تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

Jacy Fang; Isabella Salinas; Sarah San Vicente; Caroline Zielinski; Moshe Sade-Feldman

doi:10.3791/66766

مقالة منهجية

تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

DOI:

10.3791/66766

⸱

أغسطس 16, 2024

Jacy Fang^*¹^,² , Isabella Salinas^*¹^,² , Sarah San Vicente^*¹^,² , Caroline Zielinski^*¹^,² , Moshe Sade-Feldman¹^,²^,³

¹Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, ²Broad Institute of MIT and Harvard, ³Department of Medicine, Harvard Medical School

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالفصل السريع لعينات ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتوي عينات الأورام البشرية على عدد كبير من المعلومات حول بيئتها المكروية وذخيرتها المناعية. يعد التفكك الفعال لعينات الأنسجة البشرية إلى معلقات خلوية قابلة للحياة مدخلا مطلوبا لخط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq). على عكس أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يمكننا scRNAseq من استنتاج عدم تجانس النسخ في عينات الورم على مستوى الخلية الواحدة. أدى دمج هذا النهج في السنوات الأخيرة إلى العديد من الاكتشافات ، مثل تحديد الحالات الخلوية المناعية والأورام والبرامج المرتبطة بالاستجابات السريرية للعلاجات المناعية وأنواع أخرى من العلاجات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات الخلية الواحدة المطبقة على الأنسجة المنفصلة لتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ذخيرة مستقبلات الخلايا T و B ، والتعبير عن البروتينات ، باستخدام الأجسام المضادة المشفرة بالحمض النووي (CITEseq).

تعد صلاحية وجودة العينة المنفصلة متغيرات حرجة عند استخدام هذه التقنيات ، حيث يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التلوث المتبادل للخلايا المفردة بالحمض النووي الريبي المحيط ، وجودة البيانات ، والتفسير. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات التفكك الطويلة إلى القضاء على مجموعات الخلايا الحساسة وتنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد. للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا بروتوكول تفكك عالمي سريع ، والذي تم التحقق من صحته على أنواع متعددة من أورام الإنسان والفئران. تبدأ العملية بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي ، يليه الترشيح ، وتحلل الدم الأحمر ، والتخصيب الحي الميت ، وهو مناسب للعينات ذات المدخلات المنخفضة من الخلايا (على سبيل المثال ، خزعات لب الإبرة). يضمن هذا البروتوكول تعليقا نظيفا وقابلا للحياة أحادي الخلية له أهمية قصوى للجيل الناجح من مستحلبات حبيبات الجل (GEMs) ، والترميز الشريطي ، والتسلسل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن العديد من التطورات في أبحاث السرطان قد أدت إلى تطوير وموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على العوامل التي تستهدف المستقبلات المثبطة المعبر عنها على الخلايا المناعية والسرطانية ، والمعروفة باسم مثبطات حصار نقاط التفتيش ، إلا أن مقاومة العلاج وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المريض لا تزال صعبة¹. إن التحدي المعقد المتمثل في توصيف عدم تجانس الورم على تنوعه الجزيئي والتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية المناعية يتطلب أساليب جديدة لتشريح هذا النظام البيئي المعقد بدقة الخلية الواحدة. يعد فهم التعقيدات الجزيئية داخل الأورام وبيئاتها الدقيقة أمرا محوريا لتطوير الاستراتيجيات العلاجية وفك رموز البيولوجيا المعقدة الكامنة وراء تطور السرطان². أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) شائعا بشكل متزايد لأنه يوفر تحليلا عالي الدقة للخلايا الفردية داخل عينات الورم المعقدة ^3,4.

يشكل عدم تجانس الورم ، الذي يشمل التنوع الجيني والجيني والظاهري ، تحديا في الكشف عن تعقيدات بيولوجيا السرطان⁵. تميل الطرق التقليدية لتسلسل الحمض النووي الريبي المجمع إلى إخفاء ملامح التعبير الفريدة والأنماط الظاهرية لمجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة داخل الأورام ، حيث تقوم هذه الطرق بمتوسط الإشارات عبر مجموعات الخلايا بأكملها⁴. في المقابل ، يسمح scRNA-seq بتشريح أنواع الخلايا الفردية ، والكشف عن التعبير الجيني المتنوع ، وأنماط القمع ، والحالات الخلوية التي يتم تجاهلها^{بخلاف ذلك} ^4,6. تكمن فرضية scRNA-seq في قدرته على فك تشفير التوقيعات الجينية والجزيئية للخلايا الفردية ، مما يحمل وعدا هائلا في اكتشاف علاجات جديدة للسرطان⁷.

من خلال فك رموز ملامح التعبير الجيني للخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والمناعية المحيطة ، يمكن للباحثين تحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير استراتيجيات الطب الوراثي الدقيقة المصممة خصيصا للمرضى^{الفرديين 6}. علاوة على ذلك ، فإن تشريح الذخيرة المناعية داخل البيئة المكروية للورم يوفر رؤى حاسمة في التفاعل بين الخلايا السرطانية والمستجيبات المناعية ، مما يمهد الطريق للتدخلات العلاجية المناعية³. على الرغم من التقدم في استخدام scRNAseq على العينات السريرية ، فإن العديد من التحديات أثناء خطوات المعالجة يمكن أن تضر بسلامة الحمض النووي الريبي للخلية وصلاحيتها وجودة البيانات التي تم إنشاؤها. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي معالجة الأنسجة ذات الصلاحية المنخفضة للخلية إلى زيادة مستويات الحمض النووي الريبي المحيط في القطرات المتولدة أثناء تغليف الخلايا الفردية ، مما يؤدي إلى التلوث المتبادل والتعليق غير الصحيح لأنواع الخلايا ، في حين أن بروتوكولات التفكك الطويلة التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية يمكن أن تؤدي إلى زيادة تنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد في أنواع متعددة من الخلايا ^8,9 ^،¹⁰.

يبدأ الإجراء التدريجي (الشكل 1 أ) الموضح في هذا البروتوكول بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي السريع للأورام ، يليه الترشيح وإزالة الخلايا الميتة ، اعتمادا على صلاحية كل عينة ورم. في الوقت الحاضر ، تم التحقق من هذا الإجراء في سرطان الجلد¹¹ ، القولون والمستقيم¹² ، سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة¹³ ، عينات ورم البنكرياس والرئة (بيانات غير منشورة). تضمن هذه التقنيات توليد معلقات خلوية قابلة للحياة عالية الجودة ضرورية للتحليلات النهائية¹⁴. والجدير بالذكر أن إزالة خلايا الدم الحمراء ، الخالية من الحمض النووي الريبي المركب ، تصبح ضرورية لتنقية العينة¹⁵. يعمل التقييم اللاحق لعدد الخلايا والقضاء على الخلايا الميتة كشرط أساسي لنجاح توليد مستحلب حبة الجل 10x Genomics (GEM) ، والترميز الشريطي ، وزيادة استعادة النصوص والخلايا المتسلسلة دون تعريض استبعاد المجموعات السكانية الحساسة للخطر (على سبيل المثال ، العدلات والخلايا الظهارية)¹⁶. هذه الخطوات أساسية في إطلاق العنان لإمكانات تحليل دقة الخلية الواحدة داخل عينات الورم ^9,10 ، والكشف عن ملفات تعريف التعبير الجيني الجديدة والتوقيعات المناعية اللازمة لدفع التدخلات العلاجية المبتكرة ، وتحديد نقاط الضعف الجديدة للورم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

امتثلت هذه الدراسة لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بأخذ عينات الأنسجة البشرية. تم تلقي الموافقة المستنيرة من المرضى ، وتم إخفاء هوية بيانات العينة التي يمكن التعرف عليها. يتم جمع العينات في غرفة العمليات ، ووضعها في محلول RPMI أو محلول ملحي أو PBS ، وتأكيد إصابتها بالسرطان عبر قسم علم الأمراض قبل استخدامها في البحث. يجب تنفيذ جميع الخطوات ، باستثناء ما يشير إليه ، عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. العمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند معالجة الأنسجة البشرية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. الحصول على العينة

احصل على عينة ورم صلبة في أنبوب من الوسائط وضعها على الثلج.
1. اطلب من موظفي غرفة العمليات نقل العينة في أنبوب يحتوي على ما يكفي من RPMI أو محلول ملحي أو برنامج تلفزيوني لغمر الأنسجة تماما لتجنب جفاف العينة.
  ملاحظة: من المهم التأكد من عدم تجفيف العينة ، لأن ذلك سيقلل من صلاحيتها.
قم بتبريد جميع أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية وجلب الخلاط الحراري إلى 37 درجة مئوية.
أخرج إنزيمات تفكك الورم البشري أو الفأر المحضرة (جدول المواد) ، وقم بإذابة الجليد على الخلاط الحراري 37 درجة مئوية ، وانتقل إلى الجليد بمجرد إذابته.
استرجع حصة 20 مل من RPMI.
سجل معلومات العينة ذات الصلة (على سبيل المثال ، معرف المريض ، إلغاء التعريف ، نوع العينة).
انقل العينة إلى طبق زراعة الأنسجة 60 مم (يوضع على الثلج) عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات وصب المحتويات في الطبق لضمان نقل جميع مواد العينة. إذا لم يتم تسليم العينة في الوسائط عند الوصول ، أضف وسائط RPMI جديدة إلى الطبق.
1. إذا كانت العينة مجزأة ، فقم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق العينة في 420 ميكرولتر من RPMI ، وانتقل إلى القسم 2.

2. الهضم الميكانيكي والأنزيمي

ماصة 420 ميكرولتر من الوسائط من طبق العينة 60 مم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. حاول تضمين أي أجزاء عينة معلقة في الوسائط.
انقل عينة الأنسجة من طبق 60 مم إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على وسائط باستخدام الملقط. قم بتقطيع العينة بمقص نظيف داخل الأنبوب بحيث يبلغ قطر القطع 2-3 مم كحد أقصى.
أضف إنزيمات الهضم ، المحضرة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (جدول المواد) ، إلى العينة في الأحجام التالية: 42 ميكرولتر من الإنزيم H (البروتياز غير المحدد) للعينات البشرية ، الإنزيم D (البروتياز غير المحدد) لعينات الفئران ، 21 ميكرولتر من الإنزيم R (البروتياز غير المحدد) ، و 5 ميكرولتر من الإنزيم A (نوكلياز).
أضف 420 ميكرولتر أخرى من الوسائط من الطبق أو حتى علامة 1 مل على الأنبوب. لا تتجاوز 420 ميكرولتر من الوسائط.
دوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان ووضعه في خلاط حراري موضوع عموديا على جانبه (الشكل 1 ب). احتضان في 37 درجة مئوية ، 450 دورة في الدقيقة ، لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: أثناء الحضانة ، أخرج جميع مواد الجينوم 10x اللازمة لتوليد GEM ، لأنها تتطلب 30 دقيقة للتوازن مع درجة حرارة الغرفة

3. تصفية العينة

ضع مرشح خلية 50 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وقم بتجهيز المرشح عن طريق تمرير 1 مل من وسائط RPMI الجديدة من خلاله إلى الأنبوب.
بعد الهضم ، انقل العينة إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة عريض منخفض الاحتفاظ به 1000 ميكرولتر. اغسل الأنبوب سعة 1.5 مل ب 1 مل من الوسائط الطازجة وانقل الوسائط إلى المرشح لضمان تمرير جميع مواد العينة عبر الفلتر.
احصل على حقنة بلاستيكية سعة 1 مل وأخرج المكبس فقط (تخلص من باقي المحقنة). باستخدام الجزء الخلفي من مكبس المحقنة ، قم بطحن ودفع العينة على المرشح بحركة ملتوية.
اغسل المرشح ب 5 مل من الوسائط وأي وسائط متبقية من الطبق الذي يحتوي على العينة (القسم 1) لجمع أي خلايا قد تكون انفصلت عن الأنسجة.
ضع مرشح خلية 30 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل ، وقم بتجهيز المرشح ب 1 مل من الوسائط ، وانقل محتويات الأنبوب الذي يحتوي على العينة المنفصلة عبر المرشح.
ملاحظة: ستزيل هذه الخطوة الحطام الكبير الذي قد يسد أو يتسبب في فشل الترطيب عند تشغيل العينة باستخدام رقائق الموائع الدقيقة 10x Genomics.

4. تحلل خلايا الدم الحمراء

أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وسائل الإعلام ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
أعد التعليق في المخزن المؤقت ACK Lysis لإزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وتسجيل الحجم المستخدم. يعتمد الحجم على حجم الحبيبات ومدى كرات الدم الحمراء في الحبيبات.
ملاحظة: يجب أن يكون محلول عينة ACK المعاد تعليقه عديم اللون عند إضافة ما يكفي من محلول ACK Lysis ، حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة خلايا الدم الحمراء من العينة.
قم بطرد أنبوب العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية.
كرر الخطوات 4.2-4.3 حسب الحاجة حتى لا يكون لحبيبات العينة لون أحمر مرئي بعد الطرد المركزي (الشكل 2). سجل أي وحدات تخزين إضافية من المخزن المؤقت ACK Lysis المستخدم في هذه الخطوة.
أعد تعليق عينة الحبيبات في وسائط جديدة استعدادا للعد.

5. عد الخلايا

ضع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق في أنبوب سعة 1.5 مل. امزج الخلايا المنفصلة برفق ، وخذ 10 ميكرولتر من العينة ، واخلطها (1: 1) مع التريبان الأزرق. تحميل 10 ميكرولتر على كل جانب من مقياس الدم وعد الخلايا.
سجل تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا الحية ونسبة الصلاحية وحجم الوسائط النهائي بعد العدد.
تأكد من أن عدد الخلايا يتراوح بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر (7 × 10⁵- 1.2 × 10⁶ / مل) لتشغيل الجينوم 10x الأمثل.
1. إذا كانت العينة مركزة للغاية ، فقم بتخفيفها بالوسائط وأعد فرزها.
2. إذا كانت العينة مخففة جدا ، فقم بطرد العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في حجم أقل من الوسائط.
3. إذا كانت صلاحية الخلية أقل من 80٪ ، فقم بإجراء حي ميت لإزالة الخلايا الميتة.
4. إذا كان هناك أقل من مليون خلية ، انظر القسم 6.
5. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء > 10٪ ، انظر القسم 6.
6. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء < 10٪ ، انظر القسم 7.
7. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

6. إزالة الخلايا الميتة - كيت 1

ملاحظة: اعمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند استخدام كواشف إزالة الخلايا الميتة ، حيث يمكن أن تتلوث بسهولة.

أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
قم بإعداد وسائط العزل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة: 9.8 مل من PBS ، و 10 ميكرولتر من CaCl₂ ، و 200 ميكرولتر من FCS المعطل بالحرارة (يضاف في غطاء السلامة البيولوجية).
بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسائط من الحبيبات وأعد تعليقها في 1 مل من وسائط العزل.
الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 450 × غرام ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسائط العزل.
نقل 100 ميكرولتر من العينة في وسائط العزل إلى بئر واحد من أنبوب شريط PCR سعة 0.2 مل.
في غطاء السلامة الأحيائية ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل Annexin V و 10 ميكرولتر من كوكتيل اختيار البيوتين إلى البئر الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من العينة في وسط العزل. ماصة خلط الحل والسماح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
بعد 4 دقائق ، دوامة الجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران لمدة 30 ثانية. أضف 20 ميكرولتر من الخرز و 60 ميكرولتر من وسائط العزل إلى العينة (حجم إجمالي 200 ميكرولتر). إذا كانت الصلاحية أقل من 40٪ ، فقم بقياس كمية الخرز حتى 40 ميكرولتر أثناء ضبط حجم وسائط العزل (حتى 40 ميكرولتر) ، مع الحفاظ على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر. مزيج ماصة والسماح للحل بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
ضع الأنبوب الشريطي على فاصل مغناطيسي 10x Genomics (على الإعداد العالي) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
انقل السائل من الأنبوب الشريطي دون إزعاج الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل من الربط. لا تقم بإزالة الأنبوب الشريطي من المغناطيس.
جهاز طرد مركزي أنبوب 1.5 مل يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وخلايا العد, كما هو موضح في القسم 5. كرر إجراء إزالة الخلايا الميتة إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ (الشكل 3 والشكل 4).
ملاحظة: لا تقم بإعادة تعليق الخلايا في وسائط العزل لتوليد GEM النهائي ، لأن كلوريد الكالسيوم سيتداخل مع عملية التغليف وخطوة النسخ العكسي (RT).
احتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. إزالة الخلايا الميتة - كيت 2

ملاحظة: اعمل داخل غطاء للسلامة البيولوجية عند استخدام كواشف المجموعة.

