يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الطباعة الحيوية المضمنة للهياكل الشبيهة بالأنسجة باستخدام وسط κ-Carrageenan Sub-Microgel

2.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66806

⸱

مايو 3, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة حماما معلقا جديدا للميكروجيل κ-carrageenan ، يعرض خصائص انتقالية رائعة للتشويش وفك التشويش عكسيا. تساهم هذه السمات في بناء أنسجة وأعضاء المحاكاة الحيوية في الطباعة الحيوية 3D المضمنة. توضح الطباعة الناجحة للأنسجة الشبيهة بالقلب / المريء بدقة عالية ونمو الخلايا تطبيقات الطباعة الحيوية وهندسة الأنسجة عالية الجودة.

الملخص

ظهرت الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) المضمنة باستخدام حمام دعم هيدروجيل حبيبي كتقنية حاسمة لإنشاء سقالات محاكاة حيوية. ومع ذلك ، فإن هندسة وسط تعليق جل مناسب يوازن بين الترسيب الدقيق للحبر الحيوي وصلاحية الخلية ووظيفتها يمثل تحديات متعددة ، لا سيما في تحقيق الخصائص اللزجة المرنة المطلوبة. هنا ، يتم تصنيع حمام دعم هلام κ-carrageenan جديد من خلال عملية طحن ميكانيكية سهلة التشغيل ، مما ينتج عنه جزيئات متجانسة دون المجهرية. تظهر هذه الهلاميات شبه الهلامية سلوك تدفق بينغهام النموذجي مع إجهاد صغير في الغلة وخصائص ترقق القص السريع ، مما يسهل الترسيب السلس للأحبار الحيوية. علاوة على ذلك ، يضمن انتقال الجل القابل للانعكاس وقدرات الشفاء الذاتي لشبكة κ-carrageenan microgel السلامة الهيكلية للتركيبات المطبوعة ، مما يتيح إنشاء هياكل أنسجة معقدة متعددة الطبقات مع ميزات معمارية محددة. بعد الطباعة ، يمكن إزالة الهلاميات الفرعية κ-carrageenan بسهولة عن طريق غسل ملحي بسيط مخزن بالفوسفات. توضح الطباعة الحيوية الإضافية باستخدام الأحبار الحيوية المحملة بالخلايا أن الخلايا داخل تركيبات المحاكاة الحيوية تتمتع بقدرة عالية على البقاء بنسبة 92٪ وتمتد بسرعة إلى pseudopodia ، بالإضافة إلى الحفاظ على انتشار قوي ، مما يشير إلى إمكانات استراتيجية الطباعة الحيوية هذه لتصنيع الأنسجة والأعضاء. باختصار ، يبرز هذا الوسيط شبه الدقيق κ-carrageenan الجديد كوسيلة واعدة للطباعة الحيوية المدمجة بجودة استثنائية ، مما يحمل آثارا عميقة على التطوير في المختبر للأنسجة والأعضاء المهندسة.

