مقالة منهجية

استئصال الودي القطني الجراحي في الفئران

5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66821

⸱

يوليو 5, 2024

 , 
1Medical Scientist Training Program, Emory University School of Medicine, 2Neuroscience Graduate Program, Laney Graduate School, Emory University, 3Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا لإزالة الخلايا العصبية القطنية الودية بعد العقدة جراحيا من الفأر. سيسهل هذا الإجراء العديد من الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في دور التعصيب الودي في أهداف الأنسجة البعيدة.

الملخص

إصابات الأعصاب الطرفية شائعة ، ويتم تحقيق الشفاء الوظيفي الكامل بعد الإصابة في 10 ٪ فقط من المرضى. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي العديد من الأدوار المهمة في الحفاظ على الاتزان الداخلي الجسدي، ولكن نادرا ما تمت دراسته في سياق إصابة العصب الطرفي. مدى الوظائف العصبية الودية بعد العقدة في الأهداف البعيدة في المحيط غير واضح حاليا. لاستكشاف دور التعصيب الودي للأهداف المحيطية بشكل أفضل ، يوفر نموذج "الضربة القاضية" الجراحي نهجا بديلا. على الرغم من أنه يمكن تحقيق ذلك كيميائيا ، إلا أن التدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقد يمكن أن يكون غير محدد ويعتمد على الجرعة. يسمح استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في الفئران ، الذي كان يعتقد أنه "غير عملي عمليا" في الصغيرة ، باستهداف محدد للخلايا العصبية الودية بعد العقدة التي تعصب الأطراف الخلفية. تصف هذه المخطوطة كيفية إزالة العقد القطنية الودية L2-L5 جراحيا من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة ، مما يقلل بشكل موثوق من استجابة عرق المخلب الخلفي وعدد المحاور العصبية الودية في العصب الوركي.

المقدمة

يمكن أن تؤدي إصابات الأعصاب المحيطية (PNIs) إلى عجز حركي وحسي وودي في أهداف الأنسجة البعيدة التي نادرا ما تتعافى وظيفيا بالكامل1. غالبا ما ركزت أبحاث PNI على التجديد الحركي والحسي. ومع ذلك ، فإن ما يقرب من ربع العصب الوركي للفئران يتكون من محاور عصبية متعاطفة غير ميالينية2. ومع ذلك ، فإن دور التعصيب الودي في الأنسجة المحيطية غير مفهوم تماما3. يلعب الجهاز العصبي السمبثاوي دورا رئيسيا في الحفاظ على التوازن الجسدي ، والمشاركة في التنظيم المناعي ، والتنظيم الحراري ، ونغمة الأوعية الدموية ، والتكوين الحيوي للميتوكوندريا ، والمزيد4،5،6،7،8،9،10،11. عندما يتم فقدان التعصيب الودي عند التقاطع العصبي العضلي ، يلاحظ ضعف العضلات المستمر وعدم الاستقرار المشبكي على الرغم من الحفاظ على التعصيب الحركي12. وقد تبين أن هذا التنظيم الودي للانتقال المشبكي عند التقاطع العصبي العضلي ينخفض مع تقدم العمر 13,14 ، مما يساهم في ساركوبينيا ، والذي يعرف بأنه انخفاض يعتمد على العمر في كتلة العضلات والقوةوالقوة 15. من الضروري فهم أفضل لدور التعصيب الودي للأنسجة المحيطية لتطوير العلاجات التي من شأنها تحسين النتائج الوظيفية للمرضى الذين يعانون من PNIs وأشكال أخرى من الخلل الوظيفي الودي.

استئصال الودي هو أداة تجريبية قوية تسمح بالتحقيق في دور التعصيب الودي في الأنسجة المستهدفة البعيدة. على وجه التحديد ، إزالة العقد الودية على مستوى L2-L5 يزيل غالبية التعصيب الودي للأطراف السفلية ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للمحققين المهتمين بالعصب الوركي.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل إزالة الخلايا العصبية الودية بعد العقدة على مستوى L2-L5 من الفأر كجراحة للبقاء على قيد الحياة. يتطلب هذا الإجراء مهارات جراحية مجهرية للقوارض والإلمام بتشريح الفأر ، وعندما يتم إجراؤه بفعالية ، لا يسبب أي اختلافات ظاهرية مرئية. تم استخدام استئصال الودي القطني الجراحي في أبحاث القوارض ، أكثر من الفئرانفي الفئران 16،17،18،19،20،21. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول مفصل يصف البروتوكول. ركزت الدراسات السابقة التي تستخدم استئصال الودي القطني بشكل أساسي على دور التعصيب الودي في استجابة الألم ، والتي يتم تخفيفها بشكل عام عن طريق استئصال الودي في نماذج إصابة الأعصاب المختلفة. استخدمت دراسات أقل هذه التقنية في الفئران22 ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى صغر حجم المعالم التشريحية ، حيث كان يعتقد أن استخدام استئصال الودي الجراحي "غير عملي تقريبا" في الصغيرة23,24. كما تم استخدام استئصال الودي الموضعي في شكل استئصال الودي الدقيق في نماذج القوارض ، وأيضا في الغالب في سياق سلوكيات الألم25،26،27. يستخدم استئصال الودي الدقيق ، على عكس استئصال الودي القطني الكلي ، نهجا ظهريا يتم من خلاله فصل جزء من الراموس الرمادي إلى عصب نخاعي معين وإزالته ، مما يسمح باستئصال الودي المستهدف للغاية الذي سيتجنب الآثار الجانبية المنتشرة على نطاق أوسع.

نظرا لأن نماذج الفئران ضرورية للعديد من الدراسات التي تتطلب التلاعب الجيني ، فإن هذا الإجراء سيكون له تطبيقات متعددة الاستخدامات تتجاوز نطاق إصابات الأعصاب الطرفية أيضا. باستخدام نهج عبر البطن ، يمكن تصور العقد القطنية المتعاطفة بشكل موثوق واستئصالها من الماوس دون أي آثار ضارة واضحة. على الرغم من توفر بروتوكولات للتدمير الكيميائي للخلايا العصبية الودية بعد العقدة ، مثل استخدام 6-هيدروكسي دوبامين (6-OHDA) 23،24 ، فإن هذا الإجراء الجراحي يسمح باستهداف محدد تشريحيا للعقد القطنية المتعاطفة بعد العقدة. يتجنب استخدام استئصال الودي الجراحي أيضا المخاوف غير المحددة والمعتمدة على الجرعة المتعلقة بالطرق الدوائية28,29.

تم وصف استخدام استئصال الودي الكيميائي عن طريق إدارة 6-OHDA في عام 1967 كطريقة بسيطة لتحقيق تدمير انتقائي للنهايات العصبية الأدرينالية لأن عمليات استئصال الودي الجراحي في الصغيرة لم تكن مفضلة23,24. 6-OHDA هو سم عصبي كاتيكولاميني يتكون داخليا في مرضى باركنسون ، وتستمد سميته من قدرته على تكوين الجذور الحرة وتثبيط سلسلة نقل الإلكترون في الميتوكوندريا30,31. من خلال آليات نقل امتصاص النورإبينفرين -1 ، فإن 6-OHDA قادر على التراكم داخل الخلايا العصبية النورادرينالية ، مثل الخلايا العصبية الودية بعدالعقدة 28. في النهاية ، يتم تدمير الخلايا العصبية بواسطة 6-OHDA ؛ ومع ذلك ، فإن المحطات الطرفية في الجهاز العصبي المحيطي تتجدد ، مع استعادة النشاط الوظيفي حتى عندما لا تزال مستويات الأمين منخفضة. توجد أيضا عتبات جرعات مختلفة للأعضاء المختلفة استجابة ل 6-OHDA ، وقد ثبت أن الجرعات العالية من 6-OHDA تظهر تأثيرات غير محددة أكثر ، مما يوسع عواقبها السمية العصبية إلى الخلايا العصبية غير المحتوية على الكاتيكولامين وحتى الخلايا غير العصبية. بصرف النظر عن الخلايا العصبية النورادرينالية ، تتأثر الخلايا العصبية الدوبامينية ب 6-OHDA أيضا29 ، مما يجعل استئصال الودي الكيميائي في النهاية أقل تحديدا للخلايا العصبية الودية بعد العقد من استئصال الودي الجراحي.

لذلك ، يتيح استئصال الودي القطني الجراحي الاستئصال المستهدف للتعصيب الودي للأطراف السفلية ، والذي يمكن دمجه مع مجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية والتلاعب الجيني في الفأر لدراسة كيفية مساهمة الجهاز العصبي الودي في حالات الإصابة والمرض المختلفة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) بجامعة إيموري (بموجب رقم بروتوكول IACUC PROTO201700371). تم استخدام أربع إناث بالغة من الفئران البرية C57BL / 6J ، تتراوح أعمارها بين 14 أسبوعا وتزن ما بين 16-21 جم ، في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة هنا مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير قبل الجراحة

  1. الأوتوكلاف الأدوات الجراحية: 1 زوج من مقص حاد ، 2 ملاقط ذات رؤوس دقيقة ، 1 سائق إبرة.
  2. سخني وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية وضعيها تحت سطح الطاولة الجراحية.
  3. رش المنطقة الجراحية ، بما في ذلك غرفة تحريض التخدير ، بمطهر وامسحها جيدا باستخدام مناشف ورقية.
  4. تأكد من ارتداء الملابس المناسبة وغسل اليدين قبل التعامل مع الماوس.
  5. قم بإطعام الفأر بالميلوكسيكام بمعدل 5 مجم / كجم من وزن الجسم ، واترك متسعا من الوقت للفأر لابتلاع الدواء تماما لتجنب الشفط أثناء الحث.
  6. حث الفأر تحت التخدير مع 3٪ إيزوفلوران في 1 لتر / دقيقة من الأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  7. بمجرد تخدير الفأر (لا يوجد رد فعل على قرصة إصبع القدم) ، ضع الفأر على سطح الطاولة الجراحية ، مستلقا ، مع وضع أنفه في مخروط أنف مناسب.
  8. بمجرد تركيب الماوس بشكل صحيح في مخروط الأنف ، اضبط الأيزوفلوران على 2٪ للحفاظ على التخدير.
  9. ضع جل العين على عيني الفأر للوقاية من التهاب القرنية والملتحمة الجاف (جفاف العين).
  10. تأكد من تثبيت الماوس بشكل صحيح بشريط جراحي على سطح الطاولة الجراحية.
  11. راقب باستمرار لسهولة التنفس ومعدل التنفس الكافي.
  12. حلق الفراء من بطن الفأر من مستوى الأعضاء التناسلية إلى أسفل الأضلاع.
  13. بمجرد إزالة الفراء ، امسح أولا المنطقة الجراحية بحركة دائرية ، من المركزية إلى الطرفية ، باستخدام 70٪ من الإيثانول. ثم امسح المنطقة الجراحية باستخدام البيتادين بنفس الحركة الدائرية. كرر كل من خطوات الإيثانول والبيتادين ما مجموعه 3 مرات.
  14. قم بثني الفأر بستارة جراحية معقمة مع فتحة بحجم مناسب مقطوعة من المنتصف لتصور المجال الجراحي. يمكن عمل الشكل المعيني عن طريق طي الستارة إلى النصف وقطع مثلث متساوي الساقين بارتفاع ~ 10 مم وقاعدة ~ 15 مم.

2. الشقوق

  1. باستخدام مقص حاد وملاقط ذات رؤوس دقيقة ، قم بإنشاء شق خط الوسط من ~ 1 مم فوق مستوى ارتفاق العانة إلى ~ 2 مم أسفل الأضلاع.
  2. تحديد لفافة خط الوسط (linea alba) بين عضلات البطن المستقيمة الثنائية. باستخدام الملقط ، ارفع عضلات البطن بعيدا عن الأعضاء الكامنة واقطعها على طول خط ألبا لدخول تجويف البطن.
    ملاحظة: يمكن التعرف على خط ألبا عن طريق سحب عضلات البطن المستقيمة الثنائية برفق بشكل جانبي للكشف عن خط لفافة أرق يقع طوليا على طول خط الوسط32. يسمح إجراء الشق عبر خط ألبا بإغلاق العضلات بسهولة أكبر.
  3. سحب عضلات البطن والجلد مع 5-0 الغرز بشكل جانبي لتصور الخطوات التالية بشكل صحيح.

3. تحديد العقد القطنية المتعاطفة L2-L5

  1. تقع العقد القطنية الودية خلف الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي. لتصور الشريان الأورطي ، قم بإزالة الأمعاء جزئيا من تجويف البطن.
    ملاحظة: تنتقل العقد الودية على مستوى L2-L5 من مستوى تشعب الأبهر إلى الأوعية الحرقفية إلى مستوى الشريان الكلوي الأيسر21,33.
    1. ضع مربعا قطنيا معقما مشبعا بمحلول ملحي معقم على الستارة ، مستلقيا بشكل متفوق وعلى يسار الشق. بعناية ، مع 2 قضيب معقم برأس قطني ، ادفع القولون والأمعاء الدقيقة جزئيا إلى مربع القطن المنقوع بالمحلول الملحي.
      ملاحظة: تأكد من أن الأعور والزائدة الدودية خارج تجويف البطن وأنه يمكن تصور القولون النازل.
    2. قم بتغطية الأمعاء المكشوفة بمربع قطن آخر مشبع بالمحلول الملحي.
    3. مراقبة التمعج بشكل دوري طوال الجراحة ، والتي يمكن تحديدها عن طريق الحركة الإيقاعية للأمعاء.
  2. تحديد القولون النازل ، وهو جزء من الأمعاء يتحرك نحو المستقيم والشرج وقد يحتوي على مادة برازية مرئية ، وحرف هذا الهيكل إلى اليسار بملاقط مغلقة للكشف عن الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي. يرتبط هذان الوعاءان بالنسيج الضام ويجب أن يتحركا كوحدة واحدة.
    1. باستخدام زوج من الملقط ، ارفع الأوعية البطنية بواسطة النسيج الضام المحيط بها. أثناء رفع هذا ، ضع بعناية خياطة نايلون 5-0 من خلال النسيج الضام.
      تنبيه: لا تثقب الأوعية البطنية بالإبرة: سيؤدي ذلك إلى تعويض سريع للفأر والموت المحتمل.
    2. بمجرد إدخال الخيط من خلال النسيج الضام ، قم بتحويل الأوعية البطنية إلى اليسار. سيعطي هذا نافذة مثلثة ، مما يسمح بالتصور المباشر لعضلات القطنية الثنائية.
      ملاحظة: نظرا للروابط الحميمة التي تربط العقد بالأوعية البطنية ، فإن العقد الودية ، على الرغم من أنها تقع عادة في خط الوسط ، ستنحرف قليلا إلى اليسار (يمين الفأر) مع الأوعية. بمجرد انحراف الأوعية البطنية ، يجب على المرء أن يتخيل مثلثا ، حيث يتكون الجانبان على اليسار من الأوعية البطنية المنحرفة والجانب الأيمن المحدد بواسطة خط وسط الفأر (بين العضلات القطنية الثنائية). تقع العقد المتعاطفة في منتصف هذا المثلث (الشكل 1 أ). تنتقل عموديا جنبا إلى جنب وتبدو شفافة. قد تتداخل مع وعاء صغير يغوص في خط وسط الفأر ويستلقي بشكل مسطح على عضلته القطنية اليمنى. استخدم الملقط لتشريح أي لفافة علوية بصراحة للكشف عن العقد (الشكل 1 ب).
  3. تحديد الشريان الكلوي الأيسر والشريان الأيسر من الخصية أو المبيض.
    ملاحظة: هذه أوعية كبيرة ستشكل رباعي الزوايا ، تتكون جوانبها من الشريان الكلوي الأيسر بشكل أعلى ، وخط الوسط للحيوان والشريان الأورطي البطني / الوريد الأجوف السفلي بشكل جانبي ، وشريان الخصية أو المبيض الأيسر بشكل سفلي. العقد المستوية L2 كبيرة وتقع داخل هذا المربع (الشكل 1 أ). تشريح حاد بعناية لإدخال هذا رباعي الزوايا مع ملاقط وتحديد العقد L2 الثنائية (الشكل 1B).
  4. بمجرد تحديد الأجزاء السفلية والعلوية من العقد ، أمسك الجانب السفلي من العقد الثنائية المرئية بزوج من الملقط واسحب لأعلى. يمكن زيادة تصور العقد ذات الموقع السفلي ، مثل L4 و L5 ، عن طريق دفع أي أعضاء تعيق الرؤية برفق باستخدام الزوج الثاني من الملقط.
    ملاحظة: سيضمن تصور وعاء ثقب خط الوسط المذكور في الخطوة 3.2.2 استئصال الودي القطني بشكل أكثر اكتمالا. من ناحية أخرى ، قم بإمساك زوج ثان من الملقط ، اسحب اللفافة والوصلات العصبية التي تمسك العقد في البطن بعيدا بينما تسحب العقد نفسها في نفس الوقت مع أول زوج من الملقط. يجب أن يتمسك زوج واحد فقط من الملقط بالعقد ، بينما يزيل الآخر اللفافة والوصلات العصبية. مرة واحدة على مستوى الخصية اليسرى أو شريان المبيض ، قد يكون من المفيد تحديد L2 إذا كانت العقد ذات السلسلة السفلية لا تزال سليمة ، حيث ستتحرك العقد L2 عند سحبها بواسطة السلسلة السفلية. يمكن كسر العقد L3-5 في شريان الخصية أو المبيض قبل استخراج العقد L2 من رباعي الزوايا بالملاقط. العقد الوحيدة الموجودة داخل رباعي الزوايا هي العقد L2.
  5. يجب أن يكون لهذا الإجراء الحد الأدنى من فقدان الدم. في حالة حدوث نزيف ، تأكد من الإرقاء الكافي قبل الإغلاق.

4. إغلاق الجلد

  1. بعد تحقيق الإرقاء الكافي ، قم بإزالة الخيط الذي يثبت الأوعية البطنية في مكانها.
  2. باستخدام 2 قضيب معقم ذو رأس قطني ، استبدل الأمعاء المحولة بعناية في تجويف البطن.
  3. مع خياطة قابلة للامتصاص 5-0 ، قم بإجراء غرزة جري لتقريب عضلات البطن.
  4. مع خياطة 5-0 نايلون ، استخدم غرز بسيطة متقطعة لإغلاق الجلد.
  5. ضع طبقة سخية من مرهم المضادات الحيوية ، مثل نيوسبورين ، على موقع الشق.
  6. ضع الماوس في قفص نظيف على وسادة التدفئة.
  7. راقب الماوس كل 15 دقيقة حتى يستيقظ ويتنقل. يستغرق هذا عادة أقل من 30 دقيقة.

5. فحص عرق بيلوكاربين

ملاحظة: لتقييم استنفاد النشاط الوظيفي الودي بعد استئصال الودي القطني ، تم استخدام مقايسة عرق بيلوكاربين بعد 7 أيام من استئصال الودي القطني.

  1. تحضير محلول هيدروكلوريد بيلوكاربين 1٪ في 0.9٪ كلوريد الصوديوم جنبا إلى جنب مع خليط من نشا البطاطس 10٪ في زيت الخروع.
  2. باستخدام فرشاة الرسم ، قم بتغطية السطح الأخمصي للقدم بالبيتادين. اترك هذه الطبقة تجف تماما.
  3. بمجرد أن تجف طبقة البيتادين ، استخدم فرشاة رسم منفصلة لتطبيق طبقة من النشا بنسبة 10٪ في زيت الخروع.
  4. يتم تطبيق 0.25 ميكرولتر/ غ من وزن الجسم بنسبة 1٪ بيلوكاربين تحت الجلد باستخدام حقنة في الجلد المترهل على الرقبة. ابدأ المؤقت مباشرة بعد إعطاء بيلوكاربين.
  5. في 8 دقائق بعد الحقن ، التقط صورا لسطح القدم الأخمصي.
  6. باستخدام فيجي ، احسب عدد البقع الداكنة الموجودة على جميع وسادات القدم الستة (6) (الشكل 2 أ).

6. الكيمياء الهيستولوجية المناعية

ملاحظة: لتقييم تنكس المحاور الودية في الأعصاب الطرفية بعد استئصال الودي القطني ، تم حصاد الأعصاب الوركية الثنائية في اليوم 21 بعد الجراحة.

  1. تخدير الفئران (باتباع الخطوة 1 من البروتوكول) ، وحصاد الأعصاب الوركية الثنائية ، ثم القتل الرحيم للحيوان على الفور (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  2. ضع الأعصاب الوركية مباشرة في 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 M (PBS) لمدة 20 دقيقة ، ثم انقلها إلى 20٪ سكروز في 0.1 M PBS للحماية من التبريد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  3. قسم الأعصاب الوركية طوليا باستخدام cryostat عند 20 ميكرومتر ، وضع الأقسام على شرائح مشحونة.
  4. سد المقاطع العصبية بنسبة 10٪ مصل الماعز الطبيعي (NGS) في محلول ملحي مخزن بنسبة 1٪ Tween 20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بإزالة المخزن المؤقت المانع واستبدله بالأجسام المضادة الأولية أرنب هيدروكسيلاز مضاد للتيروزين ودجاج مضاد للخيوط العصبية الثقيلة المخففة في المخزن المؤقت المانع (10٪ NGS في TBST) في 1: 750 و 1: 1000 ، على التوالي. اسمح للأجسام المضادة الأولية بالاحتضان طوال الليل في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الشريحة باستخدام TBST 3 مرات ، 10 دقائق لكل غسلة ، قبل تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الماعز المضادة للأرانب 647 والماعز المضادة للدجاج 488 ، وكلاهما مخفف في الساعة 1: 200 في المخزن المؤقت للحظر. اسمح للأجسام المضادة الثانوية بالاحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل الشريحة باستخدام TBST 4 مرات ، 10 دقائق لكل غسلة ، واترك الشريحة تجف في منطقة محمية من الضوء قبل التركيب.
  8. صورة المقاطع العصبية على بعد 40 ميكرومتر على الأقل على مجهر الفلورسنت على هدف 10x.
  9. في فيجي ، قم بتصويب الأقسام العصبية وارسم ثلاثة خطوط عمودية موضوعة بشكل عشوائي تمتد على عرض القسم. احسب عدد المحاور العصبية التي تعبر كل خط رأسي واقسمه على عرض المقطع عند الخط الرأسي. كرر لكل خط من الخطوط الرأسية الثلاثة لكل قسم. متوسط القيم الثلاث التي تم الحصول عليها لكل قسم ، وكذلك متوسط قيم الأقسام الثلاثة لكل عصب.

النتائج

يصف هذا البروتوكول الاستئصال الجراحي للخلايا العصبية القطنية الودية بعد العقد من الفأر. تلقى فئران استئصال الودي القطني ، وعمل فئران كعناصر تحكم. لتحقيق استئصال جراحي ناجح للودي القطني ، يجب تحقيق تصور كاف على الأقل للعقد القطنية الودية الثنائية L2 و L3 ، كما هو موضح في الشكل 1. إزالة العقد L4 و L5 من شأنه أن يحقق التعصيب الودي الكامل للجزء السفلي من الجسم. ومع ذلك ، قد يتم إعاقة تصور العقد السفلية بواسطة الأعضاء التناسلية البولية. أظهرت دراسات تتبع التراجع السابقة أن غالبية الخلايا العصبية في العقد L2-L5 تقع في العقد L2 و L3. على الرغم من أنه تم استخدام إناث الفئران المتطابقة مع العمر فقط لتحقيق النتائج التمثيلية ، فقد تم استنساخ هذا الإجراء الجراحي عدة مرات في كل من الفئران الذكور والإناث مع عدم وجود اختلافات تشريحية كبيرة لوحظت من حيث مواقع شريان الخصية أو المبيض والعقد الودية.

عند إزالة العقد ، تنخفض استجابة التعرق استجابة للبيلوكاربين بسرعة ، مع وجود اختلافات كبيرة في اليوم 7 بعد الجراحة (الشكل 2). تم اختيار اليوم 7 بعد الجراحة بسبب الانخفاض الهائل في نشاط التعرق بوساطة ودية في غضون 7 أيام بعد إصابات العصب الوركي المختلفة في الفئران34. نظرا لأن تنكس المحور العصبي قد يستغرق ما يصل إلى 14 يوما حتى يكتمل وبسبب الصعوبة المحتملة في تصور العقد L4 و L5 أثناء الجراحة (قد تعيق المثانة والأعضاء التناسلية الرؤية) ، فقد لا يتم استئصال استجابة التعرق بالكامل35,36.

انخفضت كثافة محور هيدروكسيلاز التيروزين الإيجابي (TH +) بشكل ملحوظ بحلول اليوم 21 بعد الجراحة دون أي تغيير في كثافة سلسلة الخيوط العصبية الثقيلة (NF-H) (الشكل 3). من غير المحتمل أن يتم استنفاد محاور TH + تماما بسبب وجود محاور عصبية حسية TH + تعصب المستقبلات الميكانيكية منخفضة العتبة والصعوبات المحتملة في تصور السلسلة القطنية الوديةالكاملة 37.

التوازن الثابت في تشريح البطن; رسم تخطيطي وصورة جراحية مصنفة للكلية اليسرى والأوعية الدموية.
الشكل 1: منظر أثناء العملية للعقد القطنية الودية. (أ) تخطيطي مع المعالم المتوقعة. (ب) صورة تمثيلية أثناء العملية مع معالم موسومة. تقع العقد القطنية الودية خلف الشريان الأورطي البطني الهابط والوريد الأجوف السفلي (المنحرف). يتم سحب العقد إلى يمين الفأر مع انحراف الأوعية البطنية وتقع على العضلة القطنية اليمنى ، وتجتاز بشكل أدنى ومتفوق. يمكن تصور العقد الثنائية L2 بين الشريان الكلوي الأيسر وشريان الخصية أو المبيض الأيسر ، وترى العقد L3 بشكل أدنى من الخصية اليسرى أو شريان المبيض. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

وظيفة الغدة العرقية في الكفوف القوارض. رسم تخطيطي وصور مجهرية ورسم بياني يقارن بقع التعرق.
الشكل 2: يقلل استئصال الودي القطني الجراحي من عدد بقع التعرق على المخلب الخلفي. (أ) رسم تخطيطي لمواقع وسادة القدم على السطح الأخمصي لمخلب الفأر الخلفي. (ب) صورة تمثيلية لاستجابة التعرق بعد 8 دقائق من حقن بيلوكاربين في سليم. (ب') صورة مكبرة مع أسهم بيضاء تشير إلى عدد محدد من بقع التعرق. (ج) صورة تمثيلية لاستجابة التعرق بعد 8 دقائق من حقن بيلوكاربين في تم استئصال الودي في اليوم 7 بعد الجراحة. (ج') صورة مكبرة مع أسهم بيضاء تشير إلى عدد محدد من بقع التعرق. د: إجمالي عدد بقع التعرق على جميع وسادات القدم الستة للمخلب الخلفي في الفئران السليمة مقابل الفئران التي تم استئصال سمدياها. يتم عرض البيانات مع الخط الذي يمثل الوسيط. اختبار مان ويتني. * ص < 0.05. قضبان المقياس: 1 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تحليل كثافة المحور العصبي ، مقارنة الرسم البياني الشريطي ، التحكم مقابل مجموعات SynprX ، المجهر الفلوري.
الشكل 3: يقلل استئصال الودي القطني جراحيا (Sympx) من عدد المحاور العصبية السمبثاوي في العصب الوركي. (أ) محاور عصبية موجبة لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) لكل ميكرومتر من العصب الوركي (عرض العصب) في اليوم 21 بعد الجراحة. أقسام عصبية تمثيلية من تلطيخ TH في فأر سليم (B) ومتودي (B'). (ج) محاور عصبية موجبة لسلسلة الخيوط العصبية الثقيلة (NF-H) لكل ميكرومتر من العصب الوركي. قسم العصب التمثيلي من تلطيخ NF-H في فأر سليم (D) ومتودي (D'). تمثل الخطوط المتقطعة الأرجوانية الخطوط الرأسية المحتملة الموضوعة عشوائيا والتي تمتد عبر عرض القسم العصبي المستخدم لحساب كثافات المحور العصبي في العصب. تشير الأسهم الأرجوانية إلى عدد محدد من المحاور العصبية التي تعبر الخطوط الرأسية الموضوعة عشوائيا. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM. اختبار t غير المقترن. ** ص < 0.01. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

العقد القطنية الودية هي هياكل صغيرة جدا تقع خلف العديد من أعضاء البطن الحرجة والأوعية الكبيرة. لذلك ، يتطلب هذا الإجراء دقة ودقة كبيرة. يكمن جزء كبير من الصعوبة في تحديد العقد المتعاطفة أثناء الجراحة. يقترح أن يكون المتعلم قادرا أولا على التعرف على العقد في جثة فأر قبل محاولة هذا الإجراء في فأر حي. غالبا ما يلزم حدوث استكشاف الأخطاء وإصلاحها عند تحديد العقد الودية بعد تحويل الأمعاء. لضمان التصور الكافي ، يجب أن يكون القولون النازل مرئيا. يجب أن يشمل التحويل المعوي خارج تجويف البطن الأعور. بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون المثانة ممتلئة ومتضخمة ، مما قد يعيق رؤية القولون النازل ، وبالتالي الشريان الأورطي البطني الهابط والوريد الأجوف السفلي. من الناحية المثالية ، يتم التعبير عن المثانة يدويا بمجرد أن يكون الفأر تحت التخدير قبل إجراء شق الجلد الأولي. ومع ذلك ، إذا لم يتم التعبير عن المثانة وحجب الرؤية أثناء العملية ، فمن الممكن التعبير اللطيف مع 2 قضيب معقم برأس قطني. احرص على عدم إتلاف الحالب المرتبط بالجانب الخلفي من المثانة. بمجرد تحديد الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي خلف القولون النازل ، فإن الانحراف الكافي واستقرار الأوعية أمر بالغ الأهمية لتصور العقد الودية. اللفافة صلبة نسبيا ، وإذا تم وضع الخيط فقط من خلال طبقة اللفافة والوصلات العصبية وليس من خلال جدران الوعاء الدموي ، فيجب سحب الأوعية على الأقل 1 مم من خط الوسط. يمكن تشريح اللفافة التي تغطي العقد المتعاطفة بلطف باستخدام الملقط. في حالة كسر أي وعاء صغير أثناء العملية ، اضغط باستخدام قضيب معقم ذو رأس قطني لمدة 10 ثوان على الأقل لضمان الإرقاء الكافي قبل الإغلاق. إذا تم ثقب الأوعية البطنية الكبيرة أثناء الجراحة ، فيجب القتل الرحيم للفأر بسرعة.

على الرغم من أن هذه الطريقة تسمح بالتصور المباشر وإزالة العقد الودية ، مما يسمح باستهداف أكثر تحديدا لهذه الخلايا العصبية الودية بعد العقدة مقارنة باستئصال الودي الكيميائي23 ، إلا أن هناك بعض القيود. تؤدي هذه الجراحة إلى إزالة العقد القطنية المتعاطفة L2-L5. ومع ذلك ، نظرا للانسداد البصري الناجم عن الأعضاء التناسلية الحيوية ، فإن العقد الأدنى ، مثل العقد على مستوى L4-L5 ، يصعب تصورها وإزالتها أثناء هذا الإجراء. تقع غالبية الخلايا العصبية التي تعصب الأطراف السفلية في العقد L2 الكبيرة. العقد L5 صغيرة للغاية وتحتوي على عدد أقل من الخلايا العصبية ، كما رأينا في تجارب تتبع الفلورسنت الرجعية السابقة38. ومع ذلك ، فإن الفشل في إزالة هذه الخلايا العصبية قد يشوه تحليل النتائج من الهياكل الأكثر بعدا ، مثل القدمين. لضمان نتائج أفضل عند دراسة الأهداف البعيدة في القدمين ، سيكون من المستحسن فحص الأنسجة المستخرجة لحساب عدد العقد التي تمت إزالتها. يمكن القيام بذلك عن طريق فأر مراسل فلوري يمكن فيه بسهولة تصور الخلايا العصبية الودية بعد العقد أو عن طريق جهاز تتبع رجعي فلوري يتم حقنه في الهدف البعيد قبل الجراحة. بعض الفئران المراسل الفلورية لهذا الغرض تشمل ThCre: mTmG (انظر جدول المواد) ، والتي تحتوي على علامات متفرقة للغاية للخلايا العصبية الإيجابية لهيدروكسيلازالتيروزين 39 ، و Phox2bCre: tdTomato (انظر جدول المواد) ، والتي تحتوي على علامات معتدلة للخلايا العصبية الودية بعد العقدة40,41 ، و ThCre: tdTomato (انظر جدول المواد) ، الذي يحتوي على علامات واسعة النطاق للخلايا العصبية الودية بعدالعقد 42. هذه ليست قائمة شاملة للخطوط المتاحة.

بالإضافة إلى ذلك ، نظرا للشق الكبير المطلوب لهذا الإجراء الجراحي ، قد تحتاج الفئران إلى فترة نقاهة أطول قبل إجراء المزيد من التجارب. يجب مراقبة الفئران لمدة 3 أيام على الأقل من أجل التغوط والتبول والتغذية المناسبة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي الإرقاء غير السليم إلى نزيف داخل البطن غير معالج ، مما قد يؤدي إلى وفاة الفئران في نقاط زمنية غير متوقعة. لذلك ، فإن ضمان تحقيق الإرقاء قبل الإغلاق الجراحي أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب المستقبلية. يمكن أيضا استهداف الخلايا العصبية الودية كيميائيا ، كما هو مذكورأعلاه 24.

سيسمح استخدام استئصال الودي الجراحي بإجراء العديد من الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في دور التعصيب الودي بعد العقد في الأهداف البعيدة ، مثل دور التعصيب الودي عند التقاطع العصبيالعضلي 12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تقنيات تتبع الوراء الفلورية لتحديد إعادة التعصيب الودي للأنسجة البعيدة حيث يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخراج العقد في الكتلة من الفئران الثابتة بارافورمالدهايد38. في سياق إصابات الأعصاب الطرفية ، سيسمح هذا النموذج الجراحي "بالضربة القاضية" بتوصيف أفضل للتعافي الوظيفي الودي المتوقع في الأنسجة المعصبة سابقا.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم K01NS124912 وجزئيا من خلال منحة تنموية من مركز إيموري المتخصص للتميز البحثي في الاختلافات بين الجنسين الممول من المعاهد الوطنية للصحة U54AG062334 وبرنامج تدريب العلماء الطبيين في كلية الطب بجامعة إيموري. شكرا لديفيد كيم ، ما بعد البكالوريا ، لتقسيم الأعصاب الوركية وإلى HaoMin SiMa ، أخصائي الأبحاث ، لطباعة 3D حامل هاتف لمجهرنا الاستريو الذي سمح بتصوير الفيديو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-0 خياطة قابلة للامتصاصCP Medical421A
5-0 خياطة نايلونMed-Vet InternationalMV-661
70٪ إيثانولسيجما-ألدريتشE7023-4L
غرفة التخدير التعريفيكينت العلمية VetFloVetFlo-0530XS
مبخر التخديركينت Scientific VetFlo13-005-202
BetadineHealthyPetsBET16OZ
C57BL / 6J الفئرانمختبر جاكسون# 000664
الدجاج المضاد للخيوط العصبية الثقيلةAbcamab72996
CryostatLeicaCM1850
برنامج تحليل البياناتالمنشور
ملاقط ذات رؤوس دقيقةأدوات الدقة العالمية500233
مجهر الفلورسنتنيكونTi-E
الماعز المضاد للدجاج 488InvitrogenA32931
الماعز المضاد للأرانب 647InvitrogenA21245
وسادة التدفئةBraintree Scientific39DP
برنامج تحليل الصورفيجي
التصويرنيكونNIS-Elements
IsofluraneMed-Vet InternationalRXISO-250
MeloxicamMed-Vet InternationalRXMELOXIDYL32
سائق إبرةRoboz Surgical StoreRS-7894
مصل الماعز العاديAbcamab7481
مرهم العيونRefreshRefresh P.M.
Phox2bCre:tdTomato الفئران المتحولةمختبر جاكسون #016223, #007914
بيلوكاربين هيدروكلوريدسيجما-ألدريتشP6503
أرنب مضاد للتيروزين هيدروكسيلازAbcamab112
مقص صغير مستقيم  أدوات العلوم الدقيقة14084-09
مسحات قطنية معقمة 2 × 2Dynarex3252
أدوات تطبيق قطنية معقمة ذات رؤوسDynarex4301
ستارة معقمةMed-Vet InternationalDR4042
محلول ملحي معقمMed-Vet International1070988-BX
ThCre: mTmG< em> الفئران المتحولةموارد الفأر المتحولة ومراكز الأبحاث# 017262-UCDJackson Laboratory ، سلالة # 007576
ThCre: tdTomato < / em> الفئران المتحولةالأوروبية Mouse Mutant Archiveسلالة # 00254مختبر جاكسون ، سلالة # 007914
برنامج سلالة

المراجع

  1. Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
  2. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  3. Tian, T., Moore, A. M., Ghareeb, P. A., Boulis, N. M., Ward, P. J. A perspective on electrical stimulation and sympathetic regeneration in peripheral nerve injuries. Neurotrauma Rep. 5 (1), 172-180 (2024).
  4. Gagnon, D., Crandall, C. G. Sweating as a heat loss thermoeffector. Hand Clin Neurol. 156, 211-232 (2018).
  5. Grassi, G. Role of the sympathetic nervous system in human hypertension. J Hypertens. 16 (12), 1979-1987 (1998).
  6. Dibona, G. F. Sympathetic nervous system and the kidney in hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens. 11 (2), 197-200 (2002).
  7. Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., Vizi, E. S. The sympathetic nerve-An integrative interface between two supersystems: The brain and the immune system. Pharmacol Rev. 52 (4), 595-638 (2000).
  8. Besedovsky, H. O., Del Rey, A., Sorkin, E., Da Prada, M., Keller, H. Immunoregulation mediated by the sympathetic nervous system. Cell Immunol. 48 (2), 346-355 (1979).
  9. Straka, T., et al. Postnatal development and distribution of sympathetic innervation in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 19 (7), 1935(2018).
  10. Geng, T., et al. Pgc-1α plays a functional role in exercise-induced mitochondrial biogenesis and angiogenesis but not fiber-type transformation in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 298 (3), C572-C579 (2010).
  11. Lin, J., Handschin, C., Spiegelman, B. M. Metabolic control through the pgc-1 family of transcription coactivators. Cell Metab. 1 (6), 361-370 (2005).
  12. Khan, M. M., et al. Sympathetic innervation controls homeostasis of neuromuscular junctions in health and disease. Proc Natl Acad Sci. 113 (3), 746-750 (2016).
  13. Delbono, O., Rodrigues, A. C. Z., Bonilla, H. J., Messi, M. L. The emerging role of the sympathetic nervous system in skeletal muscle motor innervation and sarcopenia. Ageing Res Rev. 67, 101305(2021).
  14. Rodrigues, A. C. Z., et al. Heart and neural crest derivative 2-induced preservation of sympathetic neurons attenuates sarcopenia with aging. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 12 (1), 91-108 (2021).
  15. Rosenberg, I. H. Summary comments. Am J Clin Nutr. 50 (5), 1231-1233 (1989).
  16. Murata, Y., Olmarker, K., Takahashi, I., Takahashi, K., Rydevik, B. Effects of lumbar sympathectomy on pain behavioral changes caused by nucleus pulposus-induced spinal nerve damage in rats. Eur Spine J. 15, 634-640 (2006).
  17. Xie, J., Park, S. K., Chung, K., Chung, J. M. The effect of lumbar sympathectomy in the spinal nerve ligation model of neuropathic pain. J Pain. 2 (5), 270-278 (2001).
  18. Lee, D. H., Katner, J., Iyengar, S., Lodge, D. The effect of lumbar sympathectomy on increased tactile sensitivity in spinal nerve ligated rats. Neurosci Lett. 298 (2), 99-102 (2001).
  19. Ringkamp, M., et al. Lumbar sympathectomy failed to reverse mechanical allodynia-and hyperalgesia-like behavior in rats with l5 spinal nerve injury. Pain. 79 (2-3), 143-153 (1999).
  20. Zhao, C., et al. Lumbar sympathectomy attenuates cold allodynia but not mechanical allodynia and hyperalgesia in rats with spared nerve injury. J Pain. 8 (12), 931-937 (2007).
  21. Zheng, Z. -F., et al. Recovery of sympathetic nerve function after lumbar sympathectomy is slower in the hind limbs than in the torso. Neural Regen Res. 12 (7), 1177(2017).
  22. Holmberg, K., Shi, T. -J. S., Albers, K. M., Davis, B. M., Hökfelt, T. Effect of peripheral nerve lesion and lumbar sympathectomy on peptide regulation in dorsal root ganglia in the ngf-overexpressing mouse. Exp Neurol. 167 (2), 290-303 (2001).
  23. Thoenen, H., Tranzer, J. Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve endings with 6-hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 261, 271-288 (1968).
  24. Thoenen, H., Tranzer, J. P., Häusler, G. Chemical sympathectomy with 6-hydroxydopamine. New Aspects of Storage and Release Mechanisms of Catecholamines. , 130-143 (1970).
  25. Xie, W., et al. Localized sympathectomy reduces mechanical hypersensitivity by restoring normal immune homeostasis in rat models of inflammatory pain. J Neuroscience. 36 (33), 8712-8725 (2016).
  26. Zhu, X., Xie, W., Zhang, J., Strong, J. A., Zhang, J. -M. Sympathectomy decreases pain behaviors and nerve regeneration by downregulating monocyte chemokine ccl2 in dorsal root ganglia in the rat tibial nerve crush model. Pain. 163 (1), e106-e120 (2022).
  27. Tonello, R., et al. Local sympathectomy promotes anti-inflammatory responses and relief of paclitaxel-induced mechanical and cold allodynia in mice. Anesthesiology. 132 (6), 1540-1553 (2020).
  28. Kostrzewa, R. M., Jacobowitz, D. M. Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine. Pharmacol Rev. 26 (3), 199-288 (1974).
  29. Michel, P., Hefti, F. Toxicity of 6-hydroxydopamine and dopamine for dopaminergic neurons in culture. J Neuroscience Res. 26 (4), 428-435 (1990).
  30. Andrew, R., et al. The determination of hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls. Neurochemical Res. 18, 1175-1177 (1993).
  31. Glinka, Y., Gassen, M., Youdim, M. Mechanism of 6-hydroxydopamine neurotoxicity. J Neural Transm Suppl. 5, 55-66 (1997).
  32. Treuting, P. M., Dintzis, S. M., Montine, K. S. Comparative anatomy and histology: A mouse, rat, and human atlas. , Academic Press. 119(2017).
  33. Hweidi, S. A., Lee, S., Wolf, P. Effect of sympathectomy on microvascular anastomosis in the rat. Microsurgery. 6 (2), 9-96 (1985).
  34. Navarro, X., Kennedy, W. R. Sweat gland reinnervation by sudomotor regeneration after different types of lesions and graft repairs. Exp Neurol. 104 (3), 229-234 (1989).
  35. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8 (1), 1-13 (2011).
  36. Babetto, E., et al. Targeting nmnat1 to axons and synapses transforms its neuroprotective potency in vivo. J Neuroscience. 30 (40), 13291-13304 (2010).
  37. Brumovsky, P. R. Dorsal root ganglion neurons and tyrosine hydroxylase-an intriguing association with implications for sensation and pain. Pain. 157 (2), 314(2016).
  38. Tian, T., Harris, A., Owyoung, J., Sima, H., Ward, P. J. Conditioning electrical stimulation fails to enhance sympathetic axon regeneration. bioRxiv. , (2023).
  39. Tian, T., Ward, P. J. The ThCre: Mtmg mouse has sparse expression in the sympathetic nervous system. bioRxiv. , 2023(2023).
  40. Ohman-Gault, L., Huang, T., Krimm, R. The transcription factor Phox2b distinguishes between oral and non-oral sensory neurons in the geniculate ganglion. J Comparative Neurol. 525 (18), 3935-3950 (2017).
  41. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. -F. The homeobox gene phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  42. François, M., et al. Sympathetic innervation of the interscapular brown adipose tissue in mouse. Ann N Y Acad Sci. 1454 (1), 3-13 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة