Method Article

عزل الميتوكوندريا لتحليل الميتوكوندريا فائقة التعقيد من عينات زراعة الأنسجة والخلايا الصغيرة

DOI:

10.3791/66771

⸱

May 3rd, 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تقنية لتحليل المعقدات التنفسية الفائقة عندما تتوفر كميات صغيرة فقط من العينات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقود الماضية ، غيرت الأدلة المتراكمة حول وجود مجمعات الجهاز التنفسي (SCs) فهمنا لتنظيم سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا ، مما أدى إلى اقتراح "نموذج اللدونة". يفترض هذا النموذج التعايش بين نسب مختلفة من SCs والمجمعات اعتمادا على الأنسجة أو حالة التمثيل الغذائي الخلوي. ستسمح الطبيعة الديناميكية للتجميع في SCs للخلايا بتحسين استخدام الوقود المتاح وكفاءة نقل الإلكترون ، وتقليل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتفضيل قدرة الخلايا على التكيف مع التغيرات البيئية.

في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تشوهات في تجميع SC في أمراض مختلفة مثل الاضطرابات التنكسية العصبية (مرض الزهايمر ومرض باركنسون) أو متلازمة بارث أو متلازمة لي أو السرطان. لا يزال دور تعديلات تجميع SC في تطور المرض بحاجة إلى تأكيد. ومع ذلك، فإن توافر كميات كافية من العينات لتحديد حالة تجميع اللجنة العليا غالبا ما يشكل تحديا. يحدث هذا مع الخزعة أو عينات الأنسجة الصغيرة أو التي يجب تقسيمها لإجراء تحليلات متعددة ، مع مزارع الخلايا ذات النمو البطيء أو تأتي من أجهزة الموائع الدقيقة ، مع بعض الثقافات الأولية أو الخلايا النادرة ، أو عندما يجب تحليل تأثير علاجات مكلفة معينة (مع الجسيمات النانوية ، والمركبات باهظة الثمن ، وما إلى ذلك). في هذه الحالات ، يلزم وجود طريقة فعالة وسهلة التطبيق. تقدم هذه الورقة طريقة تم تكييفها للحصول على كسور الميتوكوندريا المخصبة من كميات صغيرة من الخلايا أو الأنسجة لتحليل بنية ووظيفة SCs الميتوكوندريا عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي متبوعا بمقايسات نشاط الهلام أو اللطخة الغربية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجمعات الفائقة (SCs) هي ارتباطات فوق جزيئية بين مجمعات السلسلة التنفسية الفردية 1,2. منذ التحديد الأولي للطوائف المنبوذة ووصف تكوينها من قبل مجموعة Schägger 2,3 ، والتي أكدتها لاحقا مجموعات أخرى ، ثبت أنها تحتوي على مجمعات تنفسية I و III و IV (CI ، CIII ، و CIV ، على التوالي) في مقاييس متكافئة مختلفة. يمكن تعريف مجموعتين رئيسيتين من SCs ، تلك التي تحتوي على CII (وإما CIII وحدها أو CIII و CIV) وذات وزن جزيئي مرتفع جدا (MW ، بدءا من ~ 1.5 MDa ل SC الأصغر: CI + CIII2) وتلك التي تحتوي على CIII و CIV ولكن ليس CI ، مع حجم أصغر بكثير (مثل CIII2 + CIV مع ~ 680 كيلو دالتون). تتعايش هذه SCs في غشاء الميتوكوندريا الداخلي مع مجمعات حرة ، أيضا بنسب مختلفة. وهكذا ، في حين أن CI موجود في الغالب في الأشكال المرتبطة به (أي في SCs: ~ 80٪ في قلب الأبقار وأكثر من 90٪ في العديد من أنواع الخلايا البشرية)3 ، فإن CIV وفيرة جدا في شكلها الحر (أكثر من 80٪ في قلب الأبقار) ، مع CIII يظهر توزيعا أكثر توازنا (~ 40٪ في شكله الحر الأكثر وفرة ، كدايمر ، في قلب الأبقار).

في حين أن وجودها مقبول الآن بشكل عام ، إلا أن دورها الدقيق لا يزال قيد النقاش4،5،6،7،8،9،10. وفقا لنموذج اللدونة ، يمكن أن توجد نسب مختلفة من SCs والمجمعات الفردية اعتمادا على نوع الخلية أو الحالة الأيضية1،7،11. هذه الطبيعة الديناميكية للتجميع ستسمح للخلايا بتنظيم استخدام الوقود المتاح وكفاءة نظام الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) استجابة للتغيرات البيئية4،5،7. يمكن أن تساهم SCs أيضا في التحكم في معدل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية والمشاركة في تثبيت ودوران المجمعات الفردية4،12،13،14. تم وصف تعديلات حالة تجميع SC بالاقتران مع الحالات الفسيولوجية والمرضية المختلفة15,16 ومع عملية الشيخوخة17.

وهكذا ، تم وصف التغيرات في أنماط SC في الخميرة اعتمادا على مصدر الكربون المستخدم للنمو2 وفي خلايا الثدييات المستزرعة عندما يتم استبدال الجلوكوز بالجالاكتوز4. كما تم الإبلاغ عن تعديلات في كبد الفأر بعد الصيام8 وفي الخلايا النجمية عندما يتم حظر أكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا18. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على انخفاض أو تغيرات في SCs و OXPHOS في متلازمة بارث19 ، وفشل القلب20 ، والعديد من الاضطرابات الأيضية21 والعصبية22،23،24 ، وأورام مختلفة25،26،27،28. ما إذا كانت هذه التغييرات في تجميع SC ومستوياته هي السبب الرئيسي أو تمثل آثارا ثانوية في هذه الحالات المرضية لا تزال قيد التحقيق15,16. ويمكن أن توفر المنهجيات المختلفة معلومات عن تجميع الطوائف المنبوذة ووظيفتها؛ وتشمل هذه قياسات النشاط8،29 ، وتحليل البنية التحتية30،31 ، والبروتينات32،33. البديل المفيد الذي يتم استخدامه بشكل متزايد وهو نقطة البداية لبعض المنهجيات المذكورة سابقا هو التحديد المباشر لحالة تجميع SC بواسطة الرحلان الكهربائي الأزرق الأصلي (BN) الذي طورته مجموعة Schägger34,35 لهذا الغرض.

يتطلب هذا النهج إجراءات قابلة للتكرار وفعالة للحصول على أغشية الميتوكوندريا وإذابتها ويمكن استكمالها بتقنيات أخرى مثل تحليل النشاط داخل الهلام (IGA) ، والرحلان الكهربائي للبعد الثاني ، واللطخة الغربية (WB). يمكن أن يكون أحد القيود في الدراسات حول ديناميكيات SC بواسطة الرحلان الكهربائي BN هو كمية خلايا البدء أو عينات الأنسجة. نقدم سلسلة من البروتوكولات لتحليل تجميع SC ووظيفته ، مقتبسة من طرق مجموعة Schägger ، والتي يمكن تطبيقها على عينات الخلايا أو الأنسجة الطازجة أو المجمدة بدءا من 20 مجم من الأنسجة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم تحديد تكوين جميع وسائط الاستزراع والمخازن المؤقتة في الجدول 1 والتفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الميتوكوندريا من زراعة الخلايا

ملاحظة: كان الحد الأدنى لحجم الخلايا التي تم فحصها ~ 30-50 ميكرولتر من الخلايا المعبأة (الخطوة 1.4). يمكن أن يتوافق هذا تقريبا مع ما لا يقل عن اثنين أو ثلاثة من لوحات زراعة الخلايا 100 مم أو لوحة واحدة 150 مم عند 80-90٪ من التقاء ، اعتمادا على نوع الخلية (بين 5 × 106 و 107 خلايا في الخلايا المشتقة من L929 أو MDA-MB-468). يعد كسر الخلايا الفعال خطوة حاسمة.

  1. تنمو الخلايا الملتصقة إلى ما يقرب من 80 ٪ التقاء أو الخلايا المعلقة إلى كثافة كافية.
  2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق (مباشرة من تعليق الخلية في حالة الخلايا غير الملتصقة أو بعد التربسين القياسي بمحلول تربسين-EDTA بنسبة 0.05٪ تربسين و 0.02٪ EDTA في 1x PBS ، في حالة الخلايا الملتصقة).
  3. اغسل الخلايا 2x ب 1x PBS البارد وقم بترسيبها عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: من هذه النقطة ، يجب تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية. لذلك ، يجب أن تكون جميع الكواشف باردة ويجب أن تبقى الأنابيب التي تحتوي على خلايا أو الميتوكوندريا على الجليد.
  4. بعد الطرد المركزي الثاني ، تخلص من المادة الطافية ، وقم بتقدير حجم حبيبات الخلية (CPV) ، وقم بتجميد الخلايا عند -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل لتسهيل كسر الغشاء في الخطوة 1.8.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة ويمكن تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية لأسابيع. عادة ما تكون الأنابيب المتدرجة 10 أو 15 مل ذات القيعان المخروطية مناسبة.
  5. دع الخلايا تذوب ببطء على الجليد.
  6. أعد تعليق حبيبات الخلايا المعبأة في حجم من المخزن المؤقت منخفض التوتر يساوي 7 أضعاف CPV (10 mM MOPS ، 83 mM sucrose ، pH 7.2) (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر من الخلايا المعبأة في 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت).
    ملاحظة: يجب أن يكون الحجم كافيا للحصول على الملوثات العضوية الثابتة الفعالة (انظر الملاحظة في الخطوة 1.8).
  7. انقل تعليق الخلية إلى خالط Potter-Dounce بالحجم المناسب واترك الخلايا تنتفخ عن طريق احتضانها في الثلج لمدة 2 دقيقة. على سبيل المثال ، بالنسبة لحجم 700-800 ميكرولتر من تعليق الخلية ، يكون الخالط بسعة 1 مل كافيا.
  8. كسر أغشية الخلايا عن طريق إجراء ثماني إلى عشر ضربات في الخالط مقترنة بمدقة تفلون مدفوعة بمحرك تدور عند 600 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: عند إجراء السكتات الدماغية ، من المهم إنشاء فراغ يزيد من كفاءة كسر الخلايا جنبا إلى جنب مع الإجراءات منخفضة التوتر والتجميد لتورم الأغشية وضعفها ، على التوالي. إذا تم ذلك بشكل جيد ، سماع صوت "فرقعة" عند سحب الخالط لأسفل بحركة سريعة في كل ضربة.
  9. أضف نفس الحجم من المخزن المؤقت مفرط التوتر إلى تعليق الخلية (7x CPV) (30 mM MOPS ، 250 mM sucrose ، pH 7.2) لتوليد بيئة متساوية التوتر.
  10. انقل المجانس إلى أنبوب سعة 10-15 مل وجهاز طرد مركزي في دوار ثابت عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأنبوب الأصلي الذي يحتوي على الخلايا غير المنقطعة لهذا الغرض.
  11. انقل المادة الطافية، التي تحتوي على جزء الميتوكوندريا، إلى أنابيب البولي بروبلين سعة 1.5 مل.
  12. اختياري: لزيادة إنتاجية الميتوكوندريا ، أعد تعليق الحبيبات من الخطوة 1.10 في 7x حجم حبيبات الخلية للمخزن المؤقت A (10 mM Tris ، 1 mM EDTA ، 0.32 M سكروز ، درجة حموضة 7.4) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ادمج المادة الطافية الجديدة مع سابقتها قبل الانتقال إلى الخطوة 1.13.
  13. جهاز طرد مركزي في جهاز ميكروفوج عند 16000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع جزء خام الميتوكوندريا.
  14. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات غنية بالميتوكوندريا ب 0.5 مل من المخزن المؤقت A يجمع بين محتويات أنبوبين في أنبوب واحد وأجهزة طرد مركزي في ظل نفس الظروف الموضحة في الخطوة 1.13. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
  15. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A ، وقم بتحديد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل وانتقل إلى القسم 3.

2. عزل الميتوكوندريا عن كميات صغيرة من الأنسجة الحيوانية

ملاحظة: يعتمد الحد الأدنى من الأنسجة لتطبيق هذا البروتوكول بثقة معينة على نوع الخلية ووفرة الميتوكوندريا ولكن يمكن أن يكون ~ 20-30 ملغ من الأنسجة لمعظم الحالات. يمكن أن تكون عينات الأنسجة مواد طازجة أو عينات مجمدة. في الحالة الأخيرة ، اترك العينات تذوب في محلول التجانس الموضوعة على الجليد قبل بدء الإجراء.

