مقالة منهجية

نهج بصري لإحداث توسع الشعيرات في الفئران لنمذجة الخلل الوظيفي الدماغي الوعائي بوساطة الأوعية الدموية الكبيرة

DOI:

10.3791/66792

⸱

مايو 17, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Brain Health Imaging Centre, Centre for Addiction and Mental Health, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Neurology, Columbia University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد أثبتنا توسع الأوعية الدموية الكبيرة الذي يحفز كيميائيا في الفئران كنموذج للتحقيق في الخلل الوظيفي الوعائي الدماغي ، والذي يمكن استخدامه في الخرف الوعائي ونمذجة مرض الزهايمر. نوضح أيضا تصور الأوعية الدموية عن طريق حقن مركب مطاط السيليكون وتوفير إرشادات بصرية واضحة لقياس التغيرات في حجم الأوعية الدموية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدم في الدماغ (BBB) هو نظام حاسم ينظم الدورة الدموية الانتقائية للدماغ مع المحيط ، على سبيل المثال ، مما يسمح للمغذيات الضرورية بدخول وطرد الأحماض الأمينية الزائدة أو السموم من الدماغ. لنمذجة كيف يمكن اختراق BBB في أمراض مثل الخرف الوعائي (VaD) أو مرض الزهايمر (AD) ، طور الباحثون طرقا جديدة لنمذجة توسع الأوعية. يمكن أن يكون BBB المخترق في هذه الحالات المرضية ضارا ويؤدي إلى عدم تنظيم BBB مما يؤدي إلى عواقب غير مرغوب فيها ومرضية تؤثر على وظائف المخ. تمكنا من تعديل تقنية موجودة مكنتنا من الحقن مباشرة في Cisterna magna (CM) للحث على توسع الأوعية الدموية باستخدام الإيلاستاز ، وتعطيل الوصلات الضيقة (TJ) ل BBB. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من رؤية مقاييس مختلفة للنجاح مقارنة بالتقنيات السابقة ، بما في ذلك التوسع المتسق للأوعية الدموية ، وانخفاض معدل الوفيات أو تحسين التعافي ، وتحسين عامل التعبئة / التعتيم ، وهو مركب مطاط السيليكون ، والتسليم لوضع العلامات على الأوعية الدموية لتحليل التوسع. حققت هذه الطريقة المعدلة طفيفة التوغل نتائج واعدة ، مع زيادة بنسبة 19٪ -32٪ في التوسع المستمر للأوعية الدموية الكبيرة في الفئران من أسبوعين إلى 3 أشهر بعد الحقن. يتناقض هذا التحسن مع الدراسات السابقة ، والتي أظهرت زيادة التوسع فقط عند علامة أسبوع 2. تشير البيانات الإضافية إلى التوسع المستدام حتى بعد 9.5 أشهر. تم تأكيد هذه الزيادة من خلال مقارنة قطر الأوعية الدموية للإلاستاز والمجموعة المحقونة بالمركبة. بشكل عام ، هذه التقنية ذات قيمة لدراسة الاضطرابات المرضية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي (CNS) باستخدام النماذج الحيوانية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة التي تبطن الشعيرات الدموية الدماغية هي المكونات الرئيسية لتشكيل الحاجز الدموي الدماغي (BBB)1 الذي يلعب دورا حاسما في تنظيم ما يدخل أو يخرج من الدورة الدموية للدماغ مع المحيط. يسمح للعناصر الغذائية الأساسية اللازمة للأنسجة العصبية بدخول BBB ، بينما يتم طرد بعض الأحماض الأمينية الأساسية مثل الغلوتامات من الدماغ ، حيث يمكن أن تسبب التركيزات العالية ضررا عصبيا دائما لأنسجة المخ2. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، يحد BBB من كمية بروتينات البلازما مثل الألبومين 3,4 والبروثرومبين من دخول الدماغ لأن هذه يمكن أن يكون لها آثار ضارة 5,6,7. أخيرا ، يحمي BBB الدماغ من السموم العصبية المنتشرة في المحيط ، مثل xenobiotics من الطعام أو البيئة1. بشكل عام ، لا رجعة في تلف أنسجة المخ ، والشيخوخة التي ترتبط بمستويات منخفضة من تكوين الخلايا العصبية8 تسلط الضوء على أهمية BBB في حماية ومنع أي عوامل من تسريع عملية التنكس العصبي.

في توسع الأوعية الدموية (أو توسع الأوعية الدموية الكبيرة) ، لوحظ انخفاض في مرونة الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى خضوع الأوعية لتغيرات مورفولوجية ، مما يجعلها مختلةوظيفيا 9 ويؤدي إلى انخفاض تدفق الدم في الدماغ. يؤدي هذا الانخفاض في تدفق الدم لاحقا إلى تقليل إمدادات الأكسجين والجلوكوز ، مما يؤدي في النهاية إلى تلف BBB من خلال تنشيط الخلايا النجمية التفاعلية10. عندما تتلف الصفيحة الإيلاستين الداخلية للأوعية من توسع القلة11 ، يكون التحفيز المتكرر لعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) ضروريا لتكوين الأوعية. هذا يمكن أن يؤدي إلى تشكيل الأوعية المتسربة ويؤدي في نهاية المطاف إلى تكوين الأوعية المرضية ، التي تتميز بتطور الأوعية المعيبة12. أثناء تكوين الأوعية المرضية ، عندما تصبح الأوعية الدموية معيبة ، تظهر آلية تعويضية لاستعادة سلامة الأوعية الدموية عن طريق تنظيم بروتينات الوصلة الضيقة. ومع ذلك ، يمكن لهذه العملية أن تعطل BBB عن غير قصد عندما تفقد السلامة الهيكلية للأوعية الدموية13. قد يحدث هذا من خلال زيادة تعطيل BBB وتعزيز إنتاج لوحة الأميلويد14. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التسرب من المحيط التهابا عصبيا15 ، مما يؤدي إلى تنكس الخلايا العصبية وفقدان الذاكرة لاحقا.

من الناحية الهيكلية ، فإن الحماية التي يوفرها BBB هي من خلال التقاطعات الضيقة التي تمنع العوامل الغريبة من دخول الدم إلى الدماغ. عند السماح لمواد معينة بدخول الدماغ ، يقوم BBB بذلك بشكل أساسي من خلال عمليتين رئيسيتين ، الانتشار السلبي ، أو قنوات محددة (مثل القنوات الأيونية والناقلات) 1. في مرض الزهايمر ، أظهرت الأبحاث أن نظام الأوعية الدموية المختل وظيفيا يلعب دورا مهما في تطور الحالة12,13. يمكن أن ينتج تكوين لويحات أميلويد بيتا (Aβ) والتنكس العصبي عن انهيار BBB12,13 واضطرابات في تدفق الدم الدماغي16. يمكن ملاحظة انخفاض في تدفق الدم الدماغي لدى الأفراد المسنين الذين تم تشخيصهم بالخرف الوعائي و17,18 بعد الميلاد. يمكن أن يساهم تلف الحاجز الدموي الدماغي (BBB) إلى جانب تدفق الدم الدماغي المختل وظيفيا (CBF) في زيادة إنتاج تركيز Aβ في الدماغ ، مصحوبا بتسلل مواد غريبة من الدورة الدموية الطرفية19.

للتحقيق في التسبب في الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر والخرف الوعائي (VaD) ، تم تطوير نماذج لتكرار المرض. تستخدم النماذج في المختبر على نطاق واسع ولكنها تفتقر إلى البيئة البيولوجية لنمذجة الأمراض على نطاق واسع مثل عدد الخلايا المختلطة ، مما يستلزم أهمية النماذج في الجسم الحي. يشيع استخدام الفئران بسبب سهولة التلاعب الجيني في توليد خصائص شبيهة بالإنسان (مثل علم الأمراض) في المرض. مع التقدم الذي تم إحرازه حتى الآن ، لا تزال هناك حاجة مستمرة لنماذج محسنة لمحاكاة الأنماط الظاهرية للمرض مثل توسع الأوعية الكبيرة ودورها في مرض الزهايمر. تحقيقا لهذه الغاية ، رأينا فرصة وقمنا بتعديل تقنية تضمنت حقن الإيلاستاز في Cisterna magna للفئران20,21. الإيلاستاز هو إنزيم ثبت أنه يكسر الإيلاستين في النسيج الضام22 وفي الوصلات الضيقة المحيطة23. تم اختيار Cisterna magna كنقطة للحقن نظرا لكونها تقع مباشرة فوق دائرة Willis ، أكبر وعاء دموي في الدماغ. عن طريق حقن الإيلاستاز في Cisterna magna ، يمكننا اختراق BBB والأوعية الدموية عن طريق تحطيم التقاطعات الضيقة وإحداث توسع في الأوعية الدموية (دائرة ويليس)24,25. يمكن أن يوفر الجمع بين هذه التقنية واستخدام نموذج فأر AD لعلم الأمراض ، لتحسين فهم التسبب في مكون الأوعية الدموية في مرض الزهايمر ، رؤى قيمة حول التفاعلات والتأثيرات المعقدة بين هذين المرضين المتميزين.

أظهرت الدراسات السابقة حالات يظهر فيها المرضى كلا من السمات المرضية لمرض الزهايمر و VaD ، وهي حالة يشار إليها عادة باسم الخرف المختلط 26,27. وبالتالي ، فإن فهم الآليات المترابطة بين كلتا الحالتين يمكن أن يقدم منظورا أكثر شمولا حول تطور ومظاهر هذه الاضطرابات التنكسية العصبية ، ويعزز فهمنا للآليات الأساسية والاستراتيجيات العلاجية المحتملة. تحقيقا لهذه الغاية ، نوضح تطبيق الإيلاستاز في نموذج فأر علم الأمراض AD (AppNL-F) لتحديد التغيرات الوعائية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام فئرانالتطبيق NL-F(3 أشهر) التي تعبر عن لوحة الأميلويد البشرية على المستوى الفسيولوجي لهذه الدراسة على الرغم من أنه يمكن استخدام هذا النظام مع أي نموذج للقوارض. تمت الموافقة على جميع إجراءات من قبل لجنة رعاية في CAMH (البروتوكول # 843) وكانت متوافقة مع المعايير الأخلاقية لإرشادات المجلس الكندي لرعاية. تم تربية الفئران في المنزل والاحتفاظ بها في دورة 12 ساعة من الضوء والظلام مع وصول ad libitum إلى الطعام والماء.

1. إجراء حقن سيستيرنا ماجنا (CM)