المقدمة

تلعب سقالات هندسة الأنسجة ، بما في ذلك الألياف المغزولة بالكهرباء والإسفنج المسامي والهلاميات المائية البوليمرية ، دورا محوريا في إصلاح وإعادة بناء الأنسجة والأعضاء التالفة من خلال توفير إطار هيكلي يدعم نمو الخلايا وتجديد الأنسجة واستعادة وظيفة الأعضاء1،2،3. ومع ذلك ، تواجه السقالات التقليدية تحديات في تكرار هياكل الأنسجة الأصلية بدقة ، مما يؤدي إلى عدم تطابق بين الأنسجة الهندسية والطبيعية. يعيق هذا القيد الشفاء الفعال للأنسجة المعيبة ، مما يؤكد الحاجة الملحة لتطورات تصميم السقالة لتحقيق تقليد حيوي أكثر دقة. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (3D) هي تقنية تصنيع مبتكرة تبني بدقة هياكل الأنسجة البيولوجية المعقدة طبقة تلو الأخرى باستخدام أحبار وخلايا المواد الحيوية4. من بين المواد الحيوية المختلفة ، تظهر الهلاميات المائية البوليمرية كأحبار حيوية مثالية بشبكتها المميزة التي تسهل تغليف الخلايا في الموقع وتدعم نموها بشكل حاسم 5,6. ومع ذلك ، تميل العديد من الهلاميات المائية اللينة وعالية الرطوبة إلى إحداث ضبابية أو انهيار سريع لهياكل السقالات المطبوعة أثناء عملية الطباعة عند استخدامها كأحبار حيوية. لمواجهة هذا التحدي ، تستخدم تقنية الطباعة الحيوية 3D المضمنة حمام ميكروجيل كمواد داعمة ، مما يسمح بترسب دقيق للحبر الحيوي الناعم. عند هلام الأحبار الحيوية الهيدروجيل ، يتم الحصول على سقالات إلكترونية مكررة ذات هياكل معقدة عن طريق إزالة حمام microgel. تم استخدام مواد مثل الجيلاتين7،8 ، والأغاروز9 ، وصمغ جيلان10،11 لإنشاء حمامات ميكروجيل للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المدمجة ، مما أدى إلى تقدم كبير في تطبيق الهلاميات المائية اللينة في هندسة الأنسجة. ومع ذلك ، فإن حجم الجسيمات على مستوى الميكرون وغير المنتظم لهذه المواد الهلامية للجسيمات يؤثر بشكل ضار على دقة ودقة الطباعة ثلاثية الأبعاد12،13،14. هناك حاجة ملحة لتصنيع عوامة تعليق تشبه الهلام مع جزيئات صغيرة ومشتتة بشكل موحد ، مما يوفر مزايا في تحقيق طباعة حيوية عالية الدقة.

في هذا البروتوكول ، يتم تقديم حمام تعليق حبيبي جديد κ-carrageenan مع مستوى شبه ميكرون موحد للطباعة 3D المضمنة. يسهل سلوك الحمام المبتكر شبه الميكروجيل هذا للانتقال السريع للتشويش والتشويش التصنيع الدقيق لسقالات هيدروجيل المحاكية بيولوجيا بدقة هيكليةعالية 15. باستخدام وسيط التعليق الجديد هذا ، تتم طباعة سلسلة من تركيبات الأنسجة والأعضاء المحاكية بيولوجيا التي تتميز بهياكل أنسجة متعددة الطبقات بنجاح ، باستخدام حبر حيوي مركب يتكون من ميثاكريلات الجيلاتين والميثاكريلات الليفي الحرير. في هذه الدراسة ، اخترنا المريء ككائن محاكاة حيوية للطباعة الحيوية 3D بشكل أساسي لأن المريء لا يحتوي فقط على بنية أنسجة متعددة الطبقات ولكن أيضا طبقة عضلاته تعرض بنية طبقات معقدة دائرية وخارجية طولية. يعد ضمان المحاذاة والتنظيم المناسبين لهذه الطبقات أمرا ضروريا لتجديد الأنسجة الوظيفية. لذلك ، نرغب بشدة في تكرار البنية متعددة الطبقات للمريء. والأهم من ذلك ، استخدمنا الميكروهلاميات الفرعية κ-carrageenan كحمام معلق و GelMA / SFMA كحبر حيوي لتصميم وبناء سقالة محاكاة حيوية لهندسة الأنسجة. يمكن إطلاق المريء المطبوع بسهولة عن طريق الغسيل الملحي المتكرر المخزن بالفوسفات. علاوة على ذلك ، فإن حمام κ-carrageenan sub-microgel خال من المواد السامة للخلايا ، مما يضمن التوافق الخلويالعالي 15. تظهر خلايا العضلات الملساء المحملة داخل سقالات متباينة الخواص نشاطا ملحوظا للانتشار. يوفر وسيط التعليق شبه الدقيق الموحد هذا وسيلة جديدة لتصنيع الأنسجة والأعضاء المعقدة من خلال الطباعة الحيوية 3D المدمجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد حمام تعليق κ -carrageenan sub-microgel

  1. قم بإعداد 500 مل من حمام تعليق κ-carrageenan (0.35٪ وزن / حجم) بإضافة 1.75 جم من مسحوق κ -carrageenan إلى 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) داخل زجاجة زجاجية سعة 1000 مل.
  2. أدخل قضيب تحريك مغناطيسي 70 مم في الزجاجة لتقليب الخليط المائي. اربط غطاء الزجاجة ثم قم بفكه بمقدار نصف دورة.
  3. ضع الزجاجة في حمام مائي على حرارة 70 درجة مئوية وقم بتسخينها. قم بتشغيل المحرك المغناطيسي بسرعة 300 دورة في الدقيقة ، ضع الزجاجة ، وحركها حتى يذوب البوليمر تماما.
  4. خذ زجاجة زجاجية أخرى وضعها في الأوتوكلاف للتعقيم ، على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. بعد أن يبرد جهاز التعقيم عالي الضغط إلى 80 درجة مئوية ، أخرج الزجاجة من جهاز التعقيم وانقلها إلى طاولة العمل فائقة النظافة لمزيد من المناولة.
  6. قم بتصفية محلول κ-carrageenan المذاب تماما في الزجاجة الزجاجية المعقمة باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: قم بإجراء الترشيح بسرعة بينما يكون المحلول ساخنا لمنع κ-carrageenan من التبريد وعرقلة الفلتر.
  7. قم بتخزين محلول κ-carrageenan عند 4 درجات مئوية للحث على هلام متشابك الكاتيون لمدة 12 ساعة.
  8. قم بطحن الهلاميات المائية κ-carrageenan ميكانيكيا باستخدام محرك مغناطيسي 60 مم بسرعة تحريك تبلغ 1200 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية حتى تتحول بنجاح إلى حالة سائلة ، تستغرق حوالي 60 دقيقة.
    ملاحظة: قم بتخزين الهلاميات المائية κ-carrageenan بين 25-37 درجة مئوية لتجنب الهلام في درجات حرارة منخفضة أو الذوبان في درجات حرارة عالية.

2. تحضير الأحبار الحيوية المركبة من الجيلاتين ميثاكريلات / الحرير فيبروين ميثاكريلات

  1. تحضير الأحبار الحيوية المركبة عن طريق الجمع بين 10٪ (بالوزن / الحجم) ميثاكريلات الجيلاتين (GelMA) و 6٪ (بالوزن / المجلد) ميثاكريلات الحرير الفبروين (SFMA) في محلول PBS (درجة الحموضة 7.4). قم بوزن 2.0 جم من GelMA و 1.2 جم من مساحيق SFMA بشكل منفصل.
  2. أضف المساحيق ببطء إلى أنبوبي طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 10 مل من محلول PBS بشكل منفصل إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
  3. أضف محرك مغناطيسي 10 مم إلى كل منها وحركه باستمرار وسخنه في حمام مائي على حرارة 45 درجة مئوية. اترك مساحيق GelMA و SFMA تذوب تماما ، مع أخذ حوالي 30 دقيقة.
  4. امزج محاليل GelMA و SFMA بحجم متساو تحت التحريك المستمر عند 45 درجة مئوية. قم بتصفية الأحبار الحيوية المركبة باستخدام مرشح حجم المسام 100 ميكرومتر.
  5. تعقيم الأحبار الحيوية المركبة GelMA / SFMA من خلال الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة الحيوية لمدة 12 ساعة.
    ملاحظة: قم بإعداد واستخدام الأحبار الحيوية على الفور لمنع الهلام المبكر ل SFMA من خلال التجميع الذاتي.