  1. وزن أو تقدير كمية (ملغ) الأنسجة قدر الإمكان.
  2. قطع الأنسجة مع زوج من المقص وجعل 3-4 يغسل في العازلة التجانس بمساعدة مصفاة الحرص على تجنب فقدان القطع الصغيرة.
    ملاحظة: هذه الخطوة أكثر أهمية في الأنسجة مثل العضلات الهيكلية أو القلب منها في الدماغ أو الأنسجة اللينة التي يمكن بسهولة تصنيف خلاياها مباشرة عن طريق خطوة التجانس.
  3. أضف وسط تجانس جديد (4 مل لكل جرام من الكبد ، و 10 مل لكل جرام من القلب ، والأنسجة الدهنية البنية (BAT) أو العضلات ، و 5 مل لكل جرام من الدماغ أو الكلى ؛ انظر تكوين المخزن المؤقت المحدد لكل حالة في الجدول 1).
  4. انقل قطع الأنسجة ذات المخزن المؤقت إلى الخالط واتبع التجانس الأمثل وبروتوكول عزل الميتوكوندريا اعتمادا على الأنسجة المختارة.
  5. عزل الميتوكوندريا عن الكبد والطحال والكلى
    1. تجانس مع أربع إلى ست ضربات لأعلى ولأسفل في Elvehjem-Potter مع مدقة تفلون مدفوعة بمحرك عند 600 دورة في الدقيقة.
    2. نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي معقم. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. املأ أنابيب البولي بروبلين سعة 1.5 مل بالمادة الطافية التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 16000 × جم في جهاز ميكروفوج عند 4 درجات مئوية والمضي قدما فيما بعد كما هو موضح من قبل (الخطوات من 1.13 إلى 1.15)
  6. عزل الميتوكوندريا من عينات القلب والعضلات
    1. تجانس مع ستة إلى ثمانية ضربات في Elvehjem-Potter مع مدقة تفلون مدفوعة بمحرك عند 600 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
    2. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنابيب بولي بروبيلين نظيفة سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يمكن إجراء تجانس ثان للحبيبات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.6.2 باستخدام 4-5 ضربات إضافية وحجم 1/2 من محلول التجانس لزيادة إنتاجية الميتوكوندريا. يمكن دمج المادة الطافية الجديدة (بعد الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) مع المادة السابقة قبل الانتقال إلى الخطوة 2.6.3. بديل لزيادة محصول الميتوكوندريا الخام هو فصل عينات أنسجة القلب والعضلات في محلول التربسين قبل التجانس36,37. في هذه الحالة ، يجب تعطيل / إزالة التربسين بكفاءة قبل إذابة أغشية الميتوكوندريا باستخدام الديجيتونين (الخطوة 3.2).
    3. جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم في جهاز ميكروفوج لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على جزء الميتوكوندريا الخام.
    4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات غنية بالميتوكوندريا ب 0.5 مل من المخزن المؤقت AT الذي يجمع محتويات أنبوبين في أنبوب واحد وأجهزة طرد مركزي في ظل نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.6.3. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
    5. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (بدون BSA) ، وحدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل وانتقل إلى القسم 3.
  7. عزل الميتوكوندريا عن الدماغ
    1. تجانس قطع الدماغ مع 10-15 السكتات الدماغية باستخدام الخالط الزجاجي من نوع Dounce مع مدقة زجاجية مدفوعة يدويا. نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
    2. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. جمع طاف في أنبوب طرد مركزي نظيف.
    4. أعد تعليق الحبيبات التي تم الحصول عليها في خطوة الطرد المركزي السابقة بنفس حجم وسيط AT المستخدم في التجانس الأول. أعد تجانس الحبيبات عن طريق تكرار العملية الموضحة في الخطوة 2.7.1 باستخدام 5-10 تمريرات وطرد مركزي للتعليق في دوار متأرجح عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة المادة الطافية وأضفها إلى الأنبوب المعد في الخطوة 2.7.3. جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم في دوار بزاوية ثابتة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على جزء الميتوكوندريا الخام.
    6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1/2 حجم التجانس الأولي (الخطوة 2.7.1) للوسيط AT. قم بتوزيع معلق الميتوكوندريا في أنابيب البولي بروبلين النظيفة سعة 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي عند 16000 × جم في وحدة ميكروفوج لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
    7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات غنية بالميتوكوندريا ب 0.5 مل من المخزن المؤقت AT الذي يجمع محتويات أنبوبين في أنبوب واحد وأجهزة طرد مركزي في ظل نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.7.6. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
    8. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (بدون BSA) ، وحدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل وانتقل إلى القسم 3.
  8. عزل الميتوكوندريا من أفضل التقنيات المتاحة
    1. تجانس مع ثمانية إلى عشر ضربات صعودا وهبوطا في Elvehjem-Potter مع مدقة تفلون مدفوعة بمحرك عند 600 دورة في الدقيقة. نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي معقم.
    2. جهاز طرد مركزي في دوار متأرجح عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. املأ أنابيب البولي بروبلين سعة 1.5 مل بالمادة الطافية التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة مع تجنب طبقة الدهون العليا.
      ملاحظة: يمكن إجراء تجانس ثان للحبيبات التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.8.2 لزيادة إنتاجية الميتوكوندريا. يمكن دمج المادة الطافية الجديدة (بعد الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) مع المادة السابقة قبل الانتقال إلى الخطوة 2.8.4.
    4. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين عند 16000 × جم لمدة دقيقتين في جهاز ميكروفوج عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل حبيبات غنية بالميتوكوندريا ب 0.5 مل من المخزن المؤقت AT2 الذي يجمع محتويات أنبوبين في أنبوب واحد وأجهزة طرد مركزي في ظل نفس الظروف الموضحة في الخطوة 2.8.4. كرر نفس العملية حتى تصبح جميع المواد في أنبوب واحد فقط.
    6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات النهائية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت A (بدون BSA) ، وحدد تركيز بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما كان من قبل وانتقل إلى القسم 3.

3. إعداد عينات لتحليل الأزرق الأصلي

  1. إعادة تعليق كسور الميتوكوندريا (التي تم الحصول عليها من مزارع خلايا الثدييات أو الأنسجة) في محلول عينة BN (50 mM NaCl ، 50 mM Imidazole ، 5 mM Aminocaproic acid ، 4 mM PMSF) للحصول على تركيز بروتين يبلغ حوالي 10 مجم / مل. انظر الجدول 2 للاطلاع على الغلة المتوقعة لمختلف أنواع العينات.
  2. إذابة أغشية الميتوكوندريا عن طريق إضافة ديجيتونين (محلول مخزون 10٪) للحصول على نسبة 4 جم من الديجيتونين / جم من بروتين الميتوكوندريا (4 ميكرولتر من الديجيتونين 10٪ مخزون مقابل 10 ميكرولتر من معلق الميتوكوندريا المحضر في الخطوة 3.1).
    ملاحظة: يجب تحسين نسبة المنظف إلى البروتين (جم / جم) لكل نوع من العينات للحصول على نتائج قابلة للتكرار ؛ تم العثور على 2-8 غرام من الديجيتونين / غرام من بروتين الميتوكوندريا ليكون الأمثل لمعظم الأنسجة34،35.
  3. تخلط عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل. احتضان العينات على الجليد لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يجب أن يصبح تعليق الميتوكوندريا أكثر وضوحا (التحول من معتم إلى شفاف) ؛ خلاف ذلك ، يمكن أن يشير إلى أن كمية المنظف غير كافية للذوبان الصحيح للغشاء.
  4. أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة في وحدة ميكروفوج (20000 × جم تقريبا) لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  5. جمع طاف في أنبوب جديد. أضف إلى المادة الطافية حجما قدره 5٪ G-250 (Coomassie Blue G-250 5٪ في 0.75 M حمض أمينوكابرويك) أي ما يعادل 1/3 من حجم إعادة التعليق الأولي (الخطوة 3.1 ، وهذا يتوافق مع نسبة نهائية قدرها 1.6 جم من Coomassie / g من البروتين) وتخلط عن طريق الماصة.
  6. يحفظ على الثلج قبل تحميله على الجل أو يجمد القسامات عند -80 درجة مئوية.

4. الأزرق الأصلي هلام الكهربائي

ملاحظة: يتم إجراء الرحلان الكهربائي في الغرفة الباردة (4-8 درجة مئوية). إذا لم يكن هناك مرفق غرفة تبريد ، يمكن إدخال كتلة تبريد في خزان الكهربائي. يتم استخدام المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلية 3-13٪ التجارية29 ، ولكن يمكن أيضا استخدام المواد الهلامية محلية الصنع بتركيزات التدرج المرغوبة38,39.

  1. قم بتحميل الغرف العلوية والسفلية باستخدام الكاثود البارد A ومخازن الأنود ، على التوالي. بدلا من ذلك ، قم بتحميل العينات في الآبار قبل ملء الغرفة العلوية بعناية بمحلول الكاثود A.
    ملاحظة: تستخدم مخازن الرحلان الكهربائي التجارية في مختبرنا ، ولكن يمكن تحضيرها كما هو موضح في الجدول 1.
  2. تحميل ما بين 30 و 100 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا.
    ملاحظة: عادة ، يتم تحميل 30-50 ميكروغرام من البروتين (ل WB) ، أو 40-100 ميكروغرام من البروتين (ل IGA) لكل بئر في هلام 10 حارات (0.5 × 0.15 سم آبار). يحتوي المخزن المؤقت Cathode A على Coomassie Blue G-250 وله لون أزرق مكثف يجعل من الصعب رؤية آبار الهلام لتحميل العينات. من الملائم تحديد مركز كل بئر ، بعلامة حمراء ، على سبيل المثال ، للمساعدة في وضع طرف الماصة خلال هذه الخطوة. يمكن أن تكون علامات الوزن الجزيئي الأصلية مفيدة عند إعداد تقنية BN-PAGE للتأكد من أن المواد الهلامية المتدرجة قد تشكلت بشكل صحيح وأن المعقدات ونمط SCs هو النمط الصحيح.
  3. قم بالتشغيل عند 80-100 فولت لمدة 25-30 دقيقة ثم عند 160-180 فولت ، مما يحد من التيار إلى 12 مللي أمبير / هلام ، حتى تصل الصبغة إلى قاع الجل (~ 125-165 دقيقة في المجموع).
  4. إذا كان سيتم إجراء فحوصات النشاط داخل الهلام (IGAs) ، فاستبدل المخزن المؤقت للكاثود A بمخزن الكاثود B عندما تكون مقدمة الصبغة في منتصف الجل (~ 1 ساعة بعد بداية التشغيل).
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن توثيق المواد الهلامية دون أي تلطيخ بعد التشغيل مباشرة نظرا لأن بعض النطاقات مرئية (بشكل أساسي معقد V ، والذي يمكن اعتباره صانعا "داخليا" بقدرة MW ~ 600 kDa) بسبب ارتباطها بصبغة G-250 ، عادة ، لن تكون SCs والمجمعات الفردية مرئية بدون تلطيخ أو مقايسات IGA. يجب عدم تلطيخ المواد الهلامية المستخدمة في مقايسات IGA أو WB أو إصلاحها.
  5. قم بتفكيك الجل من الكاسيت واستمر في تلطيخ Coomassie الأزرق (القسم 5) أو تحليل IGA (القسم 6) أو الكشف المناعي WB (القسم 7).

5. هلام تلطيخ

  1. قم بتلطيخ الجل لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام محاليل صبغة Coomassie الزرقاء (صبغة Coomassie R-250 بنسبة 0.25٪ في 40٪ ميثانول ، 10٪ حمض الخليك ؛ بقعة لمدة 10-15 دقيقة).
  2. قم بإزالة البقع بعدة غسلات (عادة 4-5 × 15 دقيقة) في 40٪ ميثانول بالإضافة إلى 10٪ حمض الأسيتيك في RT.
  3. توثيق الجل.

6. في مقايسات نشاط الهلام (IGA)

  1. إعداد حلول IGA لتحليل المجمعات التنفسية المختلفة قبل نهاية الكهربائي والحفاظ عليها في الظلام (باستخدام صناديق بلاستيكية داكنة اللون أو تغطيتها بورق الألمنيوم ، على سبيل المثال). يتم تفصيل تكوين كل مخزن مؤقت في الجدول 1.
  2. ضع الجل أو الممرات المراد استخدامها في صندوق بلاستيكي صغير قدر الإمكان لاستيعابه.
  3. أضف حجما كافيا من المحلول المناسب لتغطية الجل (عادة 5 أو 10 مل لمدة 5 أو 10 ممرات جل ، على التوالي) واحتضانها في RT مع اهتزاز لطيف (60-80 دورة في الدقيقة) وبعيدا عن الضوء.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على المجمع المراد تحليله وعلى طبيعة وكمية العينة المحملة ؛ CI و CIV هما الأسهل والأسرع لإعطاء النتائج. وبالتالي ، سيبدأ نشاط CI عادة في أن يصبح مرئيا بعد بضع دقائق ، بينما يحتاج CII و CIV إلى ~ 30 دقيقة ليتم ملاحظتها والسيرة الذاتية ~ 1.5-2 ساعة. يمكن أن يستمر التفاعل لساعات في جميع الحالات ويمكن تقليل معدل تكثيف الإشارة عن طريق نقل الحضانة إلى غرفة باردة (4-6 درجة مئوية) ، على سبيل المثال ، لحضانة ليلية (ON). يعمل نشاط CIII فقط من أجل الرحلان الكهربائي الأصلي الواضح (CN) ، وليس ل BN34.
  4. عندما تتطور النطاقات المناسبة ، أوقف التفاعلات عن طريق إزالة محاليل الفحص ، وغسل 2x بالماء المقطر ، وتثبيت الجل بنسبة 40٪ ميثانول بالإضافة إلى 10٪ حمض الخليك (باستثناء CV الذي يتم تثبيته فقط بالميثانول) لمدة 30 دقيقة.
    1. لتحليل نشاط CIV بعد اكتشاف CI بواسطة IGA ، اغسل الجل 2x بالماء المقطر ، وتوثيق نشاط CI ، واحتضان الجل (بدون تثبيته!) مع 50 mM من محلول فوسفات البوتاسيوم (درجة الحموضة 7.2) 2x لمدة 30 دقيقة ، ثم باستخدام المخزن المؤقت الكامل لتفاعل CIV حتى تظهر النطاقات الوريدية المعقدة (عادة عن طريق احتضان ON عند RT أو 4 °C).
  5. توثيق المواد الهلامية.
    ملاحظة: بالنسبة لنشاط ATPase ، نظرا لأن الأشرطة المطورة بيضاء ، عند توثيق الجل ، ضعه على خلفية داكنة بحيث تكون الأشرطة الشفافة مرئية.

7. تحليل اللطخة الغربية

  1. قم بإعداد مخزن النقل المؤقت وفقا للجدول 1 واحفظه عند 4 درجات مئوية حتى نهاية الرحلان الكهربائي.
  2. ضع الجل في صينية وأضف المخزن المؤقت للنقل. احتضان في RT لمدة 10-15 دقيقة.
  3. قطع قطعة من غشاء PVDF من نفس حجم الجل وتنشيطه في الميثانول لمدة 10 ثوان تحت الإثارة. تغسل عدة مرات بالماء المقطر وتضاف عازلة نقل. احتضان في RT لمدة 10-15 دقيقة مع هز لطيف.
  4. قم بإعداد شطيرة النقل ، من الأسفل إلى الأعلى ، وتجنب الفقاعات بين الجل والغشاء ، بالترتيب التالي: الجانب الأسود من ورق الكاسيت - الإسفنج - الورق النشاف - الجل - الغشاء - الورق النشاف - الجانب الشفاف الإسفنجي من الكاسيت.
  5. أغلق الكاسيت وقفله وضع الساندويتش في خزان النقل في الاتجاه الصحيح للنقل (الجانب الأسود باتجاه القطب السالب).
  6. املأ خزان النقل بمخزن مؤقت للنقل ، وأضف محركا مغناطيسيا لتحريك المخزن المؤقت ، وقم بتوصيل مصدر الطاقة عند 80 فولت لمدة 2 ساعة أو 100 فولت لمدة 1 ساعة. قم بإجراء النقل بين 4 و 8 درجات مئوية (على سبيل المثال في الغرفة الباردة) ومع كتلة تبريد في نظام النقل.
  7. استرجع الغشاء واستمر في بروتوكول اللطخة الغربية القياسي ، باستخدام أجسام مضادة محددة للمجمعات التنفسية المختلفة التي سيتم اكتشافها29.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تختلف غلة الميتوكوندريا التي يتم الحصول عليها باتباع البروتوكولات الموصوفة أعلاه اعتمادا على عدة عوامل مثل خط الخلية أو نوع الأنسجة ، أو طبيعة العينات (أي إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة) ، أو كفاءة عملية التجانس. يتم جمع الغلة المتوقعة من الميتوكوندريا من خطوط الخلايا والأنسجة المختلفة في الجدول 2. بمجرد الحصول على كسور الميتوكوندريا ، فإن الخطوة التالية هي تحليل نمط SCs التنفسي ، والذي يتم إجراؤه بعد ذوبان عينة الميتوكوندريا الخام والفصل الكهربائي بواسطة BN-PAGE متبوعا بتحليل IGA أو الكشف المناعي عن WB. يوضح الشكل 1 جانب ممرات الهلام غير الملوثة بعد الجري مباشرة ونمط العصابات بعد تلطيخ Coomassie القياسي لخط خلية مستنبتة وعينة ميتوكوندريا كبد الفأر.

في الشكل 2A ، B ، يمكن ملاحظة اختلافات واضحة بين أنماط تجميع SC في الخلايا البشرية والفأر بعد استخدام مقايسات IGA. وهكذا ، لوحظ المركب الحر الأول في خلايا الفئران بينما لا يمكن اكتشافه في الميتوكوندريا البشرية. يتشابه نمط IV-IGA المعقد إلى حد كبير في كلا خطي الخلايا البشرية (الشكل 2B) بينما يعرض الاختلافات بين خطي خلايا الفأر اللذين تم تحليلهما في الشكل 2A. ترجع هذه الاختلافات إلى حقيقة أن خلايا BL6 تعبر عن متغير متحور من SCAF18.

يتم الحفاظ على أنماط SC ، التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول عزل الميتوكوندريا الموصوف هنا للعمل مع عينات صغيرة ، فيما يتعلق بالبروتوكولات "التقليدية" المستخدمة للعينات الكبيرة. يمكن ملاحظة ذلك في الشكل 2C ، من خلال مقارنة الممرات 1 و 6 (التي تم الحصول عليها بعد عزل الميتوكوندريا باستخدام بروتوكول تقليدي من 3 جم من الكبد و 1.1 جم من BAT) مع ، على التوالي ، الممرات 2 و 5 (تم الحصول عليها باستخدام البروتوكولات المعروضة هنا من حوالي 0.1 جم من كلا الأنسجة). كما هو مقترح في نموذج اللدونة ، تختلف النسبة النسبية للمجمعات التنفسية و SCs اعتمادا على نوع الخلية والحالة الأيضية. كما هو موضح في الشكل 2C ، D ، تظهر الأنسجة المختلفة أنماط تجميع SC مختلفة. وهكذا ، تظهر الميتوكوندريا في الدماغ مستويات منخفضة جدا من المركب الحر I ونسبة أعلى من SCs بالمقارنة مع الأنسجة الأخرى ، وتتميز BAT بمستوياتها المنخفضة من CV (الشكل 2A) وكميات عالية من SC III + IV (الشكل 2D). تقدم ميتوكوندريا القلب مستويات عالية من SCs و CV. أنماط تجميع CV متشابهة جدا بين خط الخلية المستنبتة وعينة الميتوكوندريا في كبد الفأر (الشكل 2E).

يمكن أيضا تحليل تجميع SC بواسطة WB كما هو موضح في الشكل 3 لعينتين تم الحصول عليهما من التحكم في الطحال والخلايا السرطانية. في هذه الحالة ، عادة ما تكون 30-50 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا كافية للكشف عن المجمعات المختلفة و SCs مع الأجسام المضادة المحددة. يوضح الشكل 4 بعض المزالق الرئيسية التي يمكن أن تحدث أثناء تطبيق هذه البروتوكولات. يمكن أن تنتج تدرجات الهلام الخاطئة أنماط هجرة غير طبيعية وغير مرغوب فيها كما في الشكل 4A ، الحارة 1 ، حيث تظل SCs قريبة من البئر في الجزء العلوي من الممر بسبب تركيز مادة الأكريلاميد أعلى من المعتاد في الهلام. يؤدي احتضان العينات ، حتى لفترات قصيرة نسبيا ، في درجات حرارة عالية (هنا 37 درجة مئوية و 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق) إلى تدهور SCs و CI (الشكل 4A الممرات 2-4). وبالمثل ، فإن نسبة المنظف إلى البروتين أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج جيدة ودقة هلام كافية. أقل من نسبة 2 غرام من الديجيتونين / غرام من البروتين ، يتم تقليل دقة النطاق تدريجيا وعند التركيز المنخفض (0.5 جم / جم) لا تظهر سوى مسحة في المنطقة المقابلة ل SCs (الشكل 4B).

figure-results-1
الشكل 1: نمط معقدات الميتوكوندريا والمركبات الفائقة بعد فصل BNGE للميتوكوندريا النفاذية للديجيتونين من خط خلية مزرعية (L929Balbc) وكبد الفأر. تمثل الممرات الموجودة على اليسار (1 و 2) جانب الجل غير الملون بعد الجري مباشرة ، حيث يمكن اكتشاف السيرة الذاتية فقط ، بينما تظهر الممرات الموجودة على اليمين (3 و 4) نمط العصابات بعد تلطيخ كوماسي. الاختصارات: BNGE = الرحلان الكهربائي للهلام الأزرق الأصلي. السيرة الذاتية = مجمع V ؛ SCs = مجمعات فائقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل IGA للميتوكوندريا المعزولة من خطوط الخلايا المختلفة وأنسجة الفأر. (أ ، ب) النشاط داخل الهلام للمعقدات المشار إليها في الميتوكوندريا المعزولة من (أ) الفأر أو (ب) خطوط الخلايا البشرية. L929Balbc هو خط خلايا ناقل تم إنشاؤه في مختبرنا عن طريق نقل الميتوكوندريا من صفائح الفأر Balb / cJ إلى خلايا ρ ° L929neo كما هو موضح سابقا40,41. الخلايا الليفية BL6 هي خط خلوي خالد تم إنشاؤه في مختبرنا من خزعة الأذن لفأر BL6. (C) أنماط CI-IGA من الميتوكوندريا الفأرية المعزولة إما باستخدام طريقة تقليدية تبدأ ب 3 جم من الكبد (الحارة 1) و 1.1 جم من BAT (الحارة 6) أو البروتوكول المقدم هنا ويبدأ بحوالي 0.1 جرام من الأنسجة في جميع الحالات (الحارة 2 ، الكبد ؛ الحارة 3 ، القلب ؛ الحارة 4 ، الدماغ ، والحارة 5 BAT). (د) أنماط CIV-IGA (يتم إجراؤها بعد CI-IGA الموضحة في اللوحة 2C ، الممرات 2-5) في كبد الفأر والقلب والدماغ والميتوكوندريا BAT. (ه) تحليل نشاط CV-IGA في الخلايا المستزرعة في الفئران والكبد. تم تحميل حوالي 60-75 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل حارة. الاختصارات: IGA = نشاط في هلام ؛ SCs = مجمعات فائقة ؛ CI = معقد I ؛ BAT = الأنسجة الدهنية البنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الكشف المناعي عن WB لمركبات الميتوكوندريا المختلفة والمجمعات الفائقة في عينات الطحال. بعد فصل Blue Native PAGE لمجمعات الميتوكوندريا و SCs التي تم الحصول عليها من عينات التحكم في الطحال (الطحال M9) والورم (الورم M9) ، تم نقلها إلى غشاء PVDF وتهجينها بالتتابع مع الأجسام المضادة التي تتعرف على الوحدات الفرعية CI و CIII و CIV و CII المشار إليها (اللوحات A-D ، على التوالي). تم تحميل حوالي 50 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل حارة. تشير العلامات النجمية إلى الإشارة المتبقية من لطخة غربية سابقة. الاختصارات: SC = فائق التعقيد ؛ CI = معقد I ؛ CIII = معقد III ؛ CIV = مجمع IV ؛ CII = مجمع II. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: المزالق في تحليل SC بواسطة Blue Native PAGE. تحليل CI IGA للميتوكوندريا المعزولة من (أ) كبد الفأر الطازج و (ب) كبد الفئران المجمد في ظل ظروف ذوبان مختلفة. (أ) الحارة 1 ، تركيز التدرج الهلامي الخاطئ (8-13٪ بدلا من 3-13٪ العادي). الممرات 2-4 ، يتم تحضين العينات لمدة 10 دقائق على الجليد أو عند 37 درجة مئوية و 40 درجة مئوية قبل التحميل ، على التوالي. (B) نمط بعد IGA ل CI للميتوكوندريا التي تم الحصول عليها من كبد الفئران المجمد باستخدام نسب مختلفة من الديجيتونين / البروتين للذوبان. الاختصارات: SC = فائق التعقيد ؛ PAGE = بولي أكريلاميد هلام الكهربائي. CI = معقد I ؛ IGA = نشاط في الهلام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

متوسطتكوين
عازلة توتر مائي10 مللي مول المماسح ، 83 ملليمتر السكروز ، درجة الحموضة 7.2
عازلة مفرطة التوتر30 مللي متر مماسح ، 250 مللي متر سكروز ، درجة حموضة 7.2
التجانس العازلة أ10 مللي متر تريس ، 1 مللي متر EDTA ، 0.32 متر سكروز ، درجة حموضة 7.4
العازلة التجانس AT225 مللي متر مانيتول ، 1 مللي مول EGTA ، 75 مللي مول سكروز ، 0.01٪ درجة حموضة BSA 7.4
التجانس العازلة AT2225 مللي مول مانيتول ، 1 مللي مول EGTA ، 75 مللي مول سكروز ، 0.02٪ درجة حموضة BSA 7.4
المخزن المؤقت لعينة BN50 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 50 ملليمتر إيميدازول، 2 ملليمتر حمض أمينوكابرويك، 1 ملليمتر EDTA الرقم الهيدروجيني 7.0
حل ديجيتونين10٪ ديجيتونين في 50 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 50 مللي مول إيميدازول ، 5 مللي مول أمينوكابرويك ، 4 مللي مول PMSF
المخزن المؤقت لتحميل BN5٪ Coomassie Blue G في 0.75 M حمض أمينوكابرويك
BN الكاثود العازلة A50 مللي متر تريسين ، 15 مللي متر بيس تريس درجة الحموضة = 7.0 (4 درجة مئوية) ، 0.02٪ G-250 (كوماسي الأزرق اللامع G-250)
BN الكاثود العازلة B50 مللي متر تريسين ، 15 مللي متر بيس تريس درجة الحموضة = 7.0 (4 درجة مئوية) ، 0.002٪ G-250
BN الأنود العازلة50 مللي متر بيس تريس ، درجة الحموضة = 7.0
مجمع I IGA الركيزة5 ملليمتر Tris-HCl درجة الحموضة 7.4 ، 0.1 ملغ / مل NADH ، 2.5 ملغ / مل نيتروبلو تيترازوليوم (NBT)
مجمع II IGA الركيزة50 mM فوسفات البوتاسيوم العازلة درجة الحموضة 7.4 ، 20 ملليمتر سكسينات الصوديوم ، 0.2 ملليمتر فينازين ميثوسلفات (PMS) ، 2.5 ملغ / مل NBT
مجمع الثالث IGA الركيزة50 mM فوسفات البوتاسيوم العازلة درجة الحموضة 7.2 ، 0.05 ٪ ديامينوبنزيدين (DAB)
مجمع IV IGA الركيزةنفس الحل مثل CIII بالإضافة إلى 50 ميكرومتر السيتوكروم ج
مجمع V IGA الركيزة35 مللي متر تريس ، 270 مللي مول درجة حموضة الجلايسين 8.3 ، 14 مللي متر MgSO4 ، 0.2٪ Pb (NO3) 2 ، 8 مللي متر ATP
حل تلطيخصبغة كوماسي R-250 عند 0.25٪ في 40٪ ميثانول و 10٪ حمض الخليك
حل إزالة البقع / التثبيت40٪ ميثانول, 10٪ حمض الخليك
نقل المخزن المؤقت48 مللي متر تريس ، 39 مللي متر جليكاين ، 20٪ ميثانول

الجدول 1: المخازن المؤقتة وتكوين الوسائط.

نوع الخلية / الأنسجةالمبلغ المبدئيالعائد المتوقع (ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا)عدد الممرات (50-60 ميكروغرام / حارة)
الخلايا المستزرعة
MDA-MB-468100 ميكرولتر vpc300-400 ميكروغرام6-9
مشتق من 143B100 ميكرولتر vpc200-350 ميكروغرام4-7
الخلايا الليفية للفأر100 ميكرولتر vpc150-200 ميكروغرام3-5
قلب100 ملغ400-500 ميكروغرام10-12*
العضلات الهيكلية100 ملغ300-400 ميكروغرام8-10*
كبد100 ملغ400-500 ميكروغرام8-10
طحال50 ملغ150-250 ميكروغرام3-5
خفاش100 ملغ200-300 ميكروغرام4-6
دماغ100 ملغ250-300 ميكروغرام5-8

الجدول 2: الغلة المتوقعة للميتوكوندريا من أنواع مختلفة من الخلايا وأنسجة الفئران. أجزاء الميتوكوندريا التي يتم الحصول عليها من عضلة القلب أو الهيكل العظمي أنقى من تلك التي يتم الحصول عليها من الأنسجة الأخرى. وبالتالي ، يمكن تحميل كميات أصغر في المواد الهلامية (*).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف التعديلات المنهجية التي تم إدخالها في البروتوكولات الموصوفة هنا إلى تجنب الخسائر وزيادة الغلة مع الحفاظ على الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا (وهو أمر بالغ الأهمية عندما يتعرض توافر كميات كافية من العينات للخطر) وإعادة إنتاج النمط المتوقع للأنسجة أو خط الخلية من SCs (انظر الشكل 2C). لهذا الغرض وبما أن نقاء الميتوكوندريا العالي غير مطلوب للكشف عن SCs بشكل صحيح ، فقد تم تقليل عدد الخطوات والأوقات والأحجام كلما كان ذلك ممكنا.

وهكذا ، بعد التجانس وإزالة النوى والخلايا غير المنقطعة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، يتم نقل المواد الطافية التي تحتوي على الميتوكوندريا إلى أنابيب البولي بروبلين سعة 1.5 مل ، ويتم إجراء عمليات الطرد المركزي اللاحقة للحصول على أجزاء الميتوكوندريا الخام في وحدة صغيرة عن طريق زيادة السرعة وتقليل الأوقات والأحجام فيما يتعلق بالبروتوكولات التقليدية. يسمح ذلك بمعالجة عدة عينات في وقت قصير نسبيا: التقدير الوثيق هو أنه يمكن معالجة 10 عينات في ~ 2-2.5 ساعة (من بداية التجانس (خطوة البروتوكول 1.6. أو ما يعادلها للأنسجة) إلى ملاحظة جزء SCs الجاهز للتحميل في هلام (خطوة البروتوكول 3.7) ويقلل من الخسائر مع الحفاظ على الأنشطة. تغيير آخر فيما يتعلق ببروتوكولات مجموعة Schägger الأصلية هو استبدال ، بعد الذوبان الغشائي لجزء SCs ، خطوة الطرد المركزي الفائق بالطرد المركزي البسيط للميكروفوج (خطوة البروتوكول 3.4).

هناك بعض الخطوات الحاسمة في الإجراء. أولا ، كفاءة كسر الخلايا ، خاصة في حالة الخلايا المستزرعة (انظر الملاحظة بعد بروتوكول الخطوة 1.8) وخاصة في حالة الخلايا الصغيرة. تمثل الأنسجة وخطوط الخلايا درجة صعوبة متغيرة في كسر الخلايا: على سبيل المثال ، في القلب والعضلات ، عادة ما تكون هذه الخطوة أقل كفاءة من الكبد أو الطحال ، ولكن يتم تعويضها في المحصول لأن الأول يحتوي على نسبة أعلى من الميتوكوندريا. أحد البدائل لتحسين إنتاج الميتوكوندريا عند عزلها عن العضلات أو القلب هو معالجة العينات بالتربسين قبل التجانس. الدماغ هو نسيج آخر يقدم كفاءة منخفضة في كسر الخلايا بسبب التجانس اليدوي ، وهو أكثر اعتدالا وأقل كفاءة وربما أيضا بسبب التباين العالي في أنواع الخلايا في هذا النسيج ، كما تم الإبلاغ عنه سابقا 42. يمكن تعويض ذلك جزئيا بخطوة تجانس ثانية كما هو مقترح في بروتوكولنا (الخطوة 2.7.4). من ناحية أخرى ، إذا كان كسر الخلية مفرطا ، فقد تكون العينة النهائية التي تحتوي على SCs ملوثة بشظايا الحمض النووي النووي التي قد تتداخل مع تشغيل الرحلان الكهربائي. تظهر هذه المشكلة على أنها زيادة في لزوجة العينة عند إضافة الديجيتونين لإذابة أغشية الميتوكوندريا ويمكن حلها عن طريق العلاج باستخدام DNAse I.

ثانيا ، إذا كانت نسبة المنظفات إلى البروتين منخفضة للغاية ، فإن ذلك سيؤدي إلى ذوبان غشاء أقل كفاءة وإمكانية تكوين الركام. يمكن أن يظهر هذا في المواد الهلامية على أنها دقة ضعيفة في SCs عالية الوزن الجزيئي (انظر الشكل 4) أو على أنها CIV تعطي نطاقات متعددة تتوافق مع oligomers43. وإذا كانت النسبة مرتفعة أكثر مما ينبغي، فقد يؤدي ذلك إلى تفصيل الطوائف المنبوذة (أساسا الطوائف المنبوذة (SCs أساسا). ثالثا ، من المهم تجنب تسخين العينات أثناء الإجراء بأكمله (انظر الشكل 4) وتجنب الدورات المتكررة للتجميد والذوبان لأنها قد تؤثر على حالة تجميع SC.

في الجدول 2 ، يتم تقديم ملخص للعوائد المتوقعة للعديد من أنواع الخلايا وعينات الأنسجة. القيم تقريبية وستعتمد على كفاءة كسر الخلية وطبيعة المصدر. في حالة الأنسجة ، إذا تم تجميد المادة الأولية ، فإنها تميل إلى إعطاء عائد أعلى من العينات الطازجة. يتم تقديم تقدير لعدد الممرات (مع الأخذ في الاعتبار حمولة تتراوح بين 50 و 60 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل حارة) التي يمكن تحميلها.

تغطي البروتوكولات المعروضة هنا مجموعة متنوعة من الأنسجة وأنواع الخلايا ذات الاختلافات الصغيرة ، ويمكن استخدامها مع عينات طازجة أو مجمدة وتتطلب معدات بسيطة وتكلفة منخفضة نسبيا ، ولا تتضمن استخدام مجموعات أو تدرجات تنقية باهظة الثمن. ومع ذلك ، قد يحتاجون إلى بعض التعديلات لاستخدامها مع أنواع أو عينات معينة من الخلايا ، وكذلك عندما تكون مجموعات معينة من الميتوكوندريا ، مثل الميتوكوندريا المتشابكة في الدماغ أو الميتوكوندريا تحت العضلية ، على سبيل المثال ، موضوع التحليل.

نظرا لأن الأدوار الفسيولوجية الدقيقة بالإضافة إلى المشاركة المحتملة للطوائف المنبوذة في الحالات المرضية لا يزال يتعين تحديدها ، فإن هناك حاجة إلى تحليل ديناميكياتها والعوامل التي تؤثر على تجميعها واستقرارها ووظيفتها. يمكن أن تمثل بروتوكولاتنا أدوات قيمة تسمح بالحصول على نتائج قابلة للتكرار على أنماط SCs ذات أحجام عينات صغيرة ومن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والأنسجة ، خاصة عند الحاجة إلى مقارنة ظروف تجريبية متعددة29.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم "PGC2018-095795-B-I00" من وزارة العلوم والابتكار (https://ciencia.sede.gob.es/) والمنح "Grupo de Referencia: E35_17R" والمنحة رقم "LMP220_21" من Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) إلى PF-S و RM-L.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الخليكPanReac131008
حمض أمينوكابرويكFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Organics327721000
فحص برادفوردBiorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
السيتوكروم جسيجما ألدريتشC2506
ديامينو   البنزيدين (DAB)سيجما ألدريتشD5637
ديجيتونينسيجما ألدريتشD5628
EDTAPanReac131669
EGTAسيجما ألدريتشE3889
خالية من الأحماض الدهنية BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
الخالط مدقة تفلونDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2< sub>HPO4< / sub>PanReac121512
KH2< sub>PO4< / sub>PanReac121509
مانيتولسيجما ألدريتشM4125
ميثانوللابكيمMTOL-P0P
MgSO4< / sub>PanReac131404
خلية ترانسبيوراد1703930
MOPSسيجما ألدريتشM1254
MTCO1 أحادي النسيلة الأجسام المضادةInvitrogen459600
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 إلى 12٪ من المواد الهلامية البروتين الصغيرInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE كاثود عازلة إضافية (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 الأجسام المضادة أحادية النسيلةInvitrogen459100
ملح نيتروبلو تيترازوليوم (NBT)سيجما ألدريتشN6876
الرصاص (NO3< / sub>) 2< / sub>Sigma-Aldrich228621
PDVF غشاءAmersham10600023
فينازين ميثاسلفات (PMS)سيجما ألدريتشP9625
بيرس ECL الركيزةالحرارية العلمية32106
PMSFميركPMSF-RO
SDHA أحادي النسيلة الأجسام المضادةInvitrogen459200
سكسينات الصوديومSigma-AldrichS2378
Streptomycin / penicillinPAN التكنولوجيا الحيويةP06-07100
السكروزسيجما ألدريتشS3089
تريسبانريكA2264
UQCRC1 الأجسام المضادة أحادية النسيلةInvitrogen459140
XCell & nbsp ؛ SureLock Mini-CellInvitrogen  EI0001
بلوت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Clinical Bioenergetics. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242(2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452(2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Celis, J. E. Cell Biology (Third Edition). , Academic Press. 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial IsolationMitochondrial SupercomplexesBlue Native ElectrophoresisSmall Tissue SamplesCell Culture MitochondriaSupercomplex AssemblyIn Gel Activity AssayMitochondrial Protein QuantificationElectron Transport ChainRespiratory Supercomplexes

Related Articles