يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نقل استنساخ جزيئي من الحمض النووي الريبوزي للنيجلرية إلى N. gruberi Trophozoites

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66726

⸱

يونيو 21, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 3Department of Biology, Washburn University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول منهجية لنقل Naegleria gruberi trophozoites مع بنية يتم الحفاظ عليها طوال تمرير trophozoites في المختبر ، وكذلك من خلال encystment و excystment.

الملخص

يتم الاحتفاظ بجميع جينات الريبوسوم في Naegleria trophozoites في الحمض النووي الريبوسومي الدائري المغلق خارج الكروموسومات (rDNA) الذي يحتوي على عنصر (CERE). في حين لا يعرف سوى القليل عن CERE ، فإن تحليل تسلسل الجينوم الكامل لثلاثة أنواع من Naegleria يوضح بوضوح أنه لا توجد صهاريج rDNA في الجينوم النووي. علاوة على ذلك ، تم تعيين أصل DNA واحد للتكرار في N. gruberi CERE ، مما يدعم الفرضية القائلة بأن CERE يتكاثر بشكل مستقل عن الجينوم النووي. تشير خاصية CERE هذه إلى أنه قد يكون من الممكن استخدام CERE الهندسي لإدخال بروتينات غريبة في Naegleria trophozoites. كخطوة أولى في استكشاف استخدام CERE كناقل في Naegleria ، قمنا بتطوير بروتوكول لنقل N. gruberi مع استنساخ جزيئي من N. gruberi CERE المستنسخ إلى pGEM7zf + (pGRUB). بعد النقل ، تم اكتشاف pGRUB بسهولة في N. gruberi trophozoites لمدة سبعة ممرات على الأقل ، وكذلك من خلال الكيس والكيس. كعنصر تحكم ، تم نقل trophozoites مع ناقل العمود الفقري ، pGEM7zf + ، بدون تسلسل N. gruberi (pGEM). لم يتم الكشف عن pGEM بعد المقطع الأول بعد النقل إلى N. gruberi ، مما يشير إلى عدم قدرته على التكاثر في كائن حقيقي النواة. تصف هذه الدراسات بروتوكول نقل Naegleria trophozoites وتثبت أن تسلسل البلازميد البكتيري في pGRUB لا يمنع النقل الناجح وتكرار استنساخ CERE المنقول. علاوة على ذلك ، سيكون بروتوكول النقل هذا حاسما في فهم الحد الأدنى من تسلسل CERE الذي يدفع تكراره في trophozoites ، وكذلك تحديد المناطق التنظيمية في التسلسل غير الريبوسومي (NRS).

المقدمة

يحتوي جنس Naegleria على أكثر من 45 نوعا ، على الرغم من أنه من غير المحتمل أن يتم تحديد جميع أعضاء الأنواع1. يمكن أن توجد النيجلرية بأشكال مختلفة: مثل trophozoites (الأميبا) ، أو السوط ، أو عندما تكون الموارد محدودة للغاية ، مثل الخراجات1،2،3،4. يعرف جنس Naegleria بنوعه الوحيد الخطير بشكل خاص ، Naegleria fowleri ، المعروف باسم "الأميبا آكلة الدماغ" (تمت مراجعته في1،2،3،4،5،6،7) ، وهو سبب التهاب السحايا والدماغ الأميبي الأولي القاتل عالميا تقريبا.

تقوم النيجلرية بتشفير الحمض النووي الريبي الخاص بها على CERE الموجود في النواة. يؤكد التسلسل الكامل لجينومات ثلاثة أنواع من النيجلرية عدم وجود الحمض النووي الريبي في الجينوم النووي8،9،10،11. استنادا إلى تسلسلات CERE المحدودة كاملة الطول ، يتراوح طول CERE من حوالي 10 kbp إلى 18 kbp. يحمل CERE لكل نوع من أنواع Naegleria صهريجا واحدا من الحمض النووي الريبوسومي (يحتوي على الحمض النووي الريبوسومي 5.8 و 18 و 28S) على كل من حوالي 4000 CERE لكل خلية12،13،14. بخلاف الحمض النووي الريبوزي (rDNA) ، يحتوي كل CERE على تسلسل كبير غير rDNA (NRS). تختلف أحجام CERE بين الأنواع. ترجع الاختلافات بشكل أساسي إلى الطول المتغير ل NRS ، حيث يتم الحفاظ على تسلسلات rDNA بشكل كبير عبر الجنس1،15،16،17،18،19،20. يوفر رسم خرائط لأصل واحد لتكرار الحمض النووي داخل N. gruberi CERE NRS21 دعما قويا للفرضية القائلة بأن Naegleria CERE يتكاثر بشكل مستقل عن الجينوم النووي.

N. gruberi هي أميبا غير مسببة للأمراض تستخدم غالبا لدراسة بيولوجيا النيجلرية . قمنا بتطوير منهجية لتحويل N. gruberi trophozoites مع استنساخ CERE من نفس النوع لاختبار الفرضية القائلة بأن Naegleria amoebae تتسامح مع وتكرار CERE بشكل مستقل داخل trophozoites. تم تحقيق ذلك عن طريق تحويل N. gruberi مع استنساخ كامل الطول من N. gruberi CERE إلى trophozoites ومتابعة مصائر استنساخ CERE المانح عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ويرد في الشكل 1 لمحة عامة عن البروتوكول. توضح البيانات المقدمة هنا أنه يمكن اكتشاف استنساخ المتبرع من خلال سبعة مقاطع على الأقل في زراعة الأنسجة ، وكذلك الحفاظ عليها من خلال الكيس والكيس. تشكل هذه الدراسات الأساس لوسيلة لتشريح كيفية تكرار CERE ، وكذلك استكشاف استخدامه كناقل لنقل Naegleria.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم سرد تفاصيل الأنواع والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد. يتم توفير تسلسل بنية pGRUB لزوج القاعدة 17004 في الملف التكميلي 1.

1. زراعة التروفوزويتات

  1. قم بإذابة N. gruberi trophozoites المجمدة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  2. تلقيح التروفوزويتات في قوارير T25 في الببتون المعدل / مستخلص الخميرة / الحمض النووي / حمض الفوليك / الهيمين مع وسائط مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (PYNFH) بالإضافة إلى 2٪ عازلة (فوسفات ثنائي الصوديوم ، فوسفات هيدروجين البوتاسيوم).
  3. استزرع التروفوزويتات عند 25 درجة مئوية حتى ~ 80٪ متقاربة ، حيث تظهر مورفولوجيا أميبية (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: عند إحياء ثقافة التروفوزويتات في البداية من حالتها المتجمدة ، قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 5-7 أيام حتى يصبح T25 متقاربا. صب الوسائط كل 3-4 أيام واستبدالها بوسائط جديدة.
  4. ضع القوارير المتقاربة على الثلج لمدة 5-10 دقائق لتحرير التروفوزويتات الملتصقة من البلاستيك. قم بتدوير القارورة برفق لإزاحة أي خلايا ملتصقة متبقية. تحتوي التروفوزويتات الآن على مورفولوجيا "مستديرة" (الشكل 2 ب).
  5. قسم الثقافات 1: 2 إلى 1: 4 إلى قوارير زراعة الأنسجة الجديدة.
  6. قم بإزالة PYNFH واستبدله بوسائط تكيسية معقمة (120 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 0.03 مللي مول كلوريد المغنيسيوم ، 1 مللي مول فوسفات ثنائي الصوديوم ، 1 مللي مول فوسفات هيدروجين البوتاسيوم ، 0.03 مللي مول كلوريد الكالسيوم ، 0.02 مللي مول كلوريد الحديد ، درجة الحموضة 6.8) 22 لموسوعة N. gruberi.
    ملاحظة: تصبح غالبية التروفوزويتات مدروسة بمقدار 72 ساعة (الشكل 2C). يجب الانتهاء من Excystment في غضون 72 ساعة.
  7. قم بإزالة الخراجات من القوارير ، وأجهزة الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية ، وأعد تعليق الخراجات في وسائط PYNFH مع مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ لتفريغ الخلايا. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة حتى تبدأ trophozoites في الظهور.

2. نقل التروفوزويتات

  1. صفيحة التروفوزويتات في صفيحة استزراع أنسجة مسطحة القاع ذات 6 آبار (1 مل من 1 × 106 تروفوزويت/مل) واستزراعها عند 25 درجة مئوية.
  2. قم بنقل الخلايا عندما تصل إلى 70٪ -80٪ متقاربة (~ 10.4 × 104 خلايا / سم2 في مجموعات من 6 آبار). قم بتسخين كاشف النقل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. تحضير خليط كاشف نقل البلازميد على النحو التالي: 75 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد و 0.225 ميكرولتر من كاشف النقل في 200 ميكرولتر من وسائط PYNFH بدون FBS. تحضير خليط كاشف نقل البلازميد الكافي لإجراء النقل في نسختين.
    ملاحظة: تم استخدام بلازميد بكتيري يحتوي على نسخة كاملة الطول من N. gruberi CERE (pGRUB) في هذه الدراسة. تم استخدام البلازميد الفارغ (pGEM) كعنصر تحكم سلبي (الشكل 3).
  4. احتضان خليط كاشف نقل البلازميد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  5. قم بإزالة ~ 800 ميكرولتر من الوسط من طبقات التروفوزويت الأحادية قبل النقل مباشرة.
  6. ضع خليط كاشف نقل البلازميد على trophozoites.
  7. قم بتدوير اللوحة برفق كل 15 دقيقة لمنع الوسائط من التجمع عند حواف اللوحة.
  8. اغسل الطبقات الأحادية مرة واحدة ب 2 مل من وسط النمو بعد 1 ساعة من الحضانة عند 25 درجة مئوية.
  9. عالج الطبقات الأحادية ب 10 U DNase في 1 مل من 10x DNase buffer لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة الحمض النووي البلازميد المتبقي ، واغسله مرة واحدة بوسط النمو ، وأضف 2 مل من الوسائط الطازجة ، وضعه عند 25 درجة مئوية. احتضان اللوحة لمدة 24-36 ساعة.
  10. ضع الطبق على الثلج لمدة 10 دقائق لتحرير الخلايا.
  11. قسم بئرا واحدا (1: 2) إلى بئرين جديدين.
  12. جمع trophozoites من الآبار المتبقية لأغراض تجريبية.
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الثقافات في نسختين. لكل حالة ، يتم استخدام بئر واحد للمرور ، ويتم استخدام 1 لعزل CERE.

3. عزل CERE من النيجلرية

  1. احسب عدد التروفوزويتات في كل بئر تستخدم لعزل CERE عن طريق تلطيخ استبعاد التريبان الأزرق ومقياس الدم23.
  2. ضع التروفوزويتات في أنبوب سعة 2.0 mL.
  3. اغسل تروفوزويتات مرة واحدة في 100 مللي متر كلوريد الصوديوم (درجة الحموضة 7.5) عن طريق الطرد المركزي (600 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية).
    ملاحظة: يمنع كلوريد الصوديوم التروفوزويتات من الالتصاق بجوانب الأنبوب.
  4. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق كريات الخلايا في 100 ميكرولتر من 100 mM EDTA (درجة الحموضة 7.5).
  5. ضع الأنبوب في كتلة حرارية لمدة 15 دقيقة عند 98 درجة مئوية لتحلل الخلايا وتعطيل الإنزيمات في التروفوزويت.
    ملاحظة: تؤدي هذه الخطوة إلى تعطيل DNases ، والتي تكون وفيرة في Naegleria trophozoites. قد تتداخل DNases مع القدرة على اكتشاف CERE الأصلي والاستنساخ الجزيئي في الخطوة 4. ينخفض إنتاج الحمض النووي عند استخدام أكثر من ~ 3 × 106 خلايا في الخطوة 3.4.
  6. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب بأقصى سرعة (16000 × جم) عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتكوير الحطام.
  7. نقل المواد الطافية إلى أنبوب جديد.
  8. يترسب الإيثانول المواد الطافية بأحجام 0.5 من أسيتات الأمونيوم 7.5 M (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 3 مجلدات من الإيثانول المطلق ، و 1 ميكرولتر من 10 مجم / مل من الجليكوجين كناقل.
  9. اقلب الأنبوب عدة مرات وضع الأنبوب عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل.
  10. قم بتسخين العينات إلى درجة حرارة الغرفة.
  11. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 16000 × جم.
  12. قم بإزالة المادة الطافية واغسل الحبيبات بنسبة 70٪ من الإيثانول عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم (في درجة حرارة الغرفة).
  13. قم بإزالة الإيثانول وجفف الحبيبات بالهواء لمدة 5 دقائق.
  14. أعد تعليق الحبيبات المجففة في ماء منزوع الأيونات (DI) معقم. تطبيع الحجم إلى 10000 تروفوزويتات لكل ميكرولتر.
  15. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامه في تفاعل البوليميراز المتسلسل.

4. الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل للتروفوزويتات المحولة

  1. استخدم 20000 خلية مكافئة من الحمض النووي ، وبادئات 600 نانومتر (الجدول 1) ، و Taq polymerase وقم بإجراء PCR24.
    ملاحظة: يتم سرد البادئات التي تميز بين CERE الأصلي و CERE المستنسخ في الجدول 1 ، وكذلك شروط PCR. يوضح الشكل 3 موقع البادئات على البنى. سيتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل التحسين اعتمادا على البادئات المستخدمة بالإضافة إلى مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد المستخدم.
  2. الميكروويف 0.8٪ أغاروز في 1x قاعدة Tris وحمض الخليك ومخزن EDTA (TAE) المؤقت حتى يذوب الأغاروز.
  3. تبريد agarose إلى ~ 50 °C في درجة حرارة الغرفة.
  4. صب الحل في صينية صب هلام تحتوي على مشط لتشكيل الآبار.
  5. دع الجل يجلس في درجة حرارة الغرفة حتى يصلب.
  6. ضع الجل في جهاز الكهربائي.
  7. صب 1x TAE في غرفة الكهربائي حتى يتم تغطية الجل.
  8. قم بإزالة المشط.
  9. أضف صبغة تحميل 6x (0.25٪ برومفينول أزرق ، 0.25٪ زيلين سيانول ، 30٪ جلسرين) إلى العينات وقم بتحميل الجل. استخدم سلم الحمض النووي لتحديد حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  10. قم بتوصيل القطب ، وقم بتشغيل مصدر الطاقة ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت لمدة ~ 1.5-2 ساعة.
  11. قم بإيقاف تشغيل الطاقة وإزالة الجل.
  12. صبغ الجل بصبغة الحمض النووي (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل بروميد الإيثيديوم) في 100 مل من ماء DI لمدة 10 دقائق.
  13. قم بإزالة صبغة الجل لمدة 20 دقيقة في ماء DI.
  14. تصور الجل على نظام الأشعة فوق البنفسجية (UV) وتوثيق النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح تفاعل البوليميراز المتسلسل للتروفوزويتات التي تم نقلها باستخدام pGRUB أن CERE المنقول يتم اكتشافه من خلال سبعة ممرات على الأقل من trophozoites ، بالإضافة إلى التكيسات و excystment (الشكل 4). البادئات المستخدمة في تلدين تفاعل البوليميراز المتسلسل لكل من ناقل pGEM وتسلسل CERE ، وبالتالي ضمان عدم اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل ل CERE الأصلي. أشار تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد نقل pGEM إلى تروفوزويتات إلى أن pGEM كان سالبا (الشكل 4) ، مما يشير إلى أن البلاز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكول المبين هنا واضح جدا ، على الرغم من أن كل بناء سيتطلب على الأرجح درجة معينة من التحسين ، لا سيما نسبة كاشف نقل الحمض النووي ، اعتمادا على طبيعة البناء وأنواع النيجلرية المستخدمة. لقد اختبرنا كاشف نقل واحد فقط متاح تجاريا باستخدام هذا البروتوكول ، ولكن من المحتمل أن يكون العديد من الآخرين فعالين. بالنظر إلى استخدام نسخة كاملة الطول من CERE ، تحتوي على أصل وظيفي للتكرار وبالتالي التكرار بشكل مستقل ، فإن البناء يمتلك جميع آلات النسخ المتماثل حقيقية النواة اللازمة. إذا تم إدخال استنساخ جزئي في متجه pGEM ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسات جزئيا بمنحة من صندوق جورج ف. هاديكس بجامعة كريتون (KMD). يتم إنشاء الشكل 1 في biorender.com ، ويتم إنشاء الشكل 3 في benchling.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseBio Rad161-3102
أسيتات الأمونيومسيجما ألدريتشA-7330
كلوريد الكالسيومSigma AldrichC-4901
قوارير ثقافة
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA ، 0.5 MAffymetrix15694
جهاز جل الفصادة الكهربائيةAmersham Biosciences80-6052-45
أنابيب Eppendorf ، 1.5 ملفيشر Scientific05-408-129
أنابيب Eppendorf ، 2 ملفيشر Scientific05-408-138
الإيثانول ، 100٪مختبرات ديكون2716
إيثيديوم بروميدسيجما ألدريتشE-8751
مصل الأبقار الجنينيجيبكو26140
حمض الفوليكسيجما ألدريتشF7876-25G
GeneRuler 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلمحراري علميSM1331
حمض الخليك الجليديفيشر ScientificUN2789
GoTaq Green PCR Master MixPromegaM7122
تسخينحرارية علمية88871001
مقياس الدمHausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
كلوريد الحديدSigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
MicrofugeThermo ScientificMySpin 12
مجهرنيكونTMS
N. gruberi< / em>ATCC30224
الحمض النوويChem Impex Int ' l# 01625
PeptoneGibco211677
pGEMPromegaP2251
فوسفات البوتاسيومSigma AldrichP0662-500G
PowerPac HC وحدة إمداد الطاقة الكهربائيBioRad1645052
كواشف كلوريد الصوديومMCBSX0420
فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدةسيجما ألدريتشS2554
جهاز طرد مركزي منضديeppendorf5415R
تريس ، قاعدةSigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue ، 0.4٪Gibco15250-061
ViaFect ReagentPromegaE4981
WeighScale Denver InstrumentsAPX-60
مستخلص الخميرةجيبكو212750
الثلج المجروش ، لوحة ثقافة T-75 Thermo Scientific 130190 ، 6 آبار Corning 3506 كتلة

المراجع

  1. De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).
  2. De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
  3. Fulton, C. Cell differentiation in Naegleria gruberi. Annu Rev Microbiol. 31, 597-629 (1977).
  4. Grace, E., Asbill, S., Virga, K. Naegleria fowleri: Pathogenesis, diagnosis, and treatment options. AAC. 59 (11), 6677-6681 (2015).
  5. Moseman, E. A. Battling brain-eating amoeba: enigmas surrounding immunity to Naegleria fowleri. PLOS Pathog. 16 (4), e1008406(2020).
  6. Marciano-Cabral, F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev. 52 (1), 114-133 (1988).
  7. Piñero, J. E., Omaña-Molina, M., Chávez-Munguía, B., Lorenzo-Morales, J. Naegleria fowleri. Trends Parasitol. 35 (10), 848-849 (2019).
  8. Zysset-Burri, D. C., et al. Genome-wide identification of pathogenicity factors of the free-living amoeba Naegleria fowleri. BMC Genomics. 15, 496-510 (2014).
  9. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. The genome of Naegleria lovaniensis, the basis for a comparative approach to unravel pathogenicity factors of the human pathogenic amoeba N. fowleri. BMC Genom. 19, 654-665 (2018).
  10. Liechti, N., Schürch, N., Bruggmann, R., Wittwer, M. Nanopore sequencing improves the draft genome of the human pathogenic amoeba Naegleria fowleri. Sci Reports. 9, 16040-16049 (2019).
  11. Fritz-Laylin, L. K., Ginger, M. L., Walsh, C., Dawson, S. C., Fulton, C. The Naegleria genome: A free-living microbial eukaryote lends unique insights into core eukaryotic cell biology. Res Microbiol. 162, 607-618 (2011).
  12. Clark, C. G., Cross, G. A. M. rRNA genes of Naegleria gruberi are carried exclusively on a 14-kilobase-pair plasmid. Mol Cell Biol. 7 (9), 3027-3031 (1987).
  13. Clark, C. G., Cross, G. A. M. Circular ribosomal RNA genes are a general feature of schizopyrenid amoebae. J Protozool. 35 (2), 326-329 (1988).
  14. Dao, F. Y., et al. Identify origin of replication in Saccharomyces cerevisiae using two-step feature selection technique. Bioinformatics. 35 (12), 2075-2083 (2019).
  15. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the circular extrachromosomal element of Naegleria gruberi strain EGB ribosomal DNA. Genome Announc. 6 (6), e00020-e00021 (2018).
  16. Mullican, J. C., Drescher, K. M., Chapman, N. M., Tracy, S. Complete genome sequence of the Naegleria fowleri (strain LEE) closed circular extrachromosomal ribosomal DNA element. Microbiol Resource Announce. 9 (49), e01055(2020).
  17. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Tracy, S., Drescher, K. M. The extrachromosomal elements of the Naegleria amoebae: How little we know. Plasmid. 115, 102567(2021).
  18. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria australiensis De Jonckheere (strain PP 397). Microbiol Resource Announce. 12, e0032123(2023).
  19. Nguyen, B. T., Chapman, N. M., Stessman, H. A. F., Tracy, S., Drescher, K. M. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element of Naegleria jadini Willaert and Ray (Strain ITMAP400). Microbiol Resource Announce. 12 (4), 0006123(2023).
  20. Nguyen, B. T., et al. Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh). Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).
  21. Mullican, J. C., Chapman, N. M., Tracy, S. Mapping the single origin of replication in the Naegleria gruberi extrachromosomal DNA element. Protist. 170, 141-152 (2019).
  22. Sohn, H. J., et al. Efficient liquid media for encystation of pathogenic free-living amoebae. Korean J Parasitol. 55 (3), 233-238 (2017).
  23. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2001).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  25. Jeong, S. R., et al. Expression of the nfa1 gene cloned from pathogenic Naegleria fowleri in non-pathogenic N. gruberi enhances cytotoxicity against CHO target cells in vitro. Infect Immun. 73 (7), 4098-4105 (2005).
  26. Clark, C. G., Cross, G. A. M., De Jonckheere, J. F. Evaluation of evolutionary divergence in the genus Naegleria by analysis of ribosomal DNA plasmid restriction patterns. Mol Biochem Parasitol. 34 (3), 281-296 (1989).
  27. De Jonckheere, J. F. Sequence variation in the ribosomal internal transcribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist. 149 (3), 221-228 (1998).
  28. Rawal, P., et al. Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Res. 16 (5), 644-655 (2006).
  29. Yadav, V. K., Abraham, J. K., Mani, P., Kulshrestha, R., Chowdhury, S. QuadBase: Genome-wide database of G4 DNA - occurrence and conservation in human, chimpanzee, mouse and rat promoters and 146 microbes. Nucleic Acids Res. 36, D381-D385 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الحمض النووي الريبوزوميتكرار CEREترصيف المستنسخ الجزيئيزراعة التروفوزويتترصيف البلازميدبروتوكول التكيستحليل PCRالفصل الكهربائي لهلام الأجاروزأصل التكرار
نقل استنساخ جزيئي من الحمض النووي الريبوزي للنيجلرية إلى N. gruberi Trophozoites
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.