3. التوصيف الريولوجي لحمام تعليق κ -carrageenan sub-microgel

  1. بدء وإعداد المعدات المتعلقة بالريولوجيا.
    1. قم بتشغيل ضاغط الهواء لمدة 30 دقيقة وتأكد من أن الضغط يصل إلى 30 رطل / بوصة مربعة. قم بإزالة مشبك المحمل عن طريق تدوير قضيب السحب عكس اتجاه عقارب الساعة. ثبت الغطاء الأسود أدناه وقم بتدوير محور المقبض أعلى الجهاز في اتجاه عقارب الساعة.
    2. قم بتشغيل مقياس الريومتر واسمح له بالتهيئة. قم بتشغيل مفتاح تدوير المياه واترك درجة الحرارة تصل إلى 15 درجة مئوية.
    3. افتح برنامج التحكم في مقياس الريومتر لإنشاء الاتصال عبر الإنترنت.
  2. معايرة مقياس ريومتر وتثبيت هندسة لوحة متوازية.
    1. قم بإجراء معايرة الأداة في برنامج التحكم ، والذي يتضمن بشكل أساسي ضبط مسار القصور الذاتي لأداة المعايرة. قم بتركيب هندسة لوحة متوازية بقطر 40 مم في نهاية قضيب السحب. اضغط مع الاستمرار على زر القفل لمدة 3 ثوان لتحريك عمود المحرك إلى وضع المنزل لوضع هندسي متسق.
    2. حدد مدير المعايرة في برنامج التحكم ثم انقر فوق القصور الذاتي ومعايرة الاحتكاك والتخطيط الدوراني لمعايرة هندسة اللوحة المتوازية.
  3. صفر ارتفاع فجوة مقياس ريومتر عن طريق إجراء تصفير الفجوة القياسي لضمان القياس الدقيق.
  4. قم بإعداد الخطوات التجريبية ، بما في ذلك منحدر التدفق الذي يتراوح من 0.01 إلى 1000 1 / ثانية معدل القص ، واكتساح السعة الذي يتراوح من 0.1٪ إلى 100٪ إجهاد عند 10 راد / ثانية ، واكتساح وقت تذبذب متعدد الخطوات يدوم لمدة 60 ثانية مع سلالات متناوبة بنسبة 1٪ و 100٪ عند 10 راد / ثانية ، واكتساح Peak Hold متعدد الخطوات يستمر لمدة 120 ثانية بمعدل قص متناوب يبلغ 0.1 1 / ثانية و 10 1 / ثانية.
  5. قم بإسقاط 2 مل من معلقات κ-carrageenan بنسبة 0.35٪ على لوحة بلتيير الخاصة بمقياس الريومتر.
  6. ضع الفجوة الهندسية إلى 510 ميكرومتر وقم بإزالة أي فائض زائد على حافة جهاز المشبك. اضبط فجوة العينة على 500 ميكرومتر للسماح للعينة بالامتداد قليلا إلى ما بعد حافة المشبك.
  7. قم بإجراء تجربة تدفق عن طريق تحديد منحدر التدفق من خيارات التصميم التجريبي.
    1. اختر اختبار منحدر التدفق في التصميم التجريبي. اضبط معدلات القص من 0.001 إلى 10 1 / ثانية عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.
    2. قم بتنفيذ الخطوة 3.5 وتجربة منحدر التدفق على العينة المضافة.
  8. قم بإجراء اختبار Peak Hold الدوري لتقييم أداء استرداد المادة.
    1. اختر Peak Hold sweep في التصميم التجريبي وقم بتعيين 5 تجارب متتالية بزمن 120 ثانية عند 25 درجة مئوية.
    2. اضبط معدل القص على 0.01 1 / ثانية للخطوات الأولى والثالثة والخامسة وإلى 10 1 / ثانية للخطوات الثانية والرابعة.
    3. أضف عينة جديدة مقدارها 2 mL. قم بإجراء الخطوة 3.5 واختبار الاسترداد الدوري.
  9. إجراء تحليل المرونة اللزوجة لتقييم الانتقال المحتمل للهلام سول لحمام تعليق κ-carrageenan.
    1. اختر اختبار اجتياح السعة في التصميم التجريبي. اضبط سلالة التذبذب من 0.1٪ إلى 100٪ عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. انقر فوق ابدأ لإجراء تجربة مسح السعة على العينة المضافة.
  10. قم بإجراء تحليل سلالة بديل لتقييم أداء الاسترداد المرن للمادة.
    1. اختر مسح وقت التذبذب في التصميم التجريبي وقم بتعيين 5 تجارب متتالية بزمن 60 ثانية عند 25 درجة مئوية.
    2. اضبط السلالة على 1٪ للخطوات الأولى والثالثة والخامسة وعلى 100٪ للخطوتين الثانية والرابعة.
    3. أضف عينة جديدة مقدارها 2 mL. قم بإجراء الخطوة 3.5 واختبار الاسترداد الدوري المستمر.
      ملاحظة: نظف اللوحة الهندسية ولوحة بلتيير بعد كل اختبار تجربة وأضف عينة جديدة من 2 مل.

4. طباعة سقالات هيدروجيل المحاكاة الحيوية باستخدام طابعة حيوية صغيرة البثق مصممة خصيصا

  1. صمم مكعبات بتنسيق STL باستخدام برنامج رسومات ثلاثي الأبعاد وقم بتنزيل نماذج تشبه الأنسجة من قاعدة بيانات ثلاثية الأبعاد (www.thingiverse.com ؛ https://3d. nih.gov/.).
    1. استيراد نماذج تنسيق STL إلى برنامج PANGO وإدخال معلمات الطباعة. قم بتعيين إحداثيات X و Y و Z المحددة للنموذج في مساحة 3D ، وأدخل حجم القياس المتوقع للنموذج بالمليمترات (مم) ، واضبط حجم ونسبة قياس الكائن على محاور X و Y و Z ، واضبط زاوية دوران النموذج في الفضاء حسب الحاجة.
    2. أدخل قطر الفتيل المقدر (عادة حوالي 200-500 ميكرومتر لمعظم الأحبار الحيوية) في مجال سمك الطبقة لتحديد سمك المحور Z لكل طبقة. اضبط سرعة الطباعة وفقا لسمك الخط المتوقع (حوالي 10-90 مم / ثانية) واضبط كثافة التعبئة على 30٪ -80٪.
    3. تصدير المعلمات النهائية كرمز G على بطاقة SD.
  2. قم بتشغيل الطابعة الحيوية ومضخة البثق الدقيقة.
    1. قم بتشغيل وحدة التحكم في مضخة البثق الدقيقة ، وحدد حقنة الحجم المقابلة (5 مل) ، واضبط معدل البثق على 0.08 مل / دقيقة ومدة البثق بالتنسيق مع وقت الطباعة المطلوب الذي تم الحصول عليه بقسمة حجم الهيدروجيل على معدل البثق.
    2. قم بتركيب المحقنة بإبرة بقطر داخلي يبلغ 210 ميكرومتر في فتحة المحقنة في الطابعة الحيوية.
    3. اضبط وحدة التحكم في المحقنة للتأكد من أن مكبس المحقنة على اتصال وثيق بالمسمار.
    4. ضع 3 مل من الحمام المعلق في طبق زراعة الخلايا 35 مم. ضع الطبق على المنصة بناء على إعدادات الرمز وتأكد من أن رأس الطباعة أعلى من قاع الطبق بمقدار 1 مم.
      ملاحظة: قم بإجراء اختبار مسبق لضمان دقة مواضع الأطباق على منصة الطباعة أثناء الطباعة.
    5. أدخل بطاقة SD التي تحتوي على الرمز في الطابعة الحيوية 3D ، وقم بتنشيط ملف التعليمات البرمجية ، وابدأ تشغيل الطابعة الحيوية ، وانقر فوق الزر "ابدأ" على وحدة التحكم.
  3. تجهيز الإنشاءات
    1. قم بتعريض البنية المطبوعة للضوء الأزرق 405 نانومتر لمدة 1 دقيقة لبدء الربط الضوئي.
    2. قم بإزالة هلام κ-carrageenan باستخدام ماصة 1 مل ، متبوعا بإضافة 3 مل من PBS (درجة الحموضة 7.4) للغسيل والإزالة اللاحقة. كرر هذه العملية لغسل شامل.
      ملاحظة: قم بإجراء عملية الغسيل برفق لتجنب إتلاف التركيبات المطبوعة.

5. جزءا لا يتجزأ من الطباعة الحيوية 3D من النظير طبقة العضلات المريء

  1. زراعة خلايا العضلات الملساء المريئية الأرنب (eSMCs).
    1. بدء المزرعة في قوارير T75 مع 2 × 106 خلايا باستخدام 15 مل من وسط DMEM المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. حافظ على eSMCs عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 و 95٪ هواء حتى تصل إلى التقاء 80٪.
  2. تحضير الحبر الحيوي لطبقة عضلات المريء
    1. نضح الوسط عند الوصول إلى نقطة التقاء واغسل eSMCs ب 5 مل من 1x PBS.
    2. أضف 2 مل من 0.2٪ Trypsin-EDTA إلى القارورة واحتضانها لمدة دقيقتين لهضم الخلايا. اضغط على القارورة لفصل الخلايا عن الحائط.
    3. قم بإنهاء عملية الهضم بإضافة 2 مل من DMEM ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بقياس كثافة الخلية باستخدام عداد خلية مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية.
    4. جهاز طرد مركزي عند 675 × جم لمدة 3 دقائق ، قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في الأحبار الحيوية المركبة GelMA / SFMA (كما تم إعدادها في الخطوة 2.1). اضبط تركيز الخلية النهائي لتحقيق كثافة 10 × 106 خلايا / مل في الحبر الحيوي ، وبالتالي تحسين الظروف لتطبيقات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد اللاحقة.
  3. إعداد الطابعة الحيوية 3D والمواد المرتبطة بها
    1. الأوتوكلاف أدوات الطباعة الأساسية ، بما في ذلك إبر الحقن ، والملقط ، ومحرك مغناطيسي ، وزجاجة سيليكات زجاجية سعة 1000 مل ، في ظل ظروف التعقيم القياسية (121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) لضمان بيئة معقمة لعملية الطباعة.
    2. ضع الطابعة الحيوية داخل خزانة السلامة الحيوية وقم بتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة للحفاظ على العقم.
    3. تحضير 50 مل من الكاراجينان المعقم κ و 5 مل من الأحبار الحيوية المركبة GelMA / SFMA المعقمة ، كما هو موضح في الخطوة 1 والخطوة 2 ، على التوالي.
    4. صمم النموذج ، واضبط المعلمات المطلوبة ، وقم بإعداد الطابعة الحيوية كما هو موضح في الخطوة 4.1.
  4. بدء عملية الطباعة الحيوية
    1. نفذ الإجراءات الموضحة في الخطوتين 4.2 و 4.3 للطباعة الحيوية لطبقة عضلات المريء ثلاثية الأبعاد ، متبوعة بغسل واستبدال PBS.
    2. قم بإجراء طباعة الخلايا باستخدام تقنيات معقمة طوال عملية الطباعة لتقليل مخاطر تلوث الخلايا في الهيكل المطبوع.
  5. استبدال وسيط زراعة الخلايا بعد الطباعة
    1. قم بشفط PBS بعناية واستبدله ب 3 مل من DMEM المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. تأكد من أن التركيبات المطبوعة مغمورة بالكامل لتوفير ظروف نمو الخلايا المثلى.
    2. احتضان طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على التركيبات المطبوعة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. استبدل وسط زراعة الخلايا بوسط جديد يوميا ، باستخدام 3 مل في كل مرة ، وراقب حالة الخلايا داخل التركيبات باستخدام المجهر الضوئي.

6. تقييم جدوى eSMCs داخل التركيبات المطبوعة عن طريق تلطيخ الفحص الحي / الميت

  1. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا بعد 5 ساعات من الحضانة واغسل التركيبات المحملة بالخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني.
  2. أضف 2 مل من محلول كالسيين-AM/بروبيديوم يوديد القياسي (1: 1000) إلى التركيبات المطبوعة المحملة بالخلايا واحتضانها.
  3. اغسل التركيبات 3x باستخدام برنامج تلفزيوني بعد حضانة مدتها 45 دقيقة ثم أضف وسط زراعة خلايا جديدة.
  4. راقب الخلايا الحية والميتة والتقط صورا فلورية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM).

7. مراقبة eSMCs داخل التركيبات المطبوعة عبر تلطيخ FITC-Phaloidin / DAPI

  1. قم بتلطيخ التركيبات المطبوعة باستخدام فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) المسمى phalloidin (أخضر) ل F-actin و 4 '، 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI ، أزرق) للحضانة النووية بعد 5 أيام من الحضانة.
  2. إعداد حل التثبيت
    1. اجمع بين 4 مل من 1x PBS مع 0.16 مل من بارافورمالدهايد (PFA) في أنبوب 5 مل من البولي إيثيلين (PE) ، مما يحقق تركيزا نهائيا بنسبة 4٪.
    2. ضع طبق الاستزراع الذي يحتوي على التركيبات المطبوعة بيولوجيا على سطح نظيف. قم بإزالة الوسيط وقم بتغطية التركيبات برفق بمحلول PFA ، مما يضمن غمرها الكامل. اترك التثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل التخلص من المحلول.
      ملاحظة: التعامل مع السوائل بعناية أثناء عمليات الإضافة والإزالة للحفاظ على السلامة الهيكلية للتركيبات المطبوعة بيولوجيا.
    3. أدخل 2.5 مل من 1x PBS إلى طبق الاستزراع ، مع غمر التركيبات بالكامل لإزالة أي كواشف تلطيخ متبقية.
  3. نفاذية غشاء الخلية
    1. قم بصياغة محلول Triton X-100 بنسبة 0.5٪ عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من Triton X-100 إلى 4 مل من 1x PBS في أنبوب PE سعة 5 مل.
    2. قم بإدارة محلول Triton X-100 للتركيبات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاختراق أغشية الخلايا ، ثم قم بإزالة المحلول.
    3. أدخل 2.5 مل من 1x PBS إلى طبق الاستزراع ، مع غمر التركيبات بالكامل لإزالة أي كواشف تلطيخ متبقية.
  4. حظر الربط غير المحدد
    1. قم بإنشاء محلول حاصر لألبومين مصل الأبقار (BSA) بنسبة 3٪ في أنبوب PE سعة 5 مل عن طريق إضافة 0.12 مل من BSA إلى 4 مل من 1x PBS.
    2. قدم محلول BSA إلى التركيبات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لحظر المواقع غير المحددة ، ثم تجاهل المحلول.
  5. تلطيخ الأكتين مع FITC-Phalloidin
    1. تحضير محلول FITC-phalloidin 0.2٪ في أنبوب PE سعة 5 مل مع 4 مل من 1x PBS و 8 ميكرولتر من كاشف التلوين.
    2. اغمر التركيبات في هذا المحلول لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، ثم تخلص من المحلول.
    3. أضف 2.5 مل من 1x PBS إلى طبق الاستزراع ، مع غمر التركيبات بالكامل لإزالة كواشف التلوين المتبقية.
  6. تلطيخ نووي مع DAPI
    1. ضع 4 مل من محلول تلطيخ DAPI على التركيبات ، مما يضمن تغطية كاملة.
    2. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل إزالة محلول DAPI.
  7. الغسيل النهائي وغمر PBS: أضف 2.5 مل من 1x PBS إلى طبق الاستزراع ، مع غمر التركيبات بالكامل لإزالة كواشف التلوين المتبقية.
    ملاحظة: تحضير حلول تلطيخ مقدما والتعامل معها بلطف. لا ينبغي أن تخضع الخلايا للجفاف داخل وعاء الاستزراع في أي وقت.
  8. المراقبة باستخدام مجهر متحد البؤر: افحص وصور التركيبات الملطخة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم نمو الخلايا ، مما يضمن توثيقا شاملا للنتائج.

8. تقييم انتشار eSMCs داخل التركيبات المطبوعة باستخدام مقايسة CCK-8

  1. قم بإزالة وسيط الاستزراع من التركيبات في اليومين 7 و 14. اغسل التركيبات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا المتوسطة والمنفصلة المتبقية.
  2. أضف حل CCK-8 لكل بناء باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تأكد من أن حجم حل CCK-8 كاف لتغطية كل بنية بالكامل.
  3. احتضان التركيبات بمحلول CCK-8 عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. بعد الحضانة ، انقل المادة الطافية بعناية إلى لوحة جديدة مكونة من 96 بئرا.
  4. قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إنشاء حمام هلام κ-carrageenan الحبيبي عن طريق تفتيت الهلاميات المائية السائبة ميكانيكيا إلى ملاط هلام الجسيمات. أظهرت أحدث دراسة أن جسيمات κ-carrageenan أظهرت قطرا متوسطا يبلغ حوالي 642 ± 65 نانومتر مع أشكال موحدة عند 1000 دورة في الدقيقة من المزج الميكانيكي15 ، أصغر بكثير من أبعاد الهلاميات الدقيقة التي تم الإبلاغ عنها سابقا في الأدبيات16،17،18 . تؤدي أوقات الكسر الأطول والسرعات الأك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تحضير حمامات تعليق κ-carrageenan sub-microgel للاستخدام في الطباعة الحيوية عملية منسقة بعناية تتضمن عدة خطوات حاسمة لضمان أن الوسط الناتج يعرض الخصائص المطلوبة لدعم الأحبار الحيوية. في البداية ، يتم تحضير محلول κ-carrageenan عن طريق إذابة مسحوق κ-carrageenan في الماء منزوع الأيونات في درجات حرارة مرتفعة ، مما يخلق خليطا متجانسا. تركيز المحلول هو المفتاح ويجب تحسينه للهلام اللاحق. 0.3-0.6٪ (بالوزن / المجلد) أظهر κ-carrageena...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس للمؤلفين أي مصلحة مالية في المنتجات الموصوفة في هذه المخطوطة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة نينغبو للعلوم الطبيعية (2022J121 ، 2023J159) ، والمشروع الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية في مدينة نينغبو (2021J256) ، والأساس المفتوح لمختبر الدولة الرئيسي للهندسة الجزيئية للبوليمرات (جامعة فودان) (K2024-35) ، والمختبر الرئيسي للطب الدقيق لأمراض تصلب الشرايين في مقاطعة تشجيانغ ، الصين (2022E10026). شكرا للدعم الفني من قبل المرافق الأساسية ، مركز العلوم الصحية بجامعة نينغبو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طابعة حيوية ثلاثية الأبعادمصممة
4 '، 6-Diamidino-2-PhenylindoleSolarbio Life ScienceC0065جاهزة للاستخدام
405 نانومتر ضوء الأشعة فوق البنفسجيةEFLXY-WJ01
عداد الخلاياCorningCyto smart 6749
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeicaSTELLARIS 5
DMEM ارتفاع الجلوكوزVivaCellC3113-0500نسبة عالية من الجلوكوز ، مع بيروفات الصوديوم و L-Glutamine
مقياس الريومتر الدوراني الديناميكيTA اكتشاف أداةHR-20
خلايا العضلات الملساء للمريءالتي يتم توفيرها من قبل قسم بيولوجيا الخلية والطب التجديدي ، مركز العلوم الصحية ، جامعةالخلايا الأولية من مريء الأرانب
مصل الأبقار الجنينيUEF9070L
فلورسين إيزوثيوسيانات المسمى الفالودينSolarbio علوم الحياةCA1610300T
الجيلاتين ميثاكريليتEFLEFL-GM-6060 استبدال
K-carrageenanعلاء الدينC121013-100 جرامكاشف الصف
ليثيوم فينيل (2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل) فوسفيناتعلاء الدينL157759-1 جم365 ~ 405 نانومتر
مجموعة Live-DeadbeyotimeC2015M
قارئ MicroplatePotenovPT-3502B
ParaformaldehydeSolarbio Life ScienceP1110   ؛4٪
البنسلين / الستربتومايسينSolarbio Life ScienceMA0110100 ´ ؛
ملحي مخزن بالفوسفاتVivaCellC3580-0500درجة الحموضة 7.2-7.4
فيبروين الحرير ميثاكريليتEFLEFL-SilMA-00139٪ استبدال
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Trypsin-EDTAVivaCellC100C10.25٪ ، بدون فينول أحمر
خصيصا نينغبو محلول

المراجع

  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

مايكروجيلات كابا-كاراجينانالطباعة الحيوية ثلاثية الأبعادهندسة الأنسجةحمام هيدروجيل حبيبيترسيب الحبر الحيويالطحن الميكانيكيأحبار حيوية محملة بالخلاياالتشبيك الضوئي
الطباعة الحيوية المضمنة للهياكل الشبيهة بالأنسجة باستخدام وسط κ-Carrageenan Sub-Microgel
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.