الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري باستخدام ضغط هواء ثابت للحصول على ردود فعل على فتح الإبرة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تجميع نظام هوائي لتوصيل الهواء المضغوط إلى إبرة أثناء عملية ميل الإبرة. يصف البروتوكول كذلك عملية الميلا لإنشاء إبر حقن مجهرية حادة وكيفية قياس حجم الفتحة النسبية للإبرة.

الملخص

تعد إبر الحقن المجهري أداة حاسمة في توصيل كواشف تعديل الجينوم ، ومكونات كريسبر (الحمض النووي الريبي الموجه ، وبروتين Cas9 ، وقالب المانح) ، ومكونات نظام الترانسبوزون (البلازميدات و transposase mRNA) في أجنة الحشرات النامية. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة مهمة بشكل خاص أثناء توصيل هذه العوامل المعدلة لأنها تساعد في تقليل الضرر الذي يلحق بالجنين الذي يتم حقنه ، وبالتالي زيادة بقاء هذه الأجنة مقارنة بالحقن بإبر غير مشطوفة. علاوة على ذلك ، ينتج عن ميل الإبر إبر أكثر اتساقا من إبرة إلى إبرة مقارنة بالإبر المفتوحة عن طريق كسر طرف الإبرة بشكل عشوائي عن طريق تنظيف الطرف بجسم ما (جانب غطاء ، سطح الجنين المراد حقنه ، إلخ). تسمح عملية الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري بهواء ضغط ثابت يتم توصيله إلى الإبرة للشخص الذي يثني الإبرة بمعرفة متى تكون الإبرة مفتوحة (وجود فقاعات) ويعطي أيضا مؤشرا نسبيا على حجم فتحة الإبرة. يمكن تحديد حجم الفتحة النسبية في الإبرة عن طريق ضبط ضغط الهواء الذي يتم توصيله إلى الإبرة حتى يتم الوصول إلى التوازن وتتوقف الفقاعات عن التدفق من طرف الإبرة. كلما انخفض الضغط الذي يتم عنده الوصول إلى التوازن ، زاد حجم الإبرة ؛ وعلى العكس من ذلك ، كلما زاد الضغط ، قل حجم الإبرة.

المقدمة

التعديل الوراثي للحشرات هو عملية تم تطويرها في الأصل في ذبابة الفاكهة بواسطة Rubin و Spradling ، وعلى مر السنين ، تم تعديل هذه العملية لإنشاء تعديلات وراثية في الأنواع الأخرى¹. تعتمد العملية على التسليم الدقيق لمكونات التعديل التي يتم حقنها في الأجنة في نافذة زمنية ومكانية محددة داخل الجنين^{النامي 2،3،4}. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة أداة حاسمة في عملية التعديل الوراثي لبعض الحشرات ، مثل البعوض^{4،5،6،7،8،9} وذباب الرمل¹⁰ بينما ليست حرجة للحشرات الأخرى ، مثل ديدان القز¹¹. غالبا ما تكون الإبر الحادة عاملا رئيسيا بين النجاح والفشل عند محاولة إنشاء حشرة معدلة وراثيا ^2,4. عادة ، يتم سحب الإبر الزجاجية ذات الشعيرات الدموية الدقيقة عن طريق تسخين الزجاج إلى النقطة التي يصبح فيها الزجاج مرنا ، مما يسمح بسحب الشعيرات الدموية إلى إبرة طرف مغلق مستدق. قبل استخدام الإبرة ، يجب فتحها بطريقة تخلق طرفا حادا للحقن. تقليديا ، يتم فتح الإبر عن طريق تنظيف طرف الإبرة برفق ضد شيء (حافة الشريحة / غطاء الغطاء ، أو الجنين ، وما إلى ذلك) الذي يتسبب في انفصال كمية صغيرة من الزجاج عن الطرف ، مما يؤدي بشكل عشوائي إلى إنشاء طرف حاد ^2,3. عملية أقل عشوائية قليلا هي الميلا الجاف ، حيث يتم إنزال الإبرة بسرعة على لوحة كاشطة مسطحة بصريا ودوارة لفترة قصيرة من الزمن ، مما يتسبب في تآكل كمية صغيرة من الزجاج من طرف الإبرة ، مما يخلق طرفا حادا. الميلا الجاف أقل عشوائية قليلا من تنظيف طرف الإبرة بشيء ما. يأخذ البروتوكول الموضح أدناه عملية الميلا خطوة إلى الأمام من خلال توفير الهواء المضغوط للإبرة المشطوفة وميلها تحت طبقة سائلة بحيث تكون الفقاعات مرئية بمجرد فتح الإبرة. يفصل هذا البروتوكول طريقة لإنتاج إبر حقن مجهرية حادة بشكل موثوق. يعد الميلا تحت طبقة سائلة تحسنا على كسر الإبرة بشكل عشوائي كما هو موضح أعلاه ، والميلا الجاف لأن المستخدم يتلقى ملاحظات حول عملية الميلا ، مما يسمح للشخص الذي ينحني بمعرفة متى تكون الإبرة مفتوحة ومدى حجم فتحة الإبرة نسبيا. يمكن أن تسمح معرفة حجم الفتح النسبي لطرف الإبرة للشخص المائل بإنشاء إبر بأحجام فتح مختلفة. أحجام فتح الإبرة المختلفة لها مزايا مختلفة ؛ على سبيل المثال ، يمكن أن تستوعب أحجام فتح الإبرة الأكبر خلطات الحقن ذات اللزوجة العالية ، بينما تسبب إبر الفتح الأصغر ضررا أقل للجنين الذي يتم حقنه.