  1. الإجراء الجراحي
    1. ضع الماوس (APPNL-F ، كلا الجنسين ، 3 أشهر) في غرفة تحريض التخدير لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: اغسل الحجرة ب 5٪ إيزوفلوران ممزوج بأكسجين 1٪ لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
    2. بعد تخدير الفأر ، أخرج من الغرفة وضعه على ستارة جراحية جديدة وحافظ على التخدير (إيزوفلوران ، 2.5٪ -3٪) عن طريق وضع مخروط أنف على الأنف.
      ملاحظة: تحقق من عمق التخدير عن طريق الضغط على إصبع القدم لضمان عدم وجود ردود فعل.
    3. تطبيق مرهم العيون لمنع الجفاف. بعد ذلك، يتم حقن 0.1 مل من البوبيفاكايين تحت الجلد (مخدر موضعي؛ 1-2 ملغ/كغ 0.125٪، مع نسبة تخفيف 1:2) في موقع الشق وميتاكام (مسكن؛ 5 ملغ/كغ، مع نسبة تخفيف 1:10). حافظ على رطوبة عن طريق حقن 0.5 مل من المحلول الملحي تحت الجلد قبل القيام بالإجراء للتعويض عن أي فقدان محتمل للدم أثناء الجراحة.
    4. للحصول على موقع شق واضح ، احلق الرقبة عند قاعدة العظم القذالي ، وامسح السطح باستخدام برنامج تلفزيوني معقم وانقل الموضوع إلى الإطار التجسيمي في وضعية الانبطاح.
      ملاحظة: تأكد من الحفاظ على التخدير من خلال مخروط الأنف المجسم.
    5. ضع قضيب الأنف من الإطار التجسيمي أعلى الماوس لتوفير الاستقرار والتأكد من تثبيت الأسنان العلوية.
    6. ضع رأس بزاوية 120 درجة من الجسم لرفع وإمالة القفا لكشف منطقة الاهتمام الجراحية.
    7. نظف موقع الجراحة باستخدام مقشر Betadine 3x ، 70٪ إيثانول 3x ، ومحلول betadine 1x بشاش معقم 2 بوصة × 2 بوصة.
    8. قم بطي الجلد برفق بمساعدة الملقط وقم بعمل شق صغير (1 سم) باستخدام مقص جراحي.
      ملاحظة: يجب أن يكشف هذا عن خط الوسط في مؤخرة العنق.
    9. قم بتشغيل المشرط بعناية على طول خط الوسط لقطع العضلات. ثم ، باستخدام ملاقط فصل العضلات بلطف عن طريق سحبها بعيدا إلى اليسار واليمين.
      ملاحظة: يجب أن يكشف هذا عن Cisterna magna (مثلث مقلوب) الموجود أسفل قاعدة الجمجمة (الشكل 1).
  2. تحضير الإيلاستاز
    ملاحظة: تحتوي عبوة الإيلاستاز (شكل مسحوق) التي تم طلبها على 250 وحدة (U). كمية الإيلاستاز المراد حقنها في كل هي 2.5 ميكرولتر. يجب أن تكون كمية الإيلاستاز التي من المفترض أن تكون في 2.5 ميكرولتر 15 مللي وحدة mU.
    1. احسب أولا تركيز المحلول المراد حقنه.
      التركيز = الكتلة / الحجم
      = 15 mU / 2.5 μL
      = 6 وحدة وحدة / ميكرولتر
      لذلك ، فإن التركيز المطلوب هو 6 mU / μL.
    2. كمية الإيلاستاز هي 250 U وتعمل الدراسة مع وحدات ملي ، لذلك قم بتحويل الوحدات إلى وحدات مللية مما يعطي 250000 mU.
    3. بعد وجود كتلة 250000 mU وتركيز 6 mU / uL ، اكتشف الحجم (PBS) الذي يتطلب تخفيف الإيلاستاز والحفاظ على تركيز 6 mU / uL.
    4. باستخدام نفس الصيغة أعلاه ، أعد الترتيب لإيجاد الحجم:
      الحجم = الكتلة / Conc.
      = 250000 mU / 6 mU / μL
      = 41666.67 ميكرولتر
    5. نظرا لأنه من الصعب ماصة 41666.67 ميكرولتر ، ما عليك سوى تحويلها إلى ملليلتر بتقسيمها على 1000 للحصول على 41.66667 مل للحصول على محلول 1x.
      1. لجعل الحل أكثر تركيزا ، قم بزيادته بمقدار 10x أو 100x.
      2. قم بإنشاء حل 10x لأنه من الأسهل العمل معه (انظر أدناه).
        محلول 10x ---------- 4.166667 مل (conc.)
    6. ضع 250 U في أنبوب قسمة سعة 5 مل وأضف 4.167 مل من PBS المعقم في أنبوب القسمة لصنع محلول مخزون 10x.
    7. ماصة 10 ميكرولتر من محلول المخزون ووضعها في 100 أنبوب قسمة مما يعطي 1000 ميكرولتر من محلول المخزون 4.167 مل. قم بتخزين الأنابيب في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    8. قم بتخزين ما تبقى من محلول المخزون في أنابيب القسمة عند 100 ميكرولتر لكل أنبوب وتخزينها في الفريزر عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: المحاليل مستقرة عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر مع عدم وجود خسارة كبيرة في النشاط. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم ملاحظة أن التجميد المفرط وذوبان الإيلاستاز يمكن أن يقلل من الاستقرار. لذلك ، لمنع حدوث ذلك ، يمكن تقسيم محلول المخزون قبل التجميد بحيث يلزم إذابة عينة واحدة فقط في كل مرة للحقن.
    9. بعد إذابة أحد أنابيب القسمة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من محلول 10x ، أضف 90 ميكرولتر من PBS المعقم للحصول على محلول 100 ميكرولتر 1x.
    10. إذا تم إذابة أنبوب القسمة الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من محلول 10x بدلا من ذلك ، فما عليك سوى إضافة 900 ميكرولتر من PBS للحصول على 1000 ميكرولتر ، وهو محلول 1x. يخزن أي من المحلولين في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع.
  3. الحقن في سيستيرنا ماجنا
    ملاحظة: نظف حقنة هاملتون قبل التحميل بالإيلاستاز عن طريق التحميل والشفط بالماء المقطر 5x ، ثم الإيثانول 5x ، وأخيرا الماء المقطر 5x.
    1. قم بتحميل حقنة هاملتون ب 2.5 ميكرولتر من الإيلاستاز (تركيز 15 mU) وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
    2. أدخل المحقنة ببطء بحيث يكون الشطبة متجهة لأعلى في وسط Cisterna magna.
      ملاحظة: تجنب ثقب أي أوعية دموية تمر عبر Cisterna magna.
    3. بعد ثقب ، وإزالة شطبة. هذا سوف يسهل إطلاق كمية صغيرة من السائل النخاعي (CSF). استخدم قطعة قطن معقمة لامتصاص السائل الدماغي النخاعي الزائد.
    4. أعد إدخال الشطبة في موقع البزل ، وقم بحقن الإيلاستاز أو السيارة ببطء لأكثر من 1 دقيقة في Cisterna magna واترك الإبرة في مكانها لمدة 1 دقيقة لمنع أي تسرب للإلاستاز.
    5. بعد إزالة شطبة ، أغلق موقع الشق بخياطة جراحية غير قابلة للامتصاص (# 4-0 بإبرة 3/8 بوصة) ، وأوقف تشغيل المخدر.
    6. أخرج من الإطار التجسيمي وضعه على وسادة حرارة دافئة عند 37 درجة مئوية حتى يتعافى الموضوع.
      ملاحظة: يوصى بجرعة أخرى من Metacam بعد الجراحة للمساعدة في تخفيف الألم أثناء التعافي بعد الجراحة.

2. حقن مركب مطاط السيليكون وحصاد الأنسجة

  1. تخدير بجرعة زائدة من الأفيرتين (1 مل ، 125-250 مجم / كجم).
    ملاحظة: اضغط على إصبع القدم لضمان توقف ردود الفعل.
  2. ضع على حفاضات وقم بتأمين جميع الأطراف بشريط جراحي مع توجيه تجويف الصدر لأعلى
  3. افتح تجويف الصدر باستخدام ملاقط ومقص لكشف القلب.
  4. أدخل إبرة حادة 23 جم في البطين الأيسر للقلب وقم بتعطيرها ب PBS مملوءة بالهيبارين (100 وحدة / مل) لمدة 4 دقائق لتنظيف الأوعية الدموية باستخدام مضخة التروية الدقيقة.
  5. استبدل الزجاجة العازلة بزجاجة تحتوي على 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) (مكونة في برنامج تلفزيوني) وتخفف لمدة 4 دقائق أخرى.
  6. قم بإعداد محلول مركب مطاط السيليكون (الأصفر) عن طريق الجمع بين 5 مل من المركب مع 5 مل من المادة المخففة في أنبوب سعة 50 مل. تخلط جيدا قبل الاستخدام.
  7. املأ حقنة سعة 10 مل ب 10 مل من مركب مطاط السيليكون أوند. قم بتوصيل المحقنة بالخرطوم المتصل بإبرة حادة 23 جيجا ، وقم بحقن المحلول يدويا بعناية في القلب.
    ملاحظة: نظرا للزوجة العالية لمركب مطاط السيليكون ، من المهم استخدام حقنة برميلية أكبر وإلا سيكون الضغط كبيرا جدا لدفع المكبس.
  8. قم بإزالة رأس الفأر بعد الحقن وتخزينه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح لمركب مطاط السيليكون بالمعالجة في الأوعية.
  9. في اليوم التالي ، قم بإزالة جمجمة الماوس برفق (يفضل استخدام ملاقط دقيقة) ، واستخراج الدماغ ، واحتضان 4٪ PFA طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT).
  10. بعد حضانة لمدة 24 ساعة في PFA ، اغسل الدماغ في PBS 3x ، وضعه في 30٪ سكروز ، واحفظه في 4 درجات مئوية.

3. التحليل الكمي

  1. لالتقاط صور عالية الجودة لدائرة ويليس في الدماغ بأكمله (الشكل 3):
    1. إزالة الدماغ من محلول السكروز. جفف الدماغ تماما باستخدام منشفة ورقية لفتل رطوبة السطح.
    2. ضع الدماغ في قطاعة الدماغ. ضع قطاعة الدماغ تحت مجهر ضوئي مزود بكاميرا.
    3. ركز المجهر على دقة واضحة وعالية الدقة لدائرة ويليس.
  2. استخدم برنامج تحليل الصور مع مرجع مسطرة 10 سم لقياس 1 سم تقريبا ولاحظ عدد البكسل. اضبط مقياس 1 سم بناء على هذا القياس ، ثم قم بقياس سمك الشريان القاعدي أفقيا لإيجاد قطره.
  3. استخدم برنامج قياس كثافة البكسل القياسي لتحليل الصورة. قم بقياس (بالسنتيمتر) خمس قراءات منفصلة للشريان القاعدي باستخدام برنامج تحليل الصور وحساب المتوسط للحصول على تمثيل دقيق لقطر الشريان القاعدي.
  4. استخدم تحليل التباين 2-way (ANOVA) لمقارنة متوسط التغير في القطر بين الإيلاستاز والمجموعة الضابطة.
    1. احسب النسبة المئوية للتغير في القطر باستخدام الصيغة أدناه 21:
      figure-protocol-1
      C = التغير النسبي
      X1 = القيمة الأولية (السيارة)
      X2 = القيمة النهائية (الإيلاستاز)
      ضع في اعتبارك قيم P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية. إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي.

4. إزالة مركب مطاط السيليكون باستخدام جفاف الكحول

ملاحظة: من المهم تجفيف الدماغ للمساعدة في إزالة مركب مطاط السيليكون الزائد من الأوعية الدموية والذي يمكن أن يحسن جودة التلوين المناعي.

  1. اغسل العقول 3x باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة السكروز.
  2. ضع الدماغ في 25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، 95٪ ، والإيثانول المطلق لمدة 24 ساعة عند كل تركيز ، لمدة إجمالية قدرها 5 أيام.
  3. بعد جفاف الأنسجة ، ضع الأنسجة في ساليسيلات الميثيل (conc. ≤100 ٪) لمدة 12-24 ساعة. سيسمح الإيثانول وساليسيلات الميثيل بإزالة السيليكون الزائد في الأنسجة.
  4. اغسل الدماغ في PBS 3x لإزالة المواد الكيميائية المتبقية واتركه طوال الليل على كرسي هزاز عند 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني جديد.
  5. ضع الدماغ في السكروز واحفظه عند 4 درجات مئوية قبل التقسيم والمناعة الملطخة.

5. تلطيخ كيميائي مناعي

  1. تقسيم العقول
    1. قبل التقسيم المناعي ، اسمح للدماغ بالاستقرار في قاع الأنبوب المملوء بالسكروز.
    2. قم بتجميد الدماغ على منصة microtome باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) المحاط بالثلج الجاف. قم بتقطيع الدماغ إلى أقسام 40 ميكرومتر باستخدام شفرة ميكروتوم.
    3. انقل كل قسم إلى لوحة ذات 96 بئرا تحتوي على مادة واقية من البرودة لمنع التجمد باستخدام فرشاة طلاء ذات طرف رفيع.
    4. أغلق اللوحة المكونة من 96 بئرا بإحكام بغلاف بلاستيكي. قم بتخزين اللوحة محكمة الغلق في فريزر -20 درجة مئوية.
  2. تلطيخ التألق المناعي (باستخدام NeuN كمثال)
    1. ضع الأقسام في طبق من 24 بئرا. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام برنامج تلفزيوني للتخلص من مادة الحماية من التبريد.
    2. لمنع الارتباط غير المحدد ، احتضان لمدة 1 ساعة في RT باستخدام محلول مانع يحتوي على 2٪ مصل الماعز ، 0.1٪ Triton-X 100 ، و 1٪ BSA.
    3. قم بإعداد جميع المكونات في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تضمن الجسم المضاد الأساسي المستخدم فأرا وحيد النسيلة مضادا ل NeuN مع تخفيف 1: 500. وشمل الجسم المضاد الثانوي المستخدم الماعز متعدد النسيلة المضاد للفأر 568 مع تخفيف 1: 200.
    4. تمييع الماوس أحادي النسيلة المضادة ل NeuN في حل الحظر المذكور أعلاه.
    5. أضف الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، محمية من الضوء بواسطة احباط.
    6. بعد الحضانة الأولية ، اغسل الأقسام 3x باستخدام PBS. تمييع الماعز متعدد النسيلة المضادة للماوس 568 في نفس حل الحظر.
    7. أضف الجسم المضاد المخفف إلى كل بئر. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء بواسطة احباط.
    8. اغسل الأقسام 3x باستخدام PBS بعد الحضانة الثانوية.
    9. استعد للتركيب عن طريق نقل الأقسام ببطء إلى الشرائح باستخدام فرش الطلاء الدقيقة. اترك جميع الأقسام حتى تجف.
    10. ضع 125-150 ميكرولتر من وسائط التركيب المضادة للتلاشي بمجرد تجفيف الأقسام. ضع أغطية الأغطية برفق.
    11. اترك الشرائح تجف لمدة 24 ساعة في RT في الظلام ، وختم الحواف بطلاء الأظافر. التقط صور الفلورسنت باستخدام برنامج التصوير.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد نجحنا في تحديد موقع Cisterna magna تحت المنطقة القذالية من الجمجمة بعد وضع الماوس بعناية على الإطار التجسيمي وتشريح العضلات. يقع هذا الهيكل التشريحي ، الذي يشبه المثلث المقلوب والمظلل باللون الأصفر ، أسفل قاعدة الجمجمة (الشكل 1). لضمان الدقة ومنع أي ضرر لأنسجة المخ ، تم إدخال 1-2 مم من شطبة حقنة هاملتون برفق في Cisterna magna.

بعد حقن الإيلاستاز ، تم ترشيح مع برنامج تلفزيوني و 4٪ PFA على ثلاث فترات زمنية متميزة: 2 أسابيع و 1 شهر و 3 أشهر. بعد ذلك، ثبتت الأوعية الدموية بمركب من مطاط السيليكون لتحسين تصور الأوعية الدموية، كما هو موضح في الشكل 2. من الناحية النوعية ، يكشف التوسع الناجم عن الإيلاستاز عن زيادة وضوح الأوعية الدموية الصغيرة حول دائرة ويليس والشريان القاعدي المتضخم والمتعرج ، مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تلقت حقنة مركبة (الشكل 3).

كشف التحليل الكمي عن وجود فرق كبير بين الإيلاستاز والمجموعات الضابطة ، مع تضخم الأوعية الدموية في مجموعة الإيلاستاز في أسبوعين (زيادة 32٪ ؛ قيمة p = 0.019) ، 1 شهر (زيادة 19٪ ؛ قيمة p = 0.020) ، و 3 أشهر (زيادة بنسبة 20٪ ؛ قيمة p = 0.020) بعد الحقن (الشكل 4). سهل الجفاف اللاحق للأدمغة من خلال الزيادة التدريجية في تركيز الإيثانول ، متبوعا بالغمر في ساليسيلات الميثيل ، إزالة مركب مطاط السيليكون الزائد وساهم في تحسين جودة التلوين النسيجي (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 1: موقع الصهريج الكبير. يكشف التصور المحسن عن Cisterna magna المعزولة عن عضلات الرقبة المجاورة ، مما يعرض موقعه فيما يتعلق بالدماغ وبنية الجمجمة ، وخاصة العظم القذالي. تم تسليط الضوء على Cisterna magna بواسطة مثلث أصفر ، ويشبه مثلثا مقلوبا ، مما يوفر الوضوح في التصوير التشريحي. قضبان المقياس: 5 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: حقن صبغة صفراء. تم استخدام التروية عبر القلب لإعداد الأنسجة للتلطيخ النسيجي. (أ) تضمن إعداد التروية للفئران ضخ برنامج تلفزيوني في الجسم لمدة 4 دقائق لإزالة الدم ، يليه PFA لمدة 4 دقائق أخرى لتثبيت البروتين. (ب) يعزز حقن صبغة في البطين الأيسر للفأر بعد التروية رؤية الأوعية الدموية في الدماغ، مما يسهل الملاحظة بالعين المجردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: رسم توضيحي للأدمغة المحقونة بالإيلاستاز و PBS. يوضح التصور توسيع BA وزيادة التعرج حول CW بعد حقن الإيلاستاز ، مقارنة بمجموعة التحكم (PBS). CW ، دائرة ويليس ؛ بالشريان القاعدي. قضبان المقياس: 3 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: توسع الأوعية الدموية الناجم عن الإيلاستاز والمستمر على مدى 3 أشهر. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة التي عولجت ب PBS ، لاحظنا توسعا كبيرا في الأوعية الدموية بعد حقنة واحدة من الإيلاستاز في Cisterna magna للفئران البالغة من العمر 3 أشهر ، والتي استمرت لمدة 3 أشهر. تم قياس الشريان القاعدي في 2 أسابيع ، 1 شهر ، و 3 أشهر بعد حقن الإيلاستاز. البيانات هي متوسط ± SD. 2- طريقة أنوفا ، سيداك (اختبار ما بعد التخصيص) ؛ * p < 0.019 (أسبوعان) و * p < 0.020 (شهر واحد) و * p < 0.020 (3 أشهر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تلطيخ الدماغ المجفف بمادة NeuN بعد إزالة الصبغة الصفراء الزائدة. بعد وضع الدماغ في تركيزات متزايدة من الإيثانول وساليسيلات الميثيل لمدة 24 ساعة لكل منهما ، تم تقسيم الدماغ باستخدام ميكروتوم وتلطيخه للعلامة العصبية NeuN. في الشكل، من الواضح أن الدماغ (أ) غير المجفف يظهر أوعية دموية مرئية أكبر مقارنة بالدماغ (ب) المصاب بالجفاف، كما هو موضح بالسهم الأبيض. هذا يسهل تحليلا أكثر دقة لهذه الأقسام ، لأنه يقلل من تداخل الخلفية المتعلق بالأوعية الدموية. قضبان المقياس: 3 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة بروتوكولا محسنا للتوسع الوعائي الدماغي ، مما يوفر نهجا دقيقا ومباشرا لحقن الإيلاستاز في Cisterna magna للفئران. تعمل هذه النقطة التشريحية كبوابة مباشرة للسائل النخاعي ، مما يوفر وسيلة قيمة للتحقيق في الأمراض العصبية المختلفة. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية المعدلة هي أن حقن جرعة واحدة من الإيلاستاز في Cisterna magna للفئران كان قادرا على التسبب والحفاظ على توسع الأوعية الدموية الكبيرة لمدة 3 أشهر على الأقل دون الحاجة إلى حقن قابل للتكرار أو زرع قنية. يعد نهج إعطاء الإيلاستاز في نموذج فأر AD ميزة ملحوظة أخرى ، خاصة لتسريع ترسب لويحات الأميلويد في الدماغ. عادة ، أظهرت نماذج AD مثل فئران التطبيقNL-F (المستخدمة في هذه الدراسة) تكوين البلاك في عمر 6 أشهر منسن 28. تم اختيار هذا النموذج لأن هذه الفئران تظهر بشكل طبيعي ترسب الأميلويد الشبيه بالإنسان في ظل ظروف الشيخوخة الطبيعية. يمكن أن يؤدي حقن الإيلاستاز في Cisterna magna في عمر 3 أشهر إلى تفاقم أمراض الزهايمر عن طريق تقليل تدفق الدم الدماغي16 وزيادة اضطرابات الحاجز الدموي الدماغي 12,13.

من المهم ملاحظة أن حقن المواد في Cisterna magna يمكن أن يعوقه ضغط السائل الدماغي النخاعي. لقد عالجنا هذا القيد من خلال تطوير طريقة تهدف إلى تقليل تأثيره ، مع إدراك أنه لا يمكننا القضاء على التداخل المحتمل للسائل النخاعي (CSF) على توصيل الإيلاستاز إلى الدماغ. تؤدي قدرة الإيلاستاز على هضم الإيلاستين إلى انخفاض تصلب الشرايين ، وبالتالي إضعاف الشرايين والتسبب في استطالة الأوعية الدموية وتصبح ملتوية29,30 ، مما يجعلها تدخلا مناسبا للتسبب في توسع القلة .

عادة ، يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة لإكمال الحقن الجراحي في Cisterna magna لكل فأر. خلال هذه العملية ، يتم تخدير الفئران بنسبة 1.5 ٪ -2 ٪ isoflurane المستخدمة كتخدير عام. يوصى بنشر استخدام إطار مجسم مع قضيب أسنان وقضبان أذن لضمان استقرار وصلابة رأس الماوس أثناء العملية ، وهي خطوة حساسة وحاسمة. قد يؤدي الوضع غير الصحيح على الإطار التجسيمي إلى إمالة الرأس والتسليم غير الدقيق ، فضلا عن إمكانية إصابة الأوعية الدموية. بدلا من قطع الجلد بمشرط ، والذي يمكن أن يكون فوضويا ، نقرص الجلد بملقط ناعم ونصنع قطعا نظيفا بمقص جراحي للكشف عن خط الوسط من مؤخرة العنق. ثم ركض المشرط على طول خط الوسط لعمل قطع أنيق ، وتم استخدام ملاقط دقيقة لفصل العضلات. بشكل عام ، هذا يقلل من النزيف ، مما يساعد الماوس على التعافي بشكل أسرع.

اخترنا جرعة 15 mU من الإيلاستاز بناء على نتائج العمل السابق20 ، والتي أظهرت أنه لا يوجد فرق بين جرعات 15 mU و 25 mU. وعلاوة على ذلك، لاحظوا أن ارتفاع التركيزات أدى إلى زيادة معدلات الوفيات. في حين تم الإبلاغ عن معدل وفيات 28 ٪ مع جرعة 15 mU20 ، فإن الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة لم تسفر عن أي وفيات بين الفوج. لم يكن لدينا أي وفيات خلال العملية الجراحية بأكملها لجميع الفئران ووفيات 5-10٪ بعد الجراحة حتى 3 أشهر بعد ذلك. ومع ذلك ، فإن التركيز الأساسي لهذه الدراسة يكمن في فهم توسع القلة ، وتمدد الأوعية الدموية الكبيرة. قادنا هذا التركيز إلى التركيز على الشريان القاعدي كمرجع أساسي لقياس التوسع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقن الإيلاستاز في Cisterna magna للفئران يؤدي إلى تأثير واسع ، مما يؤدي إلى توسيع الأوعية الدموية الكبيرة والصغيرة.

عند الحقن في الصهريج العظيم لأي ، من الأهمية بمكان مراعاة المسافة بين أنسجة المخ ومساحة Cisterna magna لتجنب إتلاف الدماغ بالإبرة. نظرا لأن الفئران لديها مسافة صغيرة نسبيا ، فإننا نقوم فقط بإدخال شطبة المحقنة في Cisterna magna. لتقليل خطر العدوى ، يجب إجراء العملية باستخدام معدات جراحية معقمة ، مع تخدير الماوس. يمكن أن يساعد إعطاء بوبيفاكايين وميتاكام قبل الإجراء في تقليل الانزعاج بعد الجراحة وتعزيز التعافي بشكل أسرع للحيوانات. يمكن رؤية Cisterna magna ، الموجود في قاعدة الجمجمة ، عن طريق تجفيف موقع الجراحة تماما باستخدام قطعة قطن معقمة. بالنسبة للتحقيق الحالي ، يبلغ حجم المنطقة الجراحية حوالي 1 سم ، وهي أقصى مساحة يمكن استخدامها للحصول على رؤية واضحة ل Cisterna magna. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد موقع الشق الصغير على الشفاء بسرعة أكبر.

من الأهمية بمكان زيادة احتباس المخدرات إلى أقصى حد داخل مساحة Cisterna magna. حاولت الأبحاث السابقة منع تسرب الدواء عن طريق وضع قطعة قطن في موقع الحقن بعد إعطاء الإيلاستاز21. ومع ذلك ، لدينا مخاوف بشأن فعالية هذه الطريقة ، حيث أن الطبيعة الماصة للقطن في موقع الحقن يمكن أن تضر بفعالية الإيلاستاز عن طريق إعادة امتصاصه بعد الحقن. وبالمثل ، في دراسة أخرى20 ، تمت إزالة الإبرة بسرعة بعد حقن الإيلاستاز في Cisterna magna ، مما يشكل تحديا محتملا آخر في ضمان دخول الدواء الأمثل إلى مساحة Cisterna magna ، مما قد يؤدي إلى تسرب الإيلاستاز إلى السائل النخاعي. لذلك ، تبدأ الطريقة المقترحة هنا بثقب Cisterna magna لإطلاق السائل النخاعي (CSF) ، متبوعا بوضع قطعة قطن معقمة في موقع البزل لامتصاص السائل الدماغي الشوكي الزائد وتخفيف الضغط داخل الفضاء. بعد ذلك ، تتم إزالة مسحة القطن ، ويتم إعادة إدخال الإبرة في نفس المكان لحقن الإيلاستاز في مساحة الخزان دون إعادة تطبيق مسحة القطن. علاوة على ذلك ، اخترنا إبقاء الإبرة في مكانها لمدة 1-2 دقيقة بعد الحقن ، مما يسمح للإلاستاز بالانتشار بشكل كاف في جميع أنحاء Cisterna magna قبل سحبه برفق. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذه التقنية تتطلب إجراء اليد الخالية من الحقن والتثبيت الثابت للإبرة أثناء ثقب Cisterna magna وحقن الإيلاستاز ببطء. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تجنب إتلاف الأوعية الدموية الكبيرة عبر Cisterna magna عند الحقن لأنه يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات مثل الدوران بعد الجراحة ، وهي نقطة نهاية وتتطلب القتل الرحيم. بشكل عام ، توضح الطريقة توسعا يستمر لمدة تصل إلى 3 أشهر من حقنة إيلاستاز واحدة في Cisterna magna ، متجاوزة التوسع لمدة أسبوعين الذي لوحظ في الطرق السابقة20,21. في الختام ، يمتد هذا النهج من مدة التوسع ولكنه أيضا يسلم باستمرار المواد ، مثل الإيلاستاز ، مباشرة إلى الدماغ. تفضل هذه الطريقة لنهجها طفيف التوغل لنقل المواد عبر الحاجز الدموي الدماغي ، مما يوفر ميزة إضافية حيث يمكن توسيعها لتوصيل الدواء إلى الجهاز العصبي المركزي.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت هذه الدراسة ممكنة بفضل المساهمات القيمة لستيفاني تام التي قدمت الدعم في المساعدة في العمليات الجراحية. نعرب عن خالص امتناننا لمساعدتها. المعاهد الوطنية للصحة (AG066162) لدعم هذا البحث.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
23 G قسطرةجامعة Medstore2546-CABD305145اللازمة للتروية   (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
الإيثانولالمطلق ميدستورhttps://www.uoftmedstore.com/index.szلإزالة مقشر البيتادين ميكروفيل
#https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrubالتعقيم
البيتادينAmazonhttps://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHWالتعقيم
بوبيفاكائينمقدمة من منشأةN / Aمسكنات
كليبرزBrainTree Scientific IncCLP-41590حلاقة الفراء
قطن Q-tipUniversity Medstore1962للجراحة (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ElastaseSigma-aldrich  E7885يستخدم لتوسيع الأوعية الدموية
الإيثانولجامعة ميدستور39752-P016-EAANالتعقيم (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
الماعز المضاد للفأر 568InvitrogenA11004لتلوين الخلايا العصبية الناضجة
منشور Graphpad 10منشور Graphpad 10https://www.graphpad.com/برنامج التحليل الإحصائي
حقنة هاميلتونSigma-aldrich28614-Uحقن الإيلاستاز
وسادة حراريةأمازونhttps://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZالحفاظ على درجة حرارة الجسم
برنامج ImageJFiji Imagejimagej.net (الولايات المتحدة الأمريكية)برنامج تحليل الصور
غرفة الحثمقدمة من منشأةN / Aالتخدير Metacam التعريفي
المقدمة من منشأة حيوانيةN / Aمسكن
ميثيل ساليسيلاتSigma-aldrichM6752لإزالة microfil
MicrofilFlow Tech ، كارفر ، ماساتشوستسhttps://www.flowtech-inc.com/order/  ؛ صبغة (أصفر)
فأر أحادي النسيلة مضاد ل NeuNMillipore SigmaMAB377لتلوين الخلايا العصبية الناضجة
Olympus VS200 الماسح الضوئي للشرائح وبرنامج VSI.أوليمبوس علوم الحياةhttps://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[التنزيلات][معرف]=847254104برنامج التصوير جامعة
بارافورمالدهايدميدستورPAR070.1لتثبيت البروتين  (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
مضخة الترويةVWR الدوليةhttps://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumpsاللازمة للتروية
جامعة مشرطMedstore 2580-M90-10للجراحة (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
Stereotaxicمقدمة من منشأة حيوانيةغير متوفرةلذا قم بتأمين للجراحة
مقص جراحيميدستور الجامعة22751-A9-240للجراحة (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
الشريط الجراحيجامعة ميدستورhttps://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2تأمين على خيوط الحفاضات
جامعة ميدستور2297-VS881للجراحة (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
ملاقط X2جامعة ميدستور7731-A10-612للجراحة (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)
محلول برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  2. Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I. Recent advances in drug delivery and targeting to the brain. J Control Release. 350, 668-687 (2022).
  3. Vagnucci, A. H. Jr, Li, W. W. Alzheimer's disease and angiogenesis. Lancet. 361 (9357), 605-608 (2003).
  4. Banks, W. A., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. J Neuroinflamm. 12, 223(2015).
  5. Archie, S. R., Shoyaib, A. A., Cucullo, L. Blood-brain barrier dysfunction in CNS disorders and putative therapeutic targets: an overview. Pharmaceutics. 13 (11), 1779(2021).
  6. Jefferies, W. A., Price, K. A., Biron, K. E., Fenninger, F., Pfeifer, C. G., Dickstein, D. L. Adjusting the compass: new insights into the role of angiogenesis in Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 5 (6), 64(2013).
  7. Kook, S. Y., Seok-Hong, H., Moon, M., Mook-Jung, I. Disruption of blood-brain barrier in Alzheimer disease pathogenesis. Tissue Barriers. 1 (2), e23993(2013).
  8. Kempermann, G. Activity dependency and aging in the regulation of adult neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a018929(2015).
  9. Del Brutto, V. J., Ortiz, J. G., Biller, J. Intracranial arterial dolichoectasia. Front Neurol. 8, 344(2017).
  10. de la Torre, J. C., Mussivand, T. Can disturbed brain microcirculation cause Alzheimer's disease. Neurol Res. 15 (3), 146-153 (1993).
  11. Gutierrez, J., Sacco, R. L., Wright, C. B. Dolichoectasia-an evolving arterial disease. Nat Rev Neurol. 7 (1), 41-50 (2011).
  12. Desai, B. S., Schneider, J. A., Li, J. L., Carvey, P. M., Hendey, B. Evidence of angiogenic vessels in Alzheimer's disease. J Neural Transm. 116 (5), 587-597 (2009).
  13. Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789(2011).
  14. Zenaro, E., Piacentino, G., Constantin, G. The blood-brain barrier in Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 107, 41-56 (2017).
  15. Brandl, S., Reindl, M. Blood-Brain barrier breakdown in neuroinflammation: current in vitro models. Int J Mol Sci. 24 (16), 12699(2023).
  16. Austin, B. P., et al. Effects of hypoperfusion in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 26, Suppl 3 123-133 (2011).
  17. Jagust, W. J., Budinger, T. F., Reed, B. R. The diagnosis of dementia with single photon emission computed tomography. Arch Neurol. 44 (3), 258-262 (1987).
  18. Schuff, N., et al. Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer's disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging. Alzheimers Dement. 5 (6), 454-462 (2009).
  19. Singh, C., Pfeifer, C. G., Jefferies, W. A. Pathogenic Angiogenic Mechanisms in Alzheimer's Disease. Physiologic and Pathologic Angiogenesis - Signaling Mechanisms and Targeted Therapy. , InTech (2017).
  20. Dai, D., Kadirvel, R., Rezek, I., Ding, Y. H., Lingineni, R., Kallmes, D. Elastase-induced intracranial dolichoectasia model in mice. Neurosurgery. 76 (3), 337-343 (2015).
  21. Liu, F. X., et al. Modified protocol for establishment of intracranial arterial Dolichoectasia model by injection of elastase into cerebellomedullary cistern in mice. Front Neurol. 13, 860541(2022).
  22. Lee, A. Y., Han, B., Lamm, S. D., Fierro, C. A., Han, H. Effects of elastin degradation and surrounding matrix support on artery stability. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (4), H873-H884 (2012).
  23. Li, Y., et al. The role of elastase in corneal epithelial barrier dysfunction caused by Pseudomonas aeruginosa exoproteins. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (9), 7(2021).
  24. Temesvári, P., Ábrahám, C. S., Gellén, J., Speer, C. P., Kovács, J., Megyeri, P. Elastase given intracisternally opens blood-brain barrier in newborn piglets. Biol Neonatol. 67 (1), 59-63 (1995).
  25. Takata, F., et al. Elevated permeability of the blood-brain barrier in mice intratracheally administered porcine pancreatic elastase. J Pharmacol Sci. 129 (1), 78-81 (2015).
  26. Hanyu, H. Diagnosis and treatment of mixed dementia. Brain Nerve. 64 (9), 1047-1055 (2012).
  27. Chui, H. C., Ramirez-Gomez, L. Clinical and imaging features of mixed alzheimer and vascular pathologies. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 21(2015).
  28. Saito, T., et al. Single app knock-in mouse models of alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
  29. Dobrin, P. B., Canfield, T. R. Elastase, collagenase, and the biaxial elastic properties of dog carotid artery. Am J Physiol. 247, 1 Pt 2 H124-H131 (1984).
  30. Wagenseil, J. E., Ciliberto, C. H., Knutsen, R. H., Levy, M. A., Kovacs, A., Mecham, R. P. Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice. Circ Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة