يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة جيلي وارتون والإكسوسومات المشتقة منها / الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

نوفمبر 11, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

في هذه المقالة

ملخص

أنسجة الحبل السري هي مصدر غني ومتاح بسهولة وغير جراحي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs). في هذا البروتوكول ، يتم توفير خطوات مفصلة لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية الجذعية الجينية للهلام البشري في وارتون (WJ-MSCs) ، متبوعا ببروتوكول قصير بسيط لعزل الإكسوسومات المشتقة أو الحويصلات الصغيرة خارج الخلية.

الملخص

في مجال الطب التجديدي ، أثارت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) اهتماما خاصا. الخلايا الجذعية الجذعية من أنسجة الحبل السري (UC) ، والتي يشار إليها باسم هلام وارتون ، راسخة بشكل خاص في مجموعة متنوعة من التطبيقات. بالمقارنة مع مصادر MSC الأخرى ، تقدم MSCs من Wharton Jelly MSCs (WJ-MSCs) عددا من الفوائد ويتم عزلها عن UC ، والتي يتم التخلص منها عادة كنفايات طبية. لذلك ، لا تثير WJ-MSCs أي قضايا أخلاقية مشابهة لتلك المتعلقة بالخلايا الجذعية الجنينية. تم استخدام تقنية استخراج بسيطة وقابلة للتكرار لعزل WJ-MSCs من أنسجة UC. في غضون خمسة إلى عشرة أيام من العزلة ، تظهر الخلايا الجذعية الجذعية WJ-كخلايا ملتصقة ذات شكل ليفي. بعد عزلها ، تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء الخلايا في 14-18 يوما. بعد ذلك ، في المقطع 3 ، تميزت WJ-MSCs المعزولة بالكامل بتحفيزها على التمايز على طول سلالات اللحمة المتوسطة الشحمية ، وهشاشة العظام ، وغضروفية. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار التنميط المناعي لعلامات سطح المجموعة السلبية من التمايز (CD) ، بما في ذلك CD34 و CD14 و HLA-DR ، بالإضافة إلى علامات سطح MSC المميزة مثل CD105 و CD90 و CD73 و CD44. علاوة على ذلك ، تم استخدام الكاشف المتسرب في نهج مباشر لعزل الإكسوسومات / الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) من الوسط المكيف لتلك الخلايا الجذعية الجذعية WJ-MSCs. بعد عزلها ، لوحظت الإكسوسومات / sEVs تحت المجهر الإلكتروني للإرسال ، واستخدم تحليل حجم الجسيمات لحساب متوسط حجمها. باختصار ، توفر WJ-MSCs إمدادا متاحا بسهولة وغير جراحي ومتجدد من الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها كمصانع لإنتاج الإكسوسومات / المركبات الكهربائية. يمكن استخدام WJ-MSCs وإكسوسومات / sEVs المشتقة منها في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية العلاجية والنهائية.

المقدمة

قبل بضع سنوات فقط ، كان يعتقد أن الخلايا الجذعية تأخذ زمام المبادرة في الطب1،2. ومع ذلك ، فإن القلق الأخلاقي الذي تمثله الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) كان عقبة كبيرة تعيق التقدم السريع في هذا المجال3. أثار هذا الكثير من الاهتمام باستكشاف مصادر بديلة متجددة للخلايا الجذعية ، خاصة تلك التي يمكن عزلها بعد الولادة عن الحبل السري (UC) 4. تلتصق UC بشكل طبيعي بالمشيمة والجنين داخل الأم الحامل. يتمثل الدور الفطري ل UC في تغذية الجنين المتنامي بإمدادات دم مستمرة وكافية عبر الأوعية الدموية وضمان حماية هذه الأوعية من خلال تجنب أي التواء أو ضغط أو التواء محتمل للجنين أثناء حركته5. من الناحية التشريحية ، يتكون UC البشري من شريانين ووريد مضمنان داخل النسيج الضام المخاطي ومحاطة بطبقة خارجية من الظهارة الأمنيوسية6. تعرف مصفوفة UC ، أو النسيج الضام المخاطي الذي يحيط بالأوعية السرية الثلاثة ، باسم "هلام وارتون" (WJ) وهي مصنوعة بشكل أساسي من البروتيوغليكان والكولاجين7.

في الآونة الأخيرة ، جذبت الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) الكثير من الاهتمام كونها طريقة علاجية جديدة فعالة لمجموعة واسعة من تطبيقات الطب التجديدي7،8،9،10،11،12. الأمر الأكثر إثارة للاهتمام حول الخلايا الجذعية الجذعية هو سهولة عزلها ، بالإضافة إلى الأنشطة المعدلة للمناعة المثبتة وتعدد القدرات13،14،15. المزايا المتفوقة الأخرى للخلايا الجذعية الجذعية بشكل عام وتلك المشتقة من WJ على وجه الخصوص هي أنه لا تظهر أي أورام مسخية عند الزرع ، على عكس ESCs ، وحقيقة أنها تحافظ على خاصية الجذع الخاصة بها حتى بعد عدة ممرات خلوية16،17. وبالتالي ، يعتقد الآن أن الخلايا الجذعية الجذعية يمكن أن توفر بالفعل تدخلات علاجية ثورية لأمراض مختلفة8،18،19. من المهم الإشارة إلى أنه في عام 2006 ، حددت الجمعية الدولية للعلاج الخلوي والجيني (ISCT) معايير دنيا محددة للتوصيف الصحيح ل MSCs20. أولا ، عند زراعتها / زراعتها في ظروف الاستزراع القياسية ، من المفترض أن تكون الخلايا الجذعية الجذعية ملتزمة بالبلاستيك. ثانيا ، يجب أن تعبر MSCs عن بعض علامات سطح المجموعات المميزة للتمايز (CD) مثل CD90 و CD105 و CD73 ، ويجب ألا تظهر تعبيرا عن الآخرين مثل CD14 و CD34 و CD45. ثالثا ، يجب أن تتمايز الخلايا الجذعية الجذعية إلى سلالات عظمية ، وأديبوجينيك ، وغضروفية في المختبر20. حتى يومنا هذا ، تم عزل الخلايا الجذعية الجذعية من مصادر متعددة ، بما في ذلك الأنسجة البالغة مثل نخاع العظم (BM) ، والأنسجة الدهنية21 ، بالإضافة إلى مصادر الجنين / الفترة المحيطة بالولادة مثل المشيمة ودم UC (UCB) ، ومصفوفة UC22،23. من الجدير بالذكر هنا أنه عند مقارنة معدل نجاح حصاد الخلايا الجذعية الجذعية ، تم الإبلاغ عن وصوله إلى ما يقرب من 100٪ من أنسجة WJ مقارنة بحوالي 6٪ فقط من UCB24,25. وبالتالي ، على الرغم من أن UCB هو بالفعل مصدر غني للخلايا الجذعية المكونة للدم ، إلا أنه يعتبر أيضا مصدرا جيدا للخلايا الجذعية الجذعية ، ولكنه أقل بكثير من WJ26،27،28.

تعتبر WJ-MSCs استثنائية عند مقارنتها بالأنواع الأخرى من الخلايا الجذعية الجذعية لأنها ، على الرغم من أنها بحسن نية (نموذجية) ، وتمتلك خصائص مماثلة مع نظيراتها البالغة ، إلا أنها تمتلك أيضا تعبيرا عن العديد من علامات تعدد القدرات / ESCs17،29. وفقا لذلك ، يعتقد أن WJ-MSCs تقع في مكان ما بين الخلايا الجذعية البالغة والجنينية17. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور على WJ-MSCs للتعبير عن كل من علامات الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية البشرية وعلامات ESCs وهي قادرة على الحفاظ على الجذع لعدة مقاطع16. لحسن الحظ ، عند الزرع ، لا تشكل الأورام المسخية17. يمكن توضيح ذلك من خلال ملفها الشخصي النسخي الفريد مقارنة ب ESCs ، بالإضافة إلى MSCsالأخرى 29،30. تقدم WJ-MSCs مزايا مختلفة على الخلايا الجذعية الجذعية البالغة ، وحتى على الأنواع الأخرى من الخلايا الجذعية بشكل عام. وسائل عزلهم متاحة بسهولة ، عبر UC التي يتم التخلص منها بشكل روتيني عند الولادة ، وبالتالي تعتبر نفايات طبية. لذلك ، على عكس ESCs ، ليس لدى WJ-MSCs مخاوف أخلاقية ، وعلى عكس BM-MSCs ، يتم عزلها عبر تقنية غازية31. علاوة على ذلك ، مثل أنواع الخلايا الجذعية الجذعية الأخرى ، تفتقر WJ-MSCs إلى التعبير عن مستضد الكريات البيض البشرية المرتبط ب D (HLA-DR) ، وقد وجد على وجه الخصوص أنه يعبر عن مستضد الكريات البيض البشرية G (HLA-G) ، مما يوفر لهم امتيازا مناعيا إضافيا32. يشير هذا إلى أن WJ-MSCs تظهر دورا مثبطا للمناعة يحاكي ما يحدث عادة في واجهة الجنين والأم في الجسم الحي33،34،35. أخيرا ، مثل نظائرها المعزولة عن UCB ، تتمتع WJ-MSCs بإمكانيات كبيرة للخدمات المصرفية36. بالنظر إلى كل هذه المزايا ، يتم الدعوة إلى WJ-MSCs لتكون المعيار الذهبي الجديد للعلاجات القائمة على MSC30.

ومن المثير للاهتمام ، أن قدرا كبيرا من الأبحاث قد كشف أن الخلايا الجذعية الجذعية تظهر آثارها العلاجية بشكل أساسي عن طريق إشارات paracrine. في كثير من الحالات ، تم الإبلاغ عن حدوث مثل هذه التأثيرات استجابة للإكسوسومات / الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) التي تفرزها الخلايا الجذعيةالجذعية 37. تعرف الإكسوسومات / sEVs باسم الحويصلات النشطة بيولوجيا ذات الحجم النانوي التي يتم الحصول عليها من نظام الغشاء الداخلي للخلية. إنها تعمل كمكوكات تنقل شحنات محددة من البروتينات ، و mRNA ، بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي غير المشفر مثل microRNAs والحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (LncRNAs) ، كرسالة في زجاجة38. نتيجة لذلك ، يمكنهم إعادة برمجة الخلايا المتلقية ويشار إليها على أنها "جسيمات إشارة" تتلاعب بالوظائف الخلوية الأساسية39. أثبتت الإكسوسومات / sEVs المشتقة من الخلايا الجذعية الجذعية تفوقها على علاجات الخلايا الجذعية الجذعية في كونها بديلا محتملا خاليا من الخلايا. على غرار الخلايا الجذعية الجذعية الأم ، تم العثور على الإكسوسومات / sEVs لإثارة التأثيرات العلاجية وتجديد الخلايا في العديد من الأمراض. ومع ذلك ، على عكس الخلايا الأم ، يمكنهم عبور الحواجز البيولوجية بسهولة أكبر. علاوة على ذلك ، فهي خالية من مخاوف السلامة الحرجة. لا تنقل أي خطر من الرفض المناعي أو تكوين الورم على المدى الطويل40. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الإكسوسومات / المركبات الذاتية للتحكم في تطبيقات العلاج الجيني كوسيلة لنظام توصيل الدواء ، كونها مجهزة بشكل طبيعي لنقل المعلومات الجينية41. وهكذا ، فإن الإكسوسومات / المركبات الكهربائية قد أشعلت بالفعل طرقا جديدة ومثيرة للتدخلات العلاجية الجديدة لأمراض مختلفة42،43،44.

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم بروتوكول شامل قائم على النباتات، لعزل وتوصيف WJ-MSCs من أنسجة UC. وسيتبع ذلك بروتوكول موجز لعزل الإكسوسومات / المركبات الكهربائية من الوسائط المكيفة لهذه WJ-MSCs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب والإجراءات وفقا للإرشادات المعتمدة وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان الأخلاقية لكل من كلية الصيدلة ، جامعة عين شمس ، القاهرة ، مصر (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC # 220) وكلية الصيدلة ، الجامعة البريطانية في مصر ، القاهرة ، مصر (CL-2309). تم الحصول على UCs بعد الحصول على موافقة مستنيرة موقعة من الوالد (الوالدين).

1. عزل WJ-MSCs عن الحبل السري البشري

  1. ضع حوالي 30-40 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في وعاء (كيس تجميع محكم الغلق) لتجميع الحبل السري (UC) (طوله حوالي 15 سم) بعد الولادة مباشرة. حافظ على UC الذي تم جمعه على الجليد وقم بمعالجته في غضون 4-5 ساعات كحد أقصى من التجميع.
    ملاحظة: لا يمكن معالجة العينة بعد 4-5 ساعات ، لأن هذا سيقلل بشكل كبير من إنتاجية الخلايا الجذعية الجذعية. تأكد من تعقيم PBS والحاوية.
  2. قم بإعداد وسائط مزرعة كاملة ل WJ-MSCs المكونة من وسط النسر المعدل منخفض الجلوكوز من دولبيكو (LG-DMEM) المكمل ب 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 2 ملي لجلوتامين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب.
  3. ضع 3 مل من الوسائط الكاملة لكل بئر في ألواح ذات 6 آبار ، ثم ضع تلك الألواح المكونة من 6 آبار تحتوي على وسائط في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للتدفئة والاستعداد.
  4. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإعداد ثمانية أطباق زراعة الخلايا مقاس 10 سم ، كل منها مليء ب 10 مل من PBS المعقم.
  5. بعناية ، باستخدام ملقط معقم ، انقل UC من الكيس البلاستيكي المغلق إلى أول طبق بتري يحتوي على PBS لغسل الدم (كرر هذه الخطوة حتى يتم غسل كل الدم من العينة).
  6. رش 70٪ إيثانول على مسحة معقمة واستخدمها لمسح UC لمدة 30 ثانية.
  7. انقل UC إلى طبق Petri جديد مليء ب PBS المعقم لإزالة أي إيثانول متبقي.
  8. انقل UC إلى طبق Petri آخر مملوء مسبقا ب PBS المعقم وباستخدام مقص معقم ، قم بتقطيع UC إلى قطع أصغر (حوالي 3 سم لكل منها). بعد ذلك ، انقل تلك القطع التي يبلغ طولها 3 سم إلى طبق بتري آخر مع PBS معقمة طازجة لتجنب إفراز الدم أثناء عملية التقطيع.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يجب الحفاظ على قطع UC على الجليد ، بالإضافة إلى جميع خطوات المعالجة اللاحقة. هذا مهم حقا لتجنب إطلاق المواد الجيلاتينية وضمان نجاح إجراء عزل WJ-MSCs من أنسجة UC. تعد معالجة UC التي تم جمعها في غضون 4-5 ساعات كحد أقصى أمرا بالغ الأهمية لنجاح عملية العزل. في السابق ، تمت معالجة UC في غضون فترات أطول بعد الجمع ، ولسوء الحظ ، لم يظهر الإجراء نتائج ناجحة (البيانات غير معروضة).
  9. ابدأ في معالجة قطع UC واحدة تلو الأخرى (على الجليد) في طبق بتري مليء ب PBS المعقم. استخدم مقصا وملقطا معقما لقطع الأوعية الدموية وعزل أنسجة هلام وارتون (WJ). ثم ضع قطع WJ الشفافة في طبق بتري آخر مليء ب PBS المعقم على الثلج.
    ملاحظة: أثناء عزل أنسجة WJ من قطعة UC ، يتم إجراء الشق الأول على الجانب الشفاف من قطعة UC ، بعيدا عن الأوعية الدموية ، لتجنب قطع الوعاء. بعد ذلك ، يتم تثبيت الأوعية الدموية وقطعها وسحبها بعيدا.
  10. كرر الخطوة السابقة على جميع قطع UC للحصول على أنسجة WJ واضحة بدون أوعية دموية.
    ملاحظة: قم بتغيير طبق PBS Petri ، إذا لزم الأمر ، أثناء معالجة قطع UC وإزالة الأوعية الدموية ، إذا أصبح محلول PBS دمويا أو غير واضح أثناء عزل أنسجة WJ.
  11. اغسل قطع WJ التي تم جمعها باستخدام PBS عن طريق نقلها إلى طبق مزرعة خلايا طازج مقاس 10 سم مليء ب PBS المعقم.
  12. استخدم مشرطا وملقطا معقما وحادا لتقطيع أنسجة WJ المجمعة إلى قطع صغيرة بطول 10 مم.
  13. انقل قطع WJ إلى ألواح 6 آبار معدة مسبقا في الخطوة 1.3. ضع 5-6 قطع WJ لكل بئر ، ثم احتضن الألواح المكونة من 6 آبار تحتوي على مستخلصات أنسجة WJ في جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 واتركها دون إزعاج لمدة 3 أيام.
  14. في اليومالرابع من وضع مستحضرات الأنسجة WJ ، أضف بعناية 1 مل من الوسائط لكل بئر ، مع الحرص على عدم إزعاج النباتات.
    ملاحظة: تجنب لمس أو خدش الجزء السفلي من اللوحة حيث يتم توصيل قطع WJ.
  15. كرر الخطوة السابقة في اليومالسادس بعد وضع مستحضرات الأنسجة WJ.
  16. فياليوم الثامن بعد وضع مستخلصات الأنسجة WJ (أي ما يقرب من أسبوع واحد بعد وضع النبات) ، ابدأ في تغيير نصف الوسائط لكل بئر كل يومين حتى اليوم 12-14 بعد وضع الزرع المستقطع. استبدل نصف وسائط الاستزراع من كل بئر عن طريق إزالة حوالي 2.5 مل من كل بئر وإضافة 2.5 مل من الوسائط الدافئة الكاملة (37 درجة مئوية).
    ملاحظة: اسحب الوسائط من سطح البئر وتجنب لمس أو خدش الجزء السفلي من اللوحة حيث يتم توصيل قطع WJ. عادة ما تظهر WJ-MSCs أسفل وحول مستخلصات أنسجة WJ في غضون 5-10 أيام بعد وضع المستخلصات.
  17. راقب الألواح المكونة من 6 آبار بشكل روتيني تحت مجهر مقلوب (تكبير 10x) ، وإذا كانت الخلايا التي تم إطلاقها تتكاثر وكان التقائها يتزايد ، ويصل إلى 50-60٪ ، فانتقل إلى الخطوة التالية ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، كرر الخطوة 1.16. مرة أخرى. يتقلص حجم قطع WJ بشكل كبير بمرور الوقت.
  18. قم بإزالة مستحضرات WJ المرفقة بقاع الآبار برفق وقم بإزالة جميع الوسائط. عادة ما تتم إزالة قطع نبات WJ في اليوم 12-14 من وضعها في البداية.
    ملاحظة: قم بإمالة الألواح قليلا بزاوية 45 درجة أثناء إزالة الوسائط لضمان إزالة جميع الوسائط.
  19. اغسل كل بئر ب 2 مل من PBS ، وقم بتدوير اللوحة برفق ، ثم تخلص من PBS. كرر خطوة الغسيل هذه مرتين.
    ملاحظة: أضف PBS برفق إلى جدار البئر وتجنب لمس قاع الآبار لضمان عدم إزعاج الخلايا على الإطلاق.
  20. أضف 2 مل من الوسائط الكاملة الدافئة لكل بئر برفق (وسائط ذات تركيب دقيق كما هو موضح في الخطوة 1.2) واحتضن الألواح المكونة من 6 آبار في ظروف مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية.
  21. قم بتغيير الوسائط تماما كل يومين (2 مل من الوسائط الكاملة لكل بئر) حتى تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء القيا.
  22. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء الخلايا ، قم بتمرير الخلايا باستخدام التربسين-EDTA إلى قوارير زراعة الخلايا T25 (يمكن تمرير إجمالي الخلايا التي تم الحصول عليها من لوحة واحدة مكونة من 6 آبار إلى قارورة ثقافة T25 واحدة ، واستخدم 8-9 مل من الوسائط الكاملة لكل قارورة T25). يشار إلى WJ-MSCs هذه بخلايا P1.
    ملاحظة: لا تترك الخلايا لفترة طويلة جدا مع التربسين-EDTA لتجنب الآثار السامة; عادة ، 3 دقائق كافية لانفصال الخلايا. يمكن للموردين المختلفين تزويد Trypsin-EDTA بفاعلية متغيرة. وفقا لذلك ، يجب مراعاة ذلك عند تحديد وقت الحضانة.
  23. قم بتغيير وسائل الإعلام كل يوم. بمجرد وصول الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء الخلايا ، قم بتمرير الخلايا باستخدام Trypsin-EDTA إلى قوارير زراعة الخلايا T75 (يمكن تمرير إجمالي الخلايا التي تم الحصول عليها من قارورة ثقافة T25 إلى قارورة ثقافة T75 واحدة ؛ استخدم 15-18 مل من الوسائط الكاملة لكل قارورة T75) ؛ يشار إلى WJ-MSCs هذه بخلايا P2.
  24. قم بتغيير وسائل الإعلام كل يوم. بمجرد أن تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء الخلايا ، افصل الخلايا باستخدام Trypsin-EDTA ، ثم قم بزرع WJ-MSCs بكثافة حوالي 0.75 × 106-1 ×10 6 خلايا لكل قارورة T75. يشار إلى WJ-MSCs هذه بخلايا P3.
    ملاحظة: استخدم الخلايا بين P3-P5 للتجارب المستقبلية الموضحة في هذا البروتوكول.
  25. يحفظ بالتبريد WJ-MSCs المعزولة في النيتروجين السائل باستخدام وسائط الحفظ بالتبريد المكونة من 80٪ FBS و 10٪ وسائط كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.2) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    ملاحظة: يتم توفير عرض تخطيطي للخطوات الكاملة لعزل WJ-MSCs في الشكل 1.

2. توصيف WJ-MSCs المعزولة عن طريق التنميط المناعي باستخدام تحليل التدفق الخلوي لعلامات سطح القرص المضغوط المختلفة

  1. افصل الخلايا باستخدام Trypsin-EDTA في المقطع 4. اغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين وعد عددها باستخدام مقياس الخلايا.
    ملاحظة: الحد الأدنى من وقت الحضانة (لمدة 3 دقائق) أثناء التربسين أمر بالغ الأهمية لفصل الخلايا بنجاح دون إحداث أي ضرر. قد تؤدي الحضانة المطولة باستخدام Trypsin-EDTA إلى إتلاف علامات سطح الخلية والتأثير سلبا على نتائج مقايسة التنميط المناعي.
  2. احتضان حوالي 100,000 خلية (في الظروف المظلمة) لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة البشرية المصنفة إما ب phycoerythrin (PE) أو الفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) على النحو التالي: Anti-CD90 PE ، Anti-CD73 PE ، Anti-CD105 FITC ، Anti-CD44 PE ، Anti-CD34 PE ، Anti-CD14 PE ، و Anti-HLA-DR FITC ، واستخدم الخلايا غير الملطخة كعناصر تحكم
  3. اشطف الخلايا باستخدام PBS وأعد تعليقها بعد ذلك في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ؛ التحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي45.

3. تقييم إمكانات التمايز ل WJ-MSCs المعزولة نحو سلالات اللحمة المتوسطة المختلفة

  1. التمايز أديبوجيني
    1. أعد تعليق الخلايا في وسائط الانتشار الكاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.2). بعد ذلك ، قم بزراعة الخلايا بكثافة 3.7 × 104 خلايا / بئر (0.5 مل وسط / بئر) في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. ثم ، احتضان في ظروف مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، بعد ذلك ، كل يومين ، قم بتغيير الوسائط حتى تصل الخلايا إلى ما يقرب من 100٪ من التقاء ؛ يستغرق هذا عادة حوالي 3-4 أيام.
    2. إزالة وسائط الانتشار واستبدالها بوسائط التمايز أديبوجينيك للحث على تكوين الشحم. استكمل وسائط LG-DMEM ب 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 0.25 ميكروغرام / مل من الأمفوتريسين B ، والمكملات الأديبوجينيك المتوفرة في مجموعة تحديد وظائف الخلايا الجذعية الوسيطة. بعد ذلك ، قم بتغيير الوسائط برفق (0.5 مل / جيد) كل 3 أيام وتجنب تعطيل فجوات الدهون.
    3. بعد حوالي 21 يوما ، باستخدام الفحص المجهري ، قم بتلطيخ فجوات الدهون باللون الأحمر الزيتي لتقييم التمايز الشدي.
    4. تحضير محلول مخزون طازج من Oil Red ؛ قم بإذابة 30 مجم من صبغة الزيت الأحمر في 10 مل من الأيزوبروبانول واتركه يرتاح لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول عمل عن طريق خلط جزأين من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) مع 3 أجزاء من محلول المخزون ، وخلطهما جيدا ، وتركه يرتاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بالتصفية باستخدام مرشح 0.22 أو 0.45 ميكرومتر.
      ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج التلوين ، قم بإعداد صبغة الزيت الأحمر حديثا.
    5. للحصول على توثيق ناجح للتمايز الشحمي ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وقم بإصلاحها باستخدام الفورمالين المحايد 10٪ (0.75 مل / جيد) لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS باستخدام 1 مل / بئر (قبل التخلص من PBS بعد كل غسلة ، احتضن الخلايا لمدة 5 دقائق تقريبا).
      ملاحظة: تستخدم الخلايا المحفوظة في وسائط الانتشار (الموضحة في الخطوة 1.2) كخلايا تحكم غير مستحثة. أضف الفورمالين المحايد المخزنة ببطء إلى الجدران ، وليس مباشرة على الخلايا ، لتجنب تلف الخلايا. بعد الغسيل النهائي باستخدام PBS ، يعد الشفط الكامل ل PBS أمرا بالغ الأهمية قبل إضافة محلول عمل Oil Red Color لتجنب التلوين غير الفعال.
    6. بعد الغسيل النهائي ، قم بتلطيخ الخلايا (1 مل / جير) بمحلول عمل Oil Red واحتضنها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، اسحب محلول البقع وتخلص منه وشطف الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS. ثم ، تحت المجهر ، لاحظ قطرات الدهون الملطخة.
  2. التمايز العظمي
    1. أعد تعليق الخلايا في وسائط الانتشار الكاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.2). بعد ذلك ، في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا ، قم بزرع 7.4 × 103 خلايا / بئر (أضف 0.5 مل وسط / بئر) ، واحتضانها لمدة 3 أيام في ظروف رطبة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية للوصول إلى ما يقرب من 70٪ من التقاء التقاء.
    2. عند حوالي 70٪ من التقاء ، استبدل وسائط التكاثر بوسائط تحريض التمايز التي تتضمن مكمل هشاشة العظام - المقدم في مجموعة التعريف الوظيفي للخلايا الجذعية الوسيطة - في وسائط LG-DMEM المكملة ب 10٪ FBS ، جنبا إلى جنب مع 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 2 ملي لتر جلوتامين ، و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب.
    3. استبدل وسائط التمايز مرة كل 3 أيام ، واستمر في تحريض هشاشة العظام لمدة 21 يوما تقريبا.
    4. تحضير محلول عملي من صبغة Alizarin Red S ؛ أحضر 9 مل من ddH2O وقم بإذابة 200 مجم من صبغة Alizarin Red S فيه ، ثم استخدم هيدروكسيد الأمونيوم و HCl لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.1-4.3. بعد ذلك ، أكمل الحجم إلى 10 مل باستخدام ddH2O. بعد ذلك ، قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح (0.22 أو 0.45 ميكرومتر) لإزالة أي رواسب.
    5. في نهاية فترة الحث ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاحها باستخدام فورمالين محايد مخزن 10٪ (0.75 مل / جيد) واتركها ترتاح لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS (1 مل / جيد) ، وتأكد من احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق مع كل شطف.
      ملاحظة: تستخدم الخلايا المحفوظة في وسائط الانتشار (الموضحة في الخطوة 1.2) كخلايا تحكم غير مستحثة.
    6. أضف محلول العمل 2٪ Alizarin-Red S المعد في الخطوة 3.2.4 إلى تلك الخلايا الثابتة من الخطوة السابقة ، واحتضن في الظلام لمدة 45-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. بعد ذلك ، تخلص من محلول البقعة ، واشطف الخلايا باستخدام ddH2O مرتين ثم باستخدام PBS مرة واحدة ، ثم قم بتقييم التمايز العظمي الناجح تحت المجهر من خلال مراقبة المصفوفة خارج الخلية الملطخة الغنية بالكالسيوم.
  3. التمايز الغضروفي
    1. أعد تعليق الخلايا في وسائط الانتشار الكاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.2). بعد ذلك ، في صفيحة زراعة الأنسجة ذات 24 بئرا ، قم بزرع 7.4 × 103 خلايا / بئر (أضف 0.5 مل من الوسط / البئر) واحتضانها في ظروف رطبة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام للوصول إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء التقاء.
    2. عند حوالي 90٪ من التقاء ، ابدأ في إحداث التمايز الغضروفي باستخدام DMEM / F12 الخالي من المصل المكمل بالأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS) ، والمكملات الغضروفية - المزود مع مجموعة التحديد الوظيفي للخلايا الجذعية الوسيطة - جنبا إلى جنب مع 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 2 ملي ل-جلوتامين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين46.
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ بوسائط الحث الكاملة للتمايز الغضروفي في الظلام عند 2-8 درجة مئوية.
    3. مواصلة تحريض التمايز الغضروفي لمدة 21 أيام ؛ في غضون ذلك ، قم بتغيير الوسائط كل 3 أيام.
    4. قم بإعداد محلول عمل البقع Alcian Blue على النحو التالي: أولا ، قم بإعداد 3٪ من حمض الخليك الجليدي في ddH2O (أضف 3 مل من حمض الخليك الجليدي واملأ ما يصل إلى 100 مل ب ddH2O). بعد ذلك ، قم بإعداد محلول عمل بقعة Alcian Blue عن طريق إضافة 20 مجم إلى 20 مل من محلول حمض الجليد 3٪ ، وإبقائه ثابتا لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ثم الترشيح لاحقا باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر لإزالة أي رواسب.
    5. في نهاية فترة الحث ، اشطف الخلايا مرتين باستخدام PBS ، ثم قم بإصلاحها باستخدام الفورمالين المخزن المحايد بنسبة 10٪ (0.75 مل / جيد) واتركها ترتاح لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS (1 مل / جيد). تأكد من احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: تستخدم الخلايا المحفوظة في وسائط الانتشار (كما هو موضح في الخطوة 1.2) كخلايا تحكم غير مستحثة.
    6. احتضان الخلايا الثابتة في محلول العمل الأزرق Alcian 0.1٪ لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اشطف الخلايا باستخدام ddH2O مرتين وباستخدام PBS مرة واحدة لإزالة البقعة المتبقية. ثم ، باستخدام الفحص المجهري ، لاحظ البروتيوغليكان الكبريتية الملطخة.

4. عزل الإكسوسومات / المركبات الكهربائية من الوسائط المكيفة WJ-MSCs

  1. أعد تعليق WJ-MSCs في وسائط الانتشار الكاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.2) وألواح زراعة الأنسجة ذات 6 آبار مع WJ-MSCs بكثافة 150,000 خلية / بئر (2 مل وسط / بئر) واحتضانها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف رطبة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. قم بإعداد وسائط جمع الإكسوسومات الخالية من المصل (SF) على النحو التالي: متوسط النسر المعدل المعدل من Dulbecco منخفض الجلوكوز (LG-DMEM) المكمل ب 2 ملي مولار L-glutamine و 100 U / mL البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين و 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب.
    ملاحظة: تحتوي وسائط جمع الإكسوسومات على نفس تركيبة وسائط الانتشار الكاملة (الموصوفة في الخطوة 1.2) ولكن بدون FBS.
  3. اتبع الألواح المكونة من 6 آبار (المحضرة في الخطوة 4.1) واستبدل الوسائط كل يومين باستخدام وسائط الانتشار (كما هو موضح في الخطوة 1.2). راقب الخلايا تحت المجهر حتى تصل إلى حوالي 75-80٪ من التقاء التقاء.
  4. عند الوصول إلى 70٪ من التقاء ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS (1 مل / جيد) ، ثم أضف وسائط جمع الإكسوسومات الخالية من المصل (SF) (1.5 مل / بئر) (موصوفة في الخطوة 4.2) ، واحتضن لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظروف رطبة عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  5. بعد 48 ساعة ، اجمع الوسائط المكيفة WJ-MSCs من ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار الموضوعة في الخطوة السابقة في أنابيب جمع الطرد المركزي سعة 15 مل. بعد ذلك ، قم بتنفيذ خطوات الطرد المركزي والترشيح المتسلسلة التالية لمسح الوسائط المكيفة التي تم جمعها47.
    ملاحظة: باستخدام صبغة استبعاد التربان الزرقاء متبوعة بعدد الخلايا باستخدام مقياس الخلايا الدموية ، قم بتقييم النسبة المئوية للبقاء للخلايا المستخدمة في البداية لاشتقاق الوسائط المكيفة التي تم جمعها ؛ يجب أن تكون الخلايا القابلة للحياة أكثر من 90٪. بعد ذلك ، قم بتخزين حبيبات الخلية التي تم جمعها في -80 درجة مئوية في حالة الحاجة إليها لأي تحقيقات مستقبلية.
    1. قم بالطرد المركزي للوسائط المكيفة التي تم جمعها عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للتخلص من أي خلايا معلقة. بعد ذلك ، اجمع المادة الطافية وقم بتنفيذ خطوة الطرد المركزي التالية لهذا الطاف الذي تم جمعه (الوسائط المشروطة).
    2. جهاز طرد مركزي للوسائط المكيفة التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.5.1 عند 3000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للتخلص من الخلايا الميتة وكذلك حطام الخلايا.
      ملاحظة: يفضل أن تتم خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، ولكن يمكن أيضا إجراؤها في درجة حرارة الغرفة بنتائج مماثلة.
    3. قم بتصفية المادة الطافية التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة عن طريق تمريرها عبر مرشح 0.22 ميكرومتر في مجموعة جديدة من أنبوب البولي بروبيلين سعة 50 مل للتخلص من أي حطام خلوي متبقي ومركبات كهربائية كبيرة.
      ملاحظة: يمكن استخدام الوسائط المكيفة التي تمت تصفيتها على الفور للخطوات اللاحقة لعزل الإكسوسومات / المركبات الكهربائية ، وتخزينها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية واستخدامها لمدة لا تزيد عن 3 أيام ، أو تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل حتى تكون هناك حاجة إلى عزل الإكسوسومات / المركبات الكهربائية. يفضل معالجة الوسائط المكيفة التي تم تطهيرها المخزنة عند -80 درجة مئوية في غضون مدة أقصاها 1-3 أشهر ؛ كلما كان ذلك أفضل.
  6. ضع 7.5 مل من الوسائط المكيفة التي تم تطهيرها (تم الحصول عليها من الخطوة 4.5) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأضف 1.5 مل من الكاشف. أضف الكاشف إلى الوسائط بنسبة 1: 5 (أي 1 مل من كاشف ترسيب Exoquick-TC لكل 5 مل من الوسائط). بعد ذلك ، اقلب الأنبوب لأعلى ولأسفل ، وقم بنقره عدة مرات لضمان الخلط المناسب للكاشف المترسب مع الوسائط.
    ملاحظة: الكاشف المترسب هو كاشف ثقيل ولزج. وبالتالي ، يجب سحب الحجم المطلوب ببطء وبعناية لضمان نقل الحجم المقصود بالكامل.
  7. قم بتخزين الأنبوب الذي يحتوي على الوسائط مع الكاشف المرسب 4 درجة مئوية في وضع الوقوف بشكل مستقيم طوال الليل لمدة 16 ساعة (12 ساعة على الأقل).
  8. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي لخليط الوسائط / الكاشف المرسب عند 1500 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي, تظهر حبيبات الإكسوسومات / sEVs على شكل حبيبات بيضاء أو بيج صغيرة جدا استقرت في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: يمكن أيضا إجراء خطوة الطرد المركزي هذه في درجة حرارة الغرفة بنتائج مماثلة. في حالة عدم ظهور حبيبات الإكزوسوم / sEVs في نهاية خطوة الطرد المركزي هذه ، يمكن إضافة وقت طرد مركزي إضافي عند 3000 × جم لمدة 20-30 دقيقة إضافية عند 4 درجات مئوية. في بعض الأحيان ، تظل حبيبات الإكسوسومات / المركبات الكهربائية غير مرئية حتى بعد وقت الطرد المركزي الممتد ، مما يعني أن هناك كمية صغيرة من الإكسوسومات / المركبات الكهربائية. في هذه الحالة ، تابع البروتوكول عن طريق ترك الجزء السفلي من 5-10 ميكرولتر من الأنبوب.
  9. استنشق المادة الطافية ، وقم بالطرد المركزي لأسفل الوسائط المتبقية / خليط الكاشف المترسب عند 1500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم ، بعناية فائقة ، استنشق الآثار المتبقية من السوائل دون إزعاج حبيبات الإكسوسومات المترسبة / sEVs.
  10. قم بتعليق حبيبات الإكسوسومات / sEVs في 100-300 ميكرولتر من PBS المعقمة وفقا لحجم الحبيبات والرؤية. بعد ذلك ، يمكن استخدام هذه الإكسوسومات / المركبات الكهربائية على الفور أو تخزينها في فريزر فائق عند -80 درجة مئوية للتجارب اللاحقة.
    ملاحظة: في حالة البدء بأكثر من أنبوب طرد مركزي واحد لنفس الوسائط (الموضحة في الخطوة 4.9) ، وتكون كريات الإكسوسومات / sEVs (التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.10) غير مرئية ، يمكن تجميع كريات exosomes / sEVs التي تم جمعها منها جميعا باستخدام حوالي 100-300 ميكرولتر من PBS المعقمة لتعليق جميعها مجمعة معا.
  11. حدد كمية الإكسوسومات / sEVs التي تم جمعها بالنسبة لمحتواها من البروتين باستخدام مجموعة قياس كمية بروتين حمض البيسينشونيك (BCA) المتوفرة تجاريا ، كما ذكرت الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يتم توفير عرض تخطيطي لجميع خطوات العزل للإكسوسومات / المركبات الكهربائية المشتقة من WJ-MSCs في الشكل 2.

5. تصوير الإكسوسومات المعزولة / المركبات الكهربائية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)

  1. قم بتعليق الإكسوسومات / المركبات الكهربائية المعزولة حديثا في 100-300 ميكرولتر من PBS المعقمة وفقا لحجم الحبيبات والرؤية (كما هو موضح سابقا في الخطوة 4.11).
    ملاحظة: يفضل استخدام الإكسوسومات المعزولة حديثا بدلا من الإكسوسومات / المركبات الكهربائية المجمدة للتصوير TEM
  2. ماصة 20 ميكرولتر من الإكسوسومات / المركبات الكهربائية المعلقة على شبكة مطلية بالكربون واتركها تجف لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإصلاح الإكسوسومات / المركبات الكهربائية الموضوعة باستخدام محلول جلوتارالديهايد (2٪ في الماء المقطر) لمدة 15 دقيقة تقريبا.
  4. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الإكسوسومات الثابتة / sEVs ب 2٪ من أسيتات اليورانيل واتركها لمدة 3 دقائق في الظلام ، ثم افحصها تحت مجهر إلكتروني ناقل الحركة (TEM) (تكبير 20000) باستخدام إعدادات TEM الافتراضية.

6. تحديد متوسط حجم الإكسوسومات المعزولة / المركبات الكهربائية باستخدام محلل حجم الجسيمات

  1. قم بتخفيف الإكسوسومات المعزولة حديثا / المركبات الكهربائية باستخدام درجة الحموضة المعقمة PBS 7.4 بنسبة 1: 250.
  2. قم بقياس متوسط توزيع حجم الجسيمات للإكسوسومات المعزولة / sEVs باستخدام محلل حجم الجسيمات عند 25 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عزل وتوصيف WJ-MSCs

كما هو موضح في الشكل 3 ، ظهرت الخلايا الصغيرة الشبيهة بالخلايا الليفية في البداية تحت أنسجة الزرع WJ والمحيطة بها في غضون 5-10 أيام بعد بذر تلك المستخلصات (الشكل 3 أ). تستمر هذه الخلايا الجذعية التي تم إصدارها في التكاثر وعادة ما تصل إلى حوالي 80٪ من التقاء في غضون 14-18 يوما بعد العزل. من الجدير بالذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، تمكنا من تقديم خطوات مفصلة لعزل WJ-MSCs عن أنسجة UC البشرية وأيضا لعزل الإكسوسومات المشتقة منها / sEVs. UC هو مصدر غير جراحي غير مستغل يمكن الوصول إليه بسهولة للحصول على MSCs ، ولا يلزم وجود معدات خاصة للجمع أو المعالجة 11،15،30،32،48. تم استخدام بروتوكولات مختلفة لعزل WJ-MSCs من أنسجة UC. في الأساس ، على ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين المشاركين عدم وجود تضارب في المصالح مرتبط بهذا العمل.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل جزئيا من جامعة عين شمس - منحة دعم أبحاث الخطة الاستراتيجية (2024/2025) ، مصر ، ومركز أبحاث تكنولوجيا النانو (NTRC) - جائزة Access (2019/2020) ، الجامعة البريطانية في مصر (BUE) ، القاهرة ، مصر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألكيان بلو 8GXسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكيةA3157
أليزارين ريد إسسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكيةA5533
هيدروكسيد الأمونيومفيشر ساينتيفيك، ألمانيا1336-21-6
الجسم المضاد لعلاج CD-105 البشري، FITCR& شركة دي سيستمز إنك، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةFAB10971F
الأجسام المضادة لعلاج CD-14 البشري، PEبيكمان كولتر، الولايات المتحدة الأمريكيةIM0650U
الأجسام المضادة للبشري CD-34، PEبيكمان كولتر، الولايات المتحدة الأمريكيةIM1420
الأجسام المضادة للبشري CD-44، PEبيكمان كولتر، الولايات المتحدة الأمريكيةA32537
الأجسام المضادة لمادة CD-73 البشرية، PER& شركة دي سيستمز إنك، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةFAB5795P
الأجسام المضادة لمادة CD-90 البشرية، PER& شركة دي سيستمز إنك، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةFAB2067P
الأجسام المضادة لعلاج HLA-DR البشري، FITCبيكمان كولتر، الولايات المتحدة الأمريكيةIM1638U
مجموعة قياس كمية بروتين حمض البيسينشونيك (BCA)ثيرموفيشر23227
خزانة السلامة الحيوية، تدفق طبقي، MSC Advantageثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
حاضنة CO2 حاضنة، شكل مباشرثيرمو ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
جهاز الطرد المركزي المبردسيغما، ألمانيا
جهاز الطرد المركزي المبردإبندورف، ألمانيا
جهاز قياس تدفق سايتوفليك بيكمان كولتر، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)فيشر ساينتيفيك، ألمانياBP231-100
DMEM - انخفاض الجلوكوز 1 ج/لترلونزا، سويسرا12-707F
DMEM/F12 لونزا، سويسرا12-719F
الماء الخالي من الحمض النووي DNAse/RNAseجيبكو ثيرمو فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية10977-035
الإيثانول المطلق، درجة علم الأحياء الجزيئيسيغما-ألدريتش، ألمانيا24103
إكزوكويك-تي سيعلوم الأحياء النظامية (SBI)، الولايات المتحدة الأمريكيةEXOTC50A-1عامل الترسيب
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو ثيرمو فيشر، البرازيل10270-106
فورمالديهايد 37٪فيشر ساينتيفكBP531-500
حمض الخليك الجليديسيغما ألدريتش، ألمانياA38S-500
محلول غلوتارالديهايد سيغماG7776
حمض الهيدروكلوريك (HCl)فيشر ساينتيفيك، ألمانياA144-212
المجهر المقلوبأوليمبوس، اليابان
إل-جلوتامينجيبكو ثيرمو فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية25030-024
مجموعة تحديد وظائف الخلايا الجذعية الميزانشيمية  R& شركة دي سيستمز إنك، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكيةSC006
قارئ الميكروبليتالكروميت، تقنيات التوعية، الولايات المتحدة الأمريكية
صبغة حمراء زيتيةسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدة الأمريكيةO0625
البنسلين-ستريبتومايسين-الأمفوتيرسينجيبكو ثيرمو فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية15240062
محلول ملحي مخزن بالفوسفات، مرة واحدة، بدون كالسيوم/ملغنيسيوملونزا، سويسراBE17-516F
حمام مائي مهزدايهان وايزباث، كوريا
فلتر الحقنة، 0.2 ميكرونكورنينغ، الولايات المتحدة الأمريكية431224
المجهر الإلكتروني الناقلJEM-1200EX II، جيول، ألمانيا
تريبان بلو  جيبكو ثيرمو فيشر، الولايات المتحدة الأمريكية15250061
تريبسين-فيرسين-إيدتا، 1xلونزا، سويسراCC-5012
محلول أسيتات اليورانيل (2٪)علوم المجهرية الإلكترونية، الولايات المتحدة الأمريكية22400-2
مقياس طياف الفوتومتري الفوق بنفسجي المرئيشيمادزو، اليابان
دوارSciLogex
زيتا-سايزر نانو ZNمالفرن بانالاليكال المحدودة، المملكة المتحدة محلل حجم الجسيمات

المراجع

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.