يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

3.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66766

⸱

أغسطس 16, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالفصل السريع لعينات ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

الملخص

تحتوي عينات الأورام البشرية على عدد كبير من المعلومات حول بيئتها المكروية وذخيرتها المناعية. يعد التفكك الفعال لعينات الأنسجة البشرية إلى معلقات خلوية قابلة للحياة مدخلا مطلوبا لخط أنابيب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq). على عكس أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، يمكننا scRNAseq من استنتاج عدم تجانس النسخ في عينات الورم على مستوى الخلية الواحدة. أدى دمج هذا النهج في السنوات الأخيرة إلى العديد من الاكتشافات ، مثل تحديد الحالات الخلوية المناعية والأورام والبرامج المرتبطة بالاستجابات السريرية للعلاجات المناعية وأنواع أخرى من العلاجات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام تقنيات الخلية الواحدة المطبقة على الأنسجة المنفصلة لتحديد مناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ذخيرة مستقبلات الخلايا T و B ، والتعبير عن البروتينات ، باستخدام الأجسام المضادة المشفرة بالحمض النووي (CITEseq).

تعد صلاحية وجودة العينة المنفصلة متغيرات حرجة عند استخدام هذه التقنيات ، حيث يمكن أن تؤثر بشكل كبير على التلوث المتبادل للخلايا المفردة بالحمض النووي الريبي المحيط ، وجودة البيانات ، والتفسير. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي بروتوكولات التفكك الطويلة إلى القضاء على مجموعات الخلايا الحساسة وتنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد. للتغلب على هذه القيود ، ابتكرنا بروتوكول تفكك عالمي سريع ، والذي تم التحقق من صحته على أنواع متعددة من أورام الإنسان والفئران. تبدأ العملية بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي ، يليه الترشيح ، وتحلل الدم الأحمر ، والتخصيب الحي الميت ، وهو مناسب للعينات ذات المدخلات المنخفضة من الخلايا (على سبيل المثال ، خزعات لب الإبرة). يضمن هذا البروتوكول تعليقا نظيفا وقابلا للحياة أحادي الخلية له أهمية قصوى للجيل الناجح من مستحلبات حبيبات الجل (GEMs) ، والترميز الشريطي ، والتسلسل.

المقدمة

على الرغم من أن العديد من التطورات في أبحاث السرطان قد أدت إلى تطوير وموافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على العوامل التي تستهدف المستقبلات المثبطة المعبر عنها على الخلايا المناعية والسرطانية ، والمعروفة باسم مثبطات حصار نقاط التفتيش ، إلا أن مقاومة العلاج وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المريض لا تزال صعبة1. إن التحدي المعقد المتمثل في توصيف عدم تجانس الورم على تنوعه الجزيئي والتفاعل المعقد بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية المناعية يتطلب أساليب جديدة لتشريح هذا النظام البيئي المعقد بدقة الخلية الواحدة. يعد فهم التعقيدات الجزيئية داخل الأورام وبيئاتها الدقيقة أمرا محوريا لتطوير الاستراتيجيات العلاجية وفك رموز البيولوجيا المعقدة الكامنة وراء تطور السرطان2. أصبح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) شائعا بشكل متزايد لأنه يوفر تحليلا عالي الدقة للخلايا الفردية داخل عينات الورم المعقدة 3,4.

يشكل عدم تجانس الورم ، الذي يشمل التنوع الجيني والجيني والظاهري ، تحديا في الكشف عن تعقيدات بيولوجيا السرطان5. تميل الطرق التقليدية لتسلسل الحمض النووي الريبي المجمع إلى إخفاء ملامح التعبير الفريدة والأنماط الظاهرية لمجموعات الخلايا غير المتجانسة الموجودة داخل الأورام ، حيث تقوم هذه الطرق بمتوسط الإشارات عبر مجموعات الخلايا بأكملها4. في المقابل ، يسمح scRNA-seq بتشريح أنواع الخلايا الفردية ، والكشف عن التعبير الجيني المتنوع ، وأنماط القمع ، والحالات الخلوية التي يتم تجاهلهابخلاف ذلك 4,6. تكمن فرضية scRNA-seq في قدرته على فك تشفير التوقيعات الجينية والجزيئية للخلايا الفردية ، مما يحمل وعدا هائلا في اكتشاف علاجات جديدة للسرطان7.

من خلال فك رموز ملامح التعبير الجيني للخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والمناعية المحيطة ، يمكن للباحثين تحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير استراتيجيات الطب الوراثي الدقيقة المصممة خصيصا للمرضىالفرديين 6. علاوة على ذلك ، فإن تشريح الذخيرة المناعية داخل البيئة المكروية للورم يوفر رؤى حاسمة في التفاعل بين الخلايا السرطانية والمستجيبات المناعية ، مما يمهد الطريق للتدخلات العلاجية المناعية3. على الرغم من التقدم في استخدام scRNAseq على العينات السريرية ، فإن العديد من التحديات أثناء خطوات المعالجة يمكن أن تضر بسلامة الحمض النووي الريبي للخلية وصلاحيتها وجودة البيانات التي تم إنشاؤها. علاوة على ذلك ، يمكن أن تؤدي معالجة الأنسجة ذات الصلاحية المنخفضة للخلية إلى زيادة مستويات الحمض النووي الريبي المحيط في القطرات المتولدة أثناء تغليف الخلايا الفردية ، مما يؤدي إلى التلوث المتبادل والتعليق غير الصحيح لأنواع الخلايا ، في حين أن بروتوكولات التفكك الطويلة التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية يمكن أن تؤدي إلى زيادة تنظيم التوقيع الجيني للاستجابة للإجهاد في أنواع متعددة من الخلايا 8,9 ، 10.

يبدأ الإجراء التدريجي (الشكل 1 أ) الموضح في هذا البروتوكول بالتفكك الميكانيكي والأنزيمي السريع للأورام ، يليه الترشيح وإزالة الخلايا الميتة ، اعتمادا على صلاحية كل عينة ورم. في الوقت الحاضر ، تم التحقق من هذا الإجراء في سرطان الجلد11 ، القولون والمستقيم12 ، سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة13 ، عينات ورم البنكرياس والرئة (بيانات غير منشورة). تضمن هذه التقنيات توليد معلقات خلوية قابلة للحياة عالية الجودة ضرورية للتحليلات النهائية14. والجدير بالذكر أن إزالة خلايا الدم الحمراء ، الخالية من الحمض النووي الريبي المركب ، تصبح ضرورية لتنقية العينة15. يعمل التقييم اللاحق لعدد الخلايا والقضاء على الخلايا الميتة كشرط أساسي لنجاح توليد مستحلب حبة الجل 10x Genomics (GEM) ، والترميز الشريطي ، وزيادة استعادة النصوص والخلايا المتسلسلة دون تعريض استبعاد المجموعات السكانية الحساسة للخطر (على سبيل المثال ، العدلات والخلايا الظهارية)16. هذه الخطوات أساسية في إطلاق العنان لإمكانات تحليل دقة الخلية الواحدة داخل عينات الورم 9,10 ، والكشف عن ملفات تعريف التعبير الجيني الجديدة والتوقيعات المناعية اللازمة لدفع التدخلات العلاجية المبتكرة ، وتحديد نقاط الضعف الجديدة للورم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

امتثلت هذه الدراسة لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية المتعلقة بأخذ عينات الأنسجة البشرية. تم تلقي الموافقة المستنيرة من المرضى ، وتم إخفاء هوية بيانات العينة التي يمكن التعرف عليها. يتم جمع العينات في غرفة العمليات ، ووضعها في محلول RPMI أو محلول ملحي أو PBS ، وتأكيد إصابتها بالسرطان عبر قسم علم الأمراض قبل استخدامها في البحث. يجب تنفيذ جميع الخطوات ، باستثناء ما يشير إليه ، عند 4 درجات مئوية أو على الجليد. العمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند معالجة الأنسجة البشرية. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. الحصول على العينة

  1. احصل على عينة ورم صلبة في أنبوب من الوسائط وضعها على الثلج.
    1. اطلب من موظفي غرفة العمليات نقل العينة في أنبوب يحتوي على ما يكفي من RPMI أو محلول ملحي أو برنامج تلفزيوني لغمر الأنسجة تماما لتجنب جفاف العينة.
      ملاحظة: من المهم التأكد من عدم تجفيف العينة ، لأن ذلك سيقلل من صلاحيتها.
  2. قم بتبريد جميع أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية وجلب الخلاط الحراري إلى 37 درجة مئوية.
  3. أخرج إنزيمات تفكك الورم البشري أو الفأر المحضرة (جدول المواد) ، وقم بإذابة الجليد على الخلاط الحراري 37 درجة مئوية ، وانتقل إلى الجليد بمجرد إذابته.
  4. استرجع حصة 20 مل من RPMI.
  5. سجل معلومات العينة ذات الصلة (على سبيل المثال ، معرف المريض ، إلغاء التعريف ، نوع العينة).
  6. انقل العينة إلى طبق زراعة الأنسجة 60 مم (يوضع على الثلج) عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات وصب المحتويات في الطبق لضمان نقل جميع مواد العينة. إذا لم يتم تسليم العينة في الوسائط عند الوصول ، أضف وسائط RPMI جديدة إلى الطبق.
    1. إذا كانت العينة مجزأة ، فقم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق العينة في 420 ميكرولتر من RPMI ، وانتقل إلى القسم 2.

2. الهضم الميكانيكي والأنزيمي

  1. ماصة 420 ميكرولتر من الوسائط من طبق العينة 60 مم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. حاول تضمين أي أجزاء عينة معلقة في الوسائط.
  2. انقل عينة الأنسجة من طبق 60 مم إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على وسائط باستخدام الملقط. قم بتقطيع العينة بمقص نظيف داخل الأنبوب بحيث يبلغ قطر القطع 2-3 مم كحد أقصى.
  3. أضف إنزيمات الهضم ، المحضرة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة (جدول المواد) ، إلى العينة في الأحجام التالية: 42 ميكرولتر من الإنزيم H (البروتياز غير المحدد) للعينات البشرية ، الإنزيم D (البروتياز غير المحدد) لعينات الفئران ، 21 ميكرولتر من الإنزيم R (البروتياز غير المحدد) ، و 5 ميكرولتر من الإنزيم A (نوكلياز).
  4. أضف 420 ميكرولتر أخرى من الوسائط من الطبق أو حتى علامة 1 مل على الأنبوب. لا تتجاوز 420 ميكرولتر من الوسائط.
  5. دوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان ووضعه في خلاط حراري موضوع عموديا على جانبه (الشكل 1 ب). احتضان في 37 درجة مئوية ، 450 دورة في الدقيقة ، لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: أثناء الحضانة ، أخرج جميع مواد الجينوم 10x اللازمة لتوليد GEM ، لأنها تتطلب 30 دقيقة للتوازن مع درجة حرارة الغرفة

3. تصفية العينة

  1. ضع مرشح خلية 50 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وقم بتجهيز المرشح عن طريق تمرير 1 مل من وسائط RPMI الجديدة من خلاله إلى الأنبوب.
  2. بعد الهضم ، انقل العينة إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام طرف ماصة عريض منخفض الاحتفاظ به 1000 ميكرولتر. اغسل الأنبوب سعة 1.5 مل ب 1 مل من الوسائط الطازجة وانقل الوسائط إلى المرشح لضمان تمرير جميع مواد العينة عبر الفلتر.
  3. احصل على حقنة بلاستيكية سعة 1 مل وأخرج المكبس فقط (تخلص من باقي المحقنة). باستخدام الجزء الخلفي من مكبس المحقنة ، قم بطحن ودفع العينة على المرشح بحركة ملتوية.
  4. اغسل المرشح ب 5 مل من الوسائط وأي وسائط متبقية من الطبق الذي يحتوي على العينة (القسم 1) لجمع أي خلايا قد تكون انفصلت عن الأنسجة.
  5. ضع مرشح خلية 30 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل ، وقم بتجهيز المرشح ب 1 مل من الوسائط ، وانقل محتويات الأنبوب الذي يحتوي على العينة المنفصلة عبر المرشح.
    ملاحظة: ستزيل هذه الخطوة الحطام الكبير الذي قد يسد أو يتسبب في فشل الترطيب عند تشغيل العينة باستخدام رقائق الموائع الدقيقة 10x Genomics.

4. تحلل خلايا الدم الحمراء

  1. أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح وسائل الإعلام ، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
  2. أعد التعليق في المخزن المؤقت ACK Lysis لإزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وتسجيل الحجم المستخدم. يعتمد الحجم على حجم الحبيبات ومدى كرات الدم الحمراء في الحبيبات.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول عينة ACK المعاد تعليقه عديم اللون عند إضافة ما يكفي من محلول ACK Lysis ، حيث سيؤدي ذلك إلى إزالة خلايا الدم الحمراء من العينة.
  3. قم بطرد أنبوب العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، ونضح المادة الطافية.
  4. كرر الخطوات 4.2-4.3 حسب الحاجة حتى لا يكون لحبيبات العينة لون أحمر مرئي بعد الطرد المركزي (الشكل 2). سجل أي وحدات تخزين إضافية من المخزن المؤقت ACK Lysis المستخدم في هذه الخطوة.
  5. أعد تعليق عينة الحبيبات في وسائط جديدة استعدادا للعد.

5. عد الخلايا

  1. ضع 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق في أنبوب سعة 1.5 مل. امزج الخلايا المنفصلة برفق ، وخذ 10 ميكرولتر من العينة ، واخلطها (1: 1) مع التريبان الأزرق. تحميل 10 ميكرولتر على كل جانب من مقياس الدم وعد الخلايا.
  2. سجل تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا الحية ونسبة الصلاحية وحجم الوسائط النهائي بعد العدد.
  3. تأكد من أن عدد الخلايا يتراوح بين 700 و 1200 خلية / ميكرولتر (7 × 105- 1.2 × 106 / مل) لتشغيل الجينوم 10x الأمثل.
    1. إذا كانت العينة مركزة للغاية ، فقم بتخفيفها بالوسائط وأعد فرزها.
    2. إذا كانت العينة مخففة جدا ، فقم بطرد العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في حجم أقل من الوسائط.
    3. إذا كانت صلاحية الخلية أقل من 80٪ ، فقم بإجراء حي ميت لإزالة الخلايا الميتة.
    4. إذا كان هناك أقل من مليون خلية ، انظر القسم 6.
    5. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء > 10٪ ، انظر القسم 6.
    6. إذا كان هناك أكثر من مليون خلية وقابلية البقاء < 10٪ ، انظر القسم 7.
    7. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

6. إزالة الخلايا الميتة - كيت 1

ملاحظة: اعمل داخل غطاء السلامة الحيوية عند استخدام كواشف إزالة الخلايا الميتة ، حيث يمكن أن تتلوث بسهولة.

  1. أجهزة الطرد المركزي العينة في 450 × جم ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. قم بإعداد وسائط العزل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة: 9.8 مل من PBS ، و 10 ميكرولتر من CaCl2 ، و 200 ميكرولتر من FCS المعطل بالحرارة (يضاف في غطاء السلامة البيولوجية).
  3. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط الوسائط من الحبيبات وأعد تعليقها في 1 مل من وسائط العزل.
  4. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 450 × غرام ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من وسائط العزل.
  5. نقل 100 ميكرولتر من العينة في وسائط العزل إلى بئر واحد من أنبوب شريط PCR سعة 0.2 مل.
  6. في غطاء السلامة الأحيائية ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل Annexin V و 10 ميكرولتر من كوكتيل اختيار البيوتين إلى البئر الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من العينة في وسط العزل. ماصة خلط الحل والسماح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
  7. بعد 4 دقائق ، دوامة الجسيمات المغناطيسية المغلفة ديكستران لمدة 30 ثانية. أضف 20 ميكرولتر من الخرز و 60 ميكرولتر من وسائط العزل إلى العينة (حجم إجمالي 200 ميكرولتر). إذا كانت الصلاحية أقل من 40٪ ، فقم بقياس كمية الخرز حتى 40 ميكرولتر أثناء ضبط حجم وسائط العزل (حتى 40 ميكرولتر) ، مع الحفاظ على حجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر. مزيج ماصة والسماح للحل بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  8. ضع الأنبوب الشريطي على فاصل مغناطيسي 10x Genomics (على الإعداد العالي) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. انقل السائل من الأنبوب الشريطي دون إزعاج الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل من الربط. لا تقم بإزالة الأنبوب الشريطي من المغناطيس.
  10. جهاز طرد مركزي أنبوب 1.5 مل يحتوي على العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وخلايا العد, كما هو موضح في القسم 5. كرر إجراء إزالة الخلايا الميتة إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ (الشكل 3 والشكل 4).
    ملاحظة: لا تقم بإعادة تعليق الخلايا في وسائط العزل لتوليد GEM النهائي ، لأن كلوريد الكالسيوم سيتداخل مع عملية التغليف وخطوة النسخ العكسي (RT).
  11. احتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

7. إزالة الخلايا الميتة - كيت 2

ملاحظة: اعمل داخل غطاء للسلامة البيولوجية عند استخدام كواشف المجموعة.

  1. ضع الميكروبيدات ومحلول مخزون 20x Binding Buffer داخل غطاء السلامة البيولوجية.
  2. جهاز طرد مركزي تعليق العينة عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. قم بإعداد محلول عازل واحد × في ظروف معقمة باستخدام 1 مل من محلول مخزون 20x Binding Buffer الذي تم سحبه إلى 19 مل من الماء المقطر الخالي من الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
  4. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم باستنشاق المادة الطافية ، وأضف الميكروبيدات ، واخلط العينة برفق ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    1. عندما يكون عدد الخلايا 107 أو أقل ، أضف 100 ميكرولتر من الميكروبيدات.
    2. بالنسبة للأعداد التي تزيد عن 107 خلايا إجمالية ، اضبط الميكروبيدات للحصول على تركيز نهائي قدره 100 ميكرولتر لكل 107 خلايا حية.
  5. أثناء الحضانة ، احصل على عمود اختيار موجب واحد ل MACS ، و MACS multistand ، والفاصل المغناطيسي المقابل. تأكد من تسوية الفاصل على الحامل المتعدد وعدم وجود جسم معدني أو مغناطيسي آخر بالقرب من الحامل ، حيث أن القوة المغناطيسية قوية ويمكن أن تؤثر على كفاءة إزالة الخلايا الميتة. ضع العمود بإحكام في حامل فاصل مع توجيه الأجنحة للخارج.
  6. بعد حضانة العينة ، إذا كان إجمالي حجم إعادة التعليق أقل من 500 ميكرولتر ، أضف 1x Binding Buffer حتى يصبح الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر.
  7. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل أسفل العمود وقم بتجهيز العمود ب 3 مل من 1x Binding Buffer.
  8. استبدل الأنبوب المخروطي بأنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل لجمع عينات الخلايا وأضف العينة إلى العمود ، مما يسمح لها بالتدفق بالكامل عبر العمود.
  9. اغسل العمود 4 × 3 مل من 1x Binding Buffer ، مع إضافة غسلة واحدة فقط في كل مرة بعد تدفق الغسيل السابق بالكامل عبر العمود.
  10. بعد الغسيل الرابع ، يتم طرد الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا المعزولة لمدة 5 دقائق عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية. تجاهل العمود والمخزن المؤقت للربط 1x المتبقي.
  11. أعد تعليق محلول العينة في الكمية المناسبة من وسائط RPMI بناء على حجم الحبيبات وعد الخلايا المعزولة باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 5 (الشكل 3 والشكل 5).
    1. إذا ظلت الصلاحية أقل من 80٪ ، وكان العدد الإجمالي للخلايا 106 أو أقل ، كرر القسم 6.
    2. إذا كانت صلاحية الخلية أعلى من 80٪ ، فاحتفظ بالخلايا المعالجة على الجليد وانتقل فورا إلى توليد GEM وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم الحصول على خزعة سرطان الجلد المعلقة في RPMI ووضعها على الفور على الجليد. تم نقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 420 ميكرولتر من RPMI وإنزيمات الهضم ، وتم فرمها إلى قطع صغيرة باستخدام مقص ، وخضعت للهضم الأنزيمي اللاحق لمدة 15 دقيقة في خلاط حراري رأسيا 37 درجة مئوية (الشكل 1). بعد الهضم ، تم ترشيح العينة من خلال مرشح معقم يمكن التخلص منه 50 ميكرومتر ، وتم غسل المرشح باستخدام RPMI جديد لزيادة إنتاجية الخلية (الشكل 1). تم التخلص من الأجزاء ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول تفكك عينات ورم الإنسان أو الفئران إلى تعليق خلية واحدة لتسلسل scRNA باستخدام نظام الموائع الدقيقة 10x Genomics. عند معالجة الأنسجة التي غالبا ما تأتي من سرطانات نادرة أو تشكل جزءا من التجارب السريرية الجارية أو التجارب الطويلة لأورام الفئران ، يجب الحفاظ على العينة على النحو الأمثل وبعناية بين جميع الخطوات. يجب تنفيذ جميع الخطوات بسرعة على الجليد أو عند 4 درجات مئوية للحفاظ على ملامح الحمض النووي الريبي الخلوي الأصلي ومنع التدهور ، لأن العمل في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة سيؤثر على جودة النسخ

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

م.س-ف. تلقى تمويلا من بريستول مايرز سكويب ، Istari Oncology ، وكان مستشارا لعلاجات Galvazine.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أديلسون للأبحاث الطبية (AMRF) ، وتحالف أبحاث سرطان الجلد (MRA) ، و U54CA224068. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 4 والشكل 5 باستخدام BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x PBSCorning21-040-CV
10 مل ماصة مصليةCorning357551
1000 & mu ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظRainin30389213
1000 مو ؛ L أطراف ماصة عريضة منخفضة الاحتفاظRainin30389218
1000 & أطراف ماصة LRainin30389212
فاصل مغناطيسي 10x10x الجينوم120250
أنابيب مخروطية 15 ملCorning430052
مل ماصة شفطCorning
20 & mu ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظRainin30389226
20 & mu ؛ أطراف ماصة LRainin30389225
200 مو ؛ L أطراف ماصة منخفضة الاحتفاظRainin30389240
200 مو ؛ أطراف ماصةL Rainin30389239
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلينFalcon352098
60 × 15 مم طبق زراعة الأنسجةFalcon353004
ACK Lysing BufferGibcoA10492-1
BD 1 مل حقنةBecton و Dickinson and Company3090659
مقياس كثافة الدم الساطعالخط Hausser Scientific551660
محلول كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتش2115-100 مل
خلية رينجر  10x الجينومN / Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
شرائح عد الخلايا لعداد الخلايا TC20Bio-Rad1450015
CellTrics 30 & mu ؛ م مرشحات معقمة يمكن التخلصSysmex04-004-2326
CellTrics 50 & mu ؛ م مرشحات معقمة يمكن التخلصSysmex04-004-2327
طقم إزالة الخلايا الميتة   ؛Miltenyi Biotec130-090-101مخزن عند -20 درجة ؛ C; المجموعة 2
ملقط تشريح ، طرف ناعمVWR82027-386
DNA LoBind أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.5 ملEppendorf22431021
EasySepTM إزالة الخلايا الميتة
(Annexin V) Kit		STEMCELL Technologies17899Store at 4 & deg ؛ C; المجموعة 1
جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5425REppendorf5406000640
أجهزة الطرد المركزي Eppendorf 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 وحدة تحكم الماصةالإلكترونية EppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 موديل 5384EppendorfEP5384000012
FBSGibco26140-079يخزن في درجة حرارة 4 درجات. C ، استخدم في غطاء بيولوجي
مقص ألماني غير قابل للصدأأدوات العلومالدقيقة 14568-12
Leica Dmi1 مجهرLeica Microsystems454793
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS ماصة L-1000XLS +Rainin17014382
Pipet-Lite LTS ماصة L-200XLS +Rainin17014391
Pipet-Lite LTS ماصة L-20XLS +Rainin17014392
Quadro MACS MagnetMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-076Store at 4 & deg; C
TempAssure 0.2 مل PCR 8-Tube شرائط الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1402-4700
Trypan Blue stain 0.4٪Thermo Fisher ScientificT10282
طقم تفكك الورم ، HumanMiltenyi Biotec130-095-929يخزن في -20 درجة ؛ ج ، قم بإعداد الإنزيمات وفقا لتعليمات المجموعة:
إعادة تكوين قارورة إنزيم H المجففة بالتجميد في 3 مل من RPMI 1640
إعادة تكوين قارورة الإنزيم R المجففة بالتجميد في 2.7 مل من RPMI 1640
إعادة تكوين قارورة الإنزيم المجفف بالتجميد A في 1 مل من Buffer A المزود بالمجموعة.
طقم تفكك الورم ، فأرMiltenyi Biotec130-096-730يخزن في -20 درجة ؛ ج ، قم بإعداد الإنزيمات وفقا لتعليمات المجموعة:
إعادة تكوين قارورة الإنزيم D المجففة بالتجميد في 3 مل من RPMI 1640
إعادة تكوين قارورة إنزيم R المجففة بالتجميد في 2.7 مل من RPMI 1640
إعادة تكوين قارورة الإنزيم المجفف بالتجميد في 1 مل من العازلة A المزودة بالمجموعة.
ماء مقطر فائق النقاءInvitrogen10977-015يخزن في 4 درجات ؛ ج
2 357558 منها منها

المراجع

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تفكيك أنسجة الورمتحضير معلق خلويعينات أورام بشريةعينات أورام فئرانالتفكيك الميكانيكيالتفكيك الإنزيميتحلل كريات الدم الحمراءإثراء الخلايا الحية والميتةعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم
تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.