يتم توفير الهواء للإبرة باستخدام منظم ونظام أنابيب يوريتان يعتمد على نظام حقن معدل ينظم ضغط الهواء². بينما يتم تزويد الإبرة بالهواء عند ضغط ثابت ، تكون الإبرة مشطوفة تحت طبقة من السائل. تتكون عملية الميلا من عملية متكررة من خمس خطوات: 1) خفض الإبرة إلى السطح الكاشطة ، 2) السماح للإبرة بالشطبة لفترة قصيرة من الزمن ، 3) رفع الإبرة بعيدا عن اللوحة الكاشطة مع إبقائها تحت سطح الطبقة السائلة ، 4) إيقاف دوران اللوحة الكاشطة للتحقق من ظهور الفقاعات. في حالة عدم وجود فقاعات ، يتم تكرار الخطوات من 1 إلى 4 حتى تظهر الفقاعات ؛ 5) بمجرد وجود الفقاعات ، يمكن تعديل ضغط الهواء لتحديد حجم الفتح النسبي للإبرة. كلما انخفض الضغط اللازم لوقف تكوين الفقاعة ، زادت الفتحة عند طرف الإبرة.

البروتوكول

ملاحظة: يستخدم البروتوكول كما هو موضح أدناه الشعيرات الدموية الدقيقة Sutter BV-10 المشطوفة. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول للاستخدام مع أي نموذج مشطوف الشعيرات الدموية الدقيقة.

1. تجميع المنظم ومقياس الضغط وأنابيب إمداد الهواء

1. قطع جزء من أنابيب اليوريتان للتوصيل من مصدر الهواء إلى قاعدة المنظم (R ؛ القسم 1 ، الشكل 1). يعتمد طول هذا القسم على المسافة من إمداد الهواء إلى المنظم ، والذي سيكون موجودا بجوار المشطاة.
2. حرك مشبك خرطوم على أنبوب اليوريتان ، ثم ادفع موصل خرطوم في نهاية الأنبوب. تأكد من إدخال موصل الخرطوم بالكامل عن طريق وضع موصل الخرطوم على سطح صلب. أثناء إمساك الأنبوب بالقرب من موصل الخرطوم ، اضغط على الأنبوب بقوة في الخرطوم حتى يتم إدخال موصل الخرطوم بالكامل. معا ، يشكل مشبك الخرطوم وموصل الخرطوم اتصال HC (الشكل 1).
3. حرك مشبك الخرطوم لأعلى حتى نهاية الأنبوب حيث يتم إدخال موصل الخرطوم. قم بتدوير مشبك الخرطوم فوق الطرف الشائك المدرج بحيث يشكل اتصالا محكم الإغلاق.
4. قم بربط موصل الخرطوم في قاعدة المنظم (R) يدويا ، ثم قم بإنهاء شد الاتصال بمفتاح ربط صغير. تأكد من أن الاتصال محكم الإغلاق ولكن ليس شديد الإغلاق.
5. في المنفذ الجانبي للمنظم ، قم بربط موصل T (T) يدويا ، ثم استخدم مفتاح ربط صغير لإنهاء الشد.
6. قطع قطعة صغيرة من أنابيب يوريتان (الشكل 1 ، القسم 2) ، طولها حوالي 3-5 سم. ضع اثنين من مشابك الخرطوم على قطعة الأنبوب ، ثم أدخل موصل خرطوم في كل طرف من طرفي الأنبوب وقم بإنهاء التوصيلات (HC) كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4 لكل طرف من طرفي الأنبوب.
7. قم بربط أحد طرفي الأنبوب القصير في قاعدة مقياس الضغط ، ثم قم بإنهاء الشد بمفتاح ربط كما في الخطوة 1.5.
8. قم بربط الطرف الآخر من الأنبوب القصير بأحد المنافذ الموجودة على الموصل T (T) المتصل بالمنظم في الخطوة 1.5.
9. قطع جزء من أنابيب اليوريتان (الشكل 1 ، القسم 3) للتوصيل بين المنظم وحامل الإبرة (NH). يعتمد حجم هذا القسم على المسافة من الشطبة إلى موقع المنظم.
10. ضع مشبك خرطوم على قسم الأنبوب ، ثم أدخل موصل خرطوم كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4.
11. على الجانب الآخر من هذا القسم من الأنبوب ، ضع موصل luer الأنثوي (LC) المزود بحامل الإبرة (NH).
12. قم بإزالة مشبك التثبيت وغسالة النايلون (الشكل 2 ، و) من المعالج. تم تصميم مشبك التثبيت والغسالة لحمل الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية فقط ، وهي ليست مصممة لتحمل الوزن الإضافي لحامل الشعيرات الدموية الدقيقة ، والقضيب الملولب ، وأنابيب إمداد الهواء.
13. قطع قطعة مستطيلة من ورقة التعبئة المطاطية 1.5 سم × 2 سم لف قضيب الملولبة في مشبك رفرف الدراجة. سيساعد ذلك في تثبيت القضيب الملولب وحامل الإبرة بشكل أكثر أمانا في مشبك مصد الدراجة. باستخدام كماشة أنف إبرة ، افتح مشبك مصدات الدراجات ، وقم بطي القطعة المستطيلة من ورقة التعبئة المطاطية فوق القضيب الملولب 3.5 سم من أحد طرفي القضيب بحيث تشكل حرف U فوق القضيب. أدخل القضيب الملولب المغطى بالألواح المطاطية في مشبك مصدات الدراجات المفتوح واستخدم الزردية لإغلاق المشبك حول القضيب والصفيحة المطاطية. قم بتثبيت مشبك الدراجة ومجموعة القضبان الملولبة على مسمار المناور ، واستبدل مشبك التثبيت بدون غسالة النايلون ، وشد مشبك التثبيت حتى يثبت مجموعة القضيب الملولبة بإحكام.
14. خيط حامل الإبرة على القضيب الملولب. تأكد من أن موصل luer ينتهي في وضع لا يربط أنبوب اليوريتان عند توصيله (الشكل 2 ، ز).
15. قم بتوصيل موصل luer الأنثوي بموصل luer الذكر (الشكل 2 ، ز) لحامل الإبرة (الشكل 2 ، د).
16. قم بتوصيل الطرف الحر من أنبوب الشكل 1 ، القسم 1 بإمداد الهواء (سيختلف هذا الاتصال بناء على مصدر الهواء المستخدم). يجب أن يكون مصدر الهواء نظيفا وجافا وخاليا من بقايا الزيت. يمكن أن يكون إمداد الهواء من مصدر هواء المنزل أو أسطوانة الغاز ، إما الهواء المضغوط أو النيتروجين.

2. إبر البورسليكات الميلا

1. اسحب إبر الحقن المجهري باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة المصنوعة من زجاج البورسليكات مع الإعدادات التالية على الجهاز: الحرارة: 305 ، Fil: 4 ، Vel: 70 ، Del: 235 ، Pul: 160 ، مع وقت حلقة 12.24.
2. قم بتجميع مجموعة الطحن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، والتي تتكون من اللوحة الكاشطة وحلقة التثبيت بالمغناطيس¹².
   ملاحظة: قد تحتاج اللوحة الكاشطة إلى لفها بشريط رفيع من الفيلم الشفاف لمنع التسرب المبكر ل Photo-Flo (عامل الترطيب) من اللوحة الكاشطة. هذا مطلوب فقط إذا تسرب محلول عامل الترطيب قبل الأوان إلى زيت القاعدة ، مما يتسبب في توقف لوحة الطحن عن الدوران. يقلل عامل الترطيب من خطر علامات التجفيف على الإبر الزجاجية بعد الميلات. استخدام عامل ترطيب ليس أمرا بالغ الأهمية لعملية الميلا ، ويمكن استبدال الماء.
3. ضع 10 قطرات من زيت القاعدة على سطح القاعدة المسطح بصريا وضع مجموعة الطحن في الأعلى. ابدأ تجميع الطحن.
4. قم بتشغيل مصدر الضوء لإضاءة السطح. تأكد من وضع مصدر الضوء خلف المشطوفة ويضيء بزاوية 45 درجة على اللوحة الكاشطة والإبرة. زاوية الإضاءة ضرورية بحيث يمكن رؤية ظل الإبرة بسهولة. عند التكبير 90x ، قم بتدوير رأس المجهر في مكانه. أوقف دوران اللوحة الكاشطة لفترة وجيزة وركز المجهر على سطح اللوحة الكاشطة.
5. أضف 1٪ عامل ترطيب إلى الفتيل حتى يصبح الفتيل رطبا تماما. أضف عامل ترطيب بنسبة 1٪ إلى سطح اللوحة الكاشطة. تأكد من أن عامل الترطيب يغطي السطح الكاشطة ولكنه لا يتسرب إلى حلقة التثبيت السوداء.
6. ضع الفتيل المبلل مسبقا على سطح اللوحة الكاشطة أثناء دورانها. تأكد من أن الفتيل على الجانب الأيسر من اللوحة الكاشطة (وأنت تنظر لأسفل من الأعلى) ويمتد من الساعة 11 إلى الساعة 6 (مع وضع اللوحة كوجه للساعة). تأكد من أن الفتيل لا يركب على الجزء الأسود من حلقة التثبيت.
7. أدخل إبرة في حامل الإبرة (الشكل 2 ، د) وشد حلقة التثبيت لتثبيت الإبرة في مكانها. افتح المنظم (الشكل 1 ، R) وقم بزيادة الضغط إلى 24 رطل / بوصة مربعة.
8. ارفع حامل الإبرة عن طريق تدوير مقبض ضبط المسار (الشكل 2 ، أ) تأكد من رفع الإبرة عاليا بدرجة كافية بحيث تكون أعلى من سطح اللوحة الكاشطة الدوارة ، ثم قم بتدوير المناور بالكامل بحيث تتأرجح الإبرة في مكانها فوق اللوحة الكاشطة الدوارة. يجب وضع الإبرة المراد شطبها على اللوحة الكاشطة الدوارة الموجهة بحيث يتحرك دوران اللوحة بعيدا عن طرف الإبرة (الشكل 3 أ)
9. عند المشاهدة من الجانب ، استخدم مقبض الضبط الخشن (الشكل 2 ، أ) لخفض الإبرة باتجاه سطح اللوحة الكاشطة. توقف عندما تكاد الإبرة تلامس سطح السائل.
10. استخدم التكبير / التصغير لخفض تكبير المجهر ، ثم حرك المجهر بحيث تكون الإبرة في وسط مجال الرؤية. بمجرد الوصول إلى مركز الرؤية ، قم بزيادة التكبير ، وضبط موضع المعالج بحيث يظل طرف الإبرة في مركز الرؤية. بمجرد الوصول إلى أقصى تكبير ، أوقف لوحة الطحن وركز المجهر على سطح اللوحة الكاشطة ، ثم أعد تشغيل دوران اللوحة على الفور بمجرد التركيز على السطح. قد لا تكون الإبرة في العرض في هذه المرحلة.
11. باستخدام مقبض الضبط الخشن للمناور ، اخفض الإبرة باتجاه اللوحة الكاشطة. في مجال الرؤية ، ستكون صورة الإبرة وظل (ظلال) الإبرة مرئية. عندما تكون الإبرة وظل (ظلال) الإبرة على وشك اللمس ، قم بالتبديل إلى مقبض الضبط الدقيق للمعالج واستمر في خفض الإبرة حتى تظهر الإبرة وظلالها (ظلالها) وكأنها تتلامس. في هذه المرحلة ، اقرأ الفرجار (الشكل 2 ، ج) ولاحظ القراءة. سطح اللوحة الكاشطة عند أو أسفل قراءة الفرجار هذه.
    ملاحظة: من الصعب رؤية متى تلامس الإبرة سطح اللوحة الكاشطة الدوارة ، لذلك قد لا تلمس الإبرة اللوحة الكاشطة في هذه المرحلة.
12. اسمح للإبرة بالبقاء عند هذا المستوى من قراءة الفرجار لمدة 5-10 ثوان.
13. باستخدام مقبض الضبط الدقيق للمناور ، ارفع الإبرة ، وتأكد من بقائها تحت سطح عامل الترطيب. أوقف دوران اللوحة الكاشطة لبضع ثوان ولاحظ ما إذا كانت الفقاعات تهرب من طرف الإبرة. في حالة وجود فقاعات ، انتقل إلى الخطوة 2.15. في حالة عدم وجود فقاعات، انتقل إلى الخطوة 2.14.
14. حرك الإبرة مرة أخرى إلى قراءة الفرجار باستخدام مقبض الضبط الدقيق للمناور ، ثم حركها لأسفل قليلا وخذ قراءة جديدة للفرجار ، ثم كرر الخطوات 2.12-2.13.
15. ابدأ تشغيل اللوحة الكاشطة مرة أخرى لمعرفة ما إذا كان تكوين الفقاعة يمكن ملاحظته أثناء دوران اللوحة. إذا كان الدليل على تكوين الفقاعة مرئيا أثناء دوران الصفيحة ، فمن المحتمل أن تكون فتحة طرف الإبرة كبيرة جدا بالنسبة للحقن المجهري للأجنة الحساسة ، مثل حقن أجنة البعوض. إذا كان تكوين الفقاعة غير مرئي أثناء دوران اللوحة الكاشطة ، فإن فتحة الإبرة مثالية للاستخدام في الإجراءات التي تتطلب إبرة فتح حادة وصغيرة.
16. استخدم مقبض ضبط مسار المناور لرفع الإبرة فوق اللوحة الكاشطة إلى موضع مرتفع بدرجة كافية فوق اللوحة بحيث لا تصطدم الإبرة بأي شيء حيث يتم تدوير المعالج بالكامل لتحريك الإبرة بعيدا عن اللوحة الكاشطة والمجهر.
17. بمجرد أن تصبح الإبرة في وضع يمكن إزالته دون الاصطدام بأي شيء ، اخفض ضغط الهواء إلى الصفر ، وأزل الإبرة ، وضعها في صندوق تخزين الإبرة (طبق بتري مع شريط لاصق مزدوج أو طين نمذجة لتثبيت الإبر المشطوفة) حتى الاستخدام.

3. تحديد حجم الفتح النسبي للإبرة المشطوفة

ملاحظة: يتم تحديد أحجام الفتحات النسبية للإبرة المشطوفة في الخطوة 2.13. تصف الخطوات أدناه هذه العملية بشكل أكبر.

1. بمجرد ملاحظة الفقاعات في الخطوة 2.13 ، مع عدم تدوير اللوحة الكاشطة ، قم بتقليل ضغط الهواء ببطء عن طريق تدوير مقبض ضبط المنظم (الشكل 1 ، R) حتى تتوقف الفقاعات عن التدفق من طرف الإبرة. لاحظ الضغط الذي تتوقف عنده الفقاعات عن التدفق من الحافة.
2. قم بزيادة ضغط الهواء حتى تتدفق الفقاعات مرة أخرى من طرف الإبرة. كلما زاد الضغط ، كلما كان فتح الإبرة أصغر.
3. تابع تحريك الإبرة إلى موضع يمكن إزالته بأمان الخطوات 2.16-2.17.

النتائج

الإجراء الموصوف أعلاه ينتج إبر حقن مجهرية حادة باستمرار. تتميز الإبر الحادة بأنها قادرة على إدخالها في أجنة حشرات المشيمية الناعمة ، مثل أجنة البعوض ، مع مقاومة قليلة أو معدومة من غشاء الجنين. عندما يتم حقن أجنة البعوض بالمجهر للتعديل الوراثي ، يكون غشاء الجنين مرنا نسبيا. سيؤدي دفع إبرة باهتة ضد غشاء الجنين إلى وضع مسافة بادئة (الشكل 4 ب). عندما يتم سحب الإبرة للخلف ، يستعيد الغشاء شكله. مع الضغط الكافي ، سوف تمزق الإبرة الباهتة في النهاية عبر الغشاء ، ومن المحتمل أن تتسرب البلازما الجنينية. كلما كانت الإبرة أكثر حدة ، قل المسافة البادئة عند ضغط الإبرة على غشاء الجنين (الشكل 4E). بدلا من التمزق في الغشاء ، سوف تنزلق إبرة حادة عبر الغشاء ، مما يتسبب في ضرر ضئيل أو معدوم للجنين. باستخدام الإبرة المثالية ، لن يكون هناك أي مسافة بادئة تقريبا لغشاء الجنين حيث تنزلق الإبرة إلى الجنين.

مرفق تحويل الحشرات بجامعة ميريلاند (UM-ITF) هو مرفق خدمة يخلق حشرات معدلة وراثيا للعملاء في الأوساط الأكاديمية والصناعية. يستخدم المرفق إبرا مشطوفة للحقن المجهري لأجنة البعوض. خلال الفترة بين يناير 2023 وديسمبر 2023، حقن UM-ITF 12,795 جنين الزاعجة عبر 56 مشروعا عميلا (الجدول 1). ساعد استخدام الإبر المشطوفة UM-ITF في الحفاظ على متوسط فتحة ما بعد الحقن بنسبة 31٪ عبر المشاريع (الجدول 2). علاوة على ذلك، تمكنت UM-ITF من الحفاظ على معدل نجاح الحقن بنسبة 96٪، على النحو الذي تحدده متابعة ما بعد المشروع مع العملاء (الجدول 2). نجاح الحقن هو مقياس لما إذا كانت مواد الحقن (أدلة كريسبر ، بروتين Cas9 ، بلازميدات ناقل الترانسبوزون ، إلخ) التي تم حقنها قد تم تسليمها إلى أجنة المشروع بطريقة تمكنت فيها هذه المواد من إحداث تعديل وراثي ، في الأساس ، هل كان هناك دليل على إنشاء كريسبر إندل ، أو إدخال ناقل قائم على ترانسبوزون العملاء أو إدخال ناقل لمراقبة جودة الحقن (ينتهي الترانسبوزون بعلامة زائد). بمعنى آخر ، هل كانت الحقن جيدة بما يكفي لإنتاج تعديل وراثي ، إذا كانت المكونات المحقونة تعمل بشكل صحيح. هناك العديد من العوامل التي تساهم في نجاح مشروع التعديل الوراثي ، والحقن المجهري عالي الجودة بالإبر الحادة هو عامل رئيسي للنجاح. تمكن إبر الميلا باستخدام الإجراء الموضح في البروتوكول أعلاه UM-ITF من إنتاج إبر حقن مجهرية حادة عالية الجودة باستمرار، مما يسمح ل UM-ITF بإعطاء حقن ناجحة باستمرار.

الشكل 1: رسم تخطيطي لمكونات نظام الهواء والاتصال بالشعيرات الدموية الدقيقة. يتم توصيل الهواء إلى الإبرة الشعرية من خلال نظام من أنابيب اليوريتان من مصدر الهواء (إما هواء المنزل أو أسطوانة الهواء). يتم توصيل أنابيب اليوريتان بالمنظم (R) ومقياس الضغط بواسطة وصلات الخرطوم (HC) ، والتي تتكون من موصل خرطوم ومشبك خرطوم. يتم تثبيت مسامير توصيل الخرطوم في وصلة أنثى من 10-32 خيطا على قاعدة المنظم (R) ومقياس الضغط. يتم توصيل موصل T (T) بالمنظم (R) لانسكاب الهواء بين مقياس الضغط وحامل الإبرة (NH). يتم توصيل أنبوب اليوريتان بحامل الإبرة بواسطة موصل luer (LC) المزود بحامل الإبرة (NH). سيختلف الاتصال بمصدر الهواء اعتمادا على مصدر الهواء المستخدم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أجزاء المناور وإعداد الهواء. أجزاء المعالج: أ. مقبض ضبط خشن ، ب. مقبض ضبط دقيق ، ج. الفرجار ، د. حامل إبرة WPI ، ه. مقياس الزاوية ، و. الاحتفاظ بالمشبك ومشبك درابزين الدراجة ، ز. محول luer وموصل خرطوم luer ، وأنابيب يوريتان ح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: وضع الإبرة فيما يتعلق بدوران اللوحة الكاشطة. (أ) وضع الإبرة بشكل صحيح أثناء الميلا . يجب وضع الإبرة المراد شطبها على اللوحة الكاشطة الدوارة الموجهة في مكان ما بين عمودي على الدوران وبما يتماشى مع الدوران ، حيث يتحرك الدوران بعيدا عن طرف الإبرة. ب: وضع إبرة بشكل غير صحيح. يحتوي دوران اللوحة الكاشطة في هذا الاتجاه على سطح اللوحة الكاشطة الذي يدفع على طرف الإبرة بدلا من أسفل الطرف وتجاوزه. في هذا الاتجاه ، قد لا يحدث الميلا بسلاسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مقارنة إدخال الإبرة بالإبر غير الحادة والحادة. (A-C) إبرة غير حادة وإبرة حادة (D-F). (أ) و(د) قبل أن تلامس الإبرة الجنين؛ (ب) و(ه) عند النقطة التي تسبق اختراق الغشاء الجنيني مباشرة، و(ج) و(و) بعد ثقب الإبرة مباشرة. يشير السهم الأبيض في (ب) إلى المسافة البادئة لغشاء الجنين؛ لأنه يجب الضغط بشكل أكبر حتى تخترق إبرة غير حادة. يشير السهم الأسود في (E) إلى عدم وجود مسافة بادئة بسبب ثقب الإبرة الذي يتم بسهولة بسبب إبرة حادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مشاريع الزاعجة UM-ITF من يناير 2023 إلى ديسمبر 2023. قائمة مشاريع الحقن المجهري للزاعجة UM-ITF مع عدد الأجنة المحقونة لكل مشروع، وعدد اليرقات التي فقست من هذه الأجنة المحقونة، والنسبة المئوية لليرقات التي فقست لكل جنين محقون. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: نتائج مشروع الزاعجة UM-ITF. UM-ITF هو مرفق خدمة يوفر خدمات الحقن المجهري للتعديل الوراثي للحشرات. يسرد الجدول عدد مشاريع الزاعجة التي ضخها الITF من يناير 2023 إلى ديسمبر 2023. عدد العملاء الذين استجابوا لطلبات متابعة المشروع التي أشارت فيها الاستجابة إلى نجاح أو فشل مشروع الحقن. عدد المشاريع الناجحة ، حيث كان المشروع الناجح هو المشروع الذي تم فيه حقن مواد الحقن الدقيقة في وقت ومكان في الجنين النامي بحيث تكون الحقن قادرة على إحداث تعديل وراثي ، وعدد المشاريع التي اعتبرت غير ناجحة بسبب نقص التعديل الوراثي. متوسط معدل الفقس لمشاريع الحقن المجهري الزاعجة خلال الفترة من يناير 2023 إلى ديسمبر 2023. معدل نجاح المشروع ومعدل استجابة العميل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

المناقشة

يعتمد التعديل الوراثي للبعوض على الحقن الدقيق الدقيق لمواد التعديل (البلازميدات أو الحمض النووي الريبي الموجه أو البروتينات) في أجنة ما قبل الأرومة^{3،4،5،6،7،8}. من الأمور الحاسمة في هذه العملية الإبر الحادة التي تخترق الجنين بسهولة أثناء الحقن ^2,4. الإبرة الحادة قادرة على الانزلاق عبر الغشاء ، وتوصيل مواد التعديل ، وسحبها من الجنين دون تسرب أي من بلازما الجنين في موقع الحقن بعد الحقن المجهري (ملاحظة شخصية).

يتم إغلاق إبر الحقن المجهري عند سحبها لأول مرة ويجب فتحها قبل الحقن². تقليديا ، تم فتح إبر الحقن المجهري عن طريق تنظيف الإبرة برفق ضد شيء مثل حافة الغطاء أو الشريحة الزجاجية التي تحمل الأجنة ، ضد الجنين نفسه ، أو بعض المواد الأخرى². ومع ذلك ، فإن فتح الإبرة عن طريق تنظيفها بالفرشاة ضد كائن ما يوفر نتيجة غير متسقة (ملاحظة شخصية). في بعض الأحيان ، تنكسر الإبرة بطريقة تجعلها حادة ، بينما في أحيان أخرى ، تصبح الإبرة باهتة للغاية ، والتي ، كما ذكرنا سابقا ، يمكن أن تلحق الضرر بالأجنة التي يتم حقنها ، مما يؤدي إلى عدم تعديلها أو ، في أسوأ الأحوال ، قتل الجنين. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا فتح الإبر عن طريق إدخال الإبرة في الجنين. هذه العملية يمكن أن تكسر الإبرة ، مما يجعلها جاهزة للحقن. ومع ذلك ، فإنه ينتج أيضا نتائج عشوائية تخلق أحيانا إبرة حادة جدا ولكن في كثير من الأحيان تسد الإبرة بمادة الجنين قبل استخدامها للحقن. على الرغم من أن إبر الميلا تستغرق وقتا وجهدا إضافيين ، إلا أن العملية تنتج إبرا حادة بشكل أكثر اتساقا.

التعديل الوراثي للبعوض هو أيضا عملية تعتمد على الوقت تتطلب حقن الأجنة الدقيقة قبل أن يتحول الجنين النامي^{إلى الخلايا 4،5،6،7،8}. عند فتح الإبر عن طريق تنظيف الإبرة بالفرشاة ضد شيء ما أو عن طريق إدخال الإبرة في الجنين ، يتم أخذ الوقت المستغرق لفتح والعثور على إبرة حادة عندما تكون الأجنة جاهزة بالفعل للحقن وتستمر في النمو. في أفضل الأحوال ، تستغرق عملية فتح إبرة وإنتاج إبرة حادة دقيقة أو دقيقتين فقط ، ولكن في أحيان أخرى ، قد يستغرق الأمر وقتا طويلا بما يكفي بحيث تكون البويضات المعدة لتلك الجولة من الحقن قديمة جدا بحلول الوقت الذي يتم فيه صنع إبرة جيدة. ميزة الميلا هي أنه يتم في وقت مبكر ، والإبر جاهزة للاستخدام بمجرد تعيين الأجنة للحقن ، مما يضمن أن الأجنة في مرحلة النمو المثالية للحقن.

على الرغم من أن البروتوكول أعلاه تم تطويره ويستخدم شطبة Sutter BV-10 ، إلا أنه يمكن تعديل البروتوكول للاستخدام مع أي شطبة. العامل الرئيسي هو أن سطح الميلا يجب أن يكون قادرا على الاحتفاظ بكمية صغيرة من السائل تحتها الإبرة.

تتميز إبر الحقن المجهري المائلة بينما يوفر مصدر الهواء الهواء المضغوط إلى الجزء الخلفي من الإبرة بميزتين. أولا ، يساعد ضغط الهواء على إنتاج إبر متسقة. يتم إنتاج الإبر الحادة باستمرار عند بدء عملية الميلا عند نفس ضغط الهواء المزود ، ويتم إيقاف الميلا عند ظهور الفقاعات لأول مرة. من الأهمية بمكان أنه من أجل مراقبة التكوين الأولي للفقاعات ، يجب إيقاف اللوحة الكاشطة للحظات حتى لا يخفي دوران اللوحة الكاشطة تكوين الفقاعة الأولي. إذا كان الدليل على وجود فقاعات مرئيا فقط عندما تكون اللوحة الكاشطة في حالة حركة ، فقد تكون فتحة الإبرة كبيرة جدا. من الأهمية بمكان أن يكون ضغط الهواء الذي يتم توفيره هو نفسه في كل مرة يتم فيها بدء الميلا ، وأن يتم إيقاف الميلا بمجرد أن تبدأ الفقاعات في الهروب (يتم تصورها عندما لا تكون اللوحة في حالة حركة) ، وأن الفقاعات غير مرئية عندما تكون اللوحة في حالة حركة الميزة الثانية هي أنه بمجرد فتح الإبرة ، يمكن قياس حجم الفتحة نسبيا عن طريق تقليل ضغط الهواء المزود حتى تتوقف الفقاعات عن الهروب من طرف الإبرة. من خلال ملاحظة الضغط الذي تتوقف عنده الفقاعات عن التدفق من الطرف ، يمكن استنتاج حجم الفتحة النسبي. كلما انخفض الضغط الذي تتوقف عنده الفقاعات عن التدفق ، زادت الفتحة في طرف الإبرة ، وكلما زاد الضغط ، قل حجم فتحة الطرف. يمكن أن تكون معرفة حجم الفتحة النسبية مفيدة عند استخدام مزيج حقن أكثر لزوجة ، وبالتالي ، من المرجح أن تسد إبرة الحقن. يسمح استخدام قياس حجم الفتحة النسبية هذا بإنشاء إبر يمكنها توفير خلطات حقن عالية اللزوجة. بالطبع ، هناك بعض المقايضات التي يتم إجراؤها عند استخدام الإبر ذات أحجام الفتح الأكبر. على وجه التحديد ، قد تكون الأجنة المحقونة أكثر عرضة للتسرب بعد الحقن ، وقد تكون معدلات البقاء على قيد الحياة للأجنة المحقونة أقل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1.0 مم OD الشعيرات الدموية الدقيقة	العالمية أدوات
المشطوف زيت الركيزة	Sutter Instruments	008
مشبك دراجات	VeloOrange	R-clip 4 عبوات	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
بوم ستاند مجهر	AmScope		AMScope 3.5X-90X ثلاثي العينيات LED بوم الوقوف مجهر ستيريو أو ما يعادل
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
لوحة جلخ الماسية   ؛	ماسية Sutter Instruments	104F	- دقيقة للغاية (0.2 & micro ؛ إلى 1.0 & أحجام طرف)
طوقا ، Buna-N	Clippard Instrument Laboratory، Inc.	11761-2-pkg	تستخدم لإغلاق الاتصال على موصلات T & nbsp ؛ أو L ، إذا لم تكن مضمنة بالفعل مع هذه القطع
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory، Inc.	5000-2-pkg
موصل خرطوم	Clippard Instrument Laboratory، Inc.	CT4-pkg	تحتاج إلى 5 موصلات خرطوم حامل
إبرة الحقن	الدقيق العالمي أدوات الدقة	MPH3-10	حامل إبرة للشعيرات الدموية الدقيقة ذات القطر الخارجي 1 مم
P-2000	أدوات		أي مجتذب إبرة
Photo-Flo 200 Solution	B & H الصور والفيديو والصوت	BH #KOPF200P  MFR # 1464510	عامل ترطيب
مقياس الضغط	مختبر أداة كليبارد ، Inc.	PG-100	0-100 رطل لكل بوصة مربعة
مقياس الفتيل المرجعي	أدوات	سوتر X050300
حامل الفتيل المرجعي	أدوات سوتر	M100019
منظم	مختبر كليبارد للأدوات ، Inc.	01-مارس	تحتاج إلى # 10-32 منافذ للتوصيلات
ورقة التعبئة المطاطية 6 بوصة × 6 في	Danco	Model # 59849
T المناسب	Clippard Instrument Laboratory، Inc.	15002-2-pkg
شريط			إما قضيب أو شريط ملولب بنهاية ملولبة. يجب أن تكون الخيوط 10-32.
أنابيب اليوريثان	مختبر أدوات كليبارد ، Inc.	URH1-0804-BLT-050