يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير بالضوء للكشف عن بنية القلب في قلوب القوارض

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66707

⸱

مارس 29, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يستخدم البروتوكول الفحص المجهري المتقدم للصفائح الضوئية جنبا إلى جنب مع طرق إزالة الأنسجة المكيفة للتحقيق في الهياكل القلبية المعقدة في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.

الملخص

يلعب المجهر ذو الصفيحة الضوئية (LSM) دورا محوريا في فهم البنية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) للقلب ، مما يوفر رؤى حاسمة في فسيولوجيا القلب الأساسية والاستجابات المرضية. نتعمق هنا في تطوير وتنفيذ تقنية LSM لتوضيح البنية الدقيقة للقلب في نماذج الفئران. تدمج المنهجية نظام LSM المخصص مع تقنيات إزالة الأنسجة ، مما يخفف من تشتت الضوء داخل أنسجة القلب للتصوير الحجمي. يسمح الجمع بين LSM التقليدي مع خياطة الصور وطرق إزالة الالتفاف متعددة الرؤية بالتقاط القلب بأكمله. لمعالجة المفاضلة المتأصلة بين الدقة المحورية ومجال الرؤية (FOV) ، نقدم أيضا طريقة مجهر الورقة الضوئية (ASLM) التي اجتاحتها محوريا لتقليل الضوء خارج التركيز البؤري وإضاءة القلب بشكل موحد عبر اتجاه الانتشار. في غضون ذلك ، تعمل طرق إزالة الأنسجة مثل iDISCO على تعزيز تغلغل الضوء ، مما يسهل تصور الهياكل العميقة وضمان فحص شامل لعضلة القلب في جميع أنحاء القلب بأكمله. يقدم الجمع بين LSM المقترح وطرق إزالة الأنسجة منصة واعدة للباحثين في حل الهياكل القلبية في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لفهم تشكل القلب وإعادة تشكيله.

المقدمة

لا يزال قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفيات في جميع أنحاء العالم ، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص القدرة على التجدد لخلايا عضلة القلب الناضجة1. تلعب البنية المعقدة للقلب دورا حاسما في وظيفته وتوفر نظرة ثاقبة للعمليات التنموية. يعد الفهم العميق لبنية القلب أمرا ضروريا لتوضيح العمليات الأساسية لتشكل القلب وإعادة تشكيله استجابة لاحتشاء عضلة القلب. وقد أظهر التقدم الأخير أن الفئران الوليدية يمكنها استعادة وظيفة القلب بعد الإصابة، في حين تفتقر الفئران البالغة إلى هذه القدرة على التجدد2. هذا يضع أساسا للتحقيق في الإشارات المرتبطة بالتشوهات الهيكلية والوظيفية في نماذج الماوس. طرق التصوير التقليدية ، مثل الفحص المجهري متحد البؤر ، لها قيود فنية ، بما في ذلك عمق الاختراق المقيد ، ونظام المسح البطيء للنقاط ، وتلف الصور الناتج عن التعرض الطويل لضوء الليزر. هذه تعيق التصوير الشامل ثلاثي الأبعاد (3D) للقلب السليم. في هذا السياق ، يظهر المجهر ذو الألواح الضوئية (LSM) كحل قوي ، حيث يوفر مزايا التصوير عالي السرعة وتقليل تلف الصور وقدرات التقسيم البصري الاستثنائية3،4،5. الميزات الفريدة ل LSM تضعها كطريقة واعدة للتغلب على قيود التقنيات التقليدية ، مما يوفر رؤى غير مسبوقة في تطوير القلب وعمليات إعادة التصميم6،7،8.

في هذا البروتوكول ، نقدم استراتيجية تصوير تجمع بين LSM المتقدم وأساليب إزالة الأنسجةالمعدلة 9 ، مما يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها دون الحاجة إلى وضع علامات محددة وتقسيم ميكانيكي. نقترح أيضا أنه يمكن تحسين تصوير LSM التقليدي من خلال تقنيات إزالة الالتفاف متعدد الرؤية10 أو تقنيات الفحص المجهري للصفائح الضوئية (ASLM)11،12،13،14،15 لتحسين الدقة المحورية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي دمج خياطة الصور مع أي من هذه الطرق إلى التغلب بشكل فعال على المفاضلة بين الدقة المكانية ومجال الرؤية (FOV) ، وبالتالي تطوير تصوير قلوب الفئران البالغة. يتيح دمج العديد من أساليب إزالة الأنسجة ، بما في ذلك الأساليب الكارهة للماء ، والمحبة للماء ، والقائمة على الهيدروجيل ، تغلغل أعمق للضوء لالتقاط مورفولوجيا القلب بأكمله16،17،18،19.

في حين أن طرق التطهير المتعددة متوافقة مع أنظمة LSM الحالية ، فإن الهدف هو تقليل تشتت الفوتون وتعزيز تغلغل الضوء في الأنسجة ، مثل القلب ، عن طريق استبدال الدهون بوسط يتطابق بشكل وثيق مع معامل الانكسار. تم اختيار iDISCO كممثل20,21 وتم تكييفه للتصوير الذاتي في هذا البروتوكول نظرا لمعالجته السريعة وشفافيته العالية (الشكل 1 أ). بشكل جماعي ، يوفر تكامل نهج LSM المتقدم مع تقنيات إزالة الأنسجة إطارا واعدا لكشف تشريح القلب المعقد في قلوب القوارض ، مما يحمل إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لتشكل القلب والإمراض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكولات والتجارب الحيوانية وأجريت تحت إشراف لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة تكساس في دالاس (IACUC # 21-03). تم استخدام الفئران C57BL6 ، بما في ذلك حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة (P1) والبالغين بعمر 8 أسابيع ، في هذه الدراسة. لم يلاحظ أي فرق بين الذكور والإناث. تم إجراء جميع عمليات الحصول على البيانات والمعالجة اللاحقة للصور باستخدام برامج أو منصات مفتوحة المصدر مع تراخيص بحثية أو تعليمية. الموارد متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.

1. تحضير العينات وتنظيف الأنسجة (6 - 10 أيام)

  1. تحضير جميع المحاليل الكيميائية في جدول المواد اللازمة لطريقة إزالة الأنسجة قبل البدء في إجراء إزالة الأنسجة.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات في غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، خاصة عند التعامل مع المواد الكيميائية السامة.
  2. القتل الرحيم للحيوانات مع CO2 عن طريق وضعها في غرفة CO2 في النقاط الزمنية المطلوبة ، مثل P1 و 8 أسابيع ، لجمع القلب بالكامل وغمر القلب المعزول حديثا في درجة حرارة الغرفة (RT) في 0.2 M KCl للقبض في الانبساط16.
  3. ثبت القلب عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) مع تحريض لطيف على الروك طوال الليل للحفاظ على تشريح القلب عند 4 درجات مئوية ، انظر الجدول 1.
    تنبيه: PFA مادة كيميائية سامة ويجب إجراؤها تحت غطاء الدخان.
  4. اغسل القلب باستخدام 1x PBS في RT لمدة 30 دقيقة ، 3x.
    ملاحظة: اختياري: قم بتضمين القلب في هلام الأغاروز لإنشاء مجموعة قلب لنظام LSM المصمم خصيصا في الخطوة 2 كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير محلول الأغاروز 1 ٪ عن طريق إذابة الأغاروز في برنامج تلفزيوني وتسخين الخليط في الميكروويف حتى يذوب تماما. صب المحلول في قالب لإنشاء طبقة سفلية حتى يبرد المحلول إلى 40 درجة مئوية.
    2. ضع القلب في القالب واملأ القالب بهلام الأغاروز حتى يصلب. تخلص من أي فقاعات في هلام الأغاروز لتقليل القطع الأثرية في التصوير.
      ملاحظة: يقلل تضمين العينة من خطر حدوث تلف محتمل لتشريح القلب أثناء التركيب.
      تنبيه: استخدم الأغاروز منخفض درجة الانصهار وتجنب وضع القلب مباشرة في أغاروز ساخن للتخفيف من خطر تعريض العينة لدرجات حرارة مرتفعة.
  5. تجفيف القلب باستخدام تدرجات الميثانول الممزوج بالماء منزوع الأيونات (الشكل 1 ب) ، والمعالجة من خلال تركيزات متسلسلة تبلغ 20٪ و 40٪ و 60٪ و 80٪ و 100٪ كما هو موضح في الجدول 1. كرر مع الميثانول الطازج 100٪ 1x لضمان الجفاف التام. تجفيف قلوب الفئران حديثي الولادة لمدة 1 ساعة في كل خليط الميثانول مع الهز. اضبط وقت الحضانة على 2 ساعة لقلوب الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع وقلوب الفئران.
    تنبيه: الميثانول مادة كيميائية متطايرة ومزعجة وقابلة للاشتعال.
  6. استبدل القلب بمحلول ميثانول طازج 100٪ وقم بتبريده لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. استبدل المحلول وقم بتبييض القلب ب 5٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) في الميثانول باستخدام نسبة حجم 1: 5 (30٪ H2O2 إلى 100٪ ميثانول) طوال الليل عند 4 درجات مئوية لإزالة الأصباغ.
    ملاحظة: تسمح إزالة الأصباغ بتقليل امتصاص الفوتون ، مما يؤدي إلى تحسين جودة الصورة مع تقليل القطع الأثرية.
  8. استبدل المحلول واحتضان القلب في ميثانول 100٪ لمدة 1 ساعة في RT.
  9. قم بإزالة الدهون من القلب بمحلول يحتوي على 66٪ ثنائي كلورو ميثان (DCM) و 33٪ ميثانول لمدة 3 ساعات مع الهز. تأكد من غرق القلب في قاع القارورة بنهاية هذه الخطوة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتجديد المحلول (66٪ DCM / 33٪ ميثانول) وقم بتمديد وقت الحضانة (على سبيل المثال ، 1 ساعة أخرى) لتحقيق إزالة الدهون الكاملة. انقل القلب إلى محلول جديد بسرعة لمنع الجفاف ، لأن DCM شديد التقلب.
    تنبيه: استخدم البولي بروبلين أو الأواني الزجاجية للتجربة ، لأن DCM غير متوافق مع البوليسترين.
  10. استخدم ثنائي بنزيل الأثير (DBE) لمطابقة معامل الانكسار (RI = 1.56). بالنسبة لقلوب الفئران حديثي الولادة ، تستغرق عملية مطابقة معامل الانكسار 2 أيام ، بينما بالنسبة لقلوب الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع ، تستغرق 5 أيام مع اهتزاز خفيف. استبدله ب DBE جديد وقم بتمديد وقت الحضانة حتى يحقق القلب الشفافية الكاملة.
    تنبيه: DBE خطير. تجنب أي اتصال مع الجلد.

2. تركيب عينة (1 يوم)

ملاحظة: في حالة استخدام نظام LSM تجاري ، اتبع بروتوكوله المحدد الذي توفره الشركة لإصلاح القلب وتخطي الخطوات 2.1 - 2.9.

  1. قم بتخصيص حجرة وحامل مقاوم لمحلول مطابقة معامل الانكسار (على سبيل المثال ، DBE في نهج iDISCO المعدل) باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ومواد Onyx (الشكل 2A)16.
  2. قم بتثبيت مغناطيس في الجزء السفلي من الغرفة لتسهيل الاتصال السريع والتوطين الدقيق تحت نظام LSM (الشكل 2B).
  3. قم بتوصيل نظارات غطاء مقاس 25 مم × 50 مم × 0.17 مم بالغرفة باستخدام غراء سيليكون شفاف وتحقق من سلامة مقاومة الماء للغرفة عن طريق ملئها ب DBE والتحقق من وجود تسربات بعد يوم 1.
  4. قم بتخصيص حامل المشبك باستخدام طابعة 3D وقم بتثبيت مغناطيس لتركيب مجموعة القلب داخل الحجرة (الشكل 2C) أو أدخل إبرة في هلام الأغاروز لتركيب مجموعة القلب.
  5. تنفيذ تطوير نظام LSM داخلي باستخدام عدسة أسطوانية وليزر الحالة الصلبة (DPSS) الذي يتم ضخه بالصمام الثنائي المستمر كما تم الإبلاغ عنه سابقا16,22. استخدم الطول الموجي للإثارة البالغ 532 نانومتر لالتقاط التألق الذاتي من عضلة القلب (الشكل 2D).
  6. قم بتركيب الغرفة على مرحلة 6 أبعاد وحدد الموضع الأمثل حيث تكون الغرفة عمودية على اتجاه انتشار الليزر.
  7. استخدم حامل مشبك مغناطيسي لوضع العينة في منتصف الغرفة وتوصيل الحامل بمرحلة آلية 4 الأبعاد (X ، Y ، Z ، و Yaw ؛ الشكل 2 د).
  8. اغمر مجموعة القلب في الحجرة المملوءة ب DBE باستخدام المرحلة الآلية وحدد نطاق المسح على طول محور الكشف (الاتجاه Z).
  9. حدد سرعة المسح (Vz) للمحرك على طول الاتجاه Z بناء على حجم الخطوة (S) ووقت الحصول على صورة (T) باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-1
    ملاحظة: تلتزم العلاقة بين حجم الخطوة والدقة المحورية لنظام التصوير بنظرية أخذ العينات Nyquist-Shannon. فعلى سبيل المثال، حدد حجم الخطوة ب 1 ميكرومتر، بالنظر إلى أن الاستبانة المحورية كانت 2.91 ميكرومتر، كما هو مبين في التقريرالسابق 16.
  10. للتحقق من الدقة المكانية وتقليل مشكلات العتامة المحتملة على أعماق مختلفة ، قم بقياس وظيفة انتشار النقطة (PSF) للنظام عن طريق تصوير حبات الفلورسنت بقطر 0.53 ميكرومتر مخفف في هلام أغاروز منخفض نقطة انصهار بنسبة 1٪ بتركيز 1: 1.5 × 105. احسب PSF عبر العينة بأكملها عن طريق قياس العرض الكامل بنصف الحد الأقصى (FWHM)16.

3. خياطة الصورة (4-8 ساعات)

  1. احسب عدد البلاط المطلوب لتغطية قلب الماوس بالكامل ، مع الأخذ في الاعتبار FOV المحدود. لكل بلاطة ، تتوافق الأبعاد مع مجال الرؤية لنظام LSM. على سبيل المثال ، يتطلب قلب الفأر الوليدي بقياس مقطعي عرضي يبلغ 3 × 3.6 مم2 بلاطة 2 × 2 للتغطية في LSM المخصص (الشكل 3 أ). في المقابل ، يتطلب قلب الفأر البالغ من العمر 8 أسابيع بقياس 5 × 8 مم2 3 × 4 بلاطات لتغطية بنية القلب بأكملها (الشكل 3 ب).
    ملاحظة: مطلوب خياطة الصورة إذا كان LSM التقليدي لديه مجال رؤية محدود لتصوير القلب كله.
  2. التقط صورا للقلب بدءا من البلاط 1 ، أي بلاط الزاوية العلوية اليسرى للقلب (الشكل 3A-B).
  3. التقط صورا بالتجانب المتبقي بالتتابع مع تداخل بنسبة 10٪ بين المربعات المتتالية حتى يتم تغطية القلب بالكامل ، كما هو موضح في الشكل 3C.
  4. قم بتنزيل وتثبيت برنامج Fiji23 مفتوح المصدر. قم بتنزيل وتثبيت المكون الإضافي Fiji ، BigStitcher24.
  5. انتقل إلى قائمة المساعدة ، وحدد تحديث ، واختر إدارة موقع التحديث ، واختر BigStitcher. بعد ذلك ، انقر فوق إغلاق ، متبوعا بتطبيق التغييرات. عند الانتهاء من تنزيل المكون الإضافي ، أعد تشغيل برنامج فيجي.
  6. افتح المكون الإضافي BigStitcher واستورد جميع المربعات الضرورية من خلال دليل ملف الصورة. احفظ مجموعة البيانات كملف HDF5.
  7. تنظيم البلاطات باختيار نقل البلاطة حسب الشبكة العادية، حدد النموذج المستخدم لتحريك القلب، وحدد تداخل 10٪ بين كل بلاطة. قم بخياطة البلاطات باستخدام خيار معالج الخياطة.
  8. قم بتصدير البيانات المخيطة باستخدام Image Fusion ، لإنشاء ملف tiff.

4. إزالة الالتفاف متعدد المشاهدات (5 أيام)

  1. استخدم حبات الفلورسنت لتسجيل صور إعادة الإعمار متعددة المشاهدات على طول القلب (الشكل 3D).
    1. تحضير الراتنج25 عن طريق خلط ثنائي الفينول-أ ديجليسيديل الأثير (D.E.R. 332) ، إيزوفورون ديامين ، 5-أمينو-1،3،3-ثلاثي ميثيل سيكلو هكسانيثيل أمين (IPDA) ، والبولي بروبيلين غليكول ديجليسيديل الأثير (D.E.R 736) بنسبة حجم 4: 1: 1.
    2. أجهزة الطرد المركزي 10 ميكرولتر من حبات مضان في 161 × غرام لمدة 5 دقائق وإضافة 20 ميكرولتر من الميثانول لتحل محل حل تخزين الخرزات. كرر ذلك 3x.
    3. قم بإعداد محلول 10 مل بتركيز حبة 1: 1 × 105 عن طريق خلط محلول حبة الميثانول في الراتنج المحضر في الخطوة 4.1.1.
    4. قم بإزالة المحلول في غرفة مفرغة لمدة 3 ساعات لإزالة الجيوب الهوائية والفقاعات.
    5. صب المحلول في قالب سيليكون أو قش شرب بلاستيكي وانتظر لمدة 2 إلى 3 أيام حتى يصلب. بعد 1 يوم قبل أن يصبح الراتنج صلبا ، ضع الأنبوب الزجاجي داخل القالب وانتظر حتى يعلق الأنبوب على الراتنج. قم بإزالة الراتنج من القالب باستخدام الأنبوب الزجاجي (الشكل 3 د).
    6. ضع القلب في الأنبوب الزجاجي ، واملأه ب DBE ، وقم بتركيب الأنبوب الزجاجي في الحجرة المملوءة ب DBE.
  2. التقط صورا متسلسلة لقلب الفأر مع الخرز من القسم المضيء عن طريق مسح مجموعة القلب عبر محور الكشف (المحور Z; الشكل 3E-F).
    ملاحظة: قم بتنفيذ خياطة الصور في الخطوة 3 لإنشاء حزم فردية من الصور إذا تجاوز حجم القلب مجال الرؤية.
  3. قم بتدوير قلب الماوس 60 درجة على طول المحور Y لالتقاط الأكوام اللاحقة من زوايا متعددة ، أي 0 درجة و 60 درجة و 120 درجة و 180 درجة و 240 درجة و 300 درجة (الشكل 3E-F).
  4. افتح المكون الإضافي BigStitcher واستورد جميع الصور من خلال دليل ملف الصورة. احفظ مجموعة البيانات كملف HDF5.
  5. اختر اكتشاف نقاط الاهتمام وحدد يدويا حبات الاهتمام للتسجيل.
  6. حدد نموذج تحويل Affine للتسجيل. اختر وظيفة انتشار النقاط وقم بتعيين PSF لجميع طرق العرض.
  7. انقر فوق Multiview Deconvolution واختر نوع التكرار على أنه Bayesian فعال. حدد عدد التكرارات على أنه 10 وقم بتنفيذه26.
  8. انقر فوق Image Fusion لتصدير ملف tiff .
    ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من المعلومات التفصيلية حول فك الالتفاف متعدد المشاهدات في تقارير أو بروتوكولات أخرى24،27،28.

5. اجتاحت محوريا أجهزة نظام ورقة الضوء (1 يوم)

  1. قم بتركيب عدسة كهربائية قابلة للضبط (ETL) على مستوى فورييه للعدسة الأسطوانية (CL) 27 (الشكل 2D) لمسح شعاع الليزر محوريا14. تأكد من أن الواجهة السائلة في ETL أفقية لمنع تشوه واجهة الموجة الناجم عن الجاذبية. قم بمحاذاة ETL بدقة لتقليل انحرافات الحزمة والانحرافات الضوئية ذات الترتيب الأعلى30.
  2. قم بتثبيت بطاقة DAQ في محطة العمل وقم بتوصيل كبل BNC ببطاقة DAQ لمزامنة التعرض للكاميرا ومسح ETL.
  3. افتح غلاف برنامج تشغيل ETL وقم بإزالة الغطاء (الشكل 4).
  4. قم بلحام سلك إشارة كبل BNC بالتناظرية في دبوس B ، كما هو موضح في الجزء السفلي من لوحة PCB (الشكل 4).
  5. لحام السلك الأرضي لكابل BNC بدبوس GND ؛ بعد ذلك ، قم بتوصيل الطرف الآخر من كابل BNC ب AO (الإخراج التناظري) في بطاقة DAQ (الشكل 4).
  6. قم بتوصيل برنامج تشغيل ETL بمنفذ USB الخاص بمحطة العمل ، وقم بتوصيل برنامج التشغيل ب ETL باستخدام كبل hirose ، وقم بتثبيت برنامج Lens Driver Controller.
  7. قم بتغيير وضع التشغيل في برنامج وحدة التحكم في برنامج التحكم في برنامج تشغيل العدسة إلى تناظري للتحكم في ETL باستخدام مشغل تم إنشاؤه من بطاقة DAQ.
  8. في برنامج كاميرا sCMOS ، قم بتبديل وضع الالتقاط إلى خارجي (ورقة خفيفة). تأكد من أن اتجاه مسح البكسل النشط عمودي على اتجاه المسح الضوئي بالليزر للمساعدة في المزامنة.
  9. قم بتوصيل منفذ التشغيل الخارجي الموجود في الجزء الخلفي من كاميرا sCMOS ب AO لبطاقة DAQ باستخدام كابل BNC (الشكل 4).

6. اجتاحت محوريا مزامنة نظام ورقة الضوء (7 أيام)

  1. حدد وقت التعرض بناء على نسبة الإشارة إلى الخلفية المقبولة (SBR) والتي لا تقل عن 10 للدراسة المقترحة. قم بزيادة وقت التعرض إذا كان SBR أقل من 10.
    ملاحظة: يوفر وقت التعرض الذي يتراوح من 10 إلى 50 مللي ثانية SBR مقبولا في هذا المشروع.
  2. حدد وقت التقاط صورة (T) وفاصل الخط (L) بناء على وقت التعرض (E) للكاميرا وتردد ETL (f) باستخدام المعادلات التالية:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    حيث يشير P إلى عدد أعمدة البكسل على مستشعر الكاميرا. المعلمات التمثيلية للمرجع هي f = 1 هرتز ، P = 2048 ، E = 10 مللي ثانية ، و L = 243 μs ، على التوالي.
  3. في برنامج LabVIEW ، يقوم Trigger Generator.vi بإنشاء مشغلات مربعة ومثلثة للمزامنة (الشكل 5).
    ملاحظة: يتوفر برنامج LabVIEW المخصص من المؤلفين بناء على طلب معقول.
  4. جبل حبات الفلورسنت المخففة في 1٪ منخفضة نقطة انصهار هلامالأغاروز 16 بتركيز 1: 1 × 103 لتحديد موضع خصر الشعاع في الصورة (الشكل 6 أ).
  5. في البرنامج ، حدد نقاط البداية والنهاية لشعاع الليزر تحت مجال الرؤية عن طريق تغيير الجهد على طول اتجاه المسح.
  6. لمزامنة كاميرا sCMOS و ETL ، قم بمسح شعاع الليزر على طول المحور X والبكسل النشط على طول المحور Y لإنشاء صورة 2D (الشكل 6B). تشير الحبيبات الأكثر إشراقا ووضوحا على طول القطر في الصورة إلى التزامن الدقيق بين sCMOS و ETL.
    ملاحظة: تعد مزامنة سرعة المسح الضوئي لتنشيط بكسل ETL و sCMOS أمرا بالغ الأهمية لجودة الصورة. يتم تلخيص العديد من الأخطاء غير المتزامنة الشائعة في الشكل 6C-F.
  7. بعد تحديد معلمات المزامنة المثلى للمزامنة، قم بتدوير كاميرا sCMOS بزاوية 90 درجة حول المحور Z لمحاذاة اتجاه البكسل النشط مع اتجاه المسح بالليزر.
  8. كرر الخطوة 2.10 ، وقم بقياس FWHM ل PSF. استخدم نفس الطريقة كما هو موضح في التقريرالسابق 16 ، مع متوسط الاستبانات الجانبية والمحورية ل ASLM على 2.18 ميكرومتر و 2.88 ميكرومتر ، على التوالي (الشكل 7).
    ملاحظة: الإضاءة والدقة الموحدة عبر مجال الرؤية بأكمله ممكنة في ظل ظروف مثالية (الشكل 7A-B). يمكن أن يؤدي التشغيل غير المتزامن ل ETL مع كاميرا sCMOS ، بالإضافة إلى عدم محاذاة الإضاءة والكشف ، إلى دقة مكانية غير موحدة (الشكل 7C-D).
  9. بالنسبة لتصوير القلب ، بعد محاذاة النظام وتحديد المعلمات المثلى لمزامنة النظام ، تابع الخطوات من 2.6 إلى 2.9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ثبت أن LSM يعزز دراسات القلب31،32،33،34،35،36،37 بسبب الحد الأدنى من مخاطر تلف الصور ، والدقة المكانية العالية ، والتقسيم البصري على عكس طرق التصوير البصري الأخرى مثل تقنيات برايت فيلد ومسح النقاط6،8،38

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد وفر تقدم طرق التصوير والحساب وتنظيف الأنسجة فرصة لا مثيل لها للتحقيق على نطاق واسع في بنية القلب ووظيفته. هذا يحمل إمكانات كبيرة لتعميق فهمنا لتشكل القلب والتسبب في المرض باستخدام نموذج قلب القوارض السليم. على عكس الدراسات في الجسم الحي لقلب الزرد باستخدام نهج مماثل40،41،42،43 ، فإن دمج تقنيات LSM المتقدمة وطرق إزالة الأنسجة يمكننا من التغلب على التحديات بين الدقة المكانية وعمق الا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

نعرب عن امتناننا لمجموعة الدكتور إريك أولسون في مركز UT Southwestern الطبي لمشاركتها بسخاء النماذج الحيوانية. نحن نقدر جميع التعليقات البناءة التي قدمها أعضاء حاضنة D في UT Dallas. تم دعم هذا العمل من قبل NIH R00HL148493 (Y.D.) و R01HL162635 (Y.D.) وبرنامج UT Dallas STARS (Y.D.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>1٪ Agarose< / قوي>
نقطة انصهار منخفضة ThermoFisher16520050
ماء منزوع الأيونات-
<قوي>مواد كيميائية لإزالة الأنسجة   < / قوي>
5-أمينو-1،3،3-ثلاثي ميثيل سيكلوهكسانميثيلامين ، خليط من رابطة الدول المستقلة وعبرسيجما ألدريتش118184
D.E.R. &trade ؛ 332سيجما ألدريتش31185
D.E.R. &trade ؛ 736سيجما ألدريتش31191
ثنائي بنزيل إيثر (DBE)سيجما ألدريتش33630
ثنائي كلورو الميثان (DCM)سيجما ألدريتش270997
حبات الفلورسنتSpherotechFP-0556-2
بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>)سيجما ألدريتش216736
الميثانولسيجما ألدريتش439193
بارافورمالدهيد (PFA)ثيرمو فيشر47392
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتش79383
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتشP3911
<قوي > البرامج والخوارزميات < / قوي>
أميرةثيرمو فيشر العلمي2021.2
BigStitcherHö rl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
المكونات الرئيسية لنظام الألواح الخفيفة المخصصة< / قوي>
0.63 - 6.3X تكبير الجسمأوليمبوسMVX-ZB10 
10X هدف الإضاءةنيكونMRH00105
1X هدف الكشفأوليمبوسMV PLAPO 1X/0.25 
473 نانومتر DPSS ليزرLaserglow TechnologiesLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSSليزر Laserglow TechnologiesLRS-0532-PFM-00100-05
589 & thinsp ؛ نانومتر DPSSليزر Laserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
موصل BNCالصك الوطنيBNC-2110
عدسة أسطوانيةThorlabsACY254-050-A
وحدة تحكم محرك DC ، 4 محاورPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
كابل ETLOptotuneCAB-6-300
ETL سائق عدسةOptotuneEL-E-4i
مرشحChromaET525 / 30
مرشحChromaET585-40
FilterChromaET645-75
الفلتر أداة الغالقLAMBDA 10-B
مرحلة الترجمة الآليةPhysik InstrumenteL-406.20DG10
مرحلة الترجمة الآليةPhysik InstrumenteL-406.40DG10
مرحلة الترجمة الآليةPhysik InstrumenteM-403.4PD
NI متعددة الوظائف I / ONational InstrumentPCIe-6363
كاميرا sCMOSHamamatsuC13440-20CU
محرك متدرجPololu1474
عدسة أنبوبيةأوليمبوسMVX-TLU
محلول عجلة

المراجع

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73(2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002(2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396(2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209(2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924(2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795(2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278(2023).
  17. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821(2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769(2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149(2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  32. Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257(2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754(2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112(2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263(2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807(2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271(2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678(2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101(2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072(2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المجهر ذو الورقة الضوئيةتصوير بنية القلبتصفية الأنسجةتصوير قلب القوارضالبنية المجهرية لعضلة القلبالمجهر ذو المسح المحوريدمج الصورفك الالتفاف متعدد الرؤىمطابقة معامل الانكسارإعادة تشكيل القلب
التصوير بالضوء للكشف عن بنية القلب في قلوب القوارض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.