مقالة منهجية

استخدام الكائنات العضوية المعوية البشرية لفهم ظهارة الأمعاء الدقيقة على مستوى النسخ أحادي الخلية

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

يونيو 28, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يجمع البروتوكول بين تقنية العضوية المعوية البشرية والتحليل النسخي أحادي الخلية لتوفير نظرة ثاقبة مهمة في بيولوجيا الأمعاء غير المستكشفة سابقا.

الملخص

أحدثت ترانسكريبتوميا الخلية الواحدة ثورة في فهمنا لبيولوجيا الخلية في جسم الإنسان. توفر أحدث مزارع الأعضاء المعوية الدقيقة البشرية أنظمة نموذجية خارج الجسم الحي تسد الفجوة بين النماذج الحيوانية والدراسات السريرية. يكشف تطبيق نسخ الخلية الواحدة على نماذج الأعضاء المعوية البشرية (HIO) عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. تستخدم منصات النسخ أحادية الخلية المتقدمة تقسيم الموائع الدقيقة والتشفير الشريطي لإنشاء مكتبات cDNA. يمكن تسلسل cDNAs المشفرة بسهولة بواسطة منصات تسلسل الجيل التالي واستخدامها بواسطة أدوات التصور المختلفة لإنشاء الخرائط. هنا ، نصف طرق زراعة وتمييز HIOs المعوية الدقيقة البشرية بتنسيقات وإجراءات مختلفة لعزل الخلايا القابلة للحياة عن هذه الأشكال المناسبة للاستخدام في منصات التنميط النسخي أحادي الخلية. تسهل هذه البروتوكولات والإجراءات استخدام HIOs المعوية الدقيقة للحصول على فهم متزايد للاستجابة الخلوية لظهارة الأمعاء البشرية على مستوى النسخ في سياق مجموعة متنوعة من البيئات المختلفة.

المقدمة

تحتوي ظهارة الأمعاء الدقيقة على منطقتين متميزتين: القبو الذي يضم الخلايا الجذعية المعوية (ISC) والزغابات ، التي تتكون من خلايا متمايزة من السلالات الإفرازية والامتصاصية. إضافة إلى هذا التعقيد هو الخصوصية الإقليمية للظهارة التي توفر خصائص وظيفية فريدة بين مناطق الأمعاء الدقيقة. أنشأ العمل الرائد ظروفا استزراعية يمكن فيها إنشاء كل من سرداب الأمعاء الدقيقة البشرية ومناطق الزغابات خارج الجسم الحي من الأنسجة الجراحية أو خزعات الأنسجة1. تعمل هذه الثقافات على سد الفجوة بين الدراسات على والتجارب السريرية وتكشف عن بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية وعلم وظائف الأعضاء في الجهاز الهضمي غير المعترف بها سابقا. يتم نشر HIOs كهياكل كروية 3D باستخدام وسائط مع عوامل النمو التي تعزز صلاحية الخلايا الجذعية ومصفوفات الدعم خارج الخلية. تؤدي هذه الحالات إلى نموذج HIO يشبه القبو يتكون في الغالب من أسلاف وخلايا جذعية. تعزز إزالة عوامل النمو تمايز مركز الدراسات الدولي (نموذج يشبه الزغابات) وإنتاج الخلايا الظهارية المعوية الناضجة (الكأس ، الغدد الصماء المعوية ، الخصلة ، الخلايا المعوية) بنسب مناسبة جنبا إلى جنب مع تكاثر الخلايا والتمايز ، والاستقطاب ، وسلامة الحاجز ، والسمات الإقليمية المحددة ، والاستجابات الفسيولوجية المناسبة2. ثقافات HIO مستقرة وراثيا ويمكن نشرها إلى أجل غير مسمى في حالتها الشبيهة بالسرداب. يتم توفير سهولة الوصول إلى السطح القمي لهذه الثقافات من خلال ظروف الاستزراع التي تسمح بالنمو في شكل أحادي الطبقة3. تسمح HIOs أيضا بتضمين اعتبارات التباين الفردي المضيف مثل الوراثة والعمر والجنس والعرق وحالة المرض في التحليلات البيولوجية. تتطابق أدوات التقييم التحليلي والوظيفي مع تلك المستخدمة في الأساليب التي تركز على خطوط الخلايا المحولة وتشمل مجموعة متنوعة من التقنيات الجزيئية مثل قياس التدفق الخلوي ، والفحص المجهري ، والنسخ ، والبروتينات ، والأيض.

تحدث ترانسكريبتوميا الخلية الواحدة ثورة في فهمنا لبيولوجيا وفسيولوجيا الأمعاء الدقيقة من خلال توفير نظرة ثاقبة للمساهمات الفردية لكل نوع من الخلايا في عملية بيولوجية. قدم العمل الرائد باستخدام هذه التقنية مشهدا لأنواع الخلايا الموجودة في الأمعاء البشريةالأصلية 4،5،6. تسمح منصات التنميط النسخي أحادي الخلية باستكشاف المشهد النسخي للخلايا الفردية ، مما يسمح لعدم تجانس الخلية بالظهور في طليعة الاستكشاف العلمي. في بعض منصات التنميط النسخي أحادي الخلية ، يتم استخدام تقسيم الموائع الدقيقة والتشفير الشريطي لإنشاء مكتبات cDNA من mRNAs الخلوية متعددة الأدينيل التي تم الحصول عليها من ما يصل إلى 10000 خلية لكل عينة. على هذه المنصة ، تشكل القطرات التي تحتوي على خلايا مفردة ، وقليل النيوكليوتيدات المشفر ، وكواشف النسخ العكسي ، والزيت حويصلة تفاعل ينتج عنها جميع cDNAs من خلية واحدة لها نفس الرمز الشريطي. يمكن بعد ذلك تسلسل cDNAs المشفرة بكفاءة باستخدام تسلسل الجيل التالي. يمكن التعامل مع البيانات التي تم إنشاؤها من خلال البرامج وأدوات التصور ، والتي تحول التسلسلات المشفرة إلى خرائط تصور وملفات تعريف نسخ خلية واحدة. يمكن تحديد مجموعات الخلايا باستخدام قواعد البيانات المتاحة للجمهور لظهارة الأمعاء الدقيقةالبشرية 4،5،6. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت هذه المنصة لاستجواب عضويات الأمعاء في الفئران على مستوى الخلية المفردة ، إلا أن تحليل استجابات النسخ أحادية الخلية ل HIOs قد تخلف عن7،8،9،10،11،12.

هنا ، نقدم دليلا تفصيليا لعزل الخلايا القابلة للحياة من HIOs المعوية الدقيقة للمعالجة على منصات التنميط النسخي أحادي الخلية (الشكل 1). نحن نقدم إرشادات الثقافة والتمايز جنبا إلى جنب مع مكونات الوسائط التي تم تحسينها للتمايز الظهاري. نحدد طرق استعادة الخلايا لثلاثة تنسيقات مختلفة للثقافة: الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) وأحادية الطبقة إما على البلاستيك أو على إدراج ثقافة الخلايا الغشائية. نحن نقدم عينات من بيانات التجميع التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج مفتوح المصدر لاشتقاق الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في كل مجموعة.

البروتوكول

تم الحصول على الخطوط العضوية المستخدمة هنا من مركز أمراض الجهاز الهضمي في مركز تكساس الطبي GEMS Core. باختصار ، لإنشاء خطوط عضوية في البداية ، تم غسل عينات الأنسجة المانحة وهضمها إنزيميا لتحرير الخبايا المعوية. تم تضمين الخبايا في غشاء قاعدي واستزراعها في وسط. وافق مجلس المراجعة المؤسسية في كلية بايلور للطب على بروتوكول الدراسة للحصول على عينات الأنسجة التي تم إنشاء خطوط عضوية منها ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المتبرعين لإنشاء خطوط عضوية من الأنسجة المتبرع بها.

1. تمرير HIOs 3D لتوسيع التمايز

  1. قم بإزالة وتجاهل الوسط من آبار المواد العضوية المزروعة في 24 لوحة بئر (حول الغشاء القاعدي الصلب) باستخدام ماصة P1000. أضف 300 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA إلى البئر وقم بتفتيت المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق السحب باستخدام ماصة P1000 لأعلى ولأسفل 5x.
  2. احتضان الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. أضف 500 ميكرولتر من الوسائط الكاملة بدون عوامل نمو (CMGF- متوسط) مع 10٪ FBS لكل بئر (الجدول 1). استخدم ماصة P1000 وماصة CMGF متوسطة وخليط HIO ، 10x ذهابا وإيابا في البئر. انقل الحجم بالكامل إلى أنبوب سعة 15 مل. اجمع بين المرور من آبار متعددة في نفس الأنبوب سعة 15 مل. لا تجمع بين أكثر من 10 آبار لكل أنبوب.
  3. قم بتدوير الخلايا عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. إزالة كل الوسط ، والحفاظ على بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. الحفاظ على الأنبوب على الجليد.
  4. احسب كمية الغشاء القاعدي اللازمة لعدد مطلي HIO ، وأعد تعليق حبيبات HIO في 30 ميكرولتر / بئر من الغشاء القاعدي باستخدام أطراف ماصة P200 الباردة. ماصة خليط الغشاء القاعدي HIO كقطرة في وسط صفيحة 24 بئرا باستخدام أطراف ماصة P200 الباردة.
  5. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية. دع الغشاء القاعدي يتجمد لمدة 5-10 دقائق ، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط درجة حرارة الغرفة الكامل الذي يحتوي على مثبط WNT و R-spondin و noggin و EGF و ROCK (WRNE + Y ؛ الجدول 1) لكل بئر وثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية. قم بتحديث الثقافة باستخدام WRNE + Y كل يوم لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: سيكون HIO الصحي كيسي الشكل مع ظهارة ناشئة لامعة (الشكل 2). لا يمكن تصور الخلايا الموجودة في منتصف الكيس. سيبدو HIO غير الصحي باهتا وله ظهارة سميكة ذات وسط صلب. السمة الأكثر أهمية هي المظهر اللامع.

2. التمايز هيو: تنسيق 3D

  1. استخدم بئرا واحدا من HIOs ثلاثي الأبعاد ل 3 آبار من HIOs المتمايزة ثلاثية الأبعاد بعد أسبوع من الزراعة.
  2. إزالة الوسائط من الآبار. قم بتفريق الغشاء القاعدي و HIOs باستخدام ماصة P1000 وإضافة 500 ميكرولتر باردة من CMGF- لكل بئر وماصة لأعلى ولأسفل على الأقل 5x. قم بتدوير HIOs عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي دوار متأرجح عند 100 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة كل الوسط مع إبقاء الحبيبات في قاع الأنبوب.
  3. أضف 30 ميكرولتر من الغشاء القاعدي لكل بئر من HIOs المطلية. ماصة قطرة 30 ميكرولتر من الغشاء القاعدي مع HIOs في بئر من لوحة 24 بئر. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 500 ميكرولتر من وسائط WRNE + Y / Diff (50/50).
  4. قم بتبديل الوسيط إلى وسيط التمايز بعد 24 ساعة لمدة 3 أيام إضافية ، مع تحديث الوسيط كل يوم. قم بإعداد 3 آبار لكل عينة للتجميع لتقليل التباين الفني.

3. تمايز HIO: تنسيق أحادي الطبقة

  1. قم بتغطية حشوات زراعة الخلايا الغشائية أو آبار صفيحة 96 بئرا مع 100 ميكرولتر / بئر من كولاجين المشيمة البشري IV (1 مجم / مل في حمض الأسيتيك 100mM) المخفف في H2O البارد (1:30). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة أو الحد الأقصى بين عشية وضحاها. لإدراج زراعة الخلايا الغشائية ، أضف H2O المعقم في مساحة اللوحة لترطيب اللوحة ؛ بالنسبة للوحة 96 بئرا ، أضف H2O المعقمة في الآبار غير المستخدمة.
  2. اجمع 3D HIOs المزروعة في WRNE لمدة 7 أيام عن طريق إزالة الوسائط واستعادة الغشاء القاعدي والخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر / بئر بارد 0.5 mM EDTA (0.5 M EDTA مخفف 1: 1000 في PBS معقم). استخدم ماصة P1000 لسحب المواد العضوية والحل لأعلى ولأسفل 5x وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 15 مل. لا تجمع أكثر من 10 آبار من المواد العضوية لكل أنبوب. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم في دوار دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لإعداد 3 آبار على لوحة 96 بئر ، استخدم 1 بئر من HIOs ثلاثية الأبعاد. لتحضير 1 إدراج زراعة خلية غشائية ، استخدم بئرا واحدا من 3D HIOs (كثافة البذر للخلايا المفردة حوالي 1-2 × 105 خلايا / بئر للوحة 96 بئرا ، 2.5-3 × 105 خلايا / بئر لإدراج ثقافة الخلايا الغشائية).
  3. قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسائط ، وترك الحبيبات في قاع الأنبوب. افصل HIOs عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين / 0.5 مللي متر EDTA واحتضانها لمدة 4-5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ماصة بقوة صعودا وهبوطا ل ~ 50x باستخدام P1000. تجنب صنع الفقاعات عن طريق الانزلاق على جانب الأنبوب.
  4. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 1 مل من CMGF - يحتوي على 10٪ FBS. قم بتصفية كتل كبيرة من الخلايا غير المهضومة عن طريق ترطيب مصفاة خلايا 40 ميكرومتر مع 1 مل من CMGF - تحتوي على 10٪ FBS وإضافة الخلايا إلى أعلى مصفاة الخلية. استخدم الجاذبية للسماح للخلايا بالمرور عبر المصفاة وتجاهل مصفاة الخلية التي تحتوي على كتل خلوية.
  5. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة السائل من ملحق زراعة الخلايا الغشائية المغلفة بالكولاجين أو من لوحة 96 بئرا. أعد تعليق حبيبات HIO في 100 ميكرولتر / بئر من WRNE تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 ، ثم ماصة في الجزء العلوي من إدخال زراعة الخلايا الغشائية أو في لوحة 96 بئرا. لإدخال زراعة الخلايا الغشائية ، أضف 600 ميكرولتر من WRNE تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 في الجزء السفلي من البئر.
  7. قم بإزالة الوسط بعد 24 ساعة من كل من الجزء العلوي والسفلي من إدخال زراعة الخلايا الغشائية أو من لوحة 96 بئرا واستبدلها بوسط تمايز لمدة 5 أيام. قم بإعداد 3 آبار لكل عينة للتجميع لتقليل التباين الفني.

4. إعداد معلقات خلية واحدة من HIOs 3D متمايزة لنسخ خلية واحدة

  1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء الهضم ثلاثي الأبعاد HIO. تحقق من HIOs باستخدام مجهر المجال الساطع عند 10x لضمان صحة الخلية.
  2. قم بإزالة الوسائط من الآبار وأضف 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا الباردة إلى الآبار. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لتحرير الخلايا من الغشاء القاعدي باستخدام ماصة P1000 وأطراف ماصة قياسية. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المكررة أعداد كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر. لا تجمع الآبار قبل الخطوة 4.7 أدناه.
  3. احتضان أنابيب الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، ماصة صعودا وهبوطا كل 5 دقائق. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × غرام عند 4 درجات مئوية.
  4. أخرج السائل من الأنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية قبل التسخين. ماصة صعودا وهبوطا مع P1000 على الأقل 10x.
  5. احتضان HIOs لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . كل 10 دقائق ، ماصة الحجم بالكامل 10x باستخدام ماصة P1000 للمساعدة في فصل الخلايا. تجنب إدخال فقاعات الهواء في تعليق الخلية.
  6. حبيبات الخلايا لمدة 3 دقائق عند 400 × غرام عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط التمايز ، وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يجب دائما الاحتفاظ ب HIOs على الجليد.
  7. ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل بسرعة 50x باستخدام P1000 لضمان فصل HIOs إلى خلايا مفردة. احرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في هذه الخطوة ، لأنها ستسبب فقدان الخلايا.
  8. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة P1000. استخدم أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لجمع الشحم.
    ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت الهضم كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت من خلال الفلتر.
  9. كرر الخطوة 4.8 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
  10. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. خفف العينة حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر ، خلايا الحبيبات لمدة 2 دقيقة عند 400 × جم عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة الوسائط الأصلية ، وأعد التعليق في وسائط زراعة الخلايا. ينتج عن هذا البروتوكول عادة 5 × 105-1 × 106 خلايا.
    ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ قابل للتطبيق و 90٪ خلية مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
  11. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي لمنصات التنميط النسخي أحادي الخلية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq13,14.

5. إعداد معلقات خلية واحدة من HIOs متباينة على إدراج ثقافة الخلايا الغشائية

  1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء عملية الهضم في زراعة الخلايا الغشائية HIO. قسم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الذي تم تسخينه مسبقا إلى 200 ميكرولتر من القسامات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، وأنبوب واحد لكل إدراج لثقافة الخلايا الغشائية. احتفظ بالأنابيب في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
  2. قم بإعداد PBS-EDTA بإضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 5 مل من PBS. القسمة 500 ميكرولتر من PBS-EDTA في لوحة 24 بئر ، 1 بئر لكل إدراج ثقافة خلية غشاء.
  3. اغسل الخلايا باستخدام PBS-EDTA: انقل إدخالات زراعة الخلايا الغشائية من الآبار التي تحتوي على وسائط نمو إلى الآبار التي تحتوي على PBS-EDTA. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا من الجانب القمي واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS-EDTA. احرص على عدم إزعاج طبقة الخلية.
  4. تخلص على الفور من PBS-EDTA المضاف إلى الجانب القمي من إدخالات زراعة الخلايا الغشائية. قم بإزالة ملحق زراعة الخلايا الغشائية من البئر ، وامسحه عن طريق لمس الحافة برفق بمنشفة ورقية ، ثم قلبه على سطح الطاولة. استخدم شفرة مشرط حادة لإزالة الغشاء من الملحق عن طريق قطع المحيط الداخلي للغشاء. العمل بسرعة لمنع الجفاف.
  5. استخدم ملقط لنقل الغشاء إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل المسخن مسبقا والمملوء بكاشف هضم الخلايا الأنزيمية وتأكد من غمر الغشاء بالكامل. كرر لجميع حشوات زراعة الخلايا الغشائية الإضافية.
    ملاحظة: زيادة حجم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية إلى 500 ميكرولتر قد يساعد في فصل الطبقات الأحادية الكثيفة.
  6. فصل الخلايا عن طريق احتضان الأنابيب مع الأغشية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 . امزج عن طريق سحب الحجم بالكامل برفق 5 أضعاف مع ماصة 200 ميكرولتر كل 10 دقائق بإجمالي 30 دقيقة. تجنب الفقاعات وشفط الغشاء للحفاظ على صلاحيته.
  7. نقل حصة صغيرة من الخلايا (1-2 ميكرولتر) إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك عن طريق التقييم النوعي لنسبة الخلايا المفردة. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 50 دقيقة مع سحب إضافي لتحقيق 80٪ -90٪ خلايا مفردة ، اعتمادا على نوع HIO. اكشط الغشاء برفق بطرف ماصة أثناء خطوات الخلط لتشجيع التفكك ، خاصة بالنسبة للخلايا التي يصعب فصلها ، ولكن الكشط قد يؤثر على قابلية الحياة.
  8. اجمع بين 3 آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 1.5 مل (إجمالي 600 ميكرولتر). أضف 400 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا (فرق) + 10 ميكرومتر ROCKi (الحجم الإجمالي 1 مل). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
    ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المكررة أعداد كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر. يجب تجميع الآبار في هذه الخطوة.
  9. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. اجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت الهضم كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت على المرور.
  10. كرر الخطوة 5.9 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
  11. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. تمييع العينة حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر, تدور 2 دقيقة عند 400 × غرام عند 4 °C لتكوير الخلايا, إزالة الوسائط الأصلية, وإعادة التعليق في WRNE + Y عند كثافة الخلية المطلوبة. ينتج هذا البروتوكول عادة 4 × 105 - 6 × 105 خلايا.
    ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ خلايا قابلة للحياة و 90٪ خلايا مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
  12. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي لمنصات التنميط النسخي أحادي الخلية وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq13,14.

6. تحضير معلقات أحادية الخلية من HIOs متباينة على أنها 96 بئرا أحادية الطبقة

  1. ضع كاشف هضم الخلايا الأنزيمية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لإذابة الجليد وتسخينه قبل 30 دقيقة من بدء هضم HIO أحادي الطبقة.
  2. قم بإعداد PBS-EDTA بإضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 5 مل من PBS. تخلص من وسائط زراعة الخلايا من لوحة 96 بئرا واستبدلها ب 100 ميكرولتر من PBS-EDTA. احرص على عدم إزعاج طبقة الخلية.
  3. فصل الخلايا: تخلص من PBS-EDTA وأضف 100 ميكرولتر من كاشف هضم الخلايا الأنزيمية الدافئة إلى كل بئر. ضع اللوحة في درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ واخلطها عن طريق سحب الحجم بالكامل برفق 5x بطرف ماصة 200 ميكرولتر كل 10 دقائق لمدة 20-30 دقيقة. تجنب الفقاعات للحفاظ على الجدوى.
    ملاحظة: زيادة حجم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية إلى 500 ميكرولتر قد يساعد في فصل الطبقات الأحادية الكثيفة.
  4. انقل حصة صغيرة من الخلايا (1-2 ميكرولتر) إلى شريحة زجاجية كل 10 دقائق لتقييم التفكك. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 50 دقيقة لتحقيق 80٪ -90٪ خلايا مفردة ، اعتمادا على نوع HIO. اكشط اللوحة برفق بطرف ماصة أثناء خطوات الخلط لتشجيع التفكك ، خاصة بالنسبة للخلايا التي يصعب فصلها ؛ ومع ذلك ، قد يؤثر القشط على الجدوى.
  5. اجمع بين 3 آبار مكررة لكل حالة في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 1.5 مل (إجمالي 300 ميكرولتر). أضف 700 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا (فرق) + 10 ميكرومتر ROCKi (حجم إجمالي 1 مل). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
    ملاحظة: يضمن استخدام الآبار المزروعة المكررة أعدادا كافية من الخلايا ويقلل من التباين من بئر إلى بئر.
  6. قم بتصفية الحجم بالكامل من خلال مصفاة طرف 70 ميكرومتر باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. اجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: لن يتم انسداد طرف المرشح إذا كان وقت هضم كاشف هضم الخلايا الأنزيمية كافيا. استخدم نصائح تصفية متعددة إذا أصبح الفلتر مسدودا ؛ لا تجبر مستوى الصوت على المرور.
  7. كرر الخطوة 6.6 باستخدام مصفاة طرف 40 ميكرومتر. تخزين العينات على الجليد.
  8. عد الخلايا المفردة القابلة للحياة في غرفة عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان أزرق إلى 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. خفف حسب الحاجة إلى 1000 خلية / ميكرولتر. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 1000 خلية / ميكرولتر ، فقم بتدوير 2 دقيقة عند 400 × جم 4 درجة مئوية لتكوير الخلايا وإزالة الوسائط الأصلية وإعادة التعليق في وسائط زراعة الخلايا + ROCKi بكثافة الخلية المطلوبة. ينتج عن هذا البروتوكول عادة 2 × 105 - 6 × 105 خلايا.
    ملاحظة: يعد تحضير معلق عالي الجودة (90٪ خلايا قابلة للحياة و 90٪ خلايا مفردة) أمرا ضروريا للحصول على بيانات أحادية الخلية عالية الجودة. ومع ذلك ، تشير التجربة إلى أنه يمكن قبول قابلية منخفضة تصل إلى 75٪ في الحالات التي يؤثر فيها العلاج ، مثل العدوى أو تطبيق جزيء صغير ، على قابلية البقاء.
  9. قم بإعداد مكتبات الحمض النووي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمنصة التنميط النسخي أحادية الخلية. معالجة البيانات وفقا لبروتوكولات أفضل الممارسات لتحليل بيانات scRNAseq13,14.

النتائج

تم تجميع المعلقات أحادية الخلية من 2-3 آبار من إدخال زراعة الخلايا الغشائية ، والطبقة الأحادية ، و HIOs ثلاثية الأبعاد لضمان إنتاجية كافية للخلايا وتقليل التباين من بئر إلى بئر. تم إعداد مكتبات الخلية المفردة باستخدام كواشف خاصة بمنصة التنميط النسخي أحادي الخلية. وتسلسلها مع قراءات نهاية مقترنة على منصة تسلسل من الجيل التالي ، 30000 قراءة / خلية. تم تعيين القراءات وعدها وتحليلها باستخدام أدوات تحليلية لعلم جينوم الخلية الواحدة. تم استبعاد الخلايا منخفضة الجودة مع قراءة أكثر من 20٪ من الميتوكوندريا ، أو أقل من 200 جين محسوب من التحليل. لتقييم جودة الخلايا ، قمنا برسم عدد الجينات ، و UMIs ، والنسبة المئوية لقراءات الميتوكوندريا لكل خلية (الشكل 3) ؛ تحتوي الخلايا عالية الجودة على ما يقرب من 3500 جين و 15000 UMIs و 10٪ من قراءات الميتوكوندريا. بعد التصفية ، حصلنا على 4000 إلى 9500 خلية مفردة اعتمادا على تنسيق نمو HIO. حدد التجميع غير الخاضع للإشراف وتقليل أبعاد UMAP مجموعات متميزة تمثل أنواع الخلايا المتوقعة ، بما في ذلك الخلايا المعوية الامتصاصية والخلايا الإفرازية (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 1: الخطوط العريضة لخطوات البروتوكول. المخططات التي تحدد الخطوات الرئيسية في طلاء HIOs بتنسيقات مختلفة لسير عمل بيانات الخلية الواحدة. تم إنشاء هذه الصورة باستخدام Biorender. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صور المجال الساطع. تم تصوير HIOs الجاهزة للمعالجة باستخدام مجهر المجال الساطع عند تكبير 5X. اليسار ، 3D العضوية. لوحة متوسطة ، 96 بئر ؛ صحيح ، ترانسويل. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: مراقبة جودة البيانات. مثال على مقاييس الخلايا المفردة التي تم تحليلها والمعزولة من HIOs الصائمية المزروعة كطبقة أحادية على 96 لوحة بئر. تظهر مخططات الكمان عدد الجينات (nFeature_RNA) ، و UMIs (nCount_RNA) ، والنسبة المئوية لقراءات الميتوكوندريا (percent.mt) لكل خلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: UMAPs للخلايا المفردة التي تم تحليلها. (أ) تم عزل ما مجموعه 9952 خلية مفردة من HIOs الصائمية المتمايزة المزروعة في 96 صفيحة بئر. (ب) تم عزل ما مجموعه 5623 خلية مفردة من HIOs الصائمية المتمايزة المزروعة على حشوات زراعة الخلايا الغشائية. (ج) تم عزل ما مجموعه 4402 خلية مفردة من HIOs اللفائفي 3D المتمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

متوسط نمو WRNEوسط التمايز
مكونحجمالتركيز النهائيوسط WRNE بدون وسط مكيف L-WRN ، نيكوتيناميد و SB202190
* Y-27632 (5 مللي مول) اختياري200 ميكرولتر10 ميكرومتر
A 83-01 (500 ميكرومتر)100 ميكرولتر500 نيوتن متر
DMEM/F12 المتقدم45 مل
ب 272 مل
EGF (50 ميكروغرام / مل)100 ميكرولتر50 نانوغرام / مل
غاسترين (10 ميكرومتر)100 ميكرولتر10 نانومتر
جلوتاماكس (100X)1 مل
هيبس 1 م1 مل
L-WRN Con- وسائل الإعلام50 مل~ 50٪
ن21 مل
إن-أسيتيل سيستئين (500 مللي مول)100 ميكرولتر500 ميكرومتر
نيكوتيناميد 1 م1 مل10 مللي متر
SB202190 (10 مللي مول)100 ميكرولتر10 ميكرومتر
الحجم الكلي100 مل
CMGF- متوسط
DMEM/F12 المتقدم500 مل
جلوتاماكس5 مل100 مرة
1 م هيبس5 مل

الجدول 1: تكوين الوسائط المختلفة المستخدمة.

المناقشة

باستخدام منصات الجينوم أحادية الخلية ، يمكن تقسيم الأنظمة البيولوجية المعقدة ، مثل ثقافات HIO المشتقة من الأنسجة التي تشكل ظهارة الأمعاء ، للحصول على مساهمات خلوية فردية في الاستجابة البيولوجية الشاملة4،5،6. يمكن أيضا تحديد عدم التجانس الخلوي ومجموعات الخلايا النادرة واستجوابها. يجب تحسين الإدخال الخلوي لزيادة الإخراج إلى أقصى حد باستخدام الأنظمة الأساسية القائمة على النسخ أحادي الخلية. هنا نصف البروتوكولات التي ستنتج معلقات خلية واحدة قابلة للتطبيق للغاية وذات نوعية جيدة والتي ستزيد من احتمالية الحصول على بيانات نسخية عالية الجودة. الإلمام بالبروتوكول له أهمية قصوى ، ويوصى بإجراء العديد من التدريبات قبل الشروع في إعداد المكتبة. يقترح تحقيق قابل للتكرار لمعلقات خلية واحدة قابلة للحياة قبل استخدام الخلايا لإعداد المكتبة. إن السرعة التي يتم بها تنفيذ البروتوكول لها أهمية قصوى لأن السرعة تتناسب طرديا مع نتائج الجدوى. بناء على ذلك ، ينصح بتحديد عدد العينات التي يتم التعامل معها في وقت واحد. يوصى بالتواصل مع الكيان الذي سيعد المكتبات قبل بدء هذه البروتوكولات للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

تؤثر جدوى HIO بشكل مباشر على مكتبة الحمض النووي المرسلة للتسلسل. تعتمد صلاحية الخلية ل HIO على عدة خطوات في إعداد تعليق الخلية الواحدة ، بما في ذلك التفكك ، والطرد المركزي ، والمخازن المؤقتة ، والسحب ، ودقة العد. الهدف من إعداد HIOs للمنصة هو تحقيق التوازن بين الحفاظ على صلاحية الخلية وجودة العينة. من الأهمية بمكان للحصول على بيانات عالية الجودة تقليل المجاميع الخلوية والخلايا الميتة والأحماض النووية غير الخلوية ومثبطات الكيمياء الحيوية للنسخ العكسي. تزيد الخلايا الميتة من ضوضاء الحمض النووي وتساهم في تكتل الخلايا ، مما يؤدي إلى فشل البيانات والنظام الأساسي7،8،9،10،11،12. يمكن أن تساعد التصفية بحجم مرشح مناسب في إزالة التجميعات الكبيرة وتحسين جودة البيانات.

يجب مراعاة عدة عوامل لتقليل موت خلايا HIO عند تحضير معلقات الخلية المفردة. من الضروري الحصول على 80٪ على الأقل من الخلايا القابلة للحياة ، كما أن قابلية بقاء > 90٪ أمر مرغوب فيه أكثر. يمكن تحسين العينات التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام استراتيجيات لإزالة الخلايا الميتة ، مثل الميكروبيدات القائمة على العمود ، على الرغم من أن هذه تتطلب المزيد من الخلايا الأولية وأحجام عينات أكبر بسبب الفقد أثناء المناولة. HIOs حساسة بشكل خاص للمخازن المؤقتة وستخضع لموت الخلايا إذا تركت لفترة طويلة في RT في بعض المخازن المؤقتة. ينتج عن الوسائط العضوية أقل قدر من فقدان الخلايا وتكوين التجميع. يمكن أن يؤثر السحب أيضا على صلاحية HIO أثناء التفكك. يمكن لأطراف التجويف العادية قص المواد العضوية ، مما يساعد على الانفصال إلى معلقات أحادية الخلية ؛ ومع ذلك ، فإن السحب بسرعة كبيرة باستخدام طرف التجويف العادي يمكن أن يتسبب في تلف خلايا HIO من قوى القص. يقلل السحب البطيء مع أطراف التجويف العريضة من الضغط على خلايا HIO ويحسن بشكل كبير أعداد الخلايا القابلة للحياة في اتجاه مجرى النهر. يعد الطرد المركزي والغسيل والتعليق من العوامل الأخرى التي يمكن أن تؤثر على جودة معلقات الخلايا المفردة HIO. ينتج عن الطرد المركزي للدلو المتأرجح تكوير ألطف لخلايا HIO ، مما يؤدي إلى انخفاض أعداد الخلايا الميتة مع تقليل فقد الخلايا. أخيرا ، تعد دقة العد لتحديد التركيز ضرورية لضمان وصول أكبر عدد ممكن من الخلايا إلى النظام الأساسي لتوليف المكتبة. سيؤدي الاهتمام بهذه التفاصيل إلى تقليل الضغط على خلايا HIO أثناء عملية العزل وضمان أعلى احتمال لعودة البيانات بعد المعالجة.

على الرغم من أن النسخ أحادي الخلية هو أداة قوية لتشريح الملامح البيولوجية والاستجابات على مستوى الخليةالواحدة 4،5،6 ، إلا أن هناك العديد من القيود التي يجب مراعاتها عند تطبيق التكنولوجيا لتحليل الثقافات العضوية المعوية البشرية. أولا ، يمكن أن يكون هناك تباين كبير في النسخ بسبب التباين الفني الذي تم إدخاله أثناء إعداد المكتبة وتسلسلها أو بسبب تأثيرات الدفعات الناتجة عن إعداد العينة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التسلسل إلى تحيز التغطية حيث يوجد عمق تسلسل غير متساو عبر الجينات أو الخلايا. هذا يسبب تحديات عند اكتشاف الجينات المعبر عنها بشكل منخفض أو تحديد مجموعات الخلايا النادرة. ثانيا ، قد يكون تحديد أنواع الخلايا أمرا صعبا بسبب عدم التجانس الخلوي والنسخي للثقافات العضوية والمظهر الخلوي الأقل تمايزا عند مقارنته بظهارة الأمعاء الأصلية. يعد اقتران استجابات النسخ بالأنماط الظاهرية الوظيفية تحديا أيضا ويتطلب التحقق الإضافي باستخدام مناهج أو فحوصات أخرى. ثالثا ، لا يشمل هذا النهج النظر في السياق المكاني أو الديناميات الزمنية للخلايا. يزيل إجراء التفكك القدرة على استنتاج تفاعلات الخلايا والخلايا من بيانات النسخ. إنه يوفر لقطة واحدة فقط في وقت الحالة الخلوية بدلا من سلسلة بيولوجية. أخيرا ، يمكن أن تكون مناهج النسخ أحادية الخلية مكلفة وتتطلب أدوات حسابية متخصصة وخبرة في المعلوماتية الحيوية. ومع ذلك ، لا يزال هذا النهج أداة مهيمنة على أحدث طراز لفهم عدم التجانس الخلوي وتحديد أنواع الخلايا الجديدة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بمنح U19 AI157984 و U01 DK103168 و U19 AI144297 و P30 DK56338 و P01 AI057788 و U19 AI116497 وإشعار اتفاقية ناسا التعاونية / TRISH NNX16AO69A.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
[Leu15] -Gastrin ISigma-AldrichG914510 نانومتر
0.05٪ Trypsin-EDTAInvitrogen25300054
0.4٪ تريبان أزرقMillipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 مم TranswellCostar3412
24 بئر Nunclon دلتا طبق ثقافة الأنسجة السطحيةThermo Scientific142475
40 & micro ؛ مصفاة الخلايا mFalcon352340
40 & micro; مصفاة طرف m FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 & micro; مصفاة طرف m FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 لوحة بئرCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM / F12Invitrogen12634-028
B27 supplementInvitrogen17504-0441X
الكروم التالي GEM خلية واحدة 3 ' GEM ، المكتبة و جل حبة كيت v3.110x الجينومPN-1000128
الكولاجين الرابعسيجما ألدريتشC5533-5MG33 & مايكرو ؛ جم / مل
حل استعادة خلايا كورنينج   ؛VWR354253
DPBS (Mg2- ، Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 ملي مولار
هيبس 1 مإنفيتروجين15630-08010 ملي متر
L-WRN وسائط مكيفةATCCCRL-3276
Matrigel ، GFR ، خالية من الفينولCorning356231
mouse المؤتلف EGFInvitrogenPMG804350 نانوغرام / مل
N2 الملحقInvitrogen17502-0481X
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165-5G500 & micro ؛ M
نيكوتيناميدسيجما ألدريتشN063610 ملم
SB202190سيجما ألدريتشS706710 & مايكرو ؛ M
TranswellCorning3413
Y27632تقنيات الخلايا الجذعية7230810 & micro; م

المراجع

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة