يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

زراعة غشاء حيوي متعدد الميكروبات ذي صلة بالتليف الكيسي لاستكشاف الأنماط الظاهرية للمجتمع

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66785

⸱

أبريل 19, 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذج الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات ذات الصلة بالرئة ذات الصلة بأربعة أنواع من التليف الكيسي (CF) والتي يمكن استخدامها لاستكشاف تأثير التفاعلات البكتيرية بين الأنواع.

الملخص

تفتقر معظم النماذج المختبرية إلى القدرة على التحقيق الكامل في الأنماط الظاهرية البكتيرية الناشئة عن التفاعلات المعقدة التي لوحظت في بيئات الحياة الواقعية. هذا صحيح بشكل خاص في سياق الالتهابات القائمة على الأغشية الحيوية التي يصعب علاجها والمزمنة والمتعددة الميكروبات التي تم اكتشافها في الشعب الهوائية للأفراد المصابين بالتليف الكيسي (CF) ، وهو مرض وراثي متعدد الأعضاء. في حين أن العديد من دراسات الميكروبيوم قد حددت التركيبات الميكروبية المكتشفة في مجرى الهواء للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (pwCF) ، لم تدمج أي نماذج في المختبر حتى الآن ميزات الرئة الهامة ذات الصلة بالتليف الكيسي بشكل كامل. لذلك ، توجد فجوة معرفية كبيرة في القدرة على التحقيق في الآليات التي تؤدي إلى التسبب في عدوى الرئة من الأنواع المختلطة CF. هنا ، نصف نموذجا للمجتمع الميكروبي المكون من أربعة أنواع تم تطويره مؤخرا ، بما في ذلك Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus و Streptococcus sanguinis و Prevotella melaninogenica المزروعة في ظروف شبيهة بالتليف الكيسي. من خلال استخدام هذا النظام ، لوحظت واستكشاف الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل التمرد المضاد للميكروبات للعديد من مسببات الأمراض واستكشافها على المستوى الجزيئي. تكمن فائدة هذا النموذج في المختبر في سير عمله الموحد الذي يمكن أن يسهل دراسة التفاعلات بين الأنواع في سياق التهابات الرئة المزمنة CF.

المقدمة

غالبا ما تفشل الاستراتيجيات التي تهدف إلى القضاء على الميكروبات المسببة للأمراض مثل تلك المكتشفة في مجرى الهواء للتليف الكيسي (CF) ، وهو مرض وراثي متعدد الأعضاء، 1. أي أن وجود مجتمعات ميكروبية مرنة تشبه الأغشية الحيوية تنمو في بيئة رئة التليف الكيسي الغنية بالمخاط يمكن أن يسبب التهابات مزمنة تمتد لعدة عقود2. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن استخدام مضادات الميكروبات في الخطوط الأمامية (Abx) والمغيرات قد أدى إلى تحسين النتائج لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (pwCF) ، فإن النهج السريري "حشرة واحدة ، عدوى واحدة" المستخدم عادة ضد مسببات الأمراض الكيسية الكبرية مثل Pseudomonas aeruginosa و Staphylococcus aureus كان غير فعال في حل الالتهابات التي يصعب علاجها والتي تم اكتشافها في رئتي هؤلاءالأفراد 3،4 ، 5،6،7.

على مدى العقدين الماضيين ، غيرت دراسات متعددة فهمنا لمرض الرئة التليفية الكيسيالمزمن 8. أي أن التقارير تشير إلى أن العدوى المكتشفة في الشعب الهوائية لالتهاب الكبد المتلأل الوهريبي ليست ناجمة فقط عن ممرض واحد ولكنها متعددة الميكروباتبطبيعتها. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التسبب في التهابات الرئة من الأنواع المختلطة لا يزال غير مفهوم جيدا ، إلا أن الأدلة السريرية تظهر أن pwCF المصابة بالعدوى المشتركة بكل من المكورات العنقودية الذهبية و P. aeruginosa في مجرى الهواء قد أدت إلى تدهور وظائف الرئة مقارنة بالأفراد الذين استعمرهم أي من هذين المسببات9.

يفترض أن التفاعلات بين الأنواع بين مسببات أمراض التليف الكيسي هي سبب عدم استئصال العدوى القائمة على الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات بسهولة من خلال استخدام علاجات التليف الكيسي ، مما يؤثر في النهاية على نتائج المريض3. ولدعم ذلك، أظهرت الدراسات المختبرية أن التفاعلات بين الميكروبات مثل المتصورة الزائفة الزنجارية، والمكورات العنقودية الذهبية وغيرها يمكن أن تؤثر على الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل استجابة Abx لأدوية التليف الكيسي في الخطوط الأمامية، بما في ذلك الفانكومايسين وتوبرامايسين6،10،11. ولذلك، لا يزال يتعين إعادة النظر في استراتيجيات العلاج الحالية الرامية إلى استئصال مسببات الأمراض المتلاطمة من التليف الكيسي في سياق حالات العدوى المختلطة الأنواع.

يعتمد المعيار الذهبي في إدارة التهابات الرئة الميكروبية الكيسية بشكل كبير على استخدام اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) لتوجيه التدخلات السريرية12. ومع ذلك ، يتم إجراء AST عادة باستخدام الزراعة الأحادية البكتيرية المزروعة في الثقافات الغنية والمختلطة جيدا ، والتي لا تعكس ظروف النمو الميكروبي المكتشفة في مجرى الهواء CF3،13. نظرا للانفصال الكبير بين نتائج المريض ونجاح العلاج ، تدعو التقارير السريرية الآن إلى تطوير مناهج جديدة تدمج السمات الحاسمة لرئة التليف الكيسي12،14.

وقد طورت دراسات قليلة الأنواع البكتيرية ذات الصلة ب CF في أنظمة المختبر تحتوي على أكثر من اثنين من مسبباتالأمراض 15،16. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج (1) لا تعكس تماما الطبيعة متعددة الميكروبات والشبيهة بالأغشية الحيوية لرئة التليف الكيسي و (2) لا تستخدم ظروفا غذائية وبيئية تقترب من تلك المكتشفة في مجرى الهواء التليف الكيسي15 ، 16. من خلال التعدين لمجموعات بيانات وحساب الجينات الكبيرة المشتقة من الرئة الكيسية 16S rRNA ، طور جان بيير وزملاؤه مؤخرا نموذجا للثقافة المشتركة في المختبر يدمج الميزات المذكورة أعلاه10. يشمل هذا النظام المتصورة الزنجارية ، المكورات العنقودية الذهبية ، العقدية النيابية و Prevotella spp. نمت في ظروف شبيهة بمجرى الهواء التليف الكيسي ومستقرة لمدة تصل إلى 14 يوما. أبلغ المؤلفون أيضا عن نمو خاص بالمجتمع ل Prevotella spp. والعديد من التغييرات في استجابة Abx لمسببات الأمراض CF هذه من خلال الآليات التي لا يزال يتعينتحديدها 10. يوفر هذا النظام المختبري القابل للتتبع أيضا إمكانية الخوض في الأسئلة المركزة ميكانيكيا المتعلقة بتعنت Abx من متغير شائع من P. aeruginosa الذي يتم اكتشافه بشكل متكرر في الشعب الهوائية ل pwCF10. لذلك ، فإن الهدف من هذا البروتوكول هو تزويد مجتمع أبحاث التليف الكيسي بسير عمل تجريبي موحد لتنمية غشاء حيوي في المختبر لديه القدرة على التوسع بشكل أكبر لمعالجة عدد من الأسئلة ذات الصلة بالتليف الكيسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تفاصيل جميع الكواشف والمعدات مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وسط البلغم الاصطناعي

ملاحظة: في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، يتم تعريف وسط البلغم الاصطناعي (ASM) على أنه الوسط ذي الصلة بالتليف الكيسي المعدل من SCFM2 ، الذي نشره تيرنر وزملاؤهسابقا 17. فيما يلي وصف لخطوات تحضير هذه الوسيلة. انظر جدول المواد لعمل حلول المخزون وظروف التخزين. يختلف هذا الإصدار من ASM عن Turner et al. ،17 لأن سعة التخزين المؤقت في الإصدار الأصلي لا تسمح بدرجة حموضة مستقرة بمرور الوقت. أي أن نشاط التخمير الذي تقوم به المكورات العقدية واللاهوائية مثل Prevotella spp. يؤدي إلى تحمض وسط النمو (ملاحظات غير منشورة). لذلك ، تم تعديل تركيز حمض 3-مورفولينوبروبان-1-سلفونيك (MOPS) من 10 ملي مولار إلى 100 مليمتر.

ملاحظة: يسهل تحضير محلول مخزون قاعدة ASM 2x (ASMb) إضافة مكونات مثل الميوسين والأجار والماء وما إلى ذلك ، دون التأثير على التركيز النهائي للجزيئات الموجودة في ASM10،18. يمكن تحضير 2x ASMb مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين في مكان مظلم. إذا تحول لون الوسط إلى اللون الأصفر ، فتخلص منه.

  1. لتحضير 2x ASM الأساسي ، في دورق نظيف يحتوي على 400 مل من diH2O ، أضف ما يلي أثناء التحريك:
    1. أضف 6.50 مل من 0.2 M NaH2PO4. H2O مخزون ؛ 6.25 مل من مخزون 0.2 M Na2HPO4 ؛ 348 ميكرولتر من مخزون 1 M KNO3 ؛ 1.084 مل من مخزون 0.25 M K2SO4 .
    2. أضف 4.0 غرام من الخميرة الاصطناعية المتسربة دون التربتوفان; 3.032 غرام من كلوريد الصوديوم ؛ 20.92 غرام من MOPS ؛ 1.116 جم من KCl و 0.124 جم من NH4Cl.
    3. أضف 9.30 مل من مخزون حمض اللاكتيك 1 م. 2.70 مل من مخزون الجلوكوز 1.1 M ؛ 1.75 مل من مخزون 1 M CaCl2.2H 2O ؛ 1.20 مل من مخزون 0.25 M N-acetylglucosamine و 1.00 مل من مخزون 3.6 ملي مولار FeSO 4.7H 2O.
    4. أضف 660 ميكرولتر من مخزون التربتوفان 0.1 م. 606 ميكرولتر من مخزون 1 م ملغنليزمكلوريد 2.6 ساعة2درجة ؛ 0.60 غرام من حمض الديوكسي ريبونوكلييك من المنوية الرنجة ؛ 400 ميكرولتر من مخزون 250 مجم / مل 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC).
    5. بمجرد إضافة جميع المكونات ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.80 باستخدام مخزون 5 M من هيدروكسيد الصوديوم. أكمل حتى 500 مل مع diH2O. تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر ، وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. لتحضير مخزون الميوسين 10 ملغم/مل (2x)، استخدم زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على 250 مل من diH2O وأثناء التقليب:
    1. أضف 5.0 غرام من الميوسين من معدة الخنازير - النوع الثاني. امزج التعليق لمدة 10 دقائق. أكمل حتى 500 مل مع diH2O.
    2. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. إعادة تشكيل ASM.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في يوم التجربة.
    1. امزج نسبة حجم 1: 1 من مخزون ASMb 2x ومخزون الميوسين 10 مجم / مل.
    2. دوامة جيدا قبل الاستخدام.

2. إعداد وسائط انتقائية للمجتمع متعدد الميكروبات

ملاحظة: فيما يلي الكميات اللازمة لإعداد حجم 1 لتر من الوسائط.

  1. لتحضير Mannitol Salt Agar (MSA) و Pseudomonas Isolation Agar (PIA) ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. لتحضير Prevotella Selective Agar (PSA) ، في زجاجة زجاجية نظيفة ، أضف ما يلي:
    1. 30.0 غرام من مرق الصويا التريبتيك (TSB). 15.0 غرام من أجار. 5.00 غرام من مستخلص الخميرة. 0.50 غرام من هيدروكلوريد L-سيستين.
    2. 10.0 مل من مخزون هيمين 0.5 مجم / مل. 100 ميكرولتر من مخزون 10 مجم / مل من ميناديون.
    3. أضف 940 مل من diH2O وحرك. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. عندما تبرد (أي يمكن وضع الزجاجة عارية اليدين) ، أضف مع التحريك: 50.0 مل من دم الأغنام المنزوعة التدبير. 2.00 مل من مخزون الكاناميسين 50 مجم / مل. 150 ميكرولتر من مخزون الفانكومايسين 50 مجم / مل. 500 ميكرولتر من مخزون بولي ميكسين ب 10 مجم / مل.
  3. لتحضير العقدية الانتقائية أجار (SSA) ، في زجاجة زجاجية نظيفة ، أضف ما يلي:
    1. 30.0 غرام من TSB. 15.0 غرام من أجار.
    2. أضف 950 مل من diH2O وقلب. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. عندما تبرد (أي يمكن وضع الزجاجة عارية اليدين) ، أضف مع التحريك: 50.0 مل من دم الأغنام المنزوعة التدبير. 1.00 مل من مخزون بولي ميكسين ب 10 مجم / مل. 1.00 مل من مخزون حمض الأكسولينيك 10 مجم / مل.
      ملاحظة: تصب في الأطباق وتحفظ عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها شهر واحد. قبل الاستخدام ، اترك الأطباق تجف في درجة حرارة الغرفة حتى 24 ساعة قبل تلقيحها. تم التحقق من صحة مستضد البروستاتا النوعي باستخدام المتصورة الميلانينوجينيكا وبريفوتيلا إنترميديا. تم التحقق من صحة SSA مع S. sanguinis، ومجموعة Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus و Streptococcus intermedius و Streptococcus anginosus ، يشار إليها باسم SMG). يوصى بشدة بالتحقق من صحة هذه الوسائط الانتقائية من جديد إذا كان سيتم اختبار سلالات جديدة.

3. تحضير الوسائط السائلة البكتيرية وظروف النمو

  1. لزراعة المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية بشكل روتيني ، استخدم وسطا غنيا معقما (على سبيل المثال ، مرق ليزوجيني (LB) أو TSB).
    1. ابدأ السائل بين عشية وضحاها عن طريق قطف مستعمرة واحدة نمت سابقا على طبق أجار LB / TSB لمدة 20-24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. قم بزراعة مزارع المرق عند 37 درجة مئوية طوال الليل مع الرج عند 250 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة.
  2. لزراعة المكورات العقدية ، استخدم مرق تود هيويت المعقم المكمل بمستخلص الخميرة بنسبة 0.5٪ (THB-YE).
    1. ابدأ الاستزراع السائل بين عشية وضحاها من مستعمرة واحدة نمت سابقا على صفيحة أجار TSB مكملة بدم الأغنام منزوع التيفان بنسبة 5٪ (صفيحة أجار الدم) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. قم بزراعة ثقافات THB-YE بشكل لاهوائي أو عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها دون اهتزاز لمدة 18-22 ساعة.
  3. لزراعة Prevotella spp. ، قم بإعداد 1 لتر من وسط نمو Prevotella (PGM) عن طريق إضافة ما يلي إلى زجاجة نظيفة:
    1. 30.0 غرام من TSB. 5.00 غرام من مستخلص الخميرة. 0.50 غرام من هيدروكلوريد L-سيستين. 10.0 مل من مخزون هيمين 0.5 مجم / مل و 100 ميكرولتر من مخزون الميناديون 10 مجم / مل.
    2. أضف 990 مل من diH2O. تعقيم عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لف الزجاجة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء.
    3. تنمو Prevotella spp. مستعمرات على صفيحة أجار الدم المحتضنة بشكل لاهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
    4. تلقيح مستعمرة واحدة في PGM وتنمو بين عشية وضحاها دون اهتزاز عند 37 درجة مئوية لاهوائية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يمكن حفظ PGM في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوعين. يوصى بشدة بإجراء اختبارات العقم على كل وسط نمو قبل الاستخدام. إذا لم تستخدم غرفة لاهوائية ، فقد يكون من الضروري بدء السائل بين عشية وضحاها من Prevotella spp. من رقعة من المستعمرات.

4. إعداد تجربة الزراعة المشتركة

ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير عمل تجريبي ملخص. يمكن إجراء التجربة في ظروف الأكسجين إذا كان وقت التحضير يستغرق أقل من 1 ساعة. إذا كان من المتوقع أن يستغرق الأمر وقتا أطول من ذلك ، فمن المستحسن بشدة إجراء التجربة باستخدام غرفة لاهوائية (مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، و 10٪ H2 ، و 80٪ N2 غاز مختلط). يمكن أيضا استخدام الجرار اللاهوائية لاحتضان العينات التجريبية.

  1. إعداد الزراعة الأحادية والثقافات المشتركة
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة للمزارع المشتركة ، قم بخلط العينات البكتيرية قبل تلقيح الألواح المكونة من 96 بئرا مباشرة. عادة ، يتم جمع حجم 1 مل ل P. aeruginosa و S. aureus السلالات من الثقافات الليلية. بالنسبة للمكورات العقدية spp. و Prevotella spp. ، قد تختلف الأحجام الليلية بين 2-4 مل. يمكن تعديل هذه الأحجام اعتمادا على عدد الشروط المراد اختبارها.
    1. باستخدام السائل البكتيري من الثقافات الليلية ، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
      1. بالنسبة لسلالات المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية ، اغسل مرتين باستخدام محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
      2. بالنسبة للمكورات العقدية spp. و Prevotella spp. ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS المعقم.
        ملاحظة: استخدم ماصة للتخلص من المواد الطافية بعناية ، حيث يمكن أن تفقد الكريات بسهولة.
      3. بعد الغسيل, أعد تعليق كل حبيبات في 1 مل من 1x ASMb المخفف بالماء.
      4. قم بعمل تخفيف 1:10 لكل عينة في PBS معقم وقم بقياس OD600.
      5. اضبط جميع الثقافات على OD600 من 0.2 في ASM.
      6. باستخدام معلقات OD600 = 0.2 ، قم بتخفيف العينات البكتيرية في ASM إلى OD600 نهائي من 0.01 (لكل ميكروب) للزراعة الأحادية والثقافات المشتركة.
      7. دوامة جيدا لمدة 5 ثوان.
        ملاحظة: على سبيل المثال ، لتحضير ما مجموعه 1 مل من P. aeruginosa معلق ASM أحادي الزراعة عند OD600 = 0.01 ، أضف 50 ميكرولتر من P. aeruginosa عند OD600 = 0.2 إلى حجم 950 ميكرولتر من ASM. بالنسبة للاستزراع المشترك ، خذ 50 ميكرولتر من كل من P. aeruginosa و S. aureus و Streptococcus spp. و Prevotella spp. معلقات عند OD600 = 0.2 وأضفها إلى 800 ميكرولتر ASM.
      8. باستخدام ماصة، أضف 100 ميكرولتر من معلقات الزراعة الأحادية والزراعة المشتركة في ثلاثة آبار منفصلة من صفيحة بلاستيكية مسطحة ذات قاع 96 بئرا معقمة.
      9. احتضان اللوحة (بدون رج) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين.
        ملاحظة: يمكن أيضا استخدام توترات الأكسجين الأخرى (على سبيل المثال ، ميكروكسيا ، نورموكسيا) هنا. ومع ذلك ، فقد تم تطوير النموذج والتحقق من صحته مع ظروف نقص الأكسجين. قم بتأكيد اللقاح الأولي عن طريق تخفيف المعلقات البكتيرية الأحادية والمشتركة بشكل متسلسل ، ويوصى بشدة بالطلاء على PIA و MSA و SSA و PSA. تركيز البداية المستهدف لكل نوع من الأنواع البكتيرية هو 1 × 107 CFU / مل (P. aeruginosa) ، 3.5 × 106 CFU / مل (S. aureus) ، 1.2 × 106 CFU / مل (المكورات العقدية spp.) ، و 4.6 × 106 CFU / مل (Prevotella spp.). يمكن أيضا تعديل اللقاح البكتيري ، كما وصفه جان بيير وزملاؤه10.
  2. استبدل الوسائط بعد تكوين الأغشية الحيوية.
    1. بعد 24 ساعة من الحضانة، قم بإزالة الخلايا غير المتصلة (العوالق) عن طريق الشفط باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    2. قم بتجديد الأغشية الحيوية المكونة مسبقا ب 100 ميكرولتر من ASM الطازج أو العلاج المطلوب (مثل المضادات الحيوية والمستقلبات وما إلى ذلك).
    3. احتضان اللوحة لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوات بشكل هوائي إذا تم تنفيذها بسرعة (أي أقل من 1 دقيقة). خلاف ذلك ، يرجى استخدام غرفة لاهوائية.

5. جمع وطلاء العينات

  1. بعد 24 ساعة إضافية من الحضانة، قم بشفط الخلايا غير المتصلة (العوالق) باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بجزء العوالق وتخفيفه وتخفيفه وتصفيفه على وسائط انتقائية أو التخلص منه.
  2. اغسل الأغشية الحيوية برفق مرتين باستخدام 125 ميكرولتر من PBS المعقم وتخلص من الأحجام.
  3. أضف 50 ميكرولتر من PBS المعقم وافصل الأغشية الحيوية عن طريق كشط الخلايا برفق من اللوحة باستخدام مكرر مكون من 96 سنا.
  4. انقل خلايا الأغشية الحيوية المعلقة إلى الصف A من صفيحة معقمة جديدة مكونة من 96 بئرا.
    ملاحظة: ستحتوي اللوحة المكونة من 96 بئرا على PBS معقم في الصفوف من B إلى H.
  5. قم بإجراء تخفيف تسلسلي 10x لأجزاء العوالق (إذا لزم الأمر) وكسور الأغشية الحيوية.
  6. لوحة 3-5 ميكرولتر من كل عينة تخفيف على PIA و MSA و SSA و PSA.
  7. اترك بقع التلقيح تجف.

6. احتضان الألواح الانتقائية وعد وحدة تشكيل المستعمرة (CFU)

  1. بالنسبة إلى المتصورة الزنجارية والمكورات العنقودية الذهبية ، تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18-20 ساعة.
  2. بالنسبة للمكورات العقدية spp ، احتضن عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين لمدة 24 ساعة.
  3. بالنسبة إلى Prevotella spp ، احتضن عند 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجين لمدة 48 ساعة.
  4. بعد الحضانة ، عد المستعمرات (~ 10-35 لكل بقعة) واحسب CFU لكل مل.
  5. ارسم البيانات باستخدام أداة التصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 2 ، تم الإبلاغ عن العديد من الأنماط الظاهرية بما في ذلك (1) انخفاض في عدد المتصورة الزنجارية و S. aureus عدد الخلايا القابلة للحياة عند زراعة مجتمعات العوالق المختلطة مقارنة بالزراعة الأحادية ، (2) زيادة في النمو متعدد الميكروبات ل S. sanguinis الخلايا و (3) نمو المجتمع المختلط ل P. melaninogenica كما ذكرت سابقا جان بيير وزملاؤه10.

علاوة على ذلك ، كما هو موضح في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تكمن فائدة هذا النظام المستنير سريريا في المختبر في قدرته على اكتشاف الوظائف البكتيرية الخاصة بالميكروبات. أي ، من خلال استخدام هذا النموذج ، أبلغنا عن أنماط ظاهرية ميكروبية تتراوح من النمو الخاص بالمجتمع ل Prevotella spp. (الشكل 2) إلى التغيرات في القابلية للإصابة بالتليف الكيسي Abx في الخط الأمامي من P. aeruginosa و S. aureus و S. sanguinis (الشكل 3). علاوة على ذلك ، على الرغم من أن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ أي إفصاح.

شكر وتقدير

نود أن نتوجه بخالص الشكر للدكتور جورج أ. أوتول والدكتور توماس إتش هامبتون لدورهما الهام في تصميم وتطوير نموذج المجتمع متعدد الميكروبات في المختبر . نشكر الدكتورة صوفي روبيتاي على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة التليف الكيسي JEAN21F0 إلى FJ-P. تم إنشاء الشكل 1 من المخطوطة باستخدام BioRender.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928قم بإعداد مخزون 250 مجم / مل في الكلوروفورم مباشرة في الزجاجة. يحفظ عند -20 درجة مئوية التركيز النهائي 200 مو ؛ جم / مل في قاعدة ASM 2x.
3-مورفولينوبروبان-1-حمض السلفونيك (MOPS)SigmaM1254التركيز النهائي 200 ملي في قاعدة 2X ASM.
النسخ المتماثل ذو 96 دبوسفيشر Scientific05-450-9النسخ المتماثلة التي تستخدم لمرة واحدة. #NC1567338 القط.
96 بئر لوحة قياسية معقمة مع غطاءفيشر Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L جرة مستطيلةFisher Scientific23-246-385
CaCl2< / sub> * 2H2< / sub>O & nbsp ؛فيشر ScientificC79-500تحضير مخزون 1 متر في الماء وتعقيم المرشح مع 0.22 & mu ؛ مرشح م. التركيز النهائي 3.5 ملي في قاعدة ASM 2x.
الأغنام المنزوعة التفريغلتحضير صفائح النمو للمكورات العقدية والبريفوتيلا.
حمض الديوكسي ريبونوكلييك من الرنجةSigmaD7290التركيز النهائي 1.2 مجم / مل في 2x ASM قاعدة.
FeSO4*7H2O فيشر العلميتحضير مخزون 1 مجم / مل (3.6 مل) في الماء وتصفية التعقيم ب 0.22 مو ؛ مرشح م. يحفظ ملفوفا بورق الألمنيوم. التركيز النهائي 0.0072 ملي مولار في قاعدة 2x ASM.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3تحضير كمخزون 20٪ (1.1 متر) في الماء وتعقيمه بواسطة الأوتوكلاف. التركيز النهائي 6 ملي في قاعدة ASM 2x.
هيمينسيجما51280قم بإذابة 100 مجم من الهيمين في 2 مل من 1 م هيدروكسيد الصوديوم ثم رفع الحجم إلى 200 مل بالماء. يحفظ في زجاجة كهرمانية أو زجاجة عادية ملفوفة بورق الألمنيوم عند 4 درجات مئوية.
K2SO4Fisher ScientificP304-500تحضير مخزون 0.25 متر في الماء وتصفية التعقيم مع 0.22 & mu; مرشح م. التركيز النهائي 0.54 ملي في قاعدة ASM 2x.
كاناميسينتحضير محلول مخزون 50 مجم / مل في الماء. تعقيم الفلتر ب 0.22 & mu ؛ م تصفية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
KClفيشر ScientificP217-500التركيز النهائي 30.0 ملي مولار في قاعدة ASM 2x.
KNO3 FisherScientificP263-500تحضير مخزون 1 متر في الماء وتصفية التعقيم ب 0.22 & mu ؛ مرشح م. التركيز النهائي 0.70 ملي مولار في قاعدة ASM 2x.
L-سيستين هيدروكلوريدفيشر AAA1038922
L-حمض اللاكتيك SigmaL1750تحضير مخزون 1 متر في الماء وتصفية التعقيم مع 0.22 & mu ؛ مرشح م. ضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0. التركيز النهائي 18.6 ملي في قاعدة ASM 2x.
L-TryptophanSigmaT0254تحضير مخزون 0.1 M في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم وتصفية التعقيم مع 0.22 & mu; مرشح م. يحفظ في الثلاجة عند 4 درجات ؛ C ملفوفة بورق الألمنيوم. التركيز النهائي 0.132 ملي في قاعدة 2x ASM.
مانيتول سولت أجارفيشر العلميB11407تحضير باستخدام توصيات الشركة المصنعة.
MenadioneSigmaM5625قم بإعداد محلول مخزون 10 مجم / مل مذاب في 96-100٪ إيثانول. حفظ عند 4 درجات ؛ C ملفوفة بورق الألمنيوم. دوامة قبل الاستخدام.
MgCl2*6H2O فيشر AA12288A9 العلميتحضير مخزون 1 متر في الماء وتعقيم المرشح ب 0.22 & mu ؛ مرشح م. التركيز النهائي 1.21 ملي مولار في قاعدة 2x ASM.
الميوسين من معدة الخنازير - النوع الثاني   ؛SigmaM2378قم بإعداد مخزون 10 مجم / مل (2x) في الماء ؛ اخلطه جيدا قبل التعقيم. يحفظ عند 4 درجات مئوية.
Na2HPO4 FisherScientificS375-500تحضير مخزون 0.2 متر في الماء وتعقيم المرشح ب 0.22 & mu ؛ مرشح م. التركيز النهائي 2.5 ملي في قاعدة ASM 2x.
N< / em>-acetylglucosamine SigmaA8625إعداد مخزون 0.25 M في الماء وتصفية التعقيم مع 0.22 & mu ; مرشح م. يحفظ المرق مبردا عند 4 درجات مئوية التركيز النهائي 0.6 ملي مولار في قاعدة 2x ASM.
كلوريد الصوديومفيشر العلميS271-500التركيز النهائي 103.7 ملي مولار في قاعدة 2x ASM.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500تحضير مخزون 0.2 متر في الماء وتعقيم المرشح ب 0.22 & mu ؛ مرشح م. التركيز النهائي 2.6 ملي في قاعدة ASM 2x.
NaOHFisher ScientificS318-500قم بإعداد محلول مخزون 5 أمتار. استخدم لضبط درجة الحموضة لمخزون ASM الأساسي 2x.
NH4< / sub>ClFisher ScientificA661-500التركيز النهائي 4.6 ملي مولار في قاعدة 2x ASM.
الأكسولينيكتحضير محلول مخزون 10 مجم / مل 0.5 مولار هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم الفلتر ب 0.22 & mu ؛ م تصفية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
بولي ميكسين بتحضير محلول مرق 10 مجم / مل في الماء. تعقيم الفلتر ب 0.22 & mu ؛ م تصفية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
Pseudomonas < / em>Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1استعد باستخدام توصيات الشركة المصنعة.
تود هيويت مرقفيشر العلميDF0492-17-6استعد باستخدام توصيات الشركة المصنعة.
مرق الصويا TrypticFisher ScientificDF0370-17-3استعد باستخدام توصيات الشركة المصنعة.
فانكومايسين: تحضير محلول مرق 50 ملغم/مل في الماء. تعقيم الفلتر ب 0.22 & mu ؛ م تصفية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
مستخلص الخميرةفيشر ScientificB11929
الخميرة الاصطناعية المتسربة دون التربتوفان   ؛سيجماY1876التركيز النهائي 8.0 مجم / مل في 2x ASM قاعدة.
يمكن أيضا استخدام دم المنوية AA1449830 العلميحمض

المراجع

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317(2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996(2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258(2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604(2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423(2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822(2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123(2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479(2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الغشاء الحيوي للتليف الكيسينموذج المجتمع الميكروبينموذج في المختبرPseudomonas aeruginosaStaphylococcus aureusStreptococcus sanguinisPrevotella melaninogenicaالمقاومة للمضادات الميكروبيةتفاعلات الميكروبيوم
زراعة غشاء حيوي متعدد الميكروبات ذي صلة بالتليف الكيسي لاستكشاف الأنماط الظاهرية للمجتمع
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.