مقالة منهجية

تقنية عزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك الجرذ

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

مايو 31, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الجذعية الوسيطة من نخاع عظم الفك لها وظائف مهمة في التمايز المتنوع والتجديد الذاتي والتعديل المناعي. لقد برزت كمستودع حاسم للخلايا السليفة في العلاج الجيني وهندسة الأنسجة والطب التجديدي. هنا ، نقدم طريقة فريدة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك في الفئران.

الملخص

الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMMSCs) هي نوع من الخلايا الجذعية ذات إمكانية التمايز متعدد الاتجاهات. بالمقارنة مع BMMSCs المشتقة من عظام الزائدة الدودية ، فإن BMMSCs المشتقة من الفك لديها قدرة أكبر على التكاثرية والتمايز العظمي ، وتصبح تدريجيا خلايا بذور مهمة لإصلاح عيوب الفك. ومع ذلك ، فإن الفك السفلي له بنية عظمية معقدة ومحتوى أقل إلغاء من عظام الزائدة الدودية. من الصعب الحصول على عدد كبير من الخلايا الجذعية الوسيطة للنخاع المشتقة من الفك باستخدام الطرق التقليدية. تقدم هذه الدراسة "نهجا متخصصا في الجذعية" لعزل وزراعة الخلايا الجذعية المتوسطة لنخاع عظم فك الفئران (JBMMSCs). تم عزل وزراعة JBMMSCs للفئران الأولية باستخدام طريقة التصاق نخاع العظم بالكامل جنبا إلى جنب مع طريقة هضم شريحة العظام. تم تحديد الخلايا المعزولة على أنها JBMMSCs من خلال مراقبة مورفولوجيا الخلية ، والكشف عن علامات سطح الخلية ، وتحريض التمايز متعدد الاتجاهات. تظهر الخلايا المستخرجة بهذه الطريقة شكل مغزل "يشبه الخلايا الليفية". الخلايا طويلة ، على شكل مغزل وتشبه الخلايا الليفية. يظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن هذه الخلايا موجبة ل CD29 و CD44 و CD90 ولكنها سلبية ل CD11b / c و CD34 و CD45 ، والتي تتوافق مع خصائص BMMSCs. تظهر الخلايا قدرة تكاثر قوية ويمكن أن تخضع لتمايز عظمي المنشأ ، ودهني المنشأ ، و غضروفي المولد. توفر هذه الدراسة طريقة فعالة ومستقرة للحصول على ما يكفي من JBMMSCs عالية الجودة مع قدرة تمايز قوية في وقت قصير ، مما قد يسهل إجراء مزيد من الدراسات لاستكشاف الوظيفة البيولوجية والطب التجديدي والتطبيقات السريرية ذات الصلة.

المقدمة

تم اكتشاف الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) لأول مرة في نخاع العظام ، والتي أظهرت القدرة على تكوين مستعمرات لاصقة في الثقافة وإمكانات عظمية قوية1. وجد Pittinger et al.2 كذلك إمكانية التمايز متعدد الاتجاهات نحو العظام والدهون والغضاريف. على الرغم من أن جميع الخلايا الجذعية الوسيطة من مصادر مختلفة لديها القدرة على التمايز متعدد الاتجاهات ، إلا أن الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم لديها أقوى إمكانات تمايز غضروفية مقارنة بالخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الأنسجة الأخرى ، مما يجعلها تعتبر أفضل الخلايا المرشحة لهندسة أنسجة العظام3. ومع ذلك ، فقد أثبتت العديد من الدراسات أن BMMSCs من أصول مختلفة تقدم خصائص وخصائص خاصة بالموقع مثل القدرة على التمايز العظمي والنشاط التكاثري الخلوي 4,5. قد يكون هذا بسبب طبقات جرثومية مختلفة بين الفك والعظام الطرفية أو قمة الحرقفي6.

تنشأ الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك (JBMMSCs) من خلايا القمة العصبية للأديم الظاهر العصبي ، بينما تنشأ BMMSCs المشتقة من عظم الفخذ من الأديم المتوسط7. بالمقارنة مع BMMSCs المشتقة من العظام الطويلة والقمة الحرقفية ، فإن JBMMSCs لديها معدل انتشار أعلى ، ونشاط ALP ، وإمكانات عظمية8. إلى جانب ذلك ، قد يختلف تأثير تطبيق BMMSCs في الأنسجة والأعضاء اعتمادا على أنواع الخلايا والبيئاتالمختلفة 9. يعتمد إصلاح عيوب الفك بشكل أساسي على تجنيد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الفك. لذلك ، يمكن أن توفر دراسة JBMMSCs أساسا تجريبيا لتطبيقه السريري في هندسة أنسجة عظام الفك10. ومع ذلك ، تركز الأبحاث الأساسية والتطبيقات السريرية بشكل أساسي على BMMSCs المشتقة من العظام الطرفية والمحورية11. البحث عن JBMMSCs محدود ، وقد يكون هذا بسبب انخفاض محتوى العظم الملغي في الفك السفلي وحقيقة أن فكي الفئران يحتوي على محتوى عظمي أقلإلغاء 12. لذلك ، من الصعب فصل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من عظم الفك باستخدام طريقة تنظيف نخاع العظم العادية ، والتي تستخدم عادة في عزل BMMSCs عن عظام الزائدة أو قمة الحرقفي13. استنادا إلى طرق Hong et al.14 و Cheng et al.15 ، افترضنا أن الجمع بين هضم العظام الكثيف وطريقة تنظيف نخاع العظم يمكن أن يعزل JBMMSCs الفئران بكفاءة.

تهدف هذه الدراسة إلى إنشاء طريقة فعالة لعزل JBMMSCs للفئران وتوفير مصادر خلايا البذور الكافية لهندسة أنسجة عظام الفك.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة أخلاقيات المؤسسية التابعة لمستشفى جيش التحرير الشعبي الصيني العام. تم استخدام ذكور فئران Wistar البالغة من العمر ثلاثة عشر أسبوعا في التجربة. يتم سرد تفاصيل والكواشف والمعدات في جدول المواد.

1. التحضير التجريبي

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، بما في ذلك مقص العيون والملاقط وعظام العظام ، في درجة حرارة وضغط مرتفعين.
  2. إعداد الإعلام الثقافي مقدما.
    1. تحضير وسط كامل α-MEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
    2. تحضير 0.1 ٪ كولاجيناز من النوع الثاني في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    3. تحضير 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 1٪ بنسلين-ستربتومايسين في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل يمكن التخلص منه.

2. عزل وزراعة الفئران JBMMSCs

  1. اعزل الفك السفلي للفأر باتباع الخطوات التالية:
    ملاحظة: للحفاظ على عقم العينة ، يجب تطهير جميع الأدوات الجراحية المعدنية في درجة حرارة عالية على لهب مصباح الكحول لمدة ثلاث ثوان على الأقل قبل الاستخدام.
    1. تخدير الجرذ ب 2٪ بنتوباربيتال الصوديوم (2 مل / كجم) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
    2. التضحية بالجرذ المخدر عن طريق خلع الفقرات العنقية (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا) بعد انخفاض معدل التنفس واسترخاء العضلات تماما.
    3. اغمر الجرذ في 75٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة لتطهيره ثم نقله إلى طاولة فائقة التنظيف.
    4. ضع الجرذ على قطعة قماش معقمة يمكن التخلص منها أو في وعاء معقم واحتفظ بها في وضع ضعيف.
    5. قطع وفصل الجلد والعضلات من أنغولا أوريس إلى المفصل على طول الراموس ، ثم فصل اللقمة عن الحفرة الحقانية عن طريق قطع قرص المفصل الصدغي الفكي والأربطة المحيطية الثنائية أفقيا بمقص العيون.
      ملاحظة: تحديد موضع المفصل الصدغي الفكي عن طريق تحريك الفك السفلي ومراقبة موضع اللقمة خارجيا.
    6. قطع وفصل العضلات والأنسجة الضامة للفك السفلي الجانبي باستخدام مقص من الأخدود الدهليزي على الجانب الشدقي من القواطع السفلية إلى الجانبين الأيسر والأيمن.
    7. شق العضلات اللسانية للفك السفلي من اللجام اللساني إلى المنطقة الخلفية من الفك السفلي.
    8. إزالة الفك السفلي من الجمجمة.
    9. قسم الفك السفلي إلى نصفين عن طريق قطع الارتفاق بين القواطع السفلية بمقص العيون.
    10. قم بإزالة العضلات المتبقية واللفافة والأنسجة الرخوة الأخرى على الفك السفلي بعناية باستخدام مقص العيون والملقط.
  2. عزل JBMMSCs.
    1. ضع منقار rongeur عند تقاطع القواطع والجزء المتوسط من الضرس الأول ، واقطع الاتصال بين القواطع السفلية والفك السفلي مع rongeur ، واستخرج القواطع السفلية تماما.
    2. إزالة جميع الأضراس مع rongeur العظام.
    3. إزالة راموس الفك السفلي مع rongeur العظام وفضح تجويف النخاع عن طريق فصل الجزء المركزي من الفك السفلي على طول الحافة البعيدة من الضرس الأخير16.
    4. مص α-MEM وسط كامل مع حقنة معقمة 1 مل يمكن التخلص منها. أدخل الإبرة في تجويف نخاع العظم واغسل نخاع العظم بشكل متكرر في طبق المزرعة باستخدام α-MEM بوسط كامل حتى يتحول العظم إلى اللون الأبيض.
    5. اجمع محلول تنظيف نخاع العظم في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وطرده مركزيا عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق الخلايا ب 10 مل من الوسط الكامل α-MEM ، وقم بوضعها في طبق استزراع جديد 10 سم.
    7. قسم الفك السفلي المتدفق إلى شرائح عظمية 1-3 مم³ مع رونجور واهضمها ب 3 مل من كولاجيناز من النوع الثاني 0.1٪ لمدة 90 دقيقة في شاكر 200 دورة في الدقيقة / دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    8. أجهزة الطرد المركزي الفك السفلي المهضومة عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
    9. استزرع الخلايا المحصودة وشرائح العظام المهضومة بوسط كامل α-MEM عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ CO2 .
    10. قم بتغيير نصف وسط الاستزراع بوسط جديد بعد 72 ساعة ثم قم بتغييره تماما كل يومين.
      ملاحظة: لا تحرك طبق الاستزراع في الأيام الثلاثة الأولى.
    11. مرور الخلايا الملتصقة بنسبة 1: 2 عندما تصل إلى التقاء 80٪ -90٪. إزالة شرائح العظام خلال الثقافة الفرعية الثانية. استخدم خلايا أجيال P2 أو P3 لإجراء التجارب.

3. قياس التدفق الخلوي لتحديد علامات سطح الخلية

  1. إعادة تعليق JBMMSCs من جيل P2 في المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا آلي واضبط التركيز على 3 × 106 خلايا / مل.
  2. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلية و 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (CD11b / c و CD29 و CD34 و CD44 و CD45 و CD90) إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية17،18.
  3. اغسل العينة مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من محلول قياس التدفق الخلوي وطردها مركزيا لمدة 5 دقائق عند 250 × جم في درجة حرارة الغرفة. إزالة الطاف.
  4. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي و 2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي الفلوري المسمى PE لكل أنبوب. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. كرر الخطوة 3.3.
  6. إعادة تعليق JBMMSCs في 300-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي لكل أنبوب.
  7. إجراء تحليل التدفق الخلوي باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: استخدم الأجسام المضادة المتماثلة كعناصر تحكم سلبية للقضاء على تلطيخ الخلفية الناجم عن مجموعة غير محددة من الأجسام المضادة.

4. تحديد تكاثر الخلايا

  1. بذرة JBMMSCs من جيل P3 في صفيحة 96 بئرا بكثافة 5 × 103 خلايا لكل بئر.
  2. أضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر.
  3. ضع لوحة 96 بئرا في الحاضنة لمدة 2 ساعة وقم بقياس الامتصاص (قيمة OD عند 450 نانومتر) باستخدام قارئ microplate.
    ملاحظة: قم بإجراء الاختبار في نفس الوقت كل يوم لمدة سبعة أيام متتالية.

5. القدرة على تشكيل مستعمرة

  1. بذرة 1000 JBMMSCs من الممر 3 إلى 10 سم أطباق الاستزراع والثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. قم بتغيير وسط الثقافة كل 3 أيام.
  3. أداء تلطيخ البنفسجي الكريستال بعد زراعة مستمرة لمدة 15 يوما.
  4. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا بالميثانول لمدة 5 دقائق وصمة عار بنسبة 2٪ من البنفسج البلوري لمدة 5 دقائق.

6. التمايز متعدد السلالات ل JBMMSCs

ملاحظة: استخدم JBMMSCs من جيل P3 للتمايز متعدد السلالات. تم استزراع المجموعة الضابطة باستخدام وسيط كامل α-MEM.

  1. أداء التمايز العظمي.
    1. تلقيح 1 × 105 JBMMSCs لكل بئر في لوحة من ستة آبار.
    2. عندما يصل التقاء الخلية إلى 70٪ ، قم بتغيير الوسط إلى وسط تحريض العظم.
      ملاحظة: قم بتغيير وسط الحث العظمي كل 3 أيام.
    3. أداء تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (ALP) بعد 7 أيام من تحريض العظم.
    4. قم بإزالة الوسط من لوحة الآبار الستة ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. تلطيخ الخلايا بمحلول تلطيخ ALP في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وحمايتها من الضوء.
    6. شطف الخلايا حتى لا يبقى محلول تلطيخ ، ومراقبة العينات تحت المجهر.
    7. أداء تلطيخ أحمر Alizarin بعد 21 يوما من تحريض العظم.
    8. تلطيخ الخلايا بمحلول تلطيخ أحمر Alizarin لمدة 5 دقائق بعد تثبيت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة.
    9. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني حتى لا يبقى محلول تلطيخ أحمر أليزارين.
    10. مراقبة عدد عقيدات الكالسيوم تحت المجهر.
  2. أداء التمايز adipogenic.
    1. تلقيح 1 × 105 JBMMSCs لكل بئر في لوحة من ستة آبار.
    2. عندما يصل التقاء الخلية إلى 70٪ ، قم بتغيير الوسط إلى وسط الحث الشحمي.
      ملاحظة: قم بتغيير وسط الحث الشحمي كل ثلاثة أيام.
    3. أداء تلطيخ الزيت الأحمر O بعد 14 يوما من الحث الشحمي.
    4. قم بإزالة الوسط من لوحة الآبار الستة ، وقم بتثبيت الخلايا بمحلول تثبيت Oil red O لمدة 20-30 دقيقة ، ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. قم بإزالة محلول التثبيت وغسل الخلايا بالماء المقطر مرتين.
    6. تزج الخلايا في 60 ٪ الأيزوبروبانول لمدة 20-30 ثانية.
    7. إزالة 60 ٪ من الأيزوبروبانول وصمة عار الخلايا مع تلطيخ الزيت الأحمر O لمدة 20-30 دقيقة.
    8. قم بإزالة محلول التلوين ، وشطف الخلايا بنسبة 60 ٪ من الأيزوبروبانول لمدة 20-30 ثانية ، ثم غسلها بالماء المقطر.
    9. وصمة عار النواة بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 1-2 دقيقة.
    10. إزالة محلول الهيماتوكسيلين وغسل الخلايا 2-3 مرات بالماء المقطر. أضف المخزن المؤقت للزيت الأحمر لمدة 1 دقيقة وقم بإزالته.
    11. مراقبة عدد قطرات الدهون تحت المجهر.
  3. أداء التمايز الغضروفية.
    1. تلقيح 1 × 105 JBMMSCs لكل بئر في لوحة من ستة آبار.
    2. عندما يصل التقاء الخلية إلى 70٪ ، قم بتغيير الوسط إلى وسط تحريض غضروفي.
      ملاحظة: قم بتغيير وسط الحث الغضروفي كل 3 أيام.
    3. أداء تلطيخ الأزرق Alcian بعد 21 يوما من الحث الغضروفي.
    4. قم بإزالة الوسط من لوحة الآبار الستة ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    5. تلطيخ الخلايا بتلطيخ أزرق ألسيان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. شطف الخلايا حتى لا يبقى حل تلطيخ ، ومراقبتها تحت المجهر.

7. PCR في الوقت الحقيقي

  1. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي وقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام علامة إنزيم (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  2. توليف cDNA باستخدام 500 نانوغرام من الحمض النوويالريبي 19.
  3. قم بإجراء qRT-PCR على نظام في الوقت الفعلي مع 10 ميكرولتر من مزيج qRT-PCR يحتوي على 1 ميكرولتر من cDNA ، و 3.5 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج ، و 5 ميكرولتر من SYBR ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي (0.1 ميكرومتر).
    ملاحظة: يتم سرد تسلسلات التمهيدي في الجدول 1. ظروف الدورة الحرارية هي كما يلي: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، ثم زيادات 0.5 درجة مئوية لمدة 5 ثوان من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لمنحنى الذوبان.
  4. استخدم GAPDH كرقابة داخلية16.

النتائج

بعد 72 ساعة من التلقيح الخلوي ، تم تعليق معظم الخلايا ومستديرة الشكل ، مع التصاق عدد قليل جدا بالجدار (الشكل 1 ب). بحلول اليوم الخامس ، ظهرت مستعمرات الخلايا الملتصقة ، وأظهرت مغازل أو أشكالا تشبه الخلايا الليفية (الشكل 1C). بحلول اليوم السابع ، وصلت الخلايا الملتصقة إلى التقاء 90٪ ، وشكلت شكل "مدرسة الأسماك" مع عدد صغير من الخلايا العالقة المتقطعة (الشكل 1 د). نمت الخلايا المارة بسرعة وتم تمريرها كل 3 أيام. كان مورفولوجيا الخلية متجانسة نسبيا ، على شكل مغزل في الغالب ، ومرتبة في نمط يشبه الدوامة بعد الالتقاء (الشكل 1E-G).

كشف تحليل قياس التدفق الخلوي عن مستويات تعبير عالية لعلامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة CD90 و CD29 و CD44 ، بمعدلات إيجابية تبلغ 97.2٪ و 97.7٪ و 95.7٪ على التوالي. على العكس من ذلك ، أظهرت علامات سطح الخلايا الجذعية المكونة للدم CD45 و CD34 و CD11b / c تعبيرا منخفضا ، بمعدلات إيجابية بلغت 1.37٪ و 0.66٪ و 1.49٪ على التوالي (الشكل 2 أ). بعد أسبوعين من الثقافة ، أظهرت JBMMSCs الاستعمار ، كما يتضح من تلطيخ الكريستال البنفسجي (الشكل 2 ب). أظهروا قدرة تمدد مستقرة في المختبر ، مع منحنى نمو الخلية بعد نمط نموذجي "يشبه S" (الشكل 2C). تضمنت عملية تكاثر الخلايا فترة كامنة ومرحلة نمو لوغاريتمية ومرحلة هضبة. بدأ النمو السريع بعد يومين ، تلاه تباطؤ بعد ستة أيام. أظهرت الخلايا الفردية خصائص التكاثر الذاتي والانتشار.

أظهرت الخلايا جزيئات تلطيخ ALP باللون الأزرق الأرجوانيفي اليوم 7 والعقيدات المعدنية الحمراءفي اليوم 21. بالإضافة إلى ذلك ، بعد 14 يوما من الحث الشحمي ، عرضت الخلايا قطرات دهنية حمراء مطرزة ، بينما أدى تحريض التمايز الغضروفي إلى تكوين أنسجة تشبه الغضروف الأزرق (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، بعد 7 أيام من الحث العظمي ، ارتفعت مستويات تعبير mRNA ل ALP و OCN و Runx2 في JBMMSCs15 (الشكل 3B).

figure-results-1
الشكل 1: عزلة وثقافة JBMMSCs. (أ) نظرة عامة على البروتوكول. (ب-د) صور الخلايا المزروعة لمدة 3 أيام و 5 أيام و 7 أيام في الثقافة الأولية ، على التوالي. (E-G) صور لخلايا P1 و P2 و P3 على التوالي. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحديد JBMMSCs. (أ) نتائج تحليل التدفق الخلوي ل JBMMSCs للفئران. كشف تحليل قياس التدفق الخلوي أن هذه الخلايا كانت إيجابية ل CD29 و CD44 و CD90 ، بما يتفق مع خصائص BMMSCs. على العكس من ذلك ، كانت سلبية ل CD11b / c و CD34 و CD45. (ب) صور تمثيلية لمستعمرات JBMMSCs الملطخة بالبنفسجي البلوري (قضبان المقياس: 100 ميكرومتر). (ج) أظهر منحنى نمو الخلايا معدل تكاثر الخلايا. تشير البيانات وأشرطة الخطأ إلى متوسط الانحراف المعياري ± ، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التمايز متعدد السلالات (العظمي ، الشحمي ، والغضروفي) ل JBMMSCs. (أ) بعد 7 أيام من تحريض العظم ، لوحظ زيادة نشاط ALP. في 21 يوما بعد الحث العظمي ، تم تلطيخ العديد من العقيدات المعدنية باللون الأحمر مع تلطيخ أحمر أليزارين. كشف تلطيخ الزيت الأحمر O عن عدد كبير من قطرات الدهون. سلط تلطيخ ألسيان الأزرق الضوء على الخلايا المستحثة في الخلايا الغضروفية بعد تحريض الغضروف. (ب) تعبير mRNA للجين المرتبط بالعظم ALP و OCN و Runx2 من JBMMSCs بعد تحريض العظم لمدة 7 أيام. (***P < 0.001، مقابل المجموعة الضابطة). تشير البيانات وأشرطة الخطأ إلى متوسط الانحراف المعياري ± ، n = 3. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجينتسلسلات التمهيدي (5'-3')
GADPHF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGTAGGAACAC
ألبF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
رنكس 2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

الجدول 1: البادئات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

المناقشة

تمثل الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم (BMMSCs) مجموعة فرعية من الخلايا الجذعية غير المكونة للدم الموجودة في نخاع العظام ، والتي تتميز بقدراتها على التجديد الذاتي ، وإمكانية التمايز متعدد الاتجاهات ، والوظائف الداعمة لتكوين الدم. تلعب هذه الخلايا أدوارا محورية في العمليات الفسيولوجية المختلفة مثل تجديد الأنسجة وتكوين الأوعية وتنظيم الأنشطة الخلوية20. وبالتالي ، يتم استخدام BMMSCs بشكل متكرر في إصلاح الأنسجة والهندسة التجديدية كمصدر مثالي لخلايا البذور21.

تظهر الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك (JBMMSCs) ، المعزولة في البداية من شفط نخاع عظم الفك البشري في عام 2005 بواسطة Matsubara et al.22 ، خصائص تمايز مميزة تعزى إلى الأصول الفريدة والمسارات التنموية للفك مقارنة بمواقع الهيكل العظمي الأخرى4،23. بالنظر إلى الآليات التنموية والمرضية المتميزة التي تحكم العظام القحفية الوجهية ، فإن إعطاء الأولوية ل JBMMSCs في إصلاح عيوب العظام القحفية الوجهية يبدو أمرا ضروريا ، نظرا لسماتها التنموية المتماثلة23. علاوة على ذلك ، تظهر JBMMSCs توافقا نسيجيا مرتفعا مع البيئة المكروية الفموية بسبب أصولها من الأنسجة الجنينية المشتركة24،25. على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال بروتوكول العزل الموحد والآمن ل JBMMSCs بعيد المنال ، ولا يزال البحث في JBMMSCs محدودا نسبيا.

يفتقر عزل وزراعة BMMSCs حاليا إلى التوحيد القياسي ، مع الطرق المستخدمة بشكل شائع بما في ذلك فرز الحبيبات المغناطيسية المناعية ، وفرز قياس التدفق الخلوي ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، وثقافة التصاق نخاع العظمالكامل 26. من بين هذه ، طريقة الخرزة المغناطيسية المناعية وطريقة فرز قياس التدفق الخلوي عزل الخلايا عن طريق التعرف على مستضدات معينة على سطح الخلية. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تنطوي على عمليات مرهقة ، وتتطلب أدوات متخصصة ، وقد تؤثر على نشاط الخلية على الرغم من إنتاج خلايا عالية النقاء27. تفصل طريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافة الخلايا من خلال الطرد المركزي والتقسيم الطبقي ، مما يمكن أن يغير البيئة المكروية للخلية ، مما يؤدي إلى تباطؤ نمو الخلايا وزيادة شيخوخة الخلايا28. على العكس من ذلك ، فإن طريقة ثقافة نخاع العظم الملتصقة بالكامل تفصل وتنقي BMMSCs عن طريق استبدال الوسط بشكل متقطع والمرور بناء على قدرات الالتصاق المتفاوتة بين أنواع الخلايا المختلفة في نخاع العظام. هذه الطريقة تلحق الحد الأدنى من الضرر بالخلايا وهي سهلة التنفيذ16.

بالمقارنة مع عظم الفخذ ، يكون الفك أصغر حجما وله تجويف نخاع عظمي أضيق ، مع تدخل من الخلايا في السن أو الرباط اللثوي. تتطلب طريقة احمرار نخاع العظم والالتصاق كمية أكبر نسبيا من نخاع العظم وهي مناسبة للحيوانات الكبيرة والبشر29. JBMMSCs في الفئران المستخرجة عن طريق تطبيق طريقة تنظيف نخاع العظم التقليدية نادرة العدد وبطيئة التكاثر وذات نوعية رديئة30,31. محتوى JBMMSCs في نخاع العظام منخفض جدا ، وتوجد بشكل رئيسي في العظام المدمجة و endosteum. استخدم Bu-Kyu Lee et al.32 شفاط الفك السفلي لعزل JBMMSCs ، في حين أن إجمالي وقت الشفط ل 10 مل من دم النخاع للفك السفلي كان أطول بخمس مرات من وقت العرف الحرقفي ، وكان العائد الأولي ل MSCs من الفك السفلي أقل بثلاث مرات من ذلك من القمة الحرقفية. لا يمكن لغسل نخاع العظم وحده عزل الخلايا في العظم المضغوط وبطانة الجهاز بشكل فعال.

في السنوات الأخيرة ، وجدت الدراسات أن العظام المدمجة هي مصدر جديد وموثوق ل BMMSCs ، وقد تم اشتقاق طريقة بسيطة نسبيا لعزل BMMSC ، وهي طريقة ثقافة هضم شريحة العظام33. BMMSCs المعزولة بهذه الطريقة لديها نقاء عالي34. نجح Guo et al.35في عزل الخلايا الجذعية الوسيطة العظمية من عظم الفخذ باستخدام طريقة ثقافة هضم شريحة العظام. طبق Yamazaet al.12 و Cheng et al.15 طريقة ثقافة هضم شريحة العظام لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم الفكي السفلي للفأر والتحقق من خصائص MSC عن طريق تكاثر الخلايا والنمط المناعي والتمايز متعدد السلالات. استخدمت هذه التجربة مزيجا من التصاق نخاع العظم الكامل المتدفق وهضم شريحة العظام لعزل وزراعة JBMMSCs الأولية للفئران. تم غسل نخاع العظم تماما من التجويف دون ترشيح للحفاظ على التركيب الخلوي الأصلي وعوامل النمو في نخاع العظام. بعد ذلك ، تم تقطيع شرائح العظام إلى قطع صغيرة وهضمها باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني لتسهيل خروج الخلايا من شظايا العظام. أخيرا ، تم تلقيح شرائح العظام في طبق مزرعة وزراعتها للسماح للخلايا بالزحف خارج شرائح العظام. تجعل طريقة الجمع نظام زراعة الخلية الأولية يحتوي في وقت واحد على مكونات من الخلايا الجذعية المكونة للدم ، والعظام الملغاة ، والعظام القشرية ، والتي يمكن أن تحاكي بشكل أفضل البيئة المكروية للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم في الجسم وهي أكثر ملاءمة للحفاظ على الخصائص البيولوجية الأصلية للخلايا. لذلك تسمى هذه الطريقة "نهجا قائما على المكانة في الجذعية"36. أكد Luet al.37 أيضا على أهمية منافذ الخلايا الجذعية في عزل BMMSCs ، لكنها تضمنت فقط البيئة الدقيقة في نخاع العظام بدون عظم قشري. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح في عزل الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم من فكالفئران 38.

لقد نجحنا أيضا في عزل وزراعة JBMMSCs للفئران باستخدام هذا النهج المتخصص. أولا ، أظهرت الخلايا المعزولة شكلا يشبه الخلايا الليفية والتقت بألواح الثقافة البلاستيكية في المختبر. ثانيا ، عبرت الخلايا بشكل إيجابي عن علامات سطح CD90 و CD29 و CD44 وعبرت سلبا عن CD45 و CD34 و CD11b / c. ثالثا ، يمكن أن تتمايز الخلايا إلى خلايا عظمية وخلايا دهنية وخلايا غضروفية. كان للخلايا التي تم الحصول عليها مورفولوجيا جيدة ، ومعدل انتشار سريع ، وقدرة تمايز ، والتي استوفت الحد الأدنى من المعايير لتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الإنسان التي اقترحتها الجمعية الدولية للعلاج الخلوي17.

تم تطوير عزل JBMMSCs واستخدامه لعزل الخلايا في البشر. كان Matsubara et al.22 أول من عزل JBMMSCs من عينات نخاع العظم السنخي البشري أثناء جراحة الفم. قد تحدث مضاعفات محتملة أثناء عملية شفط الفك السفلي ، بما في ذلك تلف الأنسجة المجاورة ، والعدوى بسبب التلوث البكتيري عن طريق الفم ، وما إلى ذلك. قام Zong et al.39 بمسح تجويف نخاع العظم لقطع عينة العظام الملغاة للحصول على JBMMSCs البشرية. قام Park et al.40 بعزل JBMMSCs البشرية من رقائق العظام السنخية التي تم الحصول عليها أثناء حفر الزرع باستخدام طريقة الهضم المتسلسلة. قام Mason et al.41 بعزل JBMMSCs البشرية مباشرة عن نوى نخاع عظم الفك ونضح المرضى الذين يخضعون لوضع زراعة الأسنان الروتينية. كان هناك معدل نجاح مرتفع لعزل الخلايا من الشفط أو النواة ومعدل نجاح أعلى للجمع. ومع ذلك ، على الرغم من أن الطرق المذكورة أعلاه قد نجحت في عزل JBMMSCs عن البشر ، إلا أن الاختلافات في الفعالية بين الطرق تحتاج إلى مقارنة. حاليا ، تم استخدام هذه الطريقة المقدمة فقط في الفئران والجرذان ، ولا يوجد بحث حول تطبيق هذه الطريقة على عزل JBMMSCs البشرية. هناك قيود على هذه الطريقة ، خاصة عندما يتم تطبيقها على البشر. أولا ، هذه الطريقة للجمع بين احمرار نخاع العظم وهضم شريحة العظام معقدة نسبيا وتتطلب المزيد من الخطوات. ثانيا ، تضع العمليات المعقدة مطالب أعلى على عقم العمليات ، وهو أمر بالغ الأهمية للبروتوكول. ثالثا ، من المستحيل مسح تجويف نخاع العظم بالكامل في عظم الفك البشري ، لذا فإن استكشاف بعض الطرق المكافئة ، مثل تنظيف شظايا العظام الملغاة ، أمر ضروري.

باختصار ، نجحت هذه الدراسة في عزل وتربية JBMMSCs الفئران باستخدام مزيج من احمرار نخاع العظم وهضم شرائح العظام بناء على مبدأ "مكانة الخلايا الجذعية". أكدت نتائج تحديد الخلايا أن هذه الطريقة يمكن أن تعزل JBMMSCs كافية وعالية النقاء ، مما يوفر مصادر خلايا وافرة لهندسة أنسجة عظم الفك ، خاصة في إصلاح عيوب العظام ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مشاريع الرعاية الصحية التابعة لإدارة لوجستيات اللجنة العسكرية (19BJZ22) ، ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7232154) ، وجامعة ميل ميد الرابعة. مشاريع البحوث السريرية (2021XB025).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alizarin Red S Solution 0.2٪SolarbioG1450
BCIP / NBT طقم تطوير ألوان الفوسفاتيز القلويةBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 نظام الوقتالحقيقي Bio-Rad
CCK8 KitDujindoCK04
طبق ثقافة الخلية 10 سمجهاز طرد
5810R
15 مل & nbsp ؛أنبوب الطرد المركزي Corning430790
50 mL Corning430828
CO2< / sub> حاضنةThermo Fisher3111
مذبذب درجة حرارة ثابتةشنغهاي Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co.، Ltd.ZWY-100H
مصل الأبقار الجنينBI04-001-1ACS
مقياس التدفق الخلويBDFACS C6 & nbsp ؛
مجهر تباين الطور المقلوبأوليمبوسCKX41  
مجموعة أدوات الكشف عن علامات السطح للخلايا الجذعية الوسيطة (الجرذ)  OricellRAXMX-09011
قارئ صفيحة دقيقة متعدد الوظائف BioTekSynergy LX Multi-Mode
Oil O Stain KitSolarbioG1262
Paraformaldehyde 4٪SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
البنسلين الستربتومايسين 0.25٪MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher  A25742
PrimeScript RT ماستر ميكس  طقم التمايزRR036A
OricellRAXMX-90031
الجذعية الوسيطة لنخاع العظام للفئران مجموعة التمايز الغضروفيOricellRAXMX-90041
الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفئرانOricellRAXMD-90021
طقم استخراج الحمض النووي الريبيTIANGENDP419
مقعد فائق النظافةبكين Yataikelong Instrument Technology Co.، Ltd.KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25٪MACGENECC012
النوع الثاني كولاجينازSolarbioC8150
Wistar الفئرانبكين Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM استزراع الوسيط C12571500BTجيبكو
مركزي 353003 Corning أنبوب الطرد المركزي Eppendorf المادي للخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظام Takara مجموعة الخلايا مجموعة الخلايا

المراجع

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقنية عزل وزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفك الجرذ
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.