ضع الميكروبيدات ومحلول مخزون 20x Binding Buffer داخل غطاء السلامة البيولوجية.
جهاز طرد مركزي تعليق العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
قم بإعداد محلول عازل واحد × في ظروف معقمة باستخدام 1 مل من محلول مخزون 20x Binding Buffer الذي تم سحبه إلى 19 مل من الماء المقطر الخالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم باستنشاق المادة الطافية ، وأضف الميكروبيدات ، واخلط العينة برفق ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
1. عندما يكون عدد الخلايا 10⁷ أو أقل ، أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات.
2. بالنسبة للأعداد التي تزيد عن 10⁷ خلايا إجمالية ، اضبط الميكروبيدات للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل 10⁷ خلايا حية.
أثناء الحضانة ، احصل على عمود اختيار موجب واحد ل MACS ، و MACS multistand ، والفاصل المغناطيسي المقابل. تأكد من تسوية الفاصل على الحامل المتعدد وعدم وجود جسم معدني أو مغناطيسي آخر بالقرب من الحامل ، حيث أن القوة المغناطيسية قوية ويمكن أن تؤثر على كفاءة إزالة الخلايا الميتة. ضع العمود بإحكام في حامل فاصل مع توجيه الأجنحة للخارج.
بعد حضانة العينة ، إذا كان إجمالي حجم إعادة التعليق أقل من 500 ميكرولتر ، أضف 1x Binding Buffer حتى يصبح الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر.
ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل أسفل العمود وقم بتجهيز العمود ب 3 مل من 1x Binding Buffer.
استبدل الأنبوب المخروطي بأنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل لجمع عينات الخلايا وأضف العينة إلى العمود ، مما يسمح لها بالتدفق بالكامل عبر العمود.
اغسل العمود 4 × 3 مل من 1x Binding Buffer ، مع إضافة غسلة واحدة فقط في كل مرة بعد تدفق الغسيل السابق بالكامل عبر العمود.
بعد الغسيل الرابع ، يتم طرد الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية. تجاهل العمود والمخزن المؤقت للربط 1x المتبقي.
أعد تعليق محلول العينة في الكمية المناسبة من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وعد الخلايا المعزولة باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 5 (الشكل 3 والشكل 5).
1. إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ ، وكان العدد الإجمالي للخلايا 10⁶ أو أقل ، كرر القسم 6.
2. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على خزعة سرطان الجلد المعلقة في RPMI ووضعها على الفور على الجليد. تم نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 420 ميكرولتر من RPMI وإنزيمات الهضم ، وتم فرمها إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ، وخضعت للهضم الأنزيمي اللاحق لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري رأسيا 37 درجة مئوية (الشكل 1). بعد الهضم ، تم ترشيح العينة من خلال مرشح معقم يمكن التخلص منه 50 ميكرومتر ، وتم غسل المرشح باستخدام RPMI جديد لزيادة إنتاجية الخلية (الشكل 1). تم التخلص من الأجزاء المتبقية من الأنسجة المتبقية بعد الغسيل ، لأنها مواد بيولوجية غير مرغوب فيها (على سبيل المثال ، الأنسجة الدهنية).

بناء على لون حبيبات الخلية الناتجة ، كانت هناك حاجة إلى 15 مل من محلول تحلل ACK لإزالة خلايا الدم الحمراء (الشكل 2). بعد إعادة التعليق في 3 مل من وسائط RPMI ، كان إجمالي عدد الخلايا 1 × 10⁶ / مل ، مع صلاحية كانت <80٪ (الشكل 3 أ). يشير هذا إلى أن هناك حاجة إلى دورة واحدة من إثراء الخلايا الحية باستخدام المجموعة 1 (قسم البروتوكول 6) قبل الانتقال إلى تحميل الجينوم 10x (الشكل 4). إذا كانت هذه العينة تحتوي على أكثر من مليون خلية وكانت صلاحيتها أقل من 10٪ ، لكانت إزالة الخلايا الميتة - المجموعة 2 قد استخدمت بدلا من ذلك (الشكل 5). تم غسل العينة بوسائط العزل ، وأضيف 10 ميكرولتر من الملحق الخامس وكوكتيل اختيار البيوتين ، تليها 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي و 60 ميكرولتر من وسائط العزل ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 6 (الشكل 4). بعد هذا الإجراء ، تم إعادة تعليق العينة في 500 ميكرولتر من الوسائط وإعادة فرزها. كان عدد الخلايا الحية 4.9 × 10⁵ / مل مع صلاحية أعلى من 90٪ (الشكل 3 ب) ، وانتقلت العينة على الفور إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على معالجة عينة الورم. (أ) توضيح العملية خطوة بخطوة لبروتوكول تفكك الأنسجة. ب: هضم عينة باستخدام خلاط حراري رأسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: علاج ما قبل ACK وبعده لعينة سرطان الجلد المصطبغة بشكل معتدل. (أ) توضح الصورة عينة سرطان الجلد التي تم ترشيحها وتكويرها بعد خطوة الهضم قبل تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) باستخدام ACK. (B) تظهر الصورة نفس عينة سرطان الجلد بعد إزالة كرات الدم الحمراء باستخدام المخزن المؤقت ACK. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: منظر للخلايا على مقياس الدم تحت التريبان الأزرق مكبرا بتكبير 200x. (أ) صورة توضح ظهور الخلايا الزرقاء قبل إثراء الخلايا الحية ، والتي تمثل الخلايا الميتة ، مع صلاحية أقل من 80٪. (ب) صورة تظهر العينة بعد إثراء الخلايا الحية باستخدام بروتوكول Kit 1 (الخطوة 6 من البروتوكول) ، تظهر زيادة في الصلاحية تزيد عن 90٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: نظرة عامة على عزل خلية العينة الحية والميتة باستخدام المجموعة 1. يتم تنفيذ هذه الخطوة عند اكتشاف أقل من مليون خلية أو أكثر من مليون خلية ذات صلاحية >10٪ بعد عدد الخلايا (خطوة البروتوكول 5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: نظرة عامة على عزل الخلايا الحية والميتة باستخدام ميكروبيدات إزالة الخلايا الميتة في المجموعة 2. يتم تنفيذ هذه الخطوة عندما يكون هناك أكثر من مليون خلية وصلاحية <10٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: التحقق من صحة تحليل الخلية الواحدة لعينة غير معالجة بعد دورة واحدة من إثراء الخلايا الحية باستخدام بروتوكول Kit 1 المعدل. يظهر الجزء العلوي تحليل UMAP يوضح الاتساق في مجموعات الخلايا وأنواعها قبل وبعد إثراء الخلايا الحية. يلخص الجزء السفلي مخرجات التسلسل الناتجة عن Cell Ranger. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تفكك عينات ورم الإنسان أو الفئران إلى تعليق خلية واحدة لتسلسل scRNA باستخدام نظام الموائع الدقيقة 10x Genomics. عند معالجة الأنسجة التي غالبا ما تأتي من سرطانات نادرة أو تشكل جزءا من التجارب السريرية الجارية أو التجارب الطويلة لأورام الفئران ، يجب الحفاظ على العينة على النحو الأمثل وبعناية بين جميع الخطوات. يجب تنفيذ جميع الخطوات بسرعة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية للحفاظ على ملامح الحمض النووي الريبي الخلوي الأصلي ومنع التدهور ، لأن العمل في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة سيؤثر على جودة النسخ^17,18.

يجب اتخاذ عدة خطوات لضمان الحد الأدنى من فقدان الخلايا طوال العملية ، خاصة عند معالجة الخزعات الأساسية الصغيرة^{بالإبرة 17}. سيؤدي التأكد من تضمين جميع أجزاء عينة الورم في عملية الهضم إلى النتيجة الأكثر نجاحا ، حيث أن المزيد من الخلايا المستخرجة من العينة ستحسن تغليف وتسلسل الجينوم 10x في المستقبل والعدد الإجمالي للخلايا والنصوص المستردة للتحليل. إذا استقرت العينة في الأنبوب الذي وصلت إليه ، فيمكن إضافة الوسائط ، وقلب الأنبوب ، ونقله إلى الطبق للمعالجة. إذا كانت العينة الأولية مجزأة أو كان المحلول غائما ، مما يشير إلى وجود خلايا معلقة ، فتأكد من جمع كل العينة للهضم الأنزيمي عن طريق الطرد المركزي للعينة بالمحلول الذي وصلت إليه وتعليقها في حجم الوسائط للهضم (قسم البروتوكول 1).

عند الشفط ، تأكد من عدم إزعاج الحبيبات طوال العملية. اترك حجما إضافيا عند الشفط ، والذي يمكن إزالته باستخدام ماصة P200. في حالة اضطراب الحبيبات ، يمكن توزيع الحجم مرة أخرى في الأنبوب وإعادة الطرد المركزي. بعد تحلل ACK أو بعد إزالة الميت الحي ، قد تكون العينة بأحجام منخفضة تصل إلى 25 ميكرولتر. وبالتالي ، من الأهمية بمكان عدم فقدان أي طاف يحتوي على الخلايا. الهضم الميكانيكي السليم ضروري لضمان تعرض الخلايا ذات الاهتمام للهضم الأنزيمي. قد تكون هناك حاجة إلى هضم إنزيمي أطول باستخدام الإنزيمات المناسبة والخلاط الحراري لأحجام العينات الأكبر⁹^،¹⁹^،²⁰. في حين أن أسماء الإنزيمات المحددة مملوكة ، فإن الشركة المصنعة تلاحظ الإنزيم A باعتباره نيوكلياز والإنزيمات H و D و R كبروتياز غير متخصص. يعد تمرير أكبر قدر ممكن من عينة الورم عبر المرشح أمرا حيويا لضمان أعلى إنتاجية ممكنة للخلايا. ستؤدي التصفية الناجحة إلى عدم وجود أي عينة مرئية صغيرة فقط في المرشح أو عدم وجود عينة مرئية صغيرة فيه. قد لا يمكن ترشيح بعض أجزاء العينة إذا كانت تحتوي على كميات عالية من الأنسجة الدهنية أو الضامة. إذا كانت هناك قطع مرئية من العينة أعلى المرشح ، فاستمر في استخدام الجزء الخلفي من مكبس المحقنة لطحن ودفع كل العينة من خلال استخدام حركة الالتواء مع غسل الجزء العلوي من المرشح بمزيد من الوسائط.

يتم تحديد نجاح خطوة تحلل خلايا الدم الحمراء من خلال عرض العينة أسفل المجهر بمجرد تحميل العينة على مقياس الدم للعد والبقاء^15,21. إذا تمت إضافة ما يكفي من ACK إلى العينة لإزالة خلايا الدم الحمراء ، فلن تكون هناك خلايا دم حمراء أو احمرار مرئي في الحبيبات. إذا كانت خلايا الدم الحمراء مرئية في العينة ، فيجب إضافة ACK إضافي ، ويجب إعادة طرد العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. بمجرد الانتهاء من ذلك ، يجب استنشاق المادة الطافية ، ويمكن إعادة تعليق حبيبات الخلايا في وسائط RPMI للتصور والعد.

لضمان التشغيل الأمثل لعلم الجينوم 10x ، يجب أن يتراوح عدد الخلايا بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر (7 × 10⁵- 1.2 × 10⁶ / مل). سيؤدي التركيز العالي إلى زيادة معدل المضاعفة (خليتان في قطرة واحدة) أثناء تكوين القطيرات. إذا كان العدد مرتفعا جدا ، فيمكن إضافة كمية مناسبة من الوسائط إلى العينة وإعادة تحميلها على مقياس الدم لإعادة الفرز. إذا كان التركيز منخفضا جدا ، يمكن إعادة طرد العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، واستنشاق المادة الطافية وإعادة تعليقها في حجم أقل من الوسائط قبل إعادة الفرز. تكون العينة جاهزة للتحميل لعلم الجينوم 10x إذا كانت صلاحية الخلية الحية أعلى من 80٪ (الشكل 3).

إذا كانت صلاحية العينة أقل من 80٪ ، فيجب إجراء ميت حي قبل تحميل 10x Genomics¹⁶. إذا لم تحقق جولة واحدة من إزالة الأحياء والموتى نسبة الصلاحية أعلى من 80٪ ، فيجب إجراء جولة أخرى إذا كان هناك أكثر من 1 × 10⁵ خلايا إجمالا. ستمنع الجدوى العالية الانسداد في بروتوكول الجينوم 10x اللاحق ، وتزيد من استعادة الخلايا ، وتقلل من وجود الحمض النووي الريبي المحيط. تم تحسين بروتوكول Kit 1 وتصغيره لفصل عينات الأنسجة الصغيرة بسرعة مع انخفاض عدد الخلايا. يؤدي انخفاض حجم الكواشف وتقصير أوقات الحضانة إلى زيادة إنتاجية الخلايا ومنع التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد (FOS و JUN و JUNB) على خلايا مختلفة ^9,22. تشمل الطرق البديلة لإثراء الخلايا الحية تلطيخ وفرز. ومع ذلك ، فإن هذا من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض إنتاج الخلايا ، وحضانة التلوين لفترات طويلة ، والتي يمكن أن تؤثر على الحالات الخلوية (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة aCD3e ستنشط الخلايا التائية) ، والإجهاد الناجم عن ضغط الجهاز على الخلايا أثناء الفرز ^9,22. يوضح المثال الموضح في الشكل 6 UMAP تم إنشاؤه بعد تسلسل التعبير الجيني 10X Genomics (GEX) وتحويل الرموز الشريطية للخلية التي تم إنشاؤها إلى ملفات FASTQ التي تم تسلسلها بعد ذلك ومحاذاتها عبر CellRanger. تم رسم نتائج التسلسل اللاحقة ومقارنات إزالة الأحياء والأموات ، مما يدل على مجموعات الخلايا في عينة قبل وبعد إزالة الأحياء والأموات وتحسين جودة التسلسل. أشارت عينة الرئة الموضحة في الشكل 6 إلى وجود مشكلة في جزء القراءات ، حيث كانت أقل من 70٪. تم إنشاء هذا التحذير بسبب ارتفاع الحمض النووي الريبي المحيط في مجموعة من الخلايا المحللة أو الميتة. ومع ذلك ، بعد إزالة الخلايا الميتة ، لم يعد هذا الخطأ موجودا وأدى إلى نسبة أعلى من قراءات الكسور في الخلايا²³.

يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عملية مكلفة وغير مستقرة أدت إلى تقدم كبير في مجال مناعة السرطان وأبحاث السرطان. يسمح بمزيد من الاستجواب للجينات والحالات الخلوية والبرامج التي يتم التعبير عنها وقمعها في أنواع معينة من الخلايا ، ويكشف المزيد عن سلوك السرطانات وعدم تجانسها. من المرجح أن تولد الأنسجة دون المستوى الأمثل أو منخفضة الصلاحية بيانات منخفضة الجودة يمكن أن تخلق قطعا أثرية تأخذ بعيدا عن واقع بيولوجيا الورم ، مع التأكيد على الأهمية الحاسمة لتفكك الورم السليم وإعداد العينة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

م.س-ف. تلقى تمويلا من بريستول مايرز سكويب ، Istari Oncology ، وكان مستشارا لعلاجات Galvazine.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أديلسون للأبحاث الطبية (AMRF) ، وتحالف أبحاث سرطان الجلد (MRA) ، و U54CA224068. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 4 والشكل 5 باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 مل ماصة مصلية	Corning	357551
1000 & mu ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظ	Rainin	30389213
1000 مو ؛ L أطراف ماصة عريضة منخفضة الاحتفاظ	Rainin	30389218
1000 & أطراف ماصة L	Rainin	30389212
فاصل مغناطيسي 10x	10x الجينوم	120250
أنابيب مخروطية 15 مل	Corning	430052
مل ماصة شفط	Corning
20 & mu ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظ	Rainin	30389226
20 & mu ؛ أطراف ماصة L	Rainin	30389225
200 مو ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظ	Rainin	30389240
200 مو ؛ أطراف ماصة	L Rainin	30389239
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلين	Falcon	352098
60 × 15 مم طبق زراعة الأنسجة	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 مل حقنة	Becton و Dickinson and Company	3090659
مقياس كثافة الدم الساطع	الخط Hausser Scientific	551660
محلول كلوريد الكالسيوم	سيجما ألدريتش	2115-100 مل
خلية رينجر	10x الجينوم	N / A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
شرائح عد الخلايا لعداد الخلايا TC20	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30 & mu ؛ م مرشحات معقمة يمكن التخلص	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50 & mu ؛ م مرشحات معقمة يمكن التخلص	Sysmex	04-004-2327
طقم إزالة الخلايا الميتة ؛	Miltenyi Biotec	130-090-101	مخزن عند -20 درجة ؛ C; المجموعة 2
ملقط تشريح ، طرف ناعم	VWR	82027-386
DNA LoBind أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.5 مل	Eppendorf	22431021
EasySepTM إزالة الخلايا الميتة (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 & deg ؛ C; المجموعة 1
جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5425R	Eppendorf	5406000640
أجهزة الطرد المركزي Eppendorf 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 وحدة تحكم الماصة	الإلكترونية Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 موديل 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C ، استخدم في غطاء بيولوجي
مقص ألماني غير قابل للصدأ	أدوات العلوم	الدقيقة 14568-12
Leica Dmi1 مجهر	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS ماصة L-1000XLS +	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS ماصة L-200XLS +	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS ماصة L-20XLS +	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 & deg; C
TempAssure 0.2 مل PCR 8-Tube شرائط الولايات	المتحدة الأمريكية العلمية	1402-4700
Trypan Blue stain 0.4٪	Thermo Fisher Scientific	T10282
طقم تفكك الورم ، Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	يخزن في -20 درجة ؛ ج ، قم بإعداد الإنزيمات وفقا لتعليمات المجموعة: إعادة تكوين قارورة إنزيم H المجففة بالتجميد في 3 مل من RPMI 1640 إعادة تكوين قارورة الإنزيم R المجففة بالتجميد في 2.7 مل من RPMI 1640 إعادة تكوين قارورة الإنزيم المجفف بالتجميد A في 1 مل من Buffer A المزود بالمجموعة.
طقم تفكك الورم ، فأر	Miltenyi Biotec	130-096-730	يخزن في -20 درجة ؛ ج ، قم بإعداد الإنزيمات وفقا لتعليمات المجموعة: إعادة تكوين قارورة الإنزيم D المجففة بالتجميد في 3 مل من RPMI 1640 إعادة تكوين قارورة إنزيم R المجففة بالتجميد في 2.7 مل من RPMI 1640 إعادة تكوين قارورة الإنزيم المجفف بالتجميد في 1 مل من العازلة A المزودة بالمجموعة.
ماء مقطر فائق النقاء	Invitrogen	10977-015	يخزن في 4 درجات ؛ ج

2 357558 منها منها

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة