يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وتنقية وتحديد Bacillus licheniformis المنتجة للباسيتراسين من البراز الطازج للخنازير السليمة

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66777

⸱

مايو 31, 2024

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول وصفا كاملا وشاملا للعملية التفصيلية لعزل وتنقية وتحديد Bacillus licheniformis المنتجة للباسيتراسين من براز الخنازير السليمة.

الملخص

تتمتع Bacillus licheniformis و bacitracin بسوق تطبيقات ضخم وقيمة في مجالات الطب والكيمياء وتربية الأحياء المائية والمنتجات الزراعية والهامشية. لذلك ، فإن اختيار B. licheniformis مع إنتاج عال من الباسيتراسين له أهمية كبيرة. في هذا البروتوكول التجريبي ، تم عزل العصيات ذات الغلة العالية من الباسيتراسين وتنقيتها وتحديدها من البراز الطازج للخنازير السليمة. كما تم اختبار التأثير المثبط لباسيتراسين المستقلب الثانوي على Micrococcus luteus. تم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء للكشف النوعي والكمي عن الباسيتراسين. تم تحديد الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية ل B. licheniformis بواسطة المجموعات ذات الصلة. العلاقات التطورية ل B. licheniformis تم تحديدها وبناؤها باستخدام اكتشاف تسلسل الجينات. يصف هذا البروتوكول ويقدم عملية العزل والتنقية وتحديد B. licheniformis من براز الطازجة من وجهات نظر متعددة ، مما يوفر طريقة للاستخدام على نطاق واسع ل B. licheniformis و bacitracin في المصانع.

المقدمة

Bacillus licheniformis هو نوع من Bacillus في عائلة Firmicutes ، والذي يتم توزيعه على نطاق واسع في بيئات مختلفة مثل الماء والتربة وأمعاء1. B. licheniformis له هيكل قصير وقوي يشبه القضيب ويتحرك بشكلفردي 2. المستعمرة مستديرة ومملة تقريبا ، مع انتفاخ مركزي وحواف أنيقة من الأبيض الرمادي3. لديها قدرة قوية على النمو والتكاثر ويمكنها امتصاص واستخدام العناصر الغذائية من مصادر الكربون المختلفة ، مثل السكريات الأحادية والسكريات والكيتوز والأحماض العضوية4. في المرحلة اللاحقة من النمو والتطور ، B. licheniformis يمكن أن توجد في شكل جراثيم نائمة وتنتج مواد مضادة للبكتيريا مثل الباسيتراسين واللحنة والسطح. يمكنه أيضا مقاومة نقص التغذية والبيئة الخارجية القاسية5. لا يوجد تفضيل واضح للكودون ، ويحدد نظام الإفراز الفعال إفراز البروتين غير المتجانس ل B. licheniformis ، وهو ضعف إفراز Bacillus subtilis6. غالبا ما يستخدم لإنتاج مستحضرات الإنزيم مثل البروتياز والأميليز والسيلولاز7. نظرا لافتقاره إلى السموم الداخلية ، فقد تم اعتماده كسلالة آمنة للطعام ومدرج في QPS من قبل EFSA8. لذلك ، هناك العديد من الاستخدامات المحتملة ، بما في ذلك إنتاج المركبات النشطة بيولوجيا ، والتي لها مجموعة واسعة من التطبيقات في تربية الأحياء المائية والزراعة والأغذية والطب الحيوي والصناعات الدوائية. أيضا ، B. licheniformis هو عنصر مهم في النباتات المعوية الحيوانية ، والتي يمكن أن تعزز لتحسين أداء الإنتاج ، وتحسين توازن الفلورا المعوية ، والوقاية من الأمراض. الجينوم الكامل ل B. licheniformis ATCC14580 تم تحليله في عام 2004 ، وتم فهم المعلومات الأساسية لترجمة النسخ وطي البروتين وآلية الإفرازتدريجيا 9. هذه المعلومات الجينية تجعلها مواتية للتعديل الجيني على المستوى الجزيئي ، مما يساهم في تسهيل إنتاج B . licheniformis على نطاق واسع.

Bacitracin هو مضاد حيوي الببتيد dodecacyclic الذي ينتجه سينثيتيز الببتيد غير الريبوزومي عن طريق التمثيل الغذائي الثانوي في B. subtilis و B. licheniformis. الباسيتراسين عبارة عن خليط يتكون من مكونات مختلفة مثل الباسيتراسين A و B و C ، حيث يختلف واحد أو اثنين من الأحماض الأمينية بين كل مكون. من بين هؤلاء ، يحتوي الباسيتراسين أ على أقوى نشاط بيولوجي10. يمكن أن يثبط الباسيتراسين البكتيريا موجبة الجرام مثل المكورات العنقودية والمكورات الدقيقة الزيرية وبعض البكتيريا سالبة الجرام عن طريق تثبيط تكوين جدار الخلية والتفاعل مع البروتينات المرتبطة بالغشاء11. وفي الوقت نفسه ، فإن الباسيتراسين آمن ومستقر ، وليس من السهل إنتاج مقاومة للأدوية ، ويمكن أن يكون متوافقا مع الأدوية الأخرى المضادةللبكتيريا 12. لذلك ، يستخدم الباسيتراسين في الممارسة الطبية والبيطرية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لمعدل التخلص السريع ومعدل الامتصاص المنخفض ، يمكن استخدامه أيضا كمادة مضافة لتغذية13.

B. licheniformis يمكن أن تستعمر الأمعاء وتحسن البيئة المكروية المعدية المعوية. تختلف القدرة على الالتصاق والتكاثر والوظائف الفسيولوجية ذات الصلة للعصيات من مصادر مختلفة في الجهاز الهضمي للحيوانات المختلفة. المشتق من الخنازير B. licheniformis هو أكثر ملاءمة للاستعمار في أمعاء الخنازير والماشية الأخرى. هناك علاقة وثيقة بين الوفرة النسبية للبروبيوتيك المعوي والحالة الصحية للمضيف14. المكملات الغذائية مع B. licheniformis مزيج في الخنازير المفطومة يحسن النظام البيئي المعوي عن طريق تغيير تكوين الجراثيم والنشاط الأيضي ، ويؤثر أيضا على الغشاء المخاطي المعوي15. يمكن أن يعكس براز نوع وكمية النباتات المعوية الحيوانية. يصف هذا البروتوكول عزل وتنقية Bacillus spp. المنتجة للباسيتراسين من براز الخنازير السليمة. البراز مشتق من بذار Taihu التي لا تتغذى على الأعلاف المركبة ولها أداء إنتاج ممتاز في مزارع الخنازير. تم تحديد العزلات على أنها B. licheniformis بناء على خصائصها المورفولوجية وخصائصها الفيزيائية والكيميائية وتحديد الكيمياء الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم توثيق جميع الإجراءات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات بجامعة نانجينغ للتكنولوجيا. تم اشتقاق البراز من بذار Taihu يبلغ من العمر حوالي عامين (انظر جدول المواد) ، والتي تم تربيتها في مزارع الخنازير المهنية والقياسية.

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. الوسط السائل Luria-Bertani (LB): أضف 10 جم من كلوريد الصوديوم ، و 5 جم من مسحوق مستخلص الخميرة ، و 10 جم من التربتون في زجاجة مخروطية ، أضف الماء المقطر إلى 1 لتر ، وحرك ، ثم قم بإذابة قضيب زجاجي. انقل 100 مل من الزجاجة المخروطية المتوسطة إلى زجاجة مخروطية سعة 500 مل واربطها بإحكام بغشاء مانع للتنفس. تعقيم عند 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة (انظر جدول المواد).
  2. رطل صلب متوسط: أضف 10 جم كلوريد الصوديوم ، 5 جم من مسحوق مستخلص الخميرة ، 10 جم من التربتون ، 20 جم من مسحوق أجار إلى زجاجة مخروطية الشكل ، أضف الماء المقطر إلى 1 لتر ، ثم قم بإذابة بقضيب زجاجي ، واربطها بإحكام بغشاء مانع للتنفس تعقيم عند 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة. عندما يبرد الوسط إلى 50 درجة مئوية ، اسكب 20 مل من الوسط في أطباق بتري ، واتركها لتبرد ، ثم قم بتخزينها رأسا على عقب.
  3. وسط تخمير الباسيتراسين: أضف 8 جم من دقيق فول الصويا ، و 4 جم من النشا القابل للذوبان ، و 0.1 جم (NH4) 2SO4 ، و 0.6 جم CaCO3 ، و 100 مل من الماء المقطر إلى زجاجة مخروطية سعة 500 مل ، وحركها بقضيب زجاجي لتذوب جيدا ، واربطها بإحكام بغشاء مانع للتنفس. تعقيم عند 121 درجة مئوية في الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة (انظر جدول المواد).
  4. تعليق M. luteus: حدد حلقة من M. luteus وتلقيح على لوحة ثقافة LB ، المحضرة في الخطوة 1.2 (انظر جدول المواد). استزراع في حاضنة درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (انظر جدول المواد). أضف 5 مل من المحلول الملحي العادي إلى الطبق ورجه برفق لتصفية المستعمرات. قم بقياس OD600 وتخفيف المحلول في أنبوب اختبار للحصول على تعليق مع OD600 من 0.3-0.7. قم بتخزين معلق M. luteus عند 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
  5. وسط فحص النشاط المضاد للبكتيريا: أضف 1 مل من معلق M. luteus ، المحضر في الخطوة 1.4 ، إلى 100 مل من الوسط الصلب السائل LB المحضر في الخطوة 1.2 ورجه قليلا. خذ على الفور 5 مل من هذا المحلول الذي يحتوي على M. luteus ووزعه بالتساوي على لوحة ثقافة LB.

2. عزل وتنقية العصيات من البراز الطازج للخنازير السليمة

  1. أضف 9 مل من المحلول الملحي العادي و 1.0 جم من براز الخنازير الطازجة في قارورة إرلينمايير سعة 150 مل. يقلب باستخدام محرك مغناطيسي (انظر جدول المواد) في درجة حرارة الغرفة عند 60 دورة في الدقيقة / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  2. ضع مستخلص البراز في حمام مائي ترموستات 80 درجة مئوية (انظر جدول المواد) لمدة 20 دقيقة لقتل البكتيريا غير المنتجة للأبواغ.
  3. أضف المعلق إلى 100 مل من الوسط السائل LB في قارورة Erlenmeyer سعة 250 مل وزراعته في شاكر (انظر جدول المواد) عند 180 دورة في الدقيقة / دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
  4. إجراء التخفيف التسلسلي للمحلول البكتيري المزروع بمحلول ملحي عادي من 10-1 إلى 10-8. ضع 0.1 مل من 10-6 و 10-7 و 10-8 مخفف بكتيري على ألواح ثقافة LB الفردية واتركها تجف. بعد 10 دقائق ، ضع الأطباق رأسا على عقب في حاضنة درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  5. استخدم حلقة التلقيح لاختيار المستعمرات التي تشبه B. licheniformis (اللون الأبيض الكريمي ، والاتساق الناعم ، والمظهر المخاطي ، والارتفاع المحدب ، والارتفاع المسطح ، والشكل غير المنتظم) 16وقم بخطها باستخدام نمط متعرج على وسط فحص النشاط المضاد للبكتيريا المحضر في الخطوة 1.5 (انظر الشكل 1).
  6. ضع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة ولاحظ ما إذا كانت هناك منطقة تثبيط حول المستعمرة.

3. فحص تثبيط نشاط المتفطرة الزهرية

  1. حدد مستعمرة واحدة ولدت منطقة مثبطة وأضفها إلى 100 مل من الوسط السائل LB ، وزراعت في شاكر عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة / دقيقة لمدة 12 ساعة.
  2. تلقيح 5 مل من وسط الاستزراع في وسط تخمير الباسيتراسين المحضر في الخطوة 1.3 والزراعة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  3. اجمع مرق التخمير في أنبوب طرد مركزي وجهاز طرد مركزي عند 13،400 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بالتصفية باستخدام غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
  4. أضف كوب أكسفورد إلى صفيحة متوسطة لفحص النشاط المضاد للبكتيريا ثم أضف 50 ميكرولتر من المرشح (طافي التخمير) إلى كوب أكسفورد (انظر جدول المواد). استزراع في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد الحضانة ، قم بقياس قطر المنطقة المثبطة باستخدام الفرجار الورني (انظر جدول المواد).
  5. حدد السلالات والمادة الطافية للتخمير المقابلة بقطر منطقة مثبطة أكبر من 15 مم للتجارب اللاحقة.

4. تحديد العصيات عن طريق الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة

  1. أضف 60 مجم من معيار الباسيتراسين وقم بإذابة 1٪ EDTA-2Na (انظر جدول المواد) في زجاجة حجمية سعة 10 مل لصنع محلول 6.0 مجم / مل من العصيات.
  2. خفف 1 مل من المادة الطافية للتخمير إلى 10 مل باستخدام 1٪ EDTA-2Na. ضع 5 ميكرولتر من العينة و 5 ميكرولتر من محلول الباسيتراسين القياسي على صفيحة الطبقة الرقيقة من هلام السيليكا المنشط (انظر جدول المواد).
  3. أضف 100 مل من n-butanol-acetic acid-water-pyridine-ethanol (60:15:10:6:5) إلى الخزان الكروماتوغرافي (انظر جدول المواد). ضع صفيحة الطبقة الرقيقة من هلام السيليكا في الخزان الكروماتوجرافي. غطيها واتركيها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  4. أخرج صفيحة الطبقة الرقيقة من هلام السيليكا ، ورش محلول البيوتانول البيريدين (99: 1) الذي يحتوي على 1٪ نينهيدرين (انظر جدول المواد) ، وقم بتسخينه عند 105 درجة مئوية لمدة 5 دقائق حتى تظهر بقع حمراء بنية اللون. احسب Rf (قيمة عامل الاستبقاء) للمعيار والعينة وفقا للصيغة التالية:
    Rf = مسافة السفر الفورية / مسافة سفر المذيب.

5. الكشف عن العصيات بواسطة HPLC

  1. أضف 0.3 مل من المادة الطافية للتخمير و 1.2 مل من الإيثانول بنسبة 50٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل ، ورجه لمدة 5 دقائق باليد ، واتركه عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة.
  2. جهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة 15 دقيقة وقم بالترشيح في زجاجة عينة تحمل علامة S1 مع غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
  3. تحضير محلول الباسيتراسين الأم: أضف معيار الباسيتراسين 0.4 جم (60 وحدة / مجم ؛ انظر جدول المواد) ، 100 مل من 40 جم / لتر EDTA-2Na (انظر جدول المواد) في قارورة حجمية سعة 100 مل لتحضير محلول أم 240 وحدة / مل.
  4. أضف 3 مل من محلول الباسيتراسين الأم و 21 و 9 و 3 و 1 و 0 مل من الماء فائق النقاء لأنابيب الاختبار المسماة A1 و B1 و C1 و D1 و E1 ، على التوالي. بعد الترشيح باستخدام غشاء مرشح صغير يسهل اختراقه 0.22 ميكرومتر ، ضع المرشح في زجاجات عينات تحمل علامة A2 و B2 و C2 و D2 و E2.
    ملاحظة: تركيزات محلول الباسيتراسين القياسي هي 30 و 60 و 120 و 180 و 240 وحدة / مل.
  5. ضع A2 و B2 و C2 و D2 و E2 و S1 في درج الاختبار الخاص بأداة HPLC. ضع 1000 مل من فورمات الأمونيوم 50 ملي / لتر و 1000 مل من الأسيتونيتريل في درج الطور المتحرك وقم بتعيينهما كمرحلتين متنقلتين A و B ، على التوالي.
    ملاحظة: يجب ضبط الرقم الهيدروجيني لفورمات الأمونيوم إلى 4.0 مع حمض الفورميك.
  6. قم بتثبيت عمود HPLC C18 (5 ميكرومتر ، 4.6 مم × 250 مم) في الاتجاه الموضح على العمود (انظر جدول المواد).
  7. اضبط معلمات الطور المتنقل على أنها 0 دقيقة و 77٪ A و 23٪ B ؛ 30 دقيقة ، 70٪ أ و 30٪ ب ؛ 40 دقيقة ، 60٪ أ و 40٪ ب ؛ 50 دقيقة ، 60٪ أ و 40٪ ب ؛ 51 دقيقة ، 77٪ أ و 23٪ ب ؛ 58 دقيقة ، 77٪ أ و 23٪ ب. ضبط حجم العينة على أنه 100 ميكرولتر ؛ معدل التدفق ، 1.0 مل / دقيقة ؛ درجة حرارة العمود ، 30 درجة مئوية.
  8. انقر على تشغيل زر لتنفيذ البرنامج.

6. التحديد المورفولوجي

  1. قم بتخفيف السلالة وغلافها بأعلى عيارق للعصيات على صفيحة ثقافة LB وزراعتها في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تلطيخ ومراقبة مورفولوجيا المستعمرة كما هو موضح أدناه.
  2. أضف قطرة من الماء النقي المعقم إلى الشريحة ، والتقط كمية صغيرة من المستعمرات ، وأضفها إلى قطرة الماء. قم بتشويه بالتساوي ، واترك الشريحة تجف بشكل طبيعي ، ثم ثبتها على اللهب.
  3. أضف البنفسج الكريستالي لمدة 1 دقيقة لتلطيخ العينة ثم اشطفها بماء الصنبور. أضف اليود لمدة 1 دقيقة لتلطيخ العينة ثم اشطفها بالماء المقطر.
  4. أضف 95٪ كحول ، ورج الشريحة لإزالة اللون لمدة 1 دقيقة ، ثم اشطفها بالماء المقطر.
  5. يضاف الزعفران لمدة 1 دقيقة لتلطيخ العينة ثم يشطف بالماء المقطر. دع الشريحة تجف بشكل طبيعي وراقب مورفولوجيا المستعمرة تحت المجهر مع غمر الزيت (انظر جدول المواد).

7. التحديد الفسيولوجي والكيميائي الحيوي

  1. أضف 2 مل من المحلول الملحي المعقم في أنبوب الاختبار وقم بتلقيح مستعمرة واحدة من الصفيحة في المحلول الملحي المعقم باستخدام حلقة التلقيح للحصول على تعليق بكتيري.
  2. أضف 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري في كل ثقب لقياس V-P ، والسترات ، والجيلاتين ، و 7٪ كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 5.7 ، وتقليل النترات ، والتحلل المائي للنشا على شريط التعريف الكيميائي الحيوي Bacillus (انظر جدول المواد).
  3. استخدم حلقة التلقيح لاختيار مستعمرة واحدة أخرى وخطها في النمط المتعرج على الأنبوب الكيميائي الحيوي للنمو اللاهوائي لشريط التعريف الكيميائي الحيوي للعصية .
  4. استخدم حلقة التلقيح لاختيار المستعمرات الأخرى وثقبها عموديا في المسام لتحديد البروبيونات و D-xyllose و L-arabinose و D-mannitol على شريط تحديد الكيمياء الحيوية Bacillus .

8. تحديد تسلسل جين الإجهاد

  1. استخرج الحمض النووي للسلالة باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي للبكتيريا (انظر جدول المواد): أضف 2 مل من سائل البذور إلى أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق سعة 5 مل وجهاز طرد مركزي بسعة 11,500 × جم لمدة دقيقة واحدة. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 110 ميكرولتر من المخزن المؤقت (يحتوي على 20 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.0 ؛ 2 ملي مولار Na2-EDTA ، و 1.2٪ تريتون) و 70 ميكرولتر من محلول الليزوزيم 50 مجم / مل إلى الحبيبات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. أضف 4 ميكرولتر من 100 مجم / مل RNase A لمدة 15 ثانية واتركه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 20 ميكرولتر من محلول البروتيناز K واخلط جيدا.
  3. أضف 220 ميكرولتر من المخزن المؤقت GB ، ورجها لمدة 15 ثانية حتى يتم تعليق الحبيبات ، وضعها عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لجعل المحلول واضحا ، وقم بإجراء دوران قصير لإزالة حبات الماء على جدار الأنبوب.
  4. أضف 220 ميكرولتر من الإيثانول اللامائي ، صدمة كاملة لمدة 15 ثانية ، فصل قصير. انقل المحلول وهطول التلبد إلى عمود الامتزاز CB3 لأنبوب التجميع ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت GD في عمود الامتزاز ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 13,400 × جم ، وتخلص من المادة الطافية. أضف 600 ميكرولتر من PW إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 13,400 × جم ، وتخلص من المادة الطافية.
  6. ضع عمود الامتزاز مرة أخرى في أنبوب التجميع ، وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 13,400 × جم ، وتخلص من المادة الطافية.
  7. ضع عمود الامتزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق حتى يجف. انقل العمود إلى أنبوب الطرد المركزي وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المميء TE في منتصف غشاء الامتزاز.
  8. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتجميع التدفق في أنبوب الطرد المركزي وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 13,400 × جم.
  9. أضف 25 ميكرولتر من 2x مزيج رئيسي (انظر جدول المواد) ، و 2.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 8.8 ، و 2 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي 27F ، و 2 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 1492R ، و 18.5 ميكرولتر من H2O المقطر المزدوج إلى أنبوب PCR سعة 0.1 مل.
    ملاحظة: التسلسلات الجينية للبادئات هي 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' و 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. ضع أنبوب PCR في جهاز PCR (انظر جدول المواد) في ظل الظروف التالية: التمسخ المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والتمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. قم بتشغيل دورة التمسخ والتلدين والتمديد ثلاث خطوات لمدة 32 ضعفا.
  11. خذ 5 ميكرولتر من المنتج وقم بإجراء الرحلان الكهربائي باستخدام هلام الاغاروز 1٪ عند 120 فولت لمدة 30 دقيقة.
    1. قم بإذابة 500 مجم من الاغاروز في 50 مل من 1x TAE عازلة. سخني المحلول في الميكروويف لمدة 1-2 دقيقة حتى يذوب الاغاروز تماما. أضف 5 ميكرولتر من صبغة تلطيخ الحمض النووي ، ثم اسكبها في صينية هلام وأدخل لوحة الفتحة. اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى يتماسك. ضع الجل في خزان الرحلان الكهربائي وأضف 1x عازلة TAE لغمر الجل. أضف 2 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 2 كيلو بايت (10 مجم / ميكرولتر) في البئر الأول و 5 ميكرولتر منتج PCR ممزوج ب 1 ميكرولتر من صبغة التحميل إلى الآبار المتبقية في الجل.
  12. ضع الجل في نظام التصوير الهلامي والتقط صورة. قص شرائط الحمض النووي بسرعة تحت الأشعة فوق البنفسجية ووزنها.
  13. أضف شرائط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وأضف حجما متساويا من محلول PN. احتفظ بالأنبوب في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى يذوب الجل تماما.
  14. أضف 500 ميكرولتر من BL السائل التوازني إلى عمود الامتزاز CA2 ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من المادة الطافية.
  15. أضف محلول الجل المذاب إلى عمود الامتزاز CA2 وضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، وقم بطرده عند 13,400 × جم لمدة 30 ثانية ، وتخلص من المادة الطافية.
  16. أضف 600 ميكرولتر من PW إلى عمود الامتزاز CA2 ، وجهاز الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من المادة الطافية ، وكرر 1x.
  17. ضع عمود الامتزاز CA2 في أنبوب تجميع ، وجهاز طرد مركزي عند 13,400 × جم لمدة دقيقتين ، وتخلص من المادة الطافية.
  18. ضع عمود الامتزاز CA2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق حتى يجف تماما ثم ضعه في أنبوب طرد مركزي نظيف.
  19. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB إلى فيلم الامتزاز المعلق في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، واجمع محلول الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي عند 13,400 × جم لمدة دقيقتين.
    ملاحظة: يتم تضمين المحاليل أو الكواشف المذكورة أعلاه في مجموعة التنقية (انظر جدول المواد).
    1. أرسل حل الحمض النووي الذي تم جمعه إلى شركة تسلسل محترفة (انظر جدول المواد) للتسلسل. قارن نتائج التسلسل بواسطة Blast في قاعدة بيانات GenBank الخاصة ب NCBI. وفقا لتماثل التسلسل ، حدد سلالات مختلفة وقم ببناء أشجار النشوء والتطور بطريقة الاحتمالية القصوى في MEGA-X لتحديد علاقات الأنواع بين السلالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه التجربة ، تم عزل 48 سلالة من العصيات من البراز الطازج للخنازير السليمة ، والتي تم ترقيمها من 1001 إلى 1048. من بينها ، كان 15 سلالة لها نشاط مضاد للبكتيريا ضد M. luteus. من السلالات ال 15 ، تم قياس عيار الباسيتراسين بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، كما هو موضح في الجدول 1. من بينها ، B. licheniformis رقم 1026 كان أعلى عيار للعصيات ، 456.35 ± 21.75 وحدة / مل ، لذلك تم اختيار رقم 1026 للتجارب اللاحقة.

تظهر نتائج التعريف بواسطة TLC في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ينمو B. licheniformis بسرعة مع ظروف الاستزراع البسيطة والاستهلاك السريع للسكر ، وتقنية التخمير الناضجة مفيدة في توفير تكاليف الإنتاج الصناعي13. حدد التطبيق الواسع ل B. licheniformis وإفرازاته ، الباسيتراسين ، قيمته السوقية الواعدة. في الزراعة ، B. licheniformis يستخدم كسماد حيوي لتحسين نمو النبات وامتصاص المغذيات من خلال تعزيز خصوبة التربة ، وتعزيز نمو الجذور ، والمساعدة في تحلل الموادالعضوية 15. لإنتاج الإنزيمات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (رقم 2022YFC2104800) ، ومشروع قمم المواهب الست في مقاطعة جيانغسو (رقم 2019-NY-058).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 & مرات فانتا فلاش ماستر ميكسنانجينغ فازيم التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، نانجينغ ، الصينP252-01
2kb DNA MarkerBeijing Trans Biotechnology Co.، Ltd. ، بكين ، الصينBM121-01
AcetonitrileShanghai علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA104443
AgaroseShanghai علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينA104062
كبريتات الأمونيوم ((NH4< / sub>) 2< / sub>SO4< / sub>)Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصين10002917
معقم الأوتوكلافZealway Instrument Inc. ، شيامن ، الصينGI36DWS
شريط تحديد الكيمياء الحيوية Bacillusتشينغداو هايبو التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، تشينغداو ، الصينHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصينB65740
بكتيريا استخراج الحمض النووي كيتTiangen Biochemical Technology Co.، Ltd. ، بكين ، الصينDP209
فيلم الختم القابل للتنفسBeijing Leiborun Biotechnology Co.، Ltd.BS-QM-01A
بوتانولشنغهاي علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينB433378
C18 (5 & mu ؛ م ، 4.6 & مرات ؛ 250 مم) عمود HPLCRizhao Kepuno New Material Co.، Ltd.، Rizhao، الصينC1805-462510
كربونات الكالسيوم (CaCO3< / sub>)Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd.، شنغهاي، الصين10005717
الطرد المركزيNew Brunswick Scientific Co.، Inc.، UK5452
خزان كروماتوغرافيا نانجينغ Tenghui التجريبية التكنولوجيا المحدودة ، نانجينغ ، الصينP-1
زجاجة مخروطيةSichuan Shubo & nbsp; Co.، Ltd. ، Chengdu ، الصين18012
حاضنة درجة حرارة ثابتةTaist Instrument Co.، Ltd. ، تيانجين ، الصينGH4500
فوسفات ثنائي البوتاسيوم (K2< / sub>HPO4< / sub>)Xilong Chemical Co.، Ltd. ، قوانغدونغ ، الصينXL0015
EDTA-2Naشنغهاي علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينE397526
التوازن الإلكترونيMettler Toledo International Co.، Ltd.FA2104
الكحول الإيثيليشنغهاي علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينE130059
جل ميدي تنقيةكيت تيانغن التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، بكين ، الصينDP302
قضيب زجاجيتشنغدو Yibang Kexi Instrument Co.، Ltd.1294
الجلوكوزشنغهاي ماكلين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينD823520
مجموعة حلول تلطيخ غرامتشينغداو هايبو التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، تشينغداو ، الصينHB8278
الكروماتوجراف السائل عالي الأداءAgilent Technologies، Inc. ، كاليفورنيا ، أمريكا1260
جهازالرحلان الكهربائي الأفقيبكين Liuyi التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، بكين ، الصينDYCP-31DN BIOMATE
حلقة التلقيحشنغهاي Muchen التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصين3171026
النمام المغناطيسيWiggens GmbH Co.، Ltd. ، ألمانياWH220 PLUS
كحول الميثيلشنغهاي علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينM116115
أنبوب الطرد المركزي الصغيرشنغهاي موتشين التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصين1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection ، سوتشو ، الصينBNCC102589
غشاء مرشح صغير يسهل اختراقهNantong Suri Experimental Equipment Co.، Ltd.PES0.22
NinhydrinShanghai علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينN105629
المجهر البصريمصنع الأدوات البصرية ، شنغهاي ، الصينDYS-108
براز الخنزيرنانجينغ Quanfu مزرعة الخنازير ، نانجينغ ، الصين
تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مكبر للصوتسوتشو دونغشنغ Xingye Scientific Instrument Co.، Ltd. ، سوتشو ، الصينETC811
شركة التسلسل المهنيةعلم الأحياء العام (آنهوي) المحدودة ، آنهوي ، الصين
بيريدينشنغهاي علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينP111516
شاكرتايكانغ Qiangle المعدات التجريبية المحدودة ، تايكانغ ، الصينHYL-C
هلام السيليكا GF254 لوحةطبقة رقيقةYantai Huayang New Material Co.، Ltd. ، Yantai ، الصينHPT-HSGF5025023
كلوريد الصوديوم (NaCl)شنغهاي Macklin Biochemical Technology Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصينS805275
سترات الصوديومSinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصينC39197100001
النشا القابل للذوبانShanghai Macklin Biochemical Technology Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصينS817547
حمام مائي ترموستاتشنغهاي Heheng Instrument Equipment Co.، Ltd. ، شنغهاي ، الصينDK-8D
TryptoneShanghai علاء الدين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصينT139519
Ultra Gel RedNanjing Vazyme Biotechnology Co.، Ltd. ، Nanjing ، ChinaGR501-01
أداة المياه النقيةالفائقة Merck KGaA Co.، Ltd. ، ألمانياملي منظف بالموجات فوق الصوتية Direct-Q8
Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co.، Ltd. ، Jiangsu ، الصينSB-100DT
Vernier الفرجار   ؛شركة Sanfeng ، اليابانN20P
مسحوق مستخلص الخميرةVicbio Biotechnology Co.، Ltd. ، بكين ، الصينLP0021
مسحوق أجار شنغهاي ماكلين التكنولوجيا الكيميائية الحيوية المحدودة ، شنغهاي ، الصين A800730

المراجع

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إنتاج الباسيتراسينالعزل البرازيميكروبيوتا الخنازيرتنقية الباسيتراسينكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقةكروماتوغرافيا السائل عالية الأداءتثبيط ميكروكوكوس لوتيسالتحليل التطوري السلاليالتوصيف الكيميائي الحيوي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.