ زيادة أوقات التفاعل (على سبيل المثال ، وقت رد فعل RPA حتى 60 دقيقة) ؛ أو تسلسلات وتركيزات أولية متفاوتة. نوصي أيضا بإضافة أكبر قدر ممكن من حجم العينة ؛ يسمح استخدام الكواشف المجففة بالتجميد بإضافة المزيد من حجم العينة. لتقليل تألق الخلفية ، يمكن للمرء القيام بخطوة تعطيل الحرارة (75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) بعد الانتهاء من RPA ، قبل الانتقال إلى الكشف ، أو تحسين تركيز المراسل. الكثير من المراسلين سيعطي خلفية أعلى. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد إضافة مثبطات RNase على منع التدهور المستقل عن Cas للمراسل.

بالإضافة إلى تحسين ظروف التفاعل المستندة إلى (RT) -RPA و CRISPR وإجراءات التعامل معها ، يجب على المرء التأكد من أن الكواشف المستخدمة ذات نوعية جيدة ، وأن خطوة استخراج الحمض النووي التي تسبق جميع التفاعلات ناجحة. توفر الكواشف المجففة بالتجميد حساسية عالية للكشف ، وهي محمولة ، وتمكن من اختبار POC ، ويمكن تطبيقها على عينات سريرية متنوعة. علاوة على ذلك ، يمكن إعادة ترطيب المجفف بالتجميد (RT) - RPA على الفور عن طريق إضافة مستخلص الحمض النووي من العينات السريرية. أظهرت دراسة سابقة حساسية أعلى عند وضع حجم أكبر من مدخلات الحمض النووي بدون حجم محدود ، مما يزيد بشكل فعال من الكمية الإجمالية للحمض النووي المستهدف.

تم تكييف التشخيصات المستندة إلى كريسبر للكشف عن مسببات الأمراض من خلال جمع عينات سريرية مثل مسحات البلعوم الأنفي والحلق والبول والمصل⁷^،⁸^،¹¹. كما تم تطبيقه للتمييز بين متغيرات النيوكليوتيدات المفردة ، وتحديد الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في الكائنات الحية المقاومة لمضادات الميكروبات ، واكتشاف الطفرات المرتبطة بالسرطان. قد تكون فائدة التكنولوجيا هي الأكبر في التطبيقات الميدانية حيث يمكن الجمع بين التفاعلات الكيميائية الحيوية الهندسية للتضخيم متساوي الحرارة والكشف المستند إلى CRISPR مع الأجهزة والقراءات الجاهزة للميدان مثل مقياس الفلور المحمول باليد أو شرائط التدفق الجانبي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمت MP و C.U. براءة اختراع في تايلاند بشأن تركيبات الكشف المتعدد عن الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2. تعلن ر. ك. عن عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعترف CU بالتمويل المقدم من بنك سيام التجاري التابع لمركز أبحاث VISTEC-Siriraj Frontier ، ومن تايلاند لأبحاث العلوم والابتكار (TSRI) ، الصندوق الأساسي ، السنة المالية 2024 ، رقم المنحة FRB670026/0457. يتم دعم R.K. و M.P. من خلال أموال المنح الدراسية والمساعدة البحثية من VISTEC ، على التوالي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>المواد< القوية> محلول
البيتين	سيجما ألدريتش	B0300-1VL
المياه	DEPC إنفيتروجين	AM9915G
ديثيوثريتول (DTT)	ميرك	3870-25GM
EpiScript النسخ العكسي	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly& نب سب.	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	إنتاج داخلي		اسم السلالة: Leptotrichia wadei ، اختصار: Lwa ، اسم البروتين: LwaCas13a
محلول كلوريد المغنيسيوم ، 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA polymerase	Lucigen	30223-2
بولي (إيثيلين جلايكول)	سيجما ألدريتش	81300-1KG
محلول أسيتات البوتاسيوم ، 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
مزيج محلول ريونيوكليوتيد	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
السكروز	TCI	TCI-S0111-500G
تريهالوز ثنائي هيدرات	سيجما-ألدريتش	SIA-90210-50G
هيدروكلوريد تريزما ، 1 متر ، درجة الحموضة 7.4	مجموعة Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Basic	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment< / strong>BluPAD
Dual LED أزرق / أبيض ضوء Transilluminator	Bio-Helix	BP001CU
حمام جاف مزدوج الكتلة	ELITE	4-2-EL-02-220	الموديل: EL-02
Fluorescence microplate قارئ		تيكان 30050303	Infinite 200 Pro
	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Benchtop FreeZone مجفف التجميد
Microplate 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom ، حجم صغير ، Hibase ، Med. ملزمة ، أسود
الوقت الحقيقي التدوير الحراري (CFX Connect Real-Time PCR) Bio-Rad		185-5201	الموديل: CFX Connect Optics
Module<قوي>Oligonucleotide< / strong>
s-gene إلى الأمام RPA التمهيدي	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene عكس RPA التمهيدي	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gene إلى الأمام RPA التمهيدي	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gene RPA التمهيدي	IDT		CAGACATTTTGCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA للجين	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAG
LwaCas13a-crRNA للجين n	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA التمهيدي	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA التمهيدي	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC

المعالجة محلول الموديل: مجفف التجميد في

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).
Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919(2021).
Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).
Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).
Twistamp. Twistamp® assay design manual. , (2023).
Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).
Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).
Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).
Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420(2021).
Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cas13a

تشخيصات قائمة على تقنية كريسبر في نقاط الرعاية مع كواشف مخلوطة مسبقا ومجففة بالتجميد

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة