مقالة منهجية

LPS و ATP الناجم عن موت البلاعم THP-1 المتمايزة PMA والتحقق من صحتها

4.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

مايو 3, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يعتمد هذا البروتوكول على الموت الناجم عن LPS و ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. نستخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل التلوين المزدوج Annexin V و 7-AAD للكشف عن موت الخلايا ، باستخدام الخلية بأكملها واستخدام المجهر الإلكتروني الماسح لمراقبة مورفولوجيا غشاء الخلية.

الملخص

موت الخلايا هو عملية أساسية في جميع الكائنات الحية. ينشئ البروتوكول عديد السكاريد الشحمي (LPS) والأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الناجم عن ترسب الدهون المتمايز فوربول -12-ميريستات -13-أسيتات (PMA) في نموذج البلاعم البشرية (THP-1) لمراقبة موت الخلايا. LPS جنبا إلى جنب مع ATP هي طريقة تحريض التهابية كلاسيكية ، وغالبا ما تستخدم لدراسة pyroptosis ، ولكن موت الخلايا المبرمج و necroptosis تستجيب أيضا للتحفيز بواسطة LPS / ATP. في ظل الظروف العادية ، يتم توطين فوسفاتيديل سيرين فقط في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، يظل غشاء الخلية سليما ويتعرض للفوسفاتيديل سيرين ، وفي المراحل اللاحقة ، يفقد غشاء الخلية سلامته. هنا ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل تلطيخ Annexin V و 7-Aminoactinomycin D (AAD) للكشف عن موت الخلايا من الخلايا بأكملها. تظهر النتائج أن الخلايا الكبيرة ماتت بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، نلاحظ الأشكال المحتملة لموت الخلايا في الخلايا الفردية. تشير النتائج إلى أن الخلايا قد تخضع لداء البروبتيس أو موت الخلايا المبرمج أو التنخر بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. يركز هذا البروتوكول على مراقبة موت الضامة بعد التحفيز باستخدام LPS / ATP. أظهرت النتائج أن موت الخلايا بعد تحفيز LPS و ATP لا يقتصر على pyroptosis وأن موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا المبرمج الناخر يمكن أن يحدث أيضا ، مما يساعد الباحثين على فهم موت الخلايا بشكل أفضل بعد تحفيز LPS و ATP واختيار طريقة تجريبية أفضل.

المقدمة

موت الخلايا هو عملية فسيولوجية أساسية في جميع الكائنات الحية. في السنوات الأخيرة ، أظهرت دراسات جوهرية أن موت الخلايا يشارك في المناعة والتوازن داخل الكائن الحي. تساعدنا دراسة موت الخلايا على فهم ظهور الأمراض وتطورها بشكل أفضل. تم وصف عدة أشكال من موت الخلايا المبرمج ، وتم تحديد بعض الأهداف الرئيسية في هذه العمليات. Pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis هي مسارات موت الخلايا الثلاثة المبرمجة المحددة وراثيا والتي تشارك في التوازن الداخلي والمرض1.

يتميز Pyroptosis بتكوين مسام الغشاء وإطلاق محتويات الخلية. تشق الكاسباز أو الجرانزيمات المنشطة gasdermins لفصل مجالاتها الطرفية N ، والتي تقوم بعد ذلك بتكوين oligomerize ، وترتبط بالغشاء ، وتشكل المسام2،3،4. توفر مسام gasdermin قناة إفراز غير نمطية عبر الأغشية الخلوية ، مما يؤدي إلى استجابات الخلايا النهائية ، بما في ذلك إطلاق المحتوى وتدفق الأيونات2،3،4. في النهاية ، تعاني الخلايا في النهاية من تمزق غشاء البلازما وتحلل الحمم البركانية الذي يسهله النينجورين -15. في موت الخلايا المبرمج ، يشكل Bax و Bak المنشطان أوليغومرات على الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ويطلقان السيتوكروم C ، الذي ينظمه التوازن بين البروتينات proapoptotic و antiapoptotic من عائلة BCL-2 ، caspases البادئ (caspase-8 ، -9 و -10) و caspases المستجيب (caspase-3 و -6 و -7) 1،6،7. تشمل التغيرات المورفولوجية لموت الخلايا المبرمج نفخ الغشاء ، وانكماش الخلايا ، والتجزئة النووية ، وتكثيف الكروماتين ، وتكوين الجسم المبرمج 6,8. إن كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع المستقبلات 1 (RIPK3) ومجال كيناز مختلط السلالة (MLKL) هما مكونان أساسيان في المصب للآلية الميتة1. يقوم RIPK3 بتجنيد وفسفرة MLKL ، و p-MLKL oligomerizes ، ويرتبط بغشاء الخلية ، ويبدأ ثقوب الغشاء ، ويسبب تدفق الأيونات ، ويزيد من الأسمولية داخل الخلايا ، وفي النهاية تمزق الخلية 6,9. يرتبط Gasdermins و MLKL بغشاء البلازما ويتوسطان pyroptosis و necroptosis ، على التوالي ، بينما يتوسط BAX / BAK موت الخلايا المبرمج عن طريق الارتباط بالغشاء الخارجي للميتوكوندريا6.

على الرغم من أن كل مسار له آليات ونتائج محددة ، إلا أنها تؤدي إلى تغييرات مماثلة على غشاء الخلية. في ظل الظروف العادية ، يتم توطين فوسفاتيديل سيرين (PS) فقط في النشرة الداخلية لغشاء البلازما. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، سيتم الكشف عن PS ، خارج غشاء البلازما. ينشط Caspase-3 / caspase-7 عائلات TMEM16 و XKR ، مما يؤدي إلى غشاء خلوي غير متماثل ويخرج PS أثناء موت الخلايا المبرمج10. يؤدي تدفق Gasdermin D بوساطة و MLKL بوساطةCa 2+ إلى فقدان تناسق طبقة الفوسفوليبيد المزدوجة على غشاء الخلية والتعرض ل PS. يحدث التعرض قبل فقدان سلامة غشاء الخلية11,12. بناء على التغييرات المماثلة في غشاء هذه الأنواع الثلاثة من موت الخلايا المبرمج ، نستخدم قياس التدفق الخلوي لتحليل التلوين المزدوج Annexin V / 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) للكشف عن موت الخلايا. يحتوي Annexin V ، وهو بروتين مرتبط بالفوسفوليبيد يعتمد على الكالسيوم ، على تقارب كبير مع PS ، والذي يمكن أن يكون بمثابة مسبار حساس للكشف عن PS المكشوف على سطح غشاء البلازما13. 7-AAD هي بقعة حمض نووي لا يمكنها المرور عبر غشاء الخلية بأكمله. إنه مشابه ليوديد البروبيديوم (PI) ، صبغة حمض نووي شائعة الاستخدام. لديهم خصائص مضان مماثلة ، ولكن 7-AAD لديه طيف انبعاث أضيق وتداخل أقل مع قنوات الكشف الأخرى. بسبب أوجه التشابه هذه ، لا يكفي التمييز بين داء البيروبتوسيس ، موت الخلايا المبرمج ، والتنخر. استخدمنا قياس التدفق الخلوي للكشف عن موت الخلايا من الخلايا الكاملة. يتم استخدام طريقة ثانية لالتقاط غشاء الخلية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لمراقبة الأشكال المحتملة لموت الخلايا في الخلايا الفردية.

أنشأنا عديد السكاريد الدهني (LPS) وأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) الناجم عن ترسب الدهون المتمايز فوربول -12-ميريستات -13-أسيتات (PMA) في نموذج البلاعم البشرية (THP-1) لمراقبة موت الخلايا. يركز هذا البروتوكول على مراقبة موت الخلايا بدلا من التحقيق في الآليات.

البروتوكول

1. خط الخلية وثقافة الخلية

  1. ينمو خط الخلايا البشرية وحيدة الخلية THP-1 في وسط زراعة كامل RPMI-1640 مع مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 0.05 مللي متر β-ميركابتوإيثانول. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 هواء مرطب. خلايا الثقافة الفرعية كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: THP-1 عبارة عن خلية تعليق ، حدد لتغيير نصف الوسط للزراعة الفرعية. عند مراقبة العديد من شظايا الخلايا تحت المجهر الضوئي ، يتم استخدام أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا الكاملة الطازجة التي تم تسخينها مسبقا.
  2. استخدم الخلايا (في المقاطع 4-10) في مرحلة النمو اللوغاريتمي لجميع التجارب. عندما تكون الخلايا في حالة جيدة ومرحلة نمو لوغاريتمية ، تكون مستديرة ومشرقة وكثيفة وبدون كتل وشظايا خلايا تحت المجهر الضوئي عند 100 x.

2. تمايز خلايا THP-1

  1. تحضير محلول مخزون من PMA بتركيز 1 mM (إذابة 1 ملغ من PMA في 1.62 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد). تمييع حل مخزون PMA مع وسط زراعة الخلايا الكامل إلى تركيز العمل النهائي من 100 نانومتر.
  2. اجمع الخلايا الموجودة في طبق الاستزراع في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 10 مل. أجهزة طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أعد تعليق الخلايا ب 3 مل من وسط الاستزراع الكامل الذي يحتوي على PMA.
  3. افتح عداد الخلية وبرنامج العد. ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى لوحة عداد الخلية وأدخلها في لوحة عداد الخلية. انقر فوق معاينة B1 ، أدر المقبض في أسفل يمين الجهاز ، واضبط المسافة البؤرية لجعل الخلايا ذات مركز ساطع مع ملامح واضحة على البرنامج. انقر فوق عد لبدء العد.
  4. بناء على نتائج العد ، استخدم وسط استزراع كامل يحتوي على PMA لضبط كثافة الخلية إلى 1 × 106 خلايا / مل. خلايا البذور في صفيحة 6 آبار ، تحتضن اللوحة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 قبل البدء في مزيد من العلاج.

3. علاج خلايا THP-1

  1. تحضير محلول مخزون من LPS بتركيز 1 مجم / مل (إذابة 1 مجم من LPS في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)). قم بتخفيف محلول مخزون LPS بوسط خال من المصل إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 1 ميكروغرام / مل. تحضير محلول مخزون من Na2ATP بتركيز 500 mM (إذابة 0.3026 جم من ATP في 1 مل من PBS).
  2. نضح الوسط المحتوي على PMA من الآبار واغسله باستخدام PBS 1x. أضف وسيطا خاليا من المصل إلى المجموعة الضابطة ووسيطا خاليا من المصل يحتوي على LPS إلى مجموعة الطرازات. احتضان اللوحة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO2 قبل الشروع في مزيد من العلاج.
  3. بعد 6 ساعات ، أضف حل مخزون ATP إلى مجموعة النماذج إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 500 نانومتر. احتضن اللوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية + 5٪ CO2 قبل المتابعة.

4. تحليل التدفق الخلوي (الطريقة 1)

  1. تحضير العينات التجريبية
    1. البذور واحتضان الخلايا في لوحات 6 آبار وفقا للخطوة 2. قم بإنشاء أربع مجموعات تحكم بدون علاج: تحكم واحد بدون تلطيخ ، وضابطان فرديان للتلوين (واحد لكل بقعة) ، وتحكم مزدوج في التلطيخ. إنشاء مجموعة علاج واحدة وعلاجها وفقا للخطوة 3.
    2. بعد العلاج ، نضح كل طاف من الآبار واغسله باستخدام PBS 2x. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين (غير EDTA) إلى كل بئر ، واحتضانها في الحاضنة لمدة 30 ثانية.
    3. أضف 1 مل من وسط الاستزراع الكامل RPMI-1640 إلى كل بئر لإيقاف انفصال الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب 5 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. أضف 1 مل من PBS لإعادة تعليق الخلايا. ضع الأنابيب التي تحتوي على خلايا في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. أجهزة الطرد المركزي جميع العينات في 300 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. تمييع 200 ميكرولتر من 5x عازلة ملزمة مع 800 ميكرولتر من الماء المقطر إلى 1x عازلة ملزمة. أضف 100 ميكرولتر من 1x عازلة ملزمة لإعادة تعليق الخلايا ونقل الخلايا إلى أنبوب 5 مل.
    6. أضف 5 ميكرولتر من محلول Annexin V-PE إلى أنبوب واحد من خلايا المجموعة الضابطة لمدة 10 دقائق و 5 ميكرولتر من محلول 7-AAD إلى أنبوب آخر من خلايا المجموعة الضابطة لمدة 5 دقائق (كضوابط تلطيخ مفردة بشكل منفصل). دوامة بلطف كل أنبوب لخلط الصبغة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. أضف 400 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق لإنهاء الحضانة.
    7. أضف 5 ميكرولتر من محلول Annexin V-PE إلى الأنابيب المتبقية واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. دوامة بلطف كل أنبوب لخلط الصبغة واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. بعد 5 دقائق ، أضف 5 ميكرولتر من محلول 7-AAD لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 400 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق لإنهاء الحضانة.
    8. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام شبكة نايلون 35 ميكرومتر تشكل جزءا من أنابيب البوليسترين ذات القاع المستدير سعة 5 مل. ضع الأنبوب على الثلج وانتظر الاختبار. اخلطه برفق قبل الاختبار ثم أدخله في الجهاز.
  2. قياس التدفق الخلوي
    1. استخدم مقياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا المنشط بالفلورة للاختبار. افتح برنامج تحليل بيانات مقياس التدفق الخلوي وتأكد من أداء الكاشف والليزر. انقر فوق Cytometer واختر بدء تشغيل Fluidics ، انتظر حتى يكون النظام جاهزا. استبعد فقاعات غرفة التدفق بالنقر فوق مقياس الخلايا > أوضاع التنظيف > خلية تدفق الغاز.
    2. انقر فوق تجربة ، وحدد بالتسلسل مجلد جديد ، تجربة ، عينة ، أنبوب وتحرير الاسم. سهم خماسي الشكل أمام الأنبوب ، يتحول إلى اللون الأخضر عندما يضيء.
    3. انقر فوق رمز Cytometer FACSCelesta (رمز مفتاح الاختصار) ، وحدد المعلمة ، ثم حدد إشارة FSC و SSC و PE . انقر فوق رمز ورقة العمل العالمية (رمز مفتاح الاختصار) لإنشاء الرسم البياني PE. بالنسبة لمقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة ، استخدم PE للملحق V عند 586 نانومتر والرسم على المحور X ؛ PerCP-Cy5.5 ل 7-AAD عند 700 نانومتر ورسم على المحور Y.
    4. أدخل عينة تحكم غير ملوثة أولا في الجهاز. انقر على أيقونة لوحة معلومات الاستحواذ (رمز مفتاح اختصار) ، واحصل على ما لا يقل عن 10000 حدث من السكان المطلوبين. استبعاد الحطام باستخدام بوابة (P1) على مخطط نقطي FSC-A وSSC-A. اضبط معدل التدفق على السرعة المتوسطة وسجل البيانات. اضبط الجهد لوضع محتوى الخلية على قطر الرسم البياني FSC / SSC وانقر فوق إعادة التشغيل. اضبط معدل التدفق على السرعة المتوسطة وسجل البيانات.
    5. انقر فوق الأنبوب التالي ، وقم بتشغيل عناصر تحكم تلطيخ مفردة للملحق V و 7-AAD لضبط التعويض. قم بتشغيل الأنابيب المتبقية وجمع البيانات.

5. تصوير SEM (الطريقة 2)

  1. تحضير العينات التجريبية
    1. قم بزرع واحتضان الخلايا في ألواح ذات 6 آبار وفقا للخطوة 2 ومعالجتها وفقا للخطوة 3.
    2. بعد العلاج ، نضح كل طاف من الآبار وغسل 2x مع برنامج تلفزيوني. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ تربسين (غير EDTA) إلى كل بئر ، واحتضانها في الحاضنة لمدة 30 ثانية.
    3. أضف 1 مل من وسط الاستزراع الكامل RPMI-1640 إلى كل بئر لإيقاف انفصال الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب 5 مل. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. ثبت الخلايا ب 500 ميكرولتر من مثبت المجهر الإلكتروني (2.5٪ ديالديهايد الجلوتاريك ، أملاح الفوسفور 100 مللي مول) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، تليها ليلة وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    5. تحضير محلول الشب الكروم: أضف 1.0 جم من الجيلاتين إلى 100 مل من الماء عالي النقاء ، وتسخين حمام مائي 70 درجة مئوية ، وحركه بالتساوي. أضف 0.05 غرام من شبة الكروم ، وحركه بالتساوي وقم بالتصفية باستخدام ورق الترشيح. اغمس الغطاء الزجاجي النظيف في محلول شبة الكروم لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية وجففه في فرن 37 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
      ملاحظة: الغرض هو منع انفصال الخلايا أثناء التجربة.
    6. جمع الخلايا من حل ثابت. أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وفجر الخلايا برفق. أسقط تعليق الخلية على زجاج الغطاء ، واتركه لمدة 5 دقائق. نضح كل طافها واغسلها 3x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: يجب إجراء العملية برفق لمنع انفصال الخلايا. لا تهتز بقوة ، تحرك ببطء ، وأضف السائل ببطء على طول الجدار.
    7. أضف 500 ميكرولتر من تثبيت حمض الأوسميك 1٪ لمدة ساعة واحدة. نضح كل طافها واغسلها 3x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    8. قم بتجفيف العينات على التوالي في سلسلة من تركيزات الإيثانول (EtOH) (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪) لمدة 15 دقيقة لكل محلول EtOH.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بأكواب الغطاء في 100٪ EtOH لعدة أيام عند 4 درجات مئوية ولكن يجب أن تجف في أسرع وقت ممكن لتجنب الجفاف المفرط.
    9. قم بتشغيل مجفف النقطة الحرجة ، وافتح خزان CO2 ، وقم بتبريد الغرفة إلى 10 °C. لف العينة بسرعة بورق الترشيح عندما يكون ضغط الغرفة 0 رطل لكل بوصة مربعة وضعها في الغرفة.
    10. افتح صمام المدخل ، ولاحظ من خلال نافذة مراقبة CO2 ، وارفع مستوى CO2 السائل بين الخطين الأحمرين (لا تتجاوز الحد الأعلى) ، وأغلق صمام المدخل. انقع العينة لمدة 10 دقائق. افتح صمامات المدخل والعادم في وقت واحد لمعادلة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 دقيقة (يحل ثاني أكسيد الكربون السائل 2 محل EtOH). أغلق صمام العادم لرفع مستوى CO2 السائل إلى الموضع المحدد ، أغلق صمام المدخل.
    11. اضبط درجة الحرارة على 35 درجة مئوية والضغط على 1250 رطل / بوصة مربعة. بمجرد استقرار درجة الحرارة والضغط ، قم بإزالة الضغط عند 100 رطل / بوصة مربعة / دقيقة. أخرج العينة عندما يكون ضغط الغرفة صفرا وأوقف تشغيل الجهاز.
    12. قم بتركيب العينات على حاملات عينات الألومنيوم SEM باستخدام شريط موصل. استخدم طبقة رش لتغطية العينات بطبقة (2-5 نانومتر) من الذهب.
  2. التصوير
    1. استخدم SEM انبعاث المجال البارد عالي الدقة للتصوير. اضبط الجهد المتسارع ل SEM على 3 كيلو فولت. اضبط مسافة العمل على 10 مم. اضبط التكبير على 1000x لمراقبة البانوراما. اضبط التكبير على 5000x و 20000x لتحديد موقع غشاء البلازما وتصوير العينة.
      ملاحظة: تشبه عملية تصور بلاعم THP-1 المتمايزة PMA عبر SEM أنواعا أخرى من الخلايا والأنسجة وتعتمد على الأدوات المستخدمة. يوفر المرجع14 بروتوكول SEM مفصلا مع مقاطع الفيديو المصاحبة.

النتائج

تمت معالجة عينات الخلايا كما هو موضح في البروتوكول وتم الكشف عن التدفق الخلوي. لا يمكن تلطيخ الخلايا الطبيعية بالملحق الخامس و 7-AAD (الملحق V- / 7-AAD-). في المراحل المبكرة من داء البروبتيس ، موت الخلايا المبرمج ، والتنخر ، تعرض PS وارتبط بالملحق الخامس ، لكن غشاء الخلية كان لا يزال سليما واستبعد 7-AAD من الفضاء خارج الخلية (Annexin V + / 7-AAD-). في المراحل اللاحقة ، يفقد غشاء الخلية سلامته ، ويتم تلطيخ الخلايا في وقت واحد بواسطة Annexin V و 7-AAD ، مما يظهر نتائج إيجابية مزدوجة (Annexin V + / 7-AAD +). كانت الخلايا الميتة ملطخة فقط ب 7-AAD (الملحق V- / 7-AAD +). يوضح الشكل 1 أنه بعد تحفيز LPS / ATP ، زادت الخلايا في منطقة Q2 بشكل ملحوظ ، مما يشير إلى موت الخلايا.

نستخدم SEM لالتقاط سطح غشاء البلازما ، مع ملاحظة خصائص الغشاء مباشرة من خلية واحدة. يوضح الشكل 2 أ خلايا التحكم ، ويوضح الشكل 2B-D الخلايا بعد تحفيز LPS / ATP. لاحظنا خلايا ذات خصائص داء البيروبتوسيس ، بما في ذلك غشاء النفخ والتمزق الغشائي (الشكل 2 ب) ، والخلايا ذات الخصائص المبرمج ، بما في ذلك فقاعة الغشاء وانكماش الخلايا (الشكل 2 ج) ، والخلايا ذات خصائص التنخر ، بما في ذلك تورم الخلايا وتمزق الغشاء (الشكل 2 د).

figure-results-1
الشكل 1: الكشف عن تلطيخ الملحق V/7-AAD المزدوج باستخدام قياس التدفق الخلوي. (أ) تلطيخ سلبي للمرفق الخامس و 7-AAD سلبي (Q4) ، تلطيخ مزدوج إيجابي للمرفق الخامس و 7-AAD سلبي (Q3) ، تلطيخ إيجابي في المرفق الخامس و 7-AAD إيجابي (Q2) ، وتلطيخ سلبي في المرفق الخامس و 7-AAD إيجابي (Q1). (ب) البيانات الكمية ل (أ). يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD (n = 3) ، اختبار t غير المزاوج ، ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مسح صور المجهر الإلكتروني لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. (أ) مجموعة التحكم، تكبير 5000x/20000x. (ب، ج، د) تظهر مجموعة LPS / ATP نفخ الغشاء ، وتمزق الغشاء (↑) ، وتورم الخلايا (↑) ، وانكماش الخلايا (↑) عند تكبير 5,000x / 20,000x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

في هذه المخطوطة ، تم استخدام طريقتين للكشف عن LPS والموت الناجم عن ATP لبلاعم THP-1 المتمايزة PMA. تم استخدام التلوين المزدوج الملحق V / 7-AAD ، وتم تحليل النتائج بواسطة قياس التدفق الخلوي من التلوين الكلي. كما هو الحال مع تحليل التدفق الخلوي الآخر ، تم إنشاء مجموعة من الخلايا غير الملوثة ومجموعتين من الخلايا أحادية اللون لاستبعاد النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة. تظهر النتائج أنه بعد تحفيز LPS / ATP ، فقدت العديد من الخلايا سلامة الغشاء ، مما يشير إلى أن موت الخلايا ربما حدث. تسمح لنا طريقة الكشف هذه بتقييم موت الخلايا من الخلايا الكاملة. تجدر الإشارة إلى أن التلوين المزدوج Annexin V / 7-AAD لا يكفي للتمييز بين pyroptosis وموت الخلايا المبرمج والتنخر. في المراحل المبكرة من هذه الأشكال الثلاثة ، سيتم الكشف عن PS خارج غشاء البلازما ، ويكون تلطيخ Annexin V إيجابيا. يتم فقدان سلامة الغشاء خلال المرحلة المتأخرة من هذه الأشكال الثلاثة ، وتظهر نتائج التلوين تلطيخا إيجابيا مزدوجا. لذلك ، استخدمنا SEM لمزيد من الملاحظة الأشكال المحتملة لموت الخلايا التي قد تحدث.

في موت الخلايا المبرمج ، يحدث تكوين مسام BAX / BAK على الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، وانكماش الخلايا اللاحق وفراء غشاء الخلية. يستخدم Necroptosis MLKL لفتح المسام في غشاء الخلية ، بينما تنشط إشارة pyroptosis gasdermin لتشكيل المسام في غشاء الخلية. تجدر الإشارة إلى أن كلا من pyroptosis و necroptosis يصاحبهما تمزق غشاء الخلية في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن مسام gasedermin أكبر بكثير من مسام MLKL ، لذلك لا تحتوي مسام gasdermin على انتقائية أيونية. تظهر الخلايا الميتة تورما كبيرا في التشكل15. تنتهي في النهاية بتمزق الغشاء. بغض النظر عن مسار الإشارات في المنبع لتنشيط نفاذية غشاء الخلية ، فإن التغيرات في غشاء الخلية تصاحب هذه الأشكال الثلاثة لموت الخلايا. استخدمنا SEM لمزيد من المراقبة لغشاء الخلية ، والذي يوفر طريقة بديهية لفحص موت الخلايا. لاحظنا خصائص pyroptosis ، بما في ذلك فقاعة الغشاء وغشاء التمزق ، و necroptosis ، بما في ذلك تورم الخلايا وغشاء التمزق ، بما يتفق مع الخصائص التي درسها الباحثون السابقون15. لاحظنا فقاعة الغشاء وانكماش الخلايا ، بما يتفق مع خصائص موت الخلايا المبرمج التي درسها الباحثون السابقون16.

في الدراسات السابقة ، غالبا ما كان يستخدم مزيج LPS و ATP للحث على الإصابة بالبيروبتوس. ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا ملامح موت الخلايا المبرمج و necroptosis. على الرغم من أن الأشكال الثلاثة قد تحدث في موت الخلايا الناجم عن LPS / ATP ، فقد أظهرت الدراسات السابقة أن داء البيروبتوسيس لا يزال هو الوضع السائد للموت. LPS هو واحد من أكثر الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض. جزيء ATP المنطلق من الخلايا الميتة، وله تركيز عال داخل الخلية. ATP خارج الخلية هو أحد الأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر17. LPS / ATP هي طريقة تحفيز كلاسيكية من خطوتين للحث على الإصابة بالبيروبتوس. أظهرت الأبحاث أن إضافة ATP إلى الخلايا المحفزة ب LPS يمكن أن تنشط بسرعة caspase-118 بينما يمكن أن يؤدي إسكات جين caspase-1 إلى عكس موت الخلايا الناجم عن LPS / ATPبشكل كبير 19. في الدراسات السابقة ، وجدنا أيضا التنشيط الناجم عن LPS / ATP للبروتينات المستهدفة موت الخلايا المبرمج والميتة20,21. على الرغم من أن LPS / ATP هو محفز كلاسيكي للبيروبتوس ، إلا أنه قد يحفز أيضا موت الخلايا المبرمج والتنخر.

في الواقع ، غالبا ما لا توجد هذه الأشكال الثلاثة بشكل مستقل ، والحديث المتبادل بين مراحل الإشارة. على سبيل المثال ، تستهدف بروتينات gasdermin الميتوكوندريا لتعزيز إطلاق السيتوكروم c لتعزيز مسار موت الخلايا المبرمج للميتوكوندريا22. يمكن أن يؤدي تنشيط caspase-3 إلى شق gasdermin E ثم تشغيل pyroptosis23. تشير دراسة إلى أن إشارات MLKL / PIPK3 تشارك في تنشيط NLRP3 inflammasomes24. أدى هذا الحديث المعقد إلى مفهوم PANoptosis ، الذي يعرف بأنه مسار موت الخلايا المبرمج الالتهابي الذي ينظمه مجمع PANoptosome مع السمات الرئيسية ل pyroptosis و / أو موت الخلايا المبرمج و / أو necroptosis التي لا يمكن تفسيرها بواسطة أي من مسارات موت الخلايا المبرمجة هذه وحدها25. كما تم اقتراح مفهوم PANoptosis ، وصف العلماء حدوث موت الخلايا المبرمج بشكل أكثر شمولا ، وهذا يسلط الضوء أيضا على تعقيد موت الخلايا المبرمج. وفي الوقت نفسه ، يشير هذا أيضا إلى قيود طريقة البحث هذه. على الرغم من أن داء البيروبتوسيس يعتبر سائدا في موت الخلايا الناجم عن LPS / ATP ، لا يمكن للمرء تحديد نسبة أشكال الموت هذه أو ما إذا كانت جميعها موجودة ، حتى مع تضمين أشكال أخرى من الموت المبرمج. يمكن أن يكون هذا مجالا للتحقيق في المستقبل.

يعتمد هذا البروتوكول على LPS وموت الضامة الناجم عن ATP. لقد وصفنا طريقة الاختبار من الكل إلى الفرد ، والتي تنطبق أيضا على النماذج والخلايا الأخرى. تشير النتائج إلى أن الخلايا ربما تكون قد خضعت لداء البيروبتوسيس أو موت الخلايا المبرمج أو التنخر ، والذي لا يقتصر على البيروبتوسيس ، مما يساعد الباحثين على فهم موت الخلايا بشكل أفضل بعد تحفيز LPS و ATP واختيار طريقة تجريبية أفضل. في الدراسات السابقة ، تم استخدام التلوين المزدوج Annexin V / 7-AAD أو Annexin V / PI بشكل شائع للإشارة إلى حدوث موت الخلايا المبرمج26,27 ، كما استخدمه بعض الباحثين لدراسة موت الخلايا المبرمج28. في الواقع ، لا يمكننا التمييز بين الأنواع الثلاثة لموت الخلايا من خلال هذه التلوين المزدوج. يذكر هذا البروتوكول الباحثين ، وخاصة المبتدئين ، بأن التلوين المزدوج Annexin V / 7-AAD أو Annexin V / PI لا يمكن أن يحدد نوع موت الخلايا. يمكن أن يظهر فقط تلف الخلايا والموت ككل أو يشير إلى أن الخلية ربما تكون قد خضعت لشكل من أشكال الموت. في الأبحاث الأكثر استهدافا ، من الضروري إدخال مجموعة مراقبة تمنع الوفيات الأخرى لإظهار أن برنامج الموت بشكل قاطع في متناول اليد. وبالمثل ، سيبحث المزيد من البحث الميكانيكي في الأهداف الحرجة لمختلف الوفيات المبرمجة.

بالإضافة إلى ذلك ، أثناء التحضير للتجربة ، وجدنا أن هناك حاليا العديد من الإجراءات التجريبية التفصيلية ل SEM للخلايا الملتصقة ، مع القليل من وصف الخلايا العالقة. هنا ، نقدم وصفا أكثر تفصيلا لطريقة تحضير العينة للخلايا العالقة. الخطوة 5.5 هي خطوة ضرورية للمساعدة في تثبيت الخلايا العالقة على شرائح الخلايا. يجب إجراء العمليات اللاحقة بلطف لمنع انفصال الخلايا. بالإضافة إلى محلول الشب الكروم ، يمكن ل poly-L-lysine أيضا شل حركة الخلايا.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نعرب عن تقديرنا الكبير لجيايي سون ولو يانغ في المعهد المبتكر للطب الصيني والصيدلة ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي ، للمساعدة في قياس التدفق الخلوي ، Cuiping Chen في مختبر الدولة الرئيسي لموارد الطب الصيني الجنوبي الغربي ، للمساعدة في المسح المجهري الإلكتروني. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [82104491] ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في سيتشوان [2023NSFSC0674] ، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه في الصين [2021M693789].

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ محلول إنزيم البنكرياس (باستثناء EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 مل أنبوب البوليسترين المستديرالقاع CORNING352235
5 مل أنبوب الطرد المركزيLabgic Technology Co.، Ltd.   ؛BS-50-M
6-well صفيحة Sorfa Life Science Research Co.، Ltd220100
Annexin V-PE / 7-AAD طقم تحليل موت الخلايا المبرمجAbsin (شنغهاي) التكنولوجيا البيولوجية co.ltdabs50007Annexin V-PE ، 7-AAD ، 5 & مرات ؛ عازلة ملزمة ، حل التحكم الإيجابي لموت الخلايا المبرمج
، حاضنة CO2< / sub> حاضنةEsco (شنغهاي) لتطوير المشاريع المحدودة.N / A
، 100 ممSorfa Life Science Research Co. ، Ltd230301
Cellometer K2 عداد الخلايا الفلوريةNexcelom Bioscience LLCمقياس السيلو K2
Cellometer SD100 غرف العدNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
آلة الطرد المركزيHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co.، LtdL530
الكروم قوانغدونغ Wengjiang الكاشف الكيميائي المحدودةنظارات غطاء PA04354
، 9 ممLabgic Technology Co., Ltd.   ؛BS-09-RC
مجفف النقطة الحرجةQuorum TechnologiesK850
ثنائي ميثيل سلفوكسيدBOSTER التكنولوجيا البيولوجية co.ltdPYG0040
المجهر الإلكتروني المثبتServicebio Technology co.ltd   ؛G11022.5٪ ثنائي الديهايد الجلوتاريك ، 100 ملي مولار أملاح الفوسفور
التوازن الإلكترونيSHIMADZUATX124
الإيثانول المطلقتشنغدو كيلونج الكيميائية المحدودة2021033102
مقياس التدفق الخلويبيكتون وديكنسون وشركاهFACSCanto figure-materials-1
برنامج تحليل قياس التدفقالخلوي Becton و Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM< / sup> برنامج
الجيلاتينقوانغدونغ Wengjiang Chemical Reagent Co.، Ltd.PA00256 
مجهر إلكتروني ماسح انبعاث المجال البارد عاليالدقة TITACHIRegulus 8100
خط الخلية البشرية أحادية الخلية THP-1Procell Life Science & التكنولوجيا المحدودةCL0233
المجهر المقلوب  Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
عديدات السكاريد الدهنية   ؛بكين سولاربيو للعلوم & شركة التكنولوجيا المحدودة L8880LPS مشتق من الإشريكية القولونية 055: B5
Na2< / sub>ATPBeijing Solarbio Science & شركة التكنولوجيا المحدودة A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate بكين سولاربيو للعلوم & شركة التكنولوجيا المحدودة P6741
ملحي مخزن بالفوسفاتServicebio Technology co.ltd G4202
ماصةEppendorf AGN / A
أطراف ماصة ، 10 & مو ؛ LServicebio Technology co.ltd T-10PL
، 1 مل & nbsp ؛Servicebio Technology co.ltd T-1250L
، 200 مو ؛ LServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 وسائط ثقافة كاملةProcell Life Science & التكنولوجيا المحدودةCM0233RPMI-1640 + 10٪ FBS + 0.05 ملي مولار &بيتا ؛ -ميركابتو إيثانول + 1٪ P / S
RPMI-1640 وسائط الثقافة   ؛شنغهاي  BasalMedia  شركة التقنيات المحدودة.K211104
غمد السوائلBECKMAN COULTER8546733
الاخرق المغطيCressington Scientific Instruments Ltd108
حمام مائي ترموستاتيGUOHUA الأجهزة الكهربائية المحدودة & nbsp ؛HH-1
طبق ثقافة الخلايا شب محلول أطراف ماصة أطراف ماصة

المراجع

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحفيز LPS ATPتمايز PMAموت الخلاياالموت الخلوي المبرمج الالتهابيالموت الخلوي المبرمجالنخر المبرمجقياس التدفق الخلويالمجهر الإلكتروني الماسحصبغ Annexin V
LPS و ATP الناجم عن موت البلاعم THP-1 المتمايزة PMA والتحقق من صحتها
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.