التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

Swetha Nagarajan; Siddhartha Bardhan; Sundar Ram Naganathan

doi:10.3791/66735

مقالة منهجية

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

DOI:

10.3791/66735

⸱

يوليو 19, 2024

Swetha Nagarajan^*¹ , Siddhartha Bardhan^*¹ , Sundar Ram Naganathan¹

¹Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف استراتيجية تحضير العينة لتصوير أجنة الزرد المبكرة داخل مشيمة سليمة باستخدام مجهر صفائح ضوئي. يحلل الاتجاهات المختلفة التي تكتسبها الأجنة داخل المشيمة في مراحل 70٪ من المشيمة والبراعم ويفصل استراتيجيات التصوير للحصول على دقة على نطاق خلوي في جميع أنحاء الجنين باستخدام نظام الورقة الضوئية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح الفحص المجهري للصفائح الضوئية هو المنهجية المفضلة للتصوير الحي لأجنة أسماك الزرد على نطاقات زمنية طويلة مع الحد الأدنى من السمية الضوئية. على وجه الخصوص ، يتيح نظام الرؤية المتعددة ، الذي يسمح بتدوير العينة ، تصوير أجنة كاملة من زوايا مختلفة. ومع ذلك ، في معظم جلسات التصوير باستخدام نظام متعدد الرؤية ، يعد تركيب العينة عملية مزعجة حيث يتم تحضير العينات عادة في أنبوب بوليمر. للمساعدة في هذه العملية ، يصف هذا البروتوكول استراتيجيات التركيب الأساسية لتصوير التطور المبكر لأسماك الزرد بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة. على وجه التحديد ، توفر الدراسة إحصائيات عن المواضع المختلفة التي تتخلف عنها الأجنة في مراحل epiboly والبراعم بنسبة 70٪ داخل المشيمة. علاوة على ذلك ، فإنه يناقش العدد الأمثل للزوايا والفاصل الزمني بين الزوايا المطلوبة لتصوير أجنة أسماك الزرد الكاملة في المراحل المبكرة من التطور بحيث يمكن استخراج المعلومات على نطاق خلوي عن طريق دمج وجهات النظر المختلفة. أخيرا ، نظرا لأن الجنين يغطي مجال رؤية الكاميرا بالكامل ، وهو أمر مطلوب للحصول على دقة على نطاق خلوي ، فإن هذا البروتوكول يوضح بالتفصيل عملية استخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل الجنين لتسجيل وجهات النظر المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد ضمان الحد الأدنى من السمية الضوئية مطلبا رئيسيا لتصوير الأجنة الحية ذات الدقة الزمانية المكانية العالية لفترات طويلة. على مدى العقد الماضي ، أصبح الفحص المجهري للورقة الضوئية هو المنهجية المفضلة لتلبية هذا المطلب¹^،²^،³^،⁴^،⁵^،⁶^،⁷. باختصار ، في هذه التقنية التي تم استخدامها لأول مرة في عام 2004 لالتقاط العمليات التنموية⁸ ، تمر لوحان رفيعان محاذيان من الليزر عبر الجنين من نهايات متعارضة ، مما يضيء فقط مستوى الاهتمام. يتم وضع هدف الكشف بشكل متعامد ، ثم يتم جمع ضوء الفلورسنت المنبعث من جميع النقاط المضيئة في العينة في وقت واحد. ثم يتم الحصول على صورة ثلاثية الأبعاد عن طريق تحريك الجنين بالتتابع عبر ورقة الضوء الساكنة.

بالإضافة إلى ذلك ، في شكل محدد من هذه المنهجية ، يسمى الفحص المجهري للصفائح الضوئية متعددة الرؤوس ، يمكن تعليق العينات في أنبوب بوليمر يمكن تدويره باستخدام دوار ، مما يتيح تصوير نفس الجنين من زوايا متعددة⁹^،¹⁰^،¹¹. بعد التصوير ، يتم دمج الصور من زوايا متعددة بناء على علامات التسجيل ، والتي عادة ما تكون علامات فلورية كروية داخل الجنين (على سبيل المثال ، النوى) أو في الأنبوب (على سبيل المثال ، حبات الفلورسنت). يعمل التصوير متعدد الرؤوس والاندماج على تحسين الدقة المحورية بشكل كبير ، مما يوفر دقة متناحية، عبر جميع الأبعاد^{الثلاثة 12}. في حين أن هذه ميزة كبيرة ، فإن التحدي الرئيسي لمنهجية الرؤية المتعددة هو تركيب العينات ، حيث يجب تركيب الأجنة والاحتفاظ بها في مكانها في الأنابيب طوال فترة التصوير الزمنية.

لإجراء التصوير متعدد المشاهدات ، للحفاظ على الأجنة في مكانها ومنع الحركة أثناء التصوير ، يمكن تضمين الأجنة في الاغاروز. ومع ذلك ، غالبا ما يؤدي هذا إلى نمو وتطور ضارين ، خاصة بالنسبة لأجنة الزرد في المراحل المبكرة¹³ ، وهو النظام النموذجي الذي تمت مناقشته هنا. تتمثل استراتيجية التركيب الثانية في استخدام أنبوب رفيع أكبر قليلا من قطر الجنين ، حيث يمكن سحب الجنين إلى الأنبوب جنبا إلى جنب مع وسط الجنين ، متبوعا بإغلاق قاع الأنبوب بسدادة الاغاروز¹⁴. في هذه الطريقة ، نظرا لأن الأنبوب مملوء بوسط الجنين ، لا يمكن استخدام علامات التسجيل مثل حبات الفلورسنت لدمج وجهات النظر المختلفة ، وبالتالي يعتمد التسجيل على علامات داخل الجنين. بشكل عام ، تعمل الخرزات كعلامات تسجيل أفضل حيث تتحلل إشارة العلامات داخل الجنين عند الانتقال إلى عمق العينة بسبب قيود الإضاءة والكشف عن أي مجهر.

وبالتالي ، فإن النهج الثالث ، الذي سيتم تفصيله هنا واستخدامه سابقا⁵^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶ ، هو تصوير أجنة الزرد المبكرة بمشيمة سليمة وملء الأنبوب بنسبة مئوية قليلة من الاغاروز ، والذي يحتوي على خرز كعلامات تسجيل. في هذا السيناريو ، نظرا لأن التدخل اليدوي لوضع الأجنة داخل المشيمة غير ممكن ، فإن هذه الدراسة تقدم إحصائيات حول الاتجاه الافتراضي الذي تقع فيه أجنة الزرد المبكرة ، مع التركيز بشكل خاص على 70٪ من مراحل epiboly والبراعم. ثم يناقش العدد الأمثل من المشاهدات المطلوبة لتصوير الأجنة في المراحل المبكرة بدقة على نطاق خلوي ويفصل عملية الاندماج باستخدام BigStitcher ، وهو مكون إضافي قائم على فيجي¹⁰^،¹⁷^،¹⁸. يهدف هذا البروتوكول معا ، الذي يستخدم هدف NA 20x / 1 ، إلى تسهيل علماء الأجنة في استخدام أنظمة الألواح الضوئية متعددة الرؤوس لتصوير الأجنة باستخدام النوى وعلامات الأغشية من المعدة إلى مراحل الجسيدات المبكرة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على صيانة أسماك الزرد والإجراءات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات ، عبر المرجع TIFR / IAEC / 2023-1 و TIFR / IAEC / 2023-5. تم حقن الأجنة التي تم الحصول عليها عن طريق تهجين الأسماك متغايرة الزيجوت التي تعبر عن Tg (actb2: GFP-Hsa.UTRN) ¹⁹ ب H2A-mCherry mRNA (30 pg) في مرحلة الخلية الواحدة. H2A-mCherry تم تصنيع mRNA باستخدام pCS2 + H2A-mCherry البلازميد (هدية من مختبر Oates ، EPFL) عن طريق النسخ في المختبر. تم تصوير الأجنة التي تعبر عن كلتا العلامتين ، المشار إليها باسم Utr-GFP و H2A-mCherry ، على التوالي ، في بقية البروتوكول ، في مرحلتي 70٪ من epiboly والبراعم. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير عينة للتصوير متعدد المشاهدات

تحضير أنابيب FEP / PTFE
1. قم بتنظيف أنابيب FEP / PTFE باتباع الإجراءات الموضحة سابقا¹⁴.
2. بعد التنظيف ، قم بتقطيع الأنابيب إلى أطوال 2-2.5 سم حسب المتطلبات وقم بتخزينها في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 2 مل تحتوي على ماء مقطر مزدوج. يمكن تخزين الأنابيب بهذه الطريقة لمدة شهر تقريبا.
3. قبل تحضير العينة ، قم بتسخين الأنابيب عند 70-75 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة تقريبا لتصويب الأنابيب. تجنب الاكتظاظ في كل أنبوب طرد مركزي دقيق لمنع التكتل ، مما يضمن مساحة كافية لاستقامة الأنبوب بشكل فعال.
  ملاحظة: ارتد القفازات أثناء إجراء معالجة الأنبوب بالكامل ، حيث أن أي بصمة / جسيمات غبار متبقية على الأنابيب قد تتداخل مع التصوير.
تحضير الاغاروز
1. قم بإعداد حلول مخزون E3 Buffer 50x على النحو التالي:
  1. مخزون 1 - 3.252 جم من Na₂HPO₄ ، 0.285 جم من KH₂PO₄ ، 11.933 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.477 جم من كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات
  2. مخزون 2 - 2.426 جم من CaCl₂ ، 4.067 جم من MgSO₄ في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
2. لعمل 1x E3 عازلة ، أضف 20 مل لكل من المحاليل 1 و 2 في 960 مل من الماء منزوع الأيونات.
  ملاحظة: لا تضيف الميثيلين الأزرق في المخزن المؤقت E3 المستخدم للتصوير لأنه يتسبب في تشتت الضوء.
3. قم بإذابة الاغاروز منخفض نقطة الانصهار في 1x E3 عن طريق التسخين عند 70-75 درجة مئوية على كتلة حرارية مع التحريك حتى يصبح المحلول صافيا بدون كتل أو بلورات.
4. للتصوير متعدد المشاهدات ، أضف حبات الفلورسنت المتوفرة تجاريا (انظر جدول المواد) إلى محلول الاغاروز ، والذي يتيح تسجيل الصورة أثناء التحليل. Sonicate الخرز في درجة حرارة الغرفة بتردد 40 كيلو هرتز لمدة 20-30 دقيقة في جهاز الموجات فوق الصوتية لحمام مائي لتفكيك الخرز.
5. بعد الصوتنة ، أضف 1 ميكرولتر من الخرز إلى 10 مل من محلول الاغاروز في أنبوب 15 مل وقم بدوامة الأنبوب جيدا لضمان تشتت موحد للخرز.
  ملاحظة: يعتمد حجم محلول الخرزة المراد إضافته إلى الاغاروز على محلول المخزون والشركة المصنعة. جرب مجموعة من الأحجام واختر تركيزا حيث تظهر الخرزات مشتتة جيدا عند تصويرها في نظام الألواح الخفيفة. يمكن أن يتجمع عدد كبير جدا من الخرز على الرغم من الصوتنة والدوامة ، في حين أن القليل جدا من الخرز يمكن أن يؤثر على تسجيل الصور.
6. احتفظ بأنبوب الاغاروز مع الخرز المضاف في حمام مائي مغلق ، مع الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل تحضير العينة. هذا يضمن أن درجة حرارة الاغاروز تنخفض من 70 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية.
تحضير العينة
1. قم بإعداد الأسماك في أزواج مع فواصل في المساء قبل يوم التصوير. قم بإزالة الفواصل لمدة 15 دقيقة تقريبا واجمع الأجنة باستخدام الإجراء القياسي²⁰.
2. بمجرد أن تصل الأجنة إلى مرحلة الاهتمام لإعداد العينة ، اسكب 10 مل من الاغاروز بالكامل (مع الخرز) الذي يتم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية في طبق بتري 6 سم.
3. انتظر حوالي 2-3 دقائق لخفض درجة الحرارة عن 33 درجة مئوية قبل نقل 10 إلى 15 جنينا إلى محلول الاغاروز.
  ملاحظة: هذه خطوة مهمة لمنع أي صدمة حرارية محتملة للأجنة المنقولة إلى الاغاروز.
4. تأكد من إضافة أقل قدر ممكن من المخزن المؤقت E3 إلى محلول الاغاروز أثناء نقل الأجنة. قم بتدوير طبق بتري حتى يتشتت المخزن المؤقت الصغير الذي كان سيتم نقله جيدا.
5. ارتد القفازات لبقية إجراءات تحضير العينة.
6. خذ ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر بطرف ماصة مناسب وأدخل أنبوبا مستقيما نظيفا مأخوذا من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى طرف الماصة كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب.
7. استنشق القليل من الاغاروز في الأنبوب ، متبوعا ب 2-3 أجنة باستخدام الماصة الدقيقة (الشكل 1C ، D). تأكد من أن الأجنة قريبة من قاع الأنبوب (الشكل 1E) ، والتي ستصبح مهمة أثناء إعداد التصوير. تأكد أيضا من وجود القليل من الاغاروز بين الأجنة المختلفة (الشكل 1E) بحيث يمكن استخدام الخرز في هذه المنطقة كعلامات تسجيل.
8. دون تحرير الضغط من الماصة ، افصل الأنبوب عن طرف الماصة وضعه على غطاء طبق بتري المملوء ب E3 حتى يتصلب الاغاروز (الشكل 1F).
9. كرر الخطوات من 1.3.6 إلى 1.3.8 حتى يتم نقل جميع الأجنة الموجودة في طبق بتري إلى الأنابيب.
10. بمجرد أن يصلب الاغاروز (والذي يمكن أن يستغرق من 5 إلى 10 دقائق ويمكن تأكيده عن طريق فحص الاغاروز في طبق بتري) ، انقل الأنابيب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب E3 (الشكل 1G).
11. قم بتخزين الأنابيب مع الأجنة في حاضنة 28 درجة مئوية أو 33 درجة مئوية ، حسب الحاجة ، قبل الشروع في التصوير متعدد الرؤية.

2. التصوير متعدد المشاهدات

ملاحظة: تقدم هذه الخطوة إجراء عاما للتصوير متعدد الرؤى لأجنة أسماك الزرد في مراحل نموها المبكرة. يمكن تكييف الطريقة المفصلة أدناه بسهولة مع أي نظام مجهر متعدد الرؤية.

تحديد موقع الجنين
ملاحظة: املأ غرفة العينة في المجهر بوسط الجنين²⁰ واضبط درجة حرارة غرفة العينة على درجة الحرارة محل الاهتمام قبل 10 دقائق على الأقل من التصوير.
1. قم بتجميع حامل العينة كما هو موضح سابقا²¹ ، مع تعديل واحد. نظرا لأنه سيتم إجراء التصوير من خلال الأنبوب ، أدخل الأنبوب مع الأجنة مباشرة في الشعيرات الدموية ذات القطر الصحيح ، بحيث يتم تثبيتها في مكانها دون دفع الاغاروز للخارج وإزعاج الأجنة في الأسفل (الشكل 1H).
  ملاحظة: نظرا لأن حجرة العينة لها ارتفاع محدد ، فإن التأكد من أن الأجنة موجودة في أسفل الأنبوب أثناء تحضير العينة (كما هو مذكور في الخطوة 1.3.7) سيمكن من وضع الجنين في مجال الرؤية دون الاصطدام بأرضية الغرفة.
2. أدخل حامل العينة في نظام العرض المتعدد واستخدم عناصر التحكم x و y لإحضار الجنين إلى مركز مجال الرؤية.
3. استخدم عنصر التحكم z في ملاح العينة لتركيز الجنين.
4. في هذه المرحلة ، سيكون اتجاه الجنين داخل المشيمة مرئيا بوضوح ، وإذا لم يكن مرضيا ، فأدخل أنبوبا جديدا واختر الجنين باتجاه الاهتمام.
محاذاة أوراق الضوء
1. بمجرد أن يصبح الجنين في موضعه ، قم بإعداد جميع الإعدادات التجريبية - الليزر ، ومسار الضوء ، والفلتر ، وفاصل الشعاع ، والكاميرا.
2. أثناء إعداد معلمات الاكتساب ، إذا كان البرنامج يوفر خيارا للفحص المحوري ، فحدده. سيقلل الفحص المحوري من تأثير التظليل المنبثق من ورقة الضوء عندما يواجه أي هياكل أو مناطق غير شفافة في العينة.
3. ابدأ المسح المباشر للعينة. قم بإعداد حجم البت وقوة الليزر والتكبير المطلوب ، والذي سيحدد سمك ورقة الضوء ، وبالتالي الدقة المحورية.
4. لمحاذاة الألواح الضوئية ، قم أولا بالتبديل إلى الإضاءة أحادية الجانب وقم بتغيير إعدادات لوحي الضوء (اليسار واليمين) بالتتابع. قم بتكبير منطقة من العينة رقميا حيث تظهر هياكل واضحة ذات أهمية.
  ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام علامة نووية (H2A-mCherry) أو غشاء (Utr-GFP) لمحاذاة الأوراق. يوصى بتغيير إعدادات ورقة الضوء في البرنامج بحيث يتم تحقيق التباين الأكثر حدة للإشارة في المنطقة التي تهمك.
5. بمجرد تحسين اللوحين الخفيفين بشكل فردي لتحقيق أفضل إشارة ، قم بتشغيل كلتا اللوحين الخفيفين. قم بإجراء جولة ثانية من المحاذاة وتأكد من أن الوميض ضئيل للغاية ، مما يشير إلى محاذاة جيدة إلى حد ما بين الورقتين.
6. بمجرد الانتهاء من المحاذاة ، قم بتنشيط خيار دمج الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الورقتين تلقائيا ، إذا سمح البرنامج بذلك. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أولا محاذاة أوراق الضوء بشكل خشن من خلال التركيز على الخرز حول العينة ثم ضبط المحاذاة باستخدام معلومات من العينة.
  ملاحظة: أثناء التصوير باستخدام اثنين من الفلوروفورات (مثل العلامات النووية والغشائية) ، عادة ما تكون المحاذاة المثلى مختلفة بشكل هامشي بالنسبة للهيكلين. في هذا السيناريو، اختر إعدادا استنادا إلى القيود المفروضة على المعالجة من الخادم. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم تقسيم حدود الخلية ، وهو أكثر كثافة معالجة نسبيا ، فقم بمحاذاة صفائح الضوء بناء على علامة الغشاء.
إعداد التصوير متعدد الرؤوس
1. بعد محاذاة الأوراق الضوئية ، قم بتنشيط خيارات إجراء مكدس z بالإضافة إلى التصوير متعدد المشاهدات.
2. ابدأ المسح الضوئي المباشر وانتقل باستخدام متصفح العينة لتحديد العرض الأول. في طريقة العرض هذه، قم بإعداد الفاصل الزمني للشريحة، متبوعا بالشرائح الأولى والأخيرة من z-stack. أضف هذا الموضع في مربع الحوار متعدد المشاهدات، والذي يلاحظ معلومات الموضع والمكدس z لطريقة العرض هذه.
3. انتقل إلى العرض التالي عن طريق تغيير الزاوية في متصفح العينة. قم بإعداد z-stack للعرض الثاني وأضف المعلومات في مربع الحوار multiview.
4. كرر نفس الشيء لطرق العرض الإضافية.
  ملاحظة: تأكد من تصوير حد أدنى معين من الشرائح في كل طريقة عرض بحيث يكون هناك تداخل كاف بين طرق العرض المختلفة ، مما سيساعد في النهاية في تسجيل طرق العرض أثناء المعالجة. يعتمد الحد الأدنى لعدد الشرائح على عامل التكبير وكذلك على عدد الزوايا المختارة للتصوير.
5. بعد تعيين جميع طرق العرض ، احفظ هذه المعلومات في ملف نصي (يسمى "مواضع الجنين" ، على سبيل المثال) ، والذي سيحتوي على معلومات z-stack ، وإحداثيات (x ، y ، z) للأنبوب بالإضافة إلى مواصفات الزاوية لكل عرض. بعد الحفظ ، قم بمسح جميع المواضع من مربع الحوار متعدد العرض.
6. نظرا لأن التصوير يتم باستخدام مشيمة سليمة ، وهي كبيرة نسبيا ، فلا يمكن عرض الخرزات في الأنبوب بنفس الإعدادات. لذلك ، يجب الحصول على معلومات الخرزة من موضع مختلف في الأنبوب. للقيام بذلك ، قم بالترجمة إلى إحداثيات "y" مختلفة بعيدا عن الجنين حيث تكون الخرزات مرئية. أضف هذا الموضع إلى مربع الحوار متعدد المشاهدات واحفظ هذا الموضع في ملف نصي (يسمى "beads-y" ، على سبيل المثال).
  ملاحظة: قم بتصوير الخرزات بالقرب من عينة الجنين قدر الإمكان لتقليل آثار الاختلافات المحتملة في انحناء الأنبوب في الموضعين. لذلك ، إذا تم تركيب أجنة متعددة في الأنبوب ، فمن المهم ترك القليل من الاغاروز بين الأنابيب لتصوير الخرز (كما هو مذكور في الخطوة 1.3.7).
7. انتقل إلى المجلد حيث يتم حفظ الملفات النصية وقم بتكرار ملف "مواضع الجنين" إلى ملف جديد باسم "مواضع الخرز". استبدل الإحداثي y لجميع طرق العرض في ملف "مواضع الخرز" بإحداثي y من ملف "beads-y". سيضمن ذلك تصوير الخرزات بنفس عدد المشاهدات ، و z-stacks ، و x-coordinates ولكن في موضع y مختلف في الأنبوب.
8. ارجع إلى برنامج التصوير وقم بتحميل ملف "مواضع الخرزة" في البرنامج. إذا تم تنشيط خيار السلسلة الزمنية، فحدد دورة واحدة وابدأ التجربة. احفظ صور الخرزة ك "خرز" ، والتي سيتم استخدامها لتسجيل طرق العرض المختلفة أثناء معالجة الصور.
9. بعد التقاط صور الخرزة ، امسح المواضع وقم بتحميل ملف "مواضع الجنين" الأولي في البرنامج. اضبط العدد المرغوب فيه من الدورات بفاصل زمني مناسب وابدأ التجربة.

3. تحليل الصور متعددة المشاهدات

ملاحظة: لدمج الصور متعددة المشاهدات ، يتم استخدام مكون FIJI الإضافي ، BigStitcher ، وهو أحدث إصدار من المكون الإضافي Multiview Reconstruction ،¹⁰^،¹⁷^،¹⁸. يمكن تثبيت المكون الإضافي عن طريق إضافة المكون الإضافي BigStitcher في وظيفة "إدارة مواقع التحديث" ، والتي يمكن الوصول إليها في خيار "تحديث" ضمن قائمة "المساعدة". بمجرد التثبيت ، سيظهر المكون الإضافي ضمن قائمة "الإضافات". الخطوات الواسعة التي ينطوي عليها الاندماج هي كما يلي: (1) تحديد أزواج ملفات .xml / .h5 لكل من الخرز والأجنة ؛ (2) تسجيل جميع المشاهدات في ملف الخرزات ؛ (3) وظيفة انتشار نقطة الاستخراج (PSF) للخرز ، والتي يمكن استخدامها لفك الالتواء (الشكل 2 أ) ؛ (4) نقل معلومات التسجيل و PSF من ملف الخرز إلى ملف الجنين والبدء في تفكيك الالتفاف متعدد المشاهدات. تم وصف معظم هذه الخطوات سابقا بالتفصيل²¹ ، وهنا ، يتم وصف الخطوات التي تتم معالجتها بشكل مختلف.

تعريف مجموعة بيانات .xml
1. حدد مجموعة بيانات جديدة لكل من الخرزات والجنين على أنها "beads.xml" و "embryo.xml" ، على التوالي ، كما هو موضح سابقا²¹.
الكشف والتسجيل باستخدام نقاط الاهتمام
1. بعد التصدير الناجح لملف beads.xml، حدد طرق العرض المطلوبة للتسجيل في مربع الحوار "مستكشف طرق العرض المتعدد" (الشكل 2 ب). انقر بزر الماوس الأيمن واختر اكتشاف نقاط الاهتمام. تابع الخطوات كما هو موضح²¹.
2. بعد اكتشاف نقاط الاهتمام، حدد جميع طرق العرض، وانقر بزر الماوس الأيمن، واختر تسجيل باستخدام نقاط الاهتمام. اتبع البروتوكول كما هو موضح²¹.
3. تحقق بعناية مما إذا كان تسجيل الخرزة قد نجح بنجاح. عند التسجيل الناجح ، يتم تثبيت الخرزات المتداخلة من وجهات نظر مختلفة (الشكل 2 ج). للتحقق من مدى دقة عمل التسجيل ، حدد طريقتين متتاليتين ، وانتقل إلى المنطقة المتداخلة ، وقم بالتبديل بين الطريقتين لملاحظة ما إذا كانت الخرزات المصورة من زوايا مختلفة متراكبة. كرر هذا لكل طريقة عرض متتالية.
4. إذا لم يكن التداخل دقيقا ، فأعد محاولة التسجيل عن طريق تخفيف الأهمية المطلوبة للتسجيل و / أو الخطأ المقبول للتداخل (يسمى "خطأ RANSAC" في مربع الحوار "التسجيل").
5. بعد التسجيل الناجح ، انقر فوق حفظ في نافذة "Multiview Explorer" لحفظ ملف .xml المحدث.
  ملاحظة: احفظ ملف السجل أيضا، لأنه يحتوي على مزيد من المعلومات التفصيلية حول كفاءة التسجيل. لترجمة معلومات التسجيل من الخرز إلى الجنين ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
6. افتح ملف bead.xml في محرر نصوص من اختيارك وانسخ المكون بأكمله ضمن "ViewRegistrations".
7. افتح embryo.xml واستبدل كتلة "ViewRegistrations" بالكتلة المنسوخة من ملف الخرز. إذا كانت هناك قنوات متعددة، فاستبدل معلومات التسجيل لكل قناة على النحو الوارد أعلاه. يمكن نقل معلومات التسجيل إما يدويا أو باستخدام كود MATLAB المكتوب خصيصا والذي يمكن تنزيله من هنا: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
8. افتح ملف embryo.xml في "BigStitcher" وتحقق بعناية مما إذا كان التسجيل قد نجح مع الجنين. كرر نفس الشيء كما هو الحال مع الخرزات ، عن طريق التحقق من تداخل الهياكل ذات الأهمية في كل عرضين متتاليين.
  ملاحظة: في بعض الأحيان ، قد لا يكون تسجيل الأجنة مرغوبا فيه على الرغم من تسجيل الخرزات بشكل مثالي. هذا ممكن إذا كانت هناك تغييرات طفيفة في انحناء الأنبوب من الموضع الذي يتم فيه تصوير الخرزات إلى موضع الجنين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون هناك حركات خفية للجنين بين وجهات النظر لأنه يطفو بحرية داخل المشيمة. في هذه الحالة ، قم بإجراء جولة ثانية من التسجيل باستخدام علامة نووية في الجنين.
9. للقيام بذلك ، افتح ملف embryo.xml في "BigStitcher" ، وانقر بزر الماوس الأيمن على جميع طرق العرض التي تحتوي على العلامة النووية ، واختر اكتشاف نقاط الاهتمام.
10. أعد تسمية نقاط الاهتمام باسم "النوى" وتابع الخطوات التي يتم إجراؤها للخرز.
11. أثناء تعيين معلمات "اختلاف الغاوسية" ، تأكد من اكتشاف معظم النوى ، إن لم يكن كلها ، وعدم وجود اكتشاف نووي خارج الرحم. بعد ذلك ، انقر فوق تم.
12. بعد ذلك ، قم بتسجيل وجهات النظر هذه عن طريق اختيار التسجيل باستخدام نقاط الاهتمام واختيار الخيار المستند إلى الواصف الدقيق (الترجمة الثابتة). تأكد من تحديد خيار "مقارنة جميع طرق العرض ونقاط الاهتمام" واستخدم "النوى" كنقاط اهتمام. استخدم خيار إصلاح العرض الأول ولا تقم بالتعيين مرة أخرى.
13. للتسجيل ، استخدم نموذج affine مع تنظيم صارم والمعلمات الافتراضية في المكون الإضافي.
14. أعد التحقق من نجاح التسجيل من خلال مقارنة كل عرضين متتاليين.
15. بعد التسجيل الناجح ، انقر فوق حفظ في نافذة "Multiview Explorer" لحفظ ملف .xml المحدث.
16. افتح الملف embryo.xml في محرر نصوص من اختيارك وانسخ معلومات التسجيل من العلامات النووية إلى القنوات الأخرى.
استخراج دالة انتشار النقاط وتعيينها
1. لإجراء تفكيك الالتفاف متعدد الرؤية، استخرج PSF لنظام التصوير من مجموعة بيانات الخرز المسجلة وقم بتطبيقه على ملف الجنين.
2. للحصول على هذه المعلومات ، حدد جميع طرق العرض في ملف الخرزة ثم انقر بزر الماوس الأيمن واختر وظائف انتشار النقطة وخيارات الاستخراج .
3. في مربع الحوار الذي يظهر، تأكد من تحديد استخدام نقاط الاهتمام المقابلة وإزالة إسقاطات الحد الأدنى للكثافة من PSF ، وتابع أحجام PSF الافتراضية، وانقر فوق موافق.
  ملاحظة: إذا نجح استخراج PSF لجميع طرق العرض ، فسيعرض ملف السجل "Excludeded n / n PSFs"
4. بعد ذلك ، أعد حفظ ملف .xml. سيظهر مربع اختيار محدد في عمود PSF في مربع الحوار "Multiview Explorer" ، وسيتم إنشاء مجلد "psf" في المجلد المعني مع جميع PSFs المستخرجة.
5. افتح ملف embryo.xml وقم بتعيين PSF لكل طريقة عرض على حدة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق "طريقة عرض" → انقر فوق Point Spread Functions → اختر تعيين → حدد خيارات متقدمة ، متبوعا بتعيين PSF جديد لجميع طرق العرض المحددة. انقر فوق تصفح ، وانتقل إلى مسار ملف .xml ، وافتح مجلد psf .
6. اختر PSF المطابق مع المعرف المقابل في العرض المحدد وانقر فوق موافق ، وبعد ذلك سيظهر مربع اختيار PSF محددا في نافذة "Multiview Explorer".
7. كرر العملية لجميع طرق العرض الأخرى.
الانصهار متعدد المشاهدات وفك الالتفاف
1. بعد تعيين وظيفة انتشار النقاط لجميع طرق العرض ، انقر بزر الماوس الأيمن واختر Multiview Deconvolution.
2. حدد المربع المحيط كطرق عرض محددة حاليا. بالنسبة لهذا العمل، يعمل تسريع OSEM الافتراضي وعدد التكرارات بشكل جيد.
3. قم بتقليل عينات الصور كما هو مطلوب إذا كان الحساب الأسرع مطلوبا أو إذا كانت ذاكرة وحدة المعالجة المركزية محدودة.
  ملاحظة: إذا تجاوزت ذاكرة الوصول العشوائي المطلوبة الذاكرة الموجودة، فستظهر رسالة خطأ تحذير باللون الأحمر في أسفل النافذة. لا تبدأ الالتفاف إذا ظهر هذا التحذير ، حيث سيتوقف المكون الإضافي ويتوقف عن الاستجابة في مرحلة ما أثناء المعالجة.
4. لتقييم تقدم التفكيك ، تحقق من ملف السجل ، والذي سيعرض النتائج كل 5 تكرارات.
5. لزيادة السرعة الحسابية ، قم بإجراء فك الالتفاف متعدد الرؤية في وحدة معالجة الرسومات إذا تم تثبيته مسبقا.
  ملاحظة: في نهاية هذه العملية ، ستظهر نافذة صورة مدمجة ، والتي يمكن حفظها كملف tiff.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توجيه العينة بطريقة دقيقة جزءا حيويا من الاستخدام الفعال لإعداد الفحص المجهري. ومع ذلك ، غالبا ما يكون توجيه العينات يدويا غير ممكن عند استخدام نظام ورقة ضوئية متعددة الرؤوس ، نظرا لمتطلبات تحضير العينات في أنبوب. لذلك ، للتحقق مما إذا كانت هناك أوضاع نمطية تتخذها الأجنة داخل المشيمة ، تم تصوير أجنة الزرد بنسبة 70٪ (حوالي 7 ساعات بعد الإخصاب (HPF)) ، حيث كان التصوير بفاصل زمني من المعدة إلى مراحل الجسيدات المبكرة هو محور هذه الدراسة. عندما تم تحضير العينات مباشرة قبل التصوير بنسبة 70٪ ، لم تظهر الأجنة أي اتجاه محدد يتم ملاحظته بشكل متكرر عبر العينات. نظرا لأن هذا غير مرغوب فيه في كثير من الأحيان ، فقد تم تحضير العينات قبل المعدة بوقت طويل وتخزينها في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة عند درجة الحرارة المناسبة حتى بدء التصوير. في ظل هذه الظروف ، عند 70٪ epiboly (N = 3 ؛ n = 87 جنين) ، يمكن تصنيف اتجاهات الجنين إلى (1) أفقي ، عندما يكون المحور النباتي الحيواني (AV) للجنين متعامدا مع المحور الطويل لأنبوب البوليمر ، (2) عموديا ، عندما كان المحور الأذيني البطيني موازيا للمحور الطويل لأنبوب البوليمر ، و (3) مائل ، عندما كان محور AV بزاوية حادة (الشكل 3 أ). كان الوضع الأفقي هو الأقل تمثيلا ، بينما لوحظت المواضع الرأسية والمائلة بالتساوي (الشكل 4).

عندما تركت الأجنة في الأنابيب ، كانت الأجنة مستقرة في هذه المواضع حتى 90٪ epiboly ، وبعد ذلك غيرت معظم الأجنة اتجاهاتها. لذلك ، كانت هناك حاجة إلى جولة ثانية من توثيق التوجهات في مرحلة البراعم من التطور الجنيني (حوالي 10 HPF) لحساب الاتجاهات المتغيرة. تم إجراء ذلك للعينات المعدة بشكل مستقل. لتصوير مراحل الجسيدات المبكرة ، تم الإبلاغ سابقا عن أن الجنين ذو الحبل الظهري المتعامد مع المحور الطويل لأنبوب البوليمر كان الاتجاه المثالي لأنه يسمح بتصور العديد من الجسيدات الثنائية التي تتشكل على طول المحور¹⁵. عندما تم تحضير العينات قبل المعدة (N = 3 ، n = 93 جنينا) ، أظهرت حوالي 25٪ من الأجنة هذا الاتجاه (الشكل 4) وظلت هذه الأجنة مستقرة في هذا الاتجاه حتى مرحلة 8 جسدات على الأقل ، بما يتفق مع التقارير السابقة¹⁵. أظهرت بقية الأجنة اتجاهات أخرى مختلفة في مرحلة البراعم (مصنفة في الشكل 3 ب والشكل 4) ؛ ومع ذلك ، أعاد العديد منهم توجيههم إلى الوضع الأفقي أثناء تكوين الجسيدات المبكر. ومن المثير للاهتمام ، أن نسبة مماثلة من الأجنة قدمت اتجاها أفقيا في مرحلة البراعم بغض النظر عما إذا كانت العينة قد تم تحضيرها قبل المعدة ، أو عند 70٪ epiboly ، أو قبل مرحلة البراعم مباشرة. وبالتالي ، يبدو توقيت تحضير العينة أقل أهمية للاتجاه الأفقي محل الاهتمام لتصوير مراحل الجسيدات ، على عكس ما لوحظ للتصوير بنسبة 70٪ epiboly.

تتمثل ميزة نظام العرض المتعدد في القدرة على عرض نفس العينة من زوايا متعددة. ومع ذلك ، بالنسبة لأجنة الزرد في المراحل المذكورة ، فإن عدد المشاهدات المطلوبة للحصول على دقة خلوية عبر الجنين بأكمله غير واضح. لتوصيف ذلك ، تم تصوير أجنة الزرد باستخدام هدف NA 20x / 1 في ذراع الكشف بعامل تكبير 1 ، والذي يتوافق مع سماكة ورقة خفيفة تبلغ 4.57 ميكرومتر. في ظل هذه الإعدادات ، غطى الجنين مجال الرؤية الكامل لكاميرا sCMOS بحجم بكسل 6.5 ميكرومتر ومساحة 1920 × 1920 بكسل. الحقن المجهري ل mRNA للفلوروفور الموسوم بالهيستون (H2A-mCherry) في أجنة من مرحلة خلية واحدة تم الحصول عليها من خط معدل وراثيا ميز خيوط الأكتين (Utr-GFP) سمحت بتصور كل من النوى وأغشية الخلايا في الجنين. لإجراء الاندماج متعدد المشاهدات للأجنة بفترات زاوية مختلفة ، تم إجراء اكتساب 360 درجة للأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة وكذلك الخرز في الأنبوب كل 30 درجة (ن = 3 أجنة عند 70٪ epiboly ؛ ن = 3 أجنة في مرحلة البراعم) أو 45 درجة (ن = 3 أجنة عند 70٪ epiboly ؛ ن = 3 أجنة في مرحلة البراعم) فواصل زمنية مع حوالي 100 شريحة في كل زاوية وفاصل شريحة يبلغ 2 ميكرومتر. من خلال تخطي الزوايا البديلة أثناء معالجة الصور ، وفرت عمليات الاستحواذ 30 درجة و 45 درجة بالإضافة إلى مجموعات البيانات 60 درجة و 90 درجة.

ثم تم تسجيل الصور المكتسبة باستخدام معلومات الخرزة ، وتم نقل تفاصيل التسجيل إلى مجموعة بيانات الجنين كما هو موضح في قسم البروتوكول. تم تحقيق التسجيل الناجح باستخدام المكون الإضافي BigStitcher لعمليات الاستحواذ المختلفة باستثناء مجموعة البيانات 90 درجة ، والتي من المحتمل أن تكون بسبب تغطية أقل للعينة من كل زاوية. للتغلب على ذلك ، تم تصوير الأجنة كل 90 درجة مع حوالي 400 شريحة في كل زاوية وفاصل شريحة يبلغ 2 ميكرومتر ، في كل من مرحلتي 70٪ من epiboly والبراعم ، والتي تم تسجيلها بنجاح (ن = 3 أجنة لكل مرحلة).

كانت الخطوة التالية هي إجراء اندماج متعدد المشاهدات وفك الالتفاف لمجموعات البيانات المسجلة. تم ذلك مع تقليل أخذ العينات 4x لتسريع الحساب. كما يتضح من تمثيل النوى من وجهات النظر الفردية والجنين متعدد الرؤوس المعاد بناؤه (الشكل 5) ، تغطي المناظر الفردية مجال رؤية أصغر ، والذي ، عند الاندماج ، أسفر عن صورة للجنين بأكمله. بالنسبة للتمثيل ، تم اكتشاف النوى باستخدام Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon) ، وهو مكون إضافي قائم على FIJI ، والذي يمكن إضافته في قسم "إدارة مواقع التحديث" في قائمة "المساعدة" في FIJI والوصول إليه ضمن قائمة المكونات الإضافية بمجرد إضافتها. للكشف ، تم تحويل الصور المعنية أولا إلى تنسيق XML / hdf5 ، ثم تم إجراء الكشف النووي باستخدام المكون الإضافي "Detection" الخاص ب Mastodon مع كاشف DoG (القطر 6 ميكرومتر وعتبة الجودة 80).

من بين الصور المنصهرة المختلفة ، أظهرت مجموعة البيانات 90 درجة خلفية عالية جدا أعمق في العينة ، مما يجعلها غير مناسبة لإجراء أي قياس كمي. وبالتالي ، على عكس العينات الأصغر مثل ذبابة الفاكهة الأجنة ، والتي تم تصويرها بشكل متكرر بفاصل 90 درجة في دراسات أخرى⁹^،²² ، لا ينصح بنفس الشيء لتصوير أجنة الزرد المبكرة باستخدام هدف 20x / 1 NA. بين مجموعات البيانات المنصهرة 30 درجة و 45 درجة و 60 درجة ، من الناحية النوعية ، لم يكن هناك فرق جوهري في معلومات النوى (الشكل 6 ب ، الصف العلوي) ؛ ومع ذلك ، بدت الهياكل الدقيقة مثل حدود الخلية محلولة بشكل أفضل مع مجموعة البيانات المدمجة بزاوية 30 درجة مقارنة بالباقي (الشكل 6 ج ، الصف العلوي).

لتأكيد هذه الملاحظة ، تم استخدام Mastodon للكشف عن النوى في الصور المنصهرة التي تم الحصول عليها من التصوير كل 30 درجة و 45 درجة و 60 درجة. تم اختيار ثلاث مناطق في الصور المنصهرة ، واحدة على عمق 20 ميكرومتر (الشكل 6 أ) و 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر من سطح الجنين ، للتحليل. لمقارنة كفاءة اكتشاف النوى عبر الصور ، تم إجراء الكشف كما هو موضح أعلاه ، مع معلمات متطابقة عبر الصور المنصهرة من فترات زاوية مختلفة. في جميع المناطق التي تم تحليلها ، تم اكتشاف كل نواة بغض النظر عن الصور المدمجة التي تم الحصول عليها من التصوير كل 30 درجة أو 45 درجة أو 60 درجة (الشكل 6 ب ، الصف السفلي). وبالتالي ، يمكن تصوير الهياكل الكروية مثل النوى في أي من الفترات الزاوية المذكورة أعلاه دون فقدان المعلومات.

لتحليل حدود الخلية ، تم استخدام محلل الأنسجة²³ ، وهو مكون إضافي من FIJI يستخدم بشكل روتيني لتجزئة الخلايا²⁴^،²⁵^،²⁶. على غرار Mastodon ، يمكن إضافة المكون الإضافي Tissue Analyzer في قسم "إدارة مواقع التحديث" في قائمة "المساعدة" في FIJI والوصول إليه ضمن قائمة المكونات الإضافية بمجرد إضافتها. تم تقسيم حدود الخلية باستخدام خوارزمية مستجمعات المياه مع المعلمات الافتراضية وضبابية قوية تتراوح من 1.5 إلى 2 اعتمادا على عمق الأنسجة وتمويه ضعيف قدره 1. تم الحفاظ على هذه المعلمات ثابتة في جميع التحليلات ، مما يسهل إجراء مقارنة مباشرة. عندما تمت مقارنة الصور المجزأة يدويا بصور الإدخال الأصلية ، لوحظت أخطاء ، حيث فشل البرنامج إما في اكتشاف حدود الخلية أو رسم حدود خلية غير موجودة (الشكل 6C ، الصف السفلي). تم تطبيع عدد الأخطاء التي أحدثها المكون الإضافي لمحلل الأنسجة إلى العدد الإجمالي للروابط التي تم اكتشافها في المنطقة وحسابها على أنها "خطأ في تجزئة الحدود". في حين أن هذه الأخطاء كانت موجودة في جميع المناطق التي تم تحليلها ، فقد زاد عدد الأخطاء بشكل كبير في الصور المنصهرة التي تم الحصول عليها من التصوير على فترات زاوية 45 درجة و 60 درجة ، مقارنة ب 30 درجة (الشكل 6 د). يشير هذا إلى أن الدقة في الصور المدمجة كانت أسوأ بشكل متزايد عند زيادة الفاصل الزمني الزاوي. وبالتالي ، لتقسيم الهياكل الدقيقة مثل حدود الخلية ، يتيح الفاصل الزمني الزاوي الأكثر إحكاما معالجة أسهل في المصب.

figure-results-1
الشكل 1: تحضير العينة باستخدام أنابيب البوليمر. (أ) يؤخذ أنبوب بوليمر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المخزنة باستخدام الملقط. (ب) ربط الأنبوب بطرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر. (ج) شفط الأجنة بمساعدة ماصة في الأنبوب. (د ، ه) أنبوب بوليمر به أجنة في مرحلة البراعم مرئية باتجاه الجزء السفلي من الأنبوب. (F) توضع أنابيب البوليمر على طبق بتري مع E3 لتصلب الاغاروز. (ز) تخزين أنابيب البوليمر في أنبوب طرد مركزي دقيق مملوء ب E3. (ح) حامل عينة مجمع مع أنبوب البوليمر المركب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: سير عمل تحليل الصور متعددة المشاهدات والتسجيل باستخدام الخرز. (أ) خط أنابيب تحليل الصور متعددة الرؤية. (ب) تعرض الصورة نافذة "Multiview Explorer" في BigStitcher ، وهو مكون إضافي من FIJI ، حيث يظهر كل عرض كصف واحد ويحتوي على معلومات حول الزاوية والقناة والتسجيل ونقاط الاهتمام و PSF. تظهر جميع الأوامر التي تمت مناقشتها في البروتوكول عند تحديد طريقة عرض متبوعة بنقرة بزر الماوس الأيمن، كما هو موضح في القائمة المنبثقة. يمكن تصور الملفات الشخصية المحددة في نافذة BigDataViewer، كما هو موضح. (ج) صورة حبة تمثيلية قبل (يسار) وبعد التسجيل (يمين) تم الحصول عليها من التصوير على فترات زاوية 30 درجة. تم تحديد جميع طرق العرض الزاوية وعرضها. أشرطة المقياس: 75 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: نظرة عامة على اتجاهات الجنين الافتراضية. صور تمثيلية للاتجاهات التي تقع فيها الأجنة داخل المشيمة عند 70٪ من مراحل الظهورة (A) والبراعم (B). يصور الصف العلوي في كل لوحة صورا للمجال الساطع تم الحصول عليها من نظام الألواح الخفيفة ، ويصور الصف السفلي رسوما كاريكاتورية تمثيلية. تشير الأسهم الموجودة في (ب) إلى موضع الحبل الظهري ، والذي تم استخدامه لتحديد الاتجاه. AP ، قطب. نائب الرئيس ، القطب النباتي. أ ، الأمامي. ف ، خلفي. أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: إحصائيات اتجاهات الجنين المختلفة. (أ) يشير العمود المكدس إلى النسب المئوية للأجنة التي تقع في الاتجاهات المشار إليها عند 70٪ epiboly عند تحضير العينات قبل المعدة (ب) تشير الأعمدة المكدسة إلى النسب المئوية للأجنة التي تقع في الاتجاهات المشار إليها في مراحل البراعم عندما يتم تحضير العينات قبل المعدة (يسار) ، عند 70٪ epiboly (متوسط) ، وفي مراحل البراعم (يمين). N ، عدد القوابض المستقلة التي تم الحصول على الأجنة منها ؛ n ، العدد الإجمالي للأجنة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تمثيل النوى من جنين متعدد الرؤية. (أ)يمثل مخطط التشتت ثلاثي الأبعاد النوى المكتشفة في جنين متعدد الرؤوس أعيد بناؤه تم تصويره على فاصل زاوي 30 درجة. تمثل كل دائرة نواة ويتم رسم النقطة الوسطى لمواضع النوى. تم الحصول على الإحداثيات النووية باستخدام Mastodon ، وهو مكون إضافي من FIJI. (ب) مخططات مبعثرة ثلاثية الأبعاد للنوى من ثلاث وجهات نظر تمثيلية لنفس الجنين - الصور متباعدة بزاوية 60 درجة. تم تعيين الألوان لكل نواة بشكل عشوائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: مقارنة المعلومات على نطاق خلوي في الصور المنصهرة. (أ) تظهر الصورة الموجودة على اليسار لقطة من جنين أعيد بناؤه متعدد الرؤى على عمق 20 ميكرومتر من السطح. تصور الدائرة الصفراء المنطقة المستخدمة لمزيد من التحليل. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر (في جميع الألواح). (ب) صور أولية تمثيلية للنوى على عمق 20 ميكرومتر من سطح الجنين من ثلاث مجموعات بيانات تم تصويرها كل 30 درجة و 45 درجة و 60 درجة على التوالي (أعلى). تم اكتشاف النوى (باللون الأخضر) في نفس الصور بواسطة Mastodon ، وهو مكون إضافي من FIJI (أسفل). (ج) صور أولية تمثيلية على عمق 20 ميكرومتر من سطح الجنين من ثلاث مجموعات بيانات يتم تصويرها كل 30 درجة و 45 درجة و 60 درجة على التوالي ، باستخدام علامة الأكتين ، Utr-GFP (أعلى). يتم عرض الحدود المقسمة بواسطة محلل الأنسجة ، وهو مكون إضافي من FIJI ، لنفس الصور (أسفل). تشير الأسهم إلى الأخطاء التي ارتكبها محلل الأنسجة في تجزئة الحدود ، حيث يمثل السهم الأصفر حدا مفقودا ويمثل السهم الأبيض الحدود المكتشفة بشكل خاطئ عندما لا تظهر أي حدود بصريا. (د) يصور مخطط الصندوق النسبة المئوية للأخطاء التي ارتكبها محلل الأنسجة بين الأجنة المعاد بناؤها متعددة الرؤوس التي تم تصويرها كل 30 درجة و 45 درجة و 60 درجة على أعماق مختلفة. تشير أشرطة الخطأ إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد وضع الجنين في الاتجاه الصحيح لتصوير منطقة الاهتمام أحد خطوات تحديد المعدل التي غالبا ما تؤدي إلى فشل جلسة الفحص المجهري للمستخدم. هذا أكثر من ذلك في مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس حيث يكون التلاعب اليدوي بالاتجاه صعبا حيث يتم تضمين العينات داخل أنبوب. للمساعدة في هذه العملية ، تشير هذه الدراسة إلى إحصائيات المواضع المختلفة التي يشغل جنين سمكة الزرد ما بين 70٪ من مراحل الجسيدات المبكرة داخل المشيمة عندما يتم الاحتفاظ بأنبوب البوليمر مع الأجنة في وضع مستقيم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.

عند 70٪ من الأجنة الرأسية أو الأفقية توفر معلومات تكميلية للأحداث عبر الجنين بأكمله. في حين أن الاتجاه الأفقي يسمح بتصور الديناميكيات الخلوية في القطب الحيواني بالإضافة إلى ديناميكيات الخلايا التي تخضع للظهارة كما ينظر إليها من القطب الخضري ، فإن الاتجاه الرأسي يسمح بتصور الجانبين الظهري والبطني للجنين ، بما في ذلك الديناميكيات الخلوية في المنظم الظهري ، واستيعاب الخلايا أثناء تدفقات المعدة والتقارب والتمديد. تظهر هذه الدراسة أن هناك احتمالا كبيرا للحصول على جنين في الاتجاه الرأسي بالصدفة البحتة إذا تم تحضير العينات قبل ساعات قليلة من التصوير. ومع ذلك ، يبدو أن الاتجاه الأفقي أقل انتشارا في هذه المراحل. بالنسبة للمراحل التي تسبق 70٪ epiboly ، يوصى بأن يوثق المستخدمون إحصائيات مماثلة لاتجاه الجنين داخل المشيمة قبل الشروع في التصوير بفاصل زمني ، لأن الحصول على هذه المعلومات مسبقا يوفر الوقت على المدى الطويل.

من مرحلة البراعم ، فإن أفضل اتجاه للتصوير هو جنين في وضع أفقي ، حيث يسمح ذلك باتباع الديناميكيات الخلوية على طول محور الجسم الأمامي الخلفي بالكامل للأجنة¹⁵. يعد الحصول على جنين في هذا الاتجاه أمرا بسيطا نسبيا ، حيث يقع حوالي 25٪ من الأجنة في هذا الوضع المستقر بغض النظر عن وقت تحضير العينة. بشكل عام ، لتصوير أي مرحلة من مراحل الاهتمام ، يوصى بإعداد حوالي 15 أنبوبا بها جنينتان إلى ثلاثة أجنة في كل أنبوب ، مما يضمن احتمالية عالية للحصول على الأجنة في الاتجاه المطلوب ، وبالتالي جلسة فحص مجهري ناجحة في أي يوم. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بفرز الأنابيب قبل حوالي ساعة من مرحلة الاهتمام لاختيار جنين بالاتجاه الصحيح للتصوير بفاصل زمني.

بعد الحصول على جنين في الاتجاه الصحيح ، من المهم مراعاة عدد المشاهدات والفاصل الزمني للزاوية بين وجهات النظر للتصوير. هذا يعتمد على الحد الأدنى من الدقة المكانية والزمانية المطلوبة. كلما زاد عدد الزوايا التي يتم من خلالها تصوير بنية أو منطقة معينة من الجنين ، كانت الدقة المكانية أفضل (كما هو موضح في الشكل 6) ، ولكن هذا يؤدي إلى حل وسط بشأن الدقة الزمنية. في هذا البروتوكول ، مع نظام يحتوي على ذراعي إضاءة وذراعي كشف واحد ، استغرق تصوير قناتين على 360 درجة كاملة بفاصل زاوي 30 درجة وحوالي 100 شريحة z في كل زاوية مع تباعد شرائح يبلغ 2 ميكرومتر ، حوالي 3 دقائق لنقطة لمرة واحدة. في حين أن هذا كاف لتتبع الخلايا في المراحل الجنينية المبكرة ، إذا أردنا التقاط الأحداث ذات الديناميكيات الأسرع ، فيجب الحصول على عدد أقل من الزوايا ، مما يضمن دقة زمنية أفضل ولكن مع حل وسط على الدقة المكانية ، خاصة إذا كان لا بد من تقسيم الهياكل الدقيقة مثل حدود الخلية. الخيار الثاني الذي يجب مراعاته لتحسين الدقة الزمنية هو استخدام نظام متعدد الرؤية مع ذراعي كشف ، مما سيزيد بشكل كبير من سرعة الاستحواذ كما تم استخدامه مؤخرا لتتبع حركات الخلايا أثناء المعدة في أجنة الزرد¹⁶. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن هدف NA 20x / 1 فقط قد تم اختباره في هذا البروتوكول ، اعتمادا على العينة التي يتم تصويرها ، والدقة المكانية المطلوبة ، ومجال الرؤية ، يجب النظر في الهدف الصحيح. مجتمعة ، بناء على المعالجة النهائية المطلوبة والقياس الكمي لعينة معينة ومجال رؤية معين ، يجب اختيار عدد المشاهدات والفاصل الزمني للزاوية بعناية. بالنسبة لتصوير أجنة الزرد المبكرة بالكامل ، خاصة بدقة على نطاق خلوي من زوايا متعددة ، يبدو أن هدف NA 20x / 1 هو الأمثل ، حيث أن الهدف ذو التكبير المنخفض و NA (على سبيل المثال ، هدف 10x / 0.5 NA) سيكون له دقة أقل بكثير ، مما يؤدي على الأرجح إلى المزيد من أخطاء التجزئة ، في حين أن الهدف الذي يحتوي على تكبير أعلى و NA لن يكون ممكنا لتغطية الجنين بأكمله في مجال رؤية الكاميرا.

في هذه الدراسة ، لمناقشة استراتيجيات التركيب والتصوير ، تم استخدام علامة الأكتين ، والتي يمكن استخدامها كوكيل لتتبع حدود الخلايا ، وعلامة هيستون ، للكشف عن النوى وتتبعها. في الواقع ، استخدمت معظم الدراسات المنشورة سابقا والتي استخدمت نظام الألواح الضوئية متعددة الرؤوس بشكل تفضيلي علامات مماثلة⁵^،⁷^،¹⁵^،¹⁶^،²⁷. السبب الرئيسي لاختيار هذه العلامات هو أن الفحص المجهري للورقة الضوئية متعددة الرؤوس يستخدم بشكل رئيسي لمتابعة ديناميكيات النطاق الخلوي (على سبيل المثال ، شكل الخلية وإعادة ترتيب الخلية) إما على مقاييس الأنسجة أو عبر الجنين بأكمله لفترات زمنية طويلة تمتد لعدة ساعات إلى أيام. من ناحية أخرى ، إذا كانت هناك حاجة للحصول على دقة شبه خلوية ، فيمكن استخدام خط مختلف معدل وراثيا يشير إلى منطقة الاهتمام ، ولكن في هذا السيناريو ، قد لا يكون مجهر الألواح الضوئية متعدد الرؤوس هو الخيار الأفضل للأداة ، بل هو نظام كونفوكال أو نظام فائق الدقة أو حتى مجهر ورقة ضوئية^{شبكية 28} ^،²⁹ قد يناسب المشكلة التي يجري التحقيق فيها بشكل أفضل.

يعمل البروتوكول الذي تمت مناقشته بشكل جيد من المعدة إلى أجنة سمكة الزرد ذات المرحلة 15 الجسيدية³⁰ (حوالي 17 حصان) دون أي تعديلات ، وعلى الرغم من عدم اختباره هنا ، فمن المحتمل أن يعمل مع الأجنة السابقة قبل مرحلة المعدة أيضا. بعد مرحلة 15 جسدية ، تبدأ تقلصات العضلات العفوية³⁰^،³¹ ، والتي يمكن قمعها عن طريق إضافة التريكيين ، وهو مخدر ، في الأنبوب وكذلك في غرفة العينة. بالإضافة إلى ذلك ، عند حوالي 18 حصانا ، يبدأ انقلاب الذيل بعيدا عن صفار^{البيض 30} ، مما يحرك الجنين بعيدا عن مجال الرؤية. للعناية بهذا ، يجب استخدام خوارزمية تتبع التي تتعقب النهاية المستطالة لإبقاء الجنين في بؤرة^{التركيز 32}. علاوة على ذلك ، لتصوير الأجنة في المرحلة اللاحقة عندما تكون خالية من المشيمة ، مثل متابعة التطور العصبي ، يجب استخدام استراتيجية تركيب بديلة كما تم إجراؤها مؤخرا³³.

لتصوير أجنة الزرد بمشيمة سليمة ، لا يمكن التقاط كل من الخرزات ، التي تعمل كعلامات تسجيل ، والجنين في نفس مجال الرؤية باستخدام هدف NA 20x / 1. توفر هذه الدراسة بديلا بسيطا عن طريق تسجيل وجهات النظر المختلفة بمعلومات من الخرز الموجود أعلى العينة أو أسفلها ، متبوعا بتحويل التسجيل من الخرز إلى الجنين أثناء المعالجة. بمجرد تسجيل عينة الجنين بهذه الطريقة ، يمكن إجراء جولة ثانية من التسجيل باستخدام النوى كعلامات تسجيل ، موجودة داخل العينة ، لمزيد من الضبط الدقيق للتسجيل الأولي. عند إجراء التصوير بفاصل زمني ، يمكن استخدام معلومات النوى ، بدورها ، لتسجيل النقاط الزمنية المتتالية كما تم الإبلاغ عنه^{سابقا 21}. أحد البدائل لهذا البروتوكول هو التخلي عن الخرز وبدلا من ذلك استخدام معلومات النوى للتسجيل الأولي. لكن التسجيل غالبا ما فشل (غير موضح هنا) في المكون الإضافي BigStitcher ، ربما بسبب مزيج من العديد من النوى التي لم يتم اكتشافها بشكل أعمق في الجنين أثناء المعالجة وأيضا بسبب عدد أقل نسبيا من النوى الموجودة في الجنين عند النظر إليها من زوايا معينة (على سبيل المثال عند النظر إليها بطنيا في مراحل الظلام المتأخرة).

في هذا البروتوكول ، نظرا لاستخدام معلومات الخرزة من أعلى أو أسفل العينة للتسجيل ولا توجد حاجة لتصوير الخرز في نفس عرض تصوير العينة ، يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لتصوير مناطق معينة ذات أهمية فقط ولكن بتكبير عال من زوايا مختلفة بدلا من الجنين بأكمله. علاوة على ذلك ، من السهل تكييف هذا البروتوكول لتصوير عينات متعددة مكدسة عموديا في الأنبوب باستخدام معلومات الخرزة من بين العينات للتسجيل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعرب عن تقديرنا للدكتور كاليداس كوهالي وفريقه لصيانة منشأة الأسماك و KV Boby لصيانة مجهر الألواح الضوئية. تعترف SRN بالدعم المالي المقدم من وزارة الطاقة الذرية (DAE) ، حكومة الهند (رقم تعريف المشروع. RTI4003 ، DAE OM رقم 1303/2/2019 / R\&D-II / DAE / 2079 بتاريخ 11.02.2020) ، برنامج مجموعة شركاء جمعية ماكس بلانك (M.PG. A MOZG0010) ومنحة أبحاث بدء التشغيل لمجلس أبحاث العلوم والهندسية (SRG / 2023 / 001716).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agarose ، درجة حرارة منخفضة للتبلور	Sigma-Aldrich	A9414
هيدرات كلوريد الكالسيوم	Sigma-Aldrich	12022
إصدار FIJI			: ImageJ 1.54f
حبات اللاتكس ، البوليسترين المعدل بالكربوكسيل ، أحمر فلورسنت ، 0.5 & mu ؛ م متوسط حجم الجسيمات ، التعليق المائي	Sigma-Aldrich	L3280
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 طقم النسخ	ThermoFischer Scientific	AM1340	من أجل النقل في المختبر ل H2A-mCherry البلازميد
البوتاسيوم Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE التغطيه AWG 15L - 1.58 مم ID × 0.15 مم جدار +/- 0.05	ابتكارات Adtech في البلاستيك الفلوري	STW15	أنابيب PTFE
كلوريد الصوديوم	سيجما-ألدريتش	S3014
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	سيجما ألدريتش	71640
منظف بالموجات فوق الصوتية	لابمان	LMUC3	الموجات فوق الصوتية
زايس لايت شيت 7 نظام	زايس

ثنائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة