مقالة منهجية

تقييم الصفات التركيبية في Triticum aestivum و Zea mays ل C3 و C4 تمايز التمثيل الضوئي باستخدام مقاطع اليد الحرة وشبه الرفيعة

2.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/66843

⸱

يوليو 12, 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

يساعد تقييم الاختلافات التشريحية بين المقاطع العرضية للأوراق C3 و C4 على فهم كفاءة التمثيل الضوئي. تصف هذه الورقة تحضير وفحص المقاطع العرضية للأوراق الحرة وشبه الرقيقة ، جنبا إلى جنب مع المحاذير في التحضير لأنواع المحاصيل Triticum aestivum و Zea mays.

الملخص

تنشأ الكفاءة المعززة لعملية التمثيل الضوئي C4 ، مقارنة بآلية C3 ، من قدرتها على تركيز CO2 في خلايا غلاف الحزمة. ترتبط فعالية التمثيل الضوئي C4 وكفاءة استخدام المياه الجوهرية ارتباطا مباشرا بحصة خلايا الميزوفيل وأوراق الحزمة ، وحجم وكثافة أغلفة الحزمة ، وحجم وكثافة وسمك جدار الخلية لخلايا غلاف الحزمة. يمكن إجراء التحليل المجهري السريع لهذه السمات على أقسام اليد الحرة وشبه الرقيقة باستخدام المجهر الضوئي التقليدي ، مما يوفر معلومات قيمة حول كفاءة التمثيل الضوئي في محاصيل C4 عن طريق تحديد وفحص أنواع معينة من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض الأخطاء في إعداد المقطع الحر وشبه الرقيق التي تؤثر على القياسات التشريحية وتشخيصات نوع الخلية ، وكذلك كيفية تجنب هذه الأخطاء. يوفر هذا النهج المجهري وسيلة فعالة لجمع الأفكار حول تأقلم التمثيل الضوئي مع التباين البيئي ويساعد في الفحص السريع للمحاصيل للمناخات المستقبلية.

المقدمة

التمثيل الضوئي هو عملية أساسية حيث يتم تحويل الطاقة الضوئية إلى طاقة كيميائية ، بمثابة حجر الزاوية في الشبكات الغذائية الأرضية. تتبع معظم النباتات مسار C3 لعملية البناء الضوئي؛ حيث يكون ناتج البناء الضوئي الأساسي هو مركب الجليسرات 3-فوسفات ثلاثي الكربون. تطور التمثيل الضوئي C3 منذ أكثر من ملياري سنة في الغلاف الجوي بكثرة في CO2 ومنخفضة في O21. إنزيم التمثيل الضوئي الرئيسي ريبولوز 1,5 ثنائي فوسفات كربوكسيلاز / أكسجيناز (روبيسكو) ، الذي تطور في ظل هذه الظروف ، هو دون المستوى الأمثللظروف O 2 المنخفضة الحالية المنخفضة CO 2 حيث يتفاعل بشكل تنافسي مع O2 ، مما يؤدي إلى بدء التنفس الضوئي2. التنفس الضوئي هو مسار مهدر يستهلك الطاقة بدلا من إنتاجها وإطلاق CO2 كمنتج ثانوي. وبالتالي ، من الأهمية بمكان الحفاظ على تركيز عال من CO2 حول Rubisco في البلاستيدات الخضراء لمنع الأوكسجين 3,4. نظرا لعدم قدرة نباتات C3 على تركيز CO2 ، هناك انخفاض كبير في CO2 من الهواء المحيط إلى البلاستيدات الخضراء ، مما يحد من التمثيل الضوئي ويؤثر على نمو النبات وإنتاج الكتلة الحيوية2،5،6.

في نباتات C3 ، يكون التمثيل الضوئي محدودا بدخول CO2 من خلال الثغور ، وانتشاره عبر الميزوفيل ، والنشاط الكيميائي الحيوي لإنزيمات التمثيل الضوئي. يقتصر دخول CO2 أولا على التوصيل الثغري ، والذي يتم التحكم فيه بواسطة الظروف البيئية مثل درجة حرارة الهواء والرطوبة. ثم ينتشر CO2 عبر المرحلة الغازية والسائلة الداخلية للورقة إلى Rubisco7. في نباتات C3 ، تحدث جميع مراحل البناء الضوئي في البلاستيدات الخضراء لخلايا الميزوفيل ، وتحتاج النباتات إلى الحفاظ على تدفق مستمر ل CO2 من الغلاف الجوي إلى البلاستيدات الخضراء. إن اعتماد توافر CO2 في البلاستيدات الخضراء على انفتاح الثغور ، وبنية الميزوفيل ، وخصائص الخلايا الفردية والبلاستيدات الخضراء يترك النباتات عرضة للقيود البيئية التي تؤثر في النهاية على التمثيل الضوئي ، مثل انخفاض توافر المياه وارتفاع درجات الحرارة7،8،9،10 ، مما يسلط الضوء بشكل خاص على ضعفها أمام ظروف تغير المناخ11.

بالنظر إلى التحديات التي يفرضها عدم كفاءة مسار C3 ، بالإضافة إلى القيود المفروضة على الحفاظ على مستويات CO2 المثلى والتعرض للعوامل البيئية ، في بعض النباتات ، تطور مسار آخر ، مسار التمثيل الضوئي C4 . بشكل مميز ، تحتوي نباتات C4 على مسارين كيميائيين حيويين منفصلين مكانيا. يحدث التثبيت الأولي لثاني أكسيد الكربون2 في خلايا الميزوفيل بواسطة كربوكسيلاز الفوسفوينول بيروفات ، الذي لديه تقارب أعلى ل CO2 من روبيسكو ويفتقر أيضا إلى نشاط الأكسجين. يتم نقل منتج C4 المشكل إلى خلايا غمد الحزمة ، حيث يتم نزع الكربوكسيل منه، ويتم إطلاق ثاني أكسيد الكربون 2 مرة أخرى وتثبيته بواسطة Rubisco (التمثيل الضوئي C3 ) 12،13،14. يسمح التقارب الأكبر لكربوكسيلاز PEP ب CO2 والجدران الخلوية السميكة لخلايا غلاف الحزمة بتركيز CO2 في خلايا غلاف الحزمة ، وبالتالي ، تقلل نباتات C4 من التنفس الضوئي عن طريق الفصل المكاني لتثبيت CO2 ودورة كالفن. يعرض اعتماد مسار C4 استجابة الطبيعة التكيفية للقيود البيئية ، ويقدم رؤى حول الاستراتيجيات المحتملة لتحسين إنتاجية المحاصيل ومرونتها في الظروف المناخيةالمتغيرة 15.

يتميز التشريح المتخصص لبنية الأوراق في نباتات C4 بأوردة محاطة بخلايا مغلفة حزمة وعائية متضخمة تحتوي على بلاستيدات خضراء وبترتيب شعاعي لخلايا الميزوفيل في حلقة خارجية حول خلايا غلاف الحزمة. تقع خلايا الميزوفيل على مقربة من خلايا غلاف الحزمة ، مما يتيح النقل السريع والمستمر للمستقلبات بين نوعي الخلايا. ترتيب هذه الخلية نموذجي لنباتات C4 ويشار إليه باسم تشريح كرانز16. في الأنواع C3 ، يمكن أن يختلف تخصص خلايا الميزوفيل والتخلص منها ، لكن خلايا الغلاف الحزمي أصغر بشكل واضح وتحتوي على عدد قليل من البلاستيدات الخضراء أو لا تحتوي على بلاستيدات خضراء على الإطلاق. يسمح تشريح كرانز المحدد بتركيز CO2 في البلاستيدات الخضراء في خلايا غلاف الحزمة حيث يوجد إنزيم C 3-carboxyylating Rubisco ، مما يعيق بشكل فعال التنفس الضوئي4،17،18. على الرغم من ترتيبها المعقد على ما يبدو ، فقد حدثت هذه التغييرات بشكل مستقل عدة مرات في تطور كاسيات البذور ، مما يشير إلى أنه مسار تطوري ممكن نسبيا19،20،21 ، وقد ثبت أن الأصناف المختلفة في مرحلة متوسطة بين استقلاب الكربون C3 و C4 ، المشار إليه باسم C3-C 4 أو C2 ، امتلاك القدرة على التركيز وإعادة استيعاب CO222،23،24،25.

العديد من نباتات C4 هي محاصيل ذات أهمية اقتصادية عالية ، وكانت الهندسة الوراثية لمحاصيل C3 ، مثل الأرز ، لتحسين قدرتها على التكيف مع المناخ وتأمين المحصول موضوعا مثيرا للاهتمام في العقودالماضية 26,27. ومع ذلك ، فإن الجهود الهندسية تدعو إلى فهم مفصل للتشريح المتخصص C4 وكيف يتحكم في التمثيل الضوئي 2,28.

يعد إنشاء تشريح C4 Kranz شرطا أساسيا لتحقيق الهدف الطموح المتمثل في هندسة التمثيل الضوئي C4 إلى محاصيل C3 25. ومع ذلك ، فإن الفهم الحالي لتنظيم تشريح كرانز وطرق الفحص السريع لسماته التشريحية الرئيسية محدود ، مما يجعل من الصعب تحديد الأنواع الهجينة. أظهرت الدراسات السابقة أن السمات الرئيسية التي تنظم كفاءة التمثيل الضوئي في نباتات C3 و C4 تشمل المسافة بين الأوردة ، وقطر مجمع غلاف الحزمة ، وحجم خلايا غلاف الحزمة14,29. يمكن فحص هذه السمات بسهولة باستخدام أقسام اليد الحرة وتحليلها كميا باستخدام أقسام شبه رقيقة. هنا ، نصف طريقة تقييم السمات التي تسمح بتشخيص التمايز التشريحي C3 و C4 من خلال الفحص المجهري المتقاطع والضوئي ، أي منطقة غمد الحزمة ، والمسافة بين الأوردة ، وتردد الوريد.

البروتوكول

1. ظروف نمو النبات

  1. حدد القمح (Triticum aestivum L. Var. القمح الشتوي ، "فريديس") والذرة (Zea mays L. Var. Saccharata ، "Golden Bantam") كنباتات تمثيلية C3 و C4 ، على التوالي. قم بزراعة كلا النوعين النباتيين في غرفة نمو يتم التحكم فيها بيئيا من البذور.
  2. حافظ على الرطوبة النسبية عند 55٪ مع درجة حرارة الهواء عند 25 درجة مئوية / 18 درجة مئوية (ليلا / نهارا) مع فترة إضاءة تبلغ 12 ساعة. الحفاظ على كثافة تدفق الفوتون الضوئي (Q) على سطح النبات عند 1200 μmol / m2 / s لتمثيل ظروف نموها الطبيعية. تنمو جميع النباتات في تركيز CO2 المحيط من 400 μmol / mol.
  3. سقي النباتاتكل يوم 2 بالماء المقطر وخصب بمحلول Hoagland بعد 10 أيام من ظهور الشتلات. قم بزراعة النباتات في الظروف المحددة لمدة 60 يوما واستخدم الأوراق الموسعة بالكامل للتحليلات المجهرية.

2. إعداد وعرض الأقسام اليدوية

  1. اختر 3 أوراق ناضجة غير شيخوخة من كل نبات واحتفظ بها في الماء المقطر. باستخدام شفرة حلاقة جديدة من جانب واحد ، قم بعمل قطع تسوية واحد لتشكيل زاوية قائمة مع سطح الورقة للتأكد من أن المقاطع عبارة عن مقاطع عرضية عرضية متعامدة مع سطح الورقة.
  2. ضع عينة الورقة على طبق زجاجي على قطعة من شمع الأسنان لتثبيت العينة وتجنب الانزلاق. اقطع عن طريق تحريك الشفرة لأسفل مباشرة على عينة الورقة لقطعها بشكل نظيف عبر الخلايا. الحفاظ على المقاطع العرضية في الماء المقطر.
  3. قم بتركيب العينات على شريحة زجاجية عن طريق وضعها على قطرة ماء وتغطيتها بغطاء زجاجي للعرض والتصوير المجهري. تجنب حبس فقاعات الهواء.
  4. اعرض الشريحة تحت مجهر ضوئي مركب بتكبير 10x و 20x. احفظ الصور وفقا لدليل البرنامج ، جنبا إلى جنب مع المقياس ذي الصلة.

3. تحضير المقاطع شبه الرقيقة

  1. قطع مقاطع بحجم 3 مم × 5 مم تقريبا من المناطق الوربية جنبا إلى جنب مع الضلع الأوسط من الأوراق من كل من Z. mays و T. aestivum على طبق زجاجي كما في الخطوة 2.2. تأكد من أن طول القسم المقطوع يمتد على طول حبة الورقة.
  2. ضع المادة النباتية في حقنة مع 1 مل من محلول التثبيت (4٪ ألدهيد جلوتاريك في 0.1 متر عازلة فوسفات ، درجة الحموضة = 6.9 ، الجدول 1).
  3. امسك المحقنة عموديا ، وأزل الهواء ، وأمسك إصبعك على الحافة ، وضخ المحقنة لإنشاء فراغ. كرر حتى تقع العينات في الجزء السفلي من المحقنة ، مما يشير إلى التسلل الناجح.
  4. انقل محتويات المحقنة إلى قنينة زجاجية عليها علامة واحفظها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة قبل الخطوة التالية (الجدول 2).
  5. لكل قارورة ، قم بإزالة المثبت برفق باستخدام ماصة وأضف المخزن المؤقت للفوسفات حتى يتم تغطية العينة. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3x.
  6. قم بإزالة المخزن المؤقت للفوسفات باستخدام ماصة وأضف رابع أكسيد الأوزميوم (ALERT) حتى يتم تغطية العينة. سوف تتحول العينات والمواد العضوية الأخرى إلى اللون الأسود. استخدم قفازات مزدوجة. اترك لمدة 1 ساعة.
  7. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بالماء المقطر. اتركيه لمدة 30 دقيقة كرر هذه الخطوة 3x واستخدم قفازات مزدوجة.
  8. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول الإيثانول بالماء المقطر 50/50. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع محاليل الإيثانول بالماء المقطر في السلسلة التالية: 30/70 و 20/80 و 10/90 و 2x عند 100٪ إيثانول. يمكن ترك العينات في أي من هذه المحاليل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  9. قم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول راتنج إيثانول. ضع العينات على طبق الخلاط واتركها لمدة 2 ساعة. كرر هذه الخطوة مع محاليل راتنج الإيثانول في السلسلة التالية: 1/2 و 1/1 و 2/1 و 3/1 و 2x عند راتنج 100٪. يمكن ترك العينات في أي من هذه المحاليل طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  10. قم بتغطية تجاويف قالب التضمين المسطح (16 تجويفا ، أبعاد التجويف: 14 لترا × 4.8 عرض × 3 عمق (مم)) براتنج 100٪ وضع العينات على أحد طرفي التجويف. قم بإعداد ملصقات ورقية مكتوبة بالقلم الرصاص لكل عينة وضعها على الطرف الآخر من التجويف.
  11. املأ جميع التجاويف بالكامل براتنج 100٪ وقم بتصويب العينات والملصقات إذا تحركت. قم بتغطية القالب بغشاء التضمين والبلمرة في الفرن وفقا لإرشادات منتج راتنج الأكريليك.
  12. اضبط الكتلة المبلمرة مع العينة في حامل العينة من ultramicrotome. قم بقص الكتلة باستخدام سكين زجاجي خشن حتى يصبح النسيج مرئيا ويتم التخلص من الراتنج الزائد.
  13. قطع المقاطع شبه الرقيقة بشكل عرضي (1 ميكرومتر) باستخدام سكين زجاجي أو ماسي. اجمع المقاطع باستخدام حلقة تلقيح معدنية من سطح الماء وضعها على شريحة زجاجية. جفف الشريحة على طبق ساخن (60 درجة مئوية) لتثبيت الأقسام على الزجاج.
  14. قم بتلطيخ الأجزاء الثابتة باللون الأزرق التولويدين (محلول مائي 1٪) لمدة 5 ثوان قبل شطفها بالماء المقطر وتجفيفها مرة أخرى على اللوح الساخن.
    ملاحظة: تأكد من إجراء عملية التثبيت الكيميائي تحت غطاء الدخان. يجب استبدال السكاكين الزجاجية بشكل دوري لضمان الجروح الحادة التي تسمح بأقسام بدون تمزق أو تشوهات.

4. تصوير العينات

  1. تصوير مقاطع الأوراق الطازجة
    1. قم بإعداد المجهر الضوئي المركب مع البرنامج المصاحب وفقا للدليل.
    2. ضع الشريحة الزجاجية على المسرح. اضبط العدسة واعرض القسم بمعدل 10 أضعاف للحصول على نظرة عامة ، ثم عند أهداف 20x و 40x.
    3. في كل هدف ، انتقل إلى القناة المباشرة ، وركز على منطقة الاهتمام ، وحدد موقع خلايا غلاف الحزمة حول الوريد.
    4. بمجرد التركيز ، انقر فوق تجميد زر وإضافة المقياس بالضغط على شريط المقياس زر في أدوات التبويب. احفظ الصورة في . تنسيق TIF لتحليل الصور.
  2. تصوير المقاطع المخترقة بالراتنج
    1. قم بإعداد المجهر الضوئي الآلي فيما يتعلق بالبرنامج المصاحب على الكمبيوتر.
    2. قم بتحميل القناة الشفافة ووضع الشريحة على مرحلة المجهر. ركز على القسم باستخدام تكبير موضوعي 40x واضبط السطوع لضمان رؤية جميع هياكل الخلايا.
    3. اضبط منطقة موقع القسم باستخدام وظيفة المتصفح للتأكد من تصوير القسم بأكمله وانقر فوق الزر غرزة .
    4. انقر فوق تم ثم ابدأ للسماح للمجهر بتصوير القسم بأكمله. افتح برنامج تحليل الصور وافتح البلاط الذي تم التقاطه بواسطة المجهر.
    5. باستخدام ميزة Align ، تأكد من عدم تداخل البلاطات. بعد إنشاء الصورة ، اضبط الموضع والسطوع والتدوير باستخدام علامة التبويب ضبط.
    6. اطبع المقياس على الصورة قبل الحفظ في . تنسيق TIF.
  3. القياسات التشريحية باستخدام برنامج ImageJ
    1. افتح برنامج ImageJ وقم بتحميل الصورة عن طريق سحبها إلى النافذة.
    2. باستخدام أداة الخط، قم بمعايرة المقياس كما يلي: ارسم خطا فوق شريط المقياس، اختر تحليل > ضبط المقياس، قم بتغيير المسافة المعروفة إلى طول شريط المقياس، وقم بتغيير وحدة الطول إلى الوحدة الصحيحة.
    3. قم بقياس السمة المحتملة عن طريق تحديد أداة الخط ، ورسم خط عبر منطقة الاهتمام ، والضغط على المفتاح M .
    4. لقياسات المساحة، حدد أداة تحديد المضلع وارسم حول النسيج محل الاهتمام. اختتم بالضغط على المفتاح M . تظهر القياسات كنافذة منبثقة ، والتي يمكن نسخها إلى جدول بيانات لمزيد من تحليل البيانات.

النتائج

يوضح الشكل 1 أ الاتجاه الصحيح لتقسيم الورقة لكل من التقسيم الطازج والفحص المجهري الضوئي. يمكن رؤية طريقة قطع المقاطع الطازجة باستخدام ماكينة حلاقة أحادية الجانب وصفيحة شمع الأسنان في الشكل 1 ب. الأقسام الناتجة موضحة في الشكل 1C.

يوضح الشكل 2 المقاطع الحرة للأوراق التمثيلية للنبات C3 T. aestivum والنبات C 4 Z. mays. تظهر خلايا غلاف الحزمة حول الوريد ، حيث تحتوي الذرة على خلايا أكثر استدارة وخضرة ، مما يشير إلى وجود أعلى للبلاستيدات الخضراء. من الممكن الحصول على سمك الورقة ومساحة غمد الحزمة الإجمالية من هذه الصور ؛ ومع ذلك ، لا يمكن إجراء مزيد من التوصيف للميزوفيل بهذه الطريقة.

يوضح الشكل 3 مقاطع عرضية شبه رفيعة من T. aestivum و Z. mays. مع هذه الطريقة ، تكون جميع أنسجة الورقة مرئية وقابلة للقياس. يتضح تشريح كرانز في Z. mays ، مع خلايا mesophyll مرتبة حول الأوردة. يتم توسيع أغلفة الحزمة وملؤها بالبلاستيدات الخضراء ، وتتركز بشكل خاص نحو خلايا الميزوفيل. هذا يسمح بالتبادل السريع للمستقلبات بين خلايا غمد الحزمة وخلايا الميزوفيل. من هذه الصور ، تم قياس السمات التركيبية للأوراق التالية: المسافة بين الأوردة بين الأوردة الصغيرة والكبيرة ، وقطر غمد الحزمة ، ومنطقة غمد الحزمة الكلية ، ومنطقة الأوردة ، وجزء من مساحة خلايا غمد الحزمة ، ومنطقة خلايا غمد الحزمة ، وتردد الوريد في حدود 500 ميكرومتر ، وسمك الورقة. توضح المخططات الصندوقية في الشكل 4 الفرق في هذه الصفات بين T. aestivum و Z. mays. تختلف جميع السمات باستثناء سمة واحدة ، وهي المسافة بين الأوردة بين الأوردة الكبيرة ، اختلافا كبيرا عند فاصل ثقة 95٪ مع قيمة p < 0.05.

يوضح الشكل 4 مجموعة من المخططات الصندوقية التي تمثل اختلافات السمات التشريحية بين T. aestivum و Z. mays ، مما يوضح الاختلافات بين هياكل غلاف الحزمة C3 و C4. هناك تمييز كبير بين المسافات بين الأوردة بين أنواع المحاصيل ، وقطر غمد الحزمة (في ظل نفس ظروف النمو) ، وجزء خلايا غمد الحزمة والمواد غير الضوئية (أي الأوردة) ، وتردد الوريد في عرض مقطع 500 ميكرومتر - وكلها تدل بقوة على ما هو متوقع بين تشريح الأوراق C3 و C4.

يوضح الشكل 5 بعض الأمثلة على الأخطاء التي من المحتمل أن تحدث عند قطع العينات أو تحضيرها. تشريح الأوراق في هذه الصور مقنع أو مشوه وبالتالي لا يمكن الاعتماد عليه للتوصيف. يمكن أن يحدث تلطيخ مفرط مع التولويدين الأزرق في أقسام مقطوعة مع ultramicrotome التي تترك فيها البقعة لفترة طويلة جدا ، وبالتالي تحجب بنية الخلية (الشكل 5A ، B). يمكن أن تحدث أخطاء شائعة أثناء بروتوكول التسلل حيث لا يخترق الراتنج أنسجة الأوراق بالكامل (الشكل 5C ، D). تؤدي المقاطع العرضية للأوراق التي يتم قطعها على طول الحبوب إلى خلايا مستطيلة لا يمكن فيها تحديد موقع خلايا الميزوفيل وغمد الحزمة أو قياسها بشكل صحيح (الشكل 5F ، G ، H).

أجريت التحليلات الإحصائية في R (الإصدار 4.3.1) لإنشاء boxplots. تم قياس الصفات التشريحية للأوراق في ثلاث نسخ (3 أوراق لكل نبات ، 3 نباتات لكل نوع).

إعداد كروماتوغرافيا قسم الأوراق ؛ استخراج الصباغ الأخضر. رسم تخطيطي لخطوات فصل الصباغ.
الشكل 1: الطريقة الصحيحة لقطع المقاطع العرضية للأوراق الطازجة. أ: اتجاه مقاطع الأوراق للحصول على مقطع عرضي. (ب) تقنية لتقسيم الأوراق باستخدام شفرة حلاقة أحادية الجانب على قطعة من شمع الأسنان المسطح. (ج) تظهر المقاطع العرضية الناتجة على شكل شظايا أوراق رقيقة جاهزة للتركيب على شريحة زجاجية وعرضها تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفحص المجهري للمقطع العرضي لبنية أوراق النبات ، مقاييس 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر ، تفاصيل أنسجة الأوعية الدموية.
الشكل 2: المقاطع الحرة للأوراق التمثيلية. (أ) نبات C3 Triticum aestivum (تكبير 400x)؛ و (ب) نبات C4 Zea mays عند (تكبير 200x). يشار إلى نوع الخلية بالأسهم ، حيث V = الوريد ، BSC = خلية غمد الحزمة ، و MC = خلية الميزوفيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخطط تشريح النبات يوضح المقطع العرضي لحزمة الأوعية الدموية مع ملصقات للأنسجة والهياكل.
الشكل 3: مقاطع عرضية شبه رفيعة. (أ) Zea mays و (B) Triticum aestivum لإظهار الاختلافات في أغلفة الحزمة ومواضع البلاستيدات الخضراء في الأنواع C4 مع تشريح كرانز (A) و C3 بدون تشريح كرانز (B). الاختصارات: Tl = سمك الورقة ، BS = غمد الحزمة ، SV = الوريد الصغير ، ID = المسافة بين الأوردة ، و LV = الوريد الكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مخططات صندوقية تقارن T. aestivum و Z. mays باستخدام اختبار T. تتضمن المقاييس SY-HD و LV-ID و VBA.
الشكل 4: مخططات صندوقية توضح الفرق في الصفات التشريحية بين Triticum aestivum و Zea mays. (أ) المسافة بين الأوردة بين الأوردة الصغيرة ، (ب) المسافة بين الأوردة بين الأوردة الكبيرة ، (ج) قطر غلاف الحزمة ، (د) مساحة غمد الحزمة الكلية ، (ه) منطقة الأوردة ، (و) جزء من مساحة خلايا غمد الحزمة ، (ز) مساحة خلايا غمد الحزمة ، (H) تردد الوريد في حدود 500 ميكرومتر و (I) سمك الورقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

صور مجهرية للمقاطع العرضية للأنسجة النباتية ، مع تسليط الضوء على التركيب الخلوي والتشريح.
الشكل 5: أمثلة على الأخطاء الشائعة التي قد تحدث في معالجة الأنسجة، ويشار إليها بالأسهم الحمراء. تلطيخ مفرط في العينات المضمنة في راتنج الأكريليك الأبيض LR (A) Triticum aestivum و (B) Zea mays ؛ الدموع في الراتنج في أقسام جزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي Spurr (C) Ceratozamia robusta و (D) Dioon mejiae ؛ T. aestivum مقاطع اليد الحرة تظهر (E) المقطع العرضي و (F) المقطع الطولي ؛ التحيز في التقسيم بسبب التخفيضات المائلة في (G) Annona muricata و (H) Encephalartos villosus. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حلاعدادالحجم النهائي
قاعدة للمخزن المؤقت 1حل 7.12 غرام من Na2HPO4 . 2H2O في 200 مل من الماء المقطر200 مل
قاعدة للمخزن المؤقت 2حل 7.12 غرام من NaH2PO4 . 2H2O في 200 مل من الماء المقطر200 مل
محلول عازلة للفوسفاتامزج 36 مل من القاعدة 1 و 14 مل من القاعدة 2 و 50 مل من الماء المقطر100 مل
الحل المثبتامزج 9.25 مل من 5٪ جلوتارالدهيد (تحذير: انظر جدول المواد) ، 12.5 مل من محلول الفوسفات و 28.25 مل من الماء المقطر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.50 مل

الجدول 1: وصفة للحل المثبت.

درجوصفمدةكرر
1الشطف مع العازلةقم بإزالة المثبت برفق باستخدام ماصة وأضف المخزن المؤقت للفوسفات حتى يتم تغطية العينة. اتركيه لمدة 30 دقيقة.30 دقيقة3x
2تلطيخ مع 1 ٪ رابع أكسيد الأوزميوم(تنبيه: انظر جدول المواد): قم بإزالة المخزن المؤقت للفوسفات باستخدام ماصة وأضف رابع أكسيد الأوزميوم حتى يتم تغطية العينة. سوف تتحول العينات والمواد العضوية الأخرى إلى اللون الأسود. استخدم قفازات مزدوجة.60 دقيقة1
3شطف العينات بالماء المقطرقم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بالماء المقطر. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة 3x. استخدم قفازات مزدوجة.30 دقيقة3 مرات
4تسلل سلسلة الإيثانولقم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول الإيثانول بالماء المقطر 50/50. اتركيه لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع محاليل الإيثانول بالماء المقطر في السلسلة التالية: 30/70 و 20/80 و 10/90 و 100٪ إيثانول.30 دقيقة1
5تسلل سلسلة الراتنج والإيثانولقم بإزالة المحلول السابق باستخدام ماصة وقم بتغطية العينات بمحلول راتنج إيثانول. ضع العينات على طبق الخلاط واتركها لمدة 2 ساعة. كرر هذه الخطوة مع محاليل الراتنج والإيثانول في السلسلة التالية: 1/2 ، 1/1 ، 2/1 ، 3/1 ، وراتنج 100٪.120 دقيقة1
6يحفظ في الثلاجة لمدة 72 ساعة قبل البلمرة
7بلمرة أقسام الأوراق المتسللة وفقا لمواصفات المنتج للحصول على عينات مدمجة بالراتنج.

الجدول 2: بروتوكول تسلل الراتنج.

المناقشة

في هذه المقالة ، نناقش كلا من الطرق الكمية والنوعية لقياس تشريح الأوراق والطرق التي يمكن من خلالها تحسينها. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق المنهجية على أنواع المحاصيل التمثيلية لتحديد السمات التشريحية الأكثر فائدة في التمييز بين المقاطع العرضية C3 و C4 . يعد فهم هذه السمات أمرا ضروريا لأن الأنواع الهجينة ، التي يطلق عليها التمثيل الضوئي C2 ، أصبحت وسيلة واعدة أكثر للبحث. اعتبارا من الآن ، تم تحديد نوع محصول واحد فقط ، Diplotaxis tenuifolia (جرجير) ، لاستخدام التمثيل الضوئي C2 ، ولكن من المحتمل أن يكون هناك أكثر مما تشير إليه السجلات الحالية25. توجد مستويات عالية من التنوع الضوئي واللدونة داخل سلالات C2 . هذا يعني أن تأكيد حدوث التمثيل الضوئي C2 يتطلب خطوطا متعددة من الأدلة ، مثل نقطة تعويض CO2 ، والتحليلات الهيكلية ، والكيمياء المناعية30.

تم استخدام المقاطع اليدوية وشبه الرقيقة في تحديد وقياس أنسجة نباتية معينة لسنوات عديدة ، ولكن تهدف هذه المقالة إلى مناقشة حالة الاستخدام الخاصة لهياكل الأوراق التشريحية التي تؤثر على تمايز التمثيل الضوئي بين نباتات المحاصيل C3 و C4 . هناك محاذير لكل من التقسيم الحر وشبه الرقيق الذي يجب مراعاته. ومن المرجح أن تؤدي المقاطع الحرة، على الرغم من سرعة الحصول عليها، إلى مقاطع أوراق ذات سمك غير متسق، مما يعيق التحليلات الكمية. يمكن تجنب ذلك باستخدام معدات متخصصة لتقسيم المواد النباتية الطازجة (على سبيل المثال ، الاهتزاز أو التبريد). يمكن أن تؤدي الأجزاء الأكثر سمكا من التقطيع اليدوي إلى طبقات متعددة من الخلايا فوق بعضها البعض ، مما يؤدي إلى تشويش الخلايا ، وبالتالي التشريح. إذا كان الغرض من التقسيم نوعيا بحتا ، فإن المقاطع اليدوية توفر ميزة المعالجة الكيميائية للأنسجة النباتية (أي الكيمياء النسيجية)31. هذا يسمح للإشارة النوعية لوجود مركبات معينة في الخلايا النباتية. على العكس من ذلك ، تؤدي المقاطع شبه الرفيعة دائما إلى أقسام سميكة باستمرار. ومع ذلك ، فإن العمليات أطول وحساسة وبالتالي عرضة للخطأ. تتم مناقشة القضايا التي قد تنشأ ، وكذلك طرق تجنبها.

تحديد
يجب استخدام المواد الطازجة لكل من المقاطع اليدوية وشبه الرقيقة ، أي أوراق النباتات التي يتم ترطيبها بدرجة كافية. لا تتمتع المقاطع من الأوراق الذابلة بسلامة تركيبية لأن الخلايا لديها ضغط انتفاخي منخفض. عند الحصول على مقاطع شبه رقيقة من مادة مدمجة بالراتنج ، من الأهمية بمكان التأكد من تثبيت أقسام الأوراق تحت فراغ لتحل محل الهواء داخل الورقة. هذا يسمح بالسلامة الهيكلية والتناضح أثناء عملية التسلل. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح ، فمن المحتمل أن تنهار الخلايا ، مما يؤدي إلى مقاطع عرضية لا تصور بدقة بنية الورقة الحقيقية وبالتالي قياسات تشريحية غير صحيحة32.

على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي ضغط الفراغ العالي إلى إتلاف الأوراق ذات الأنسجة الرخوة (مثل النبتات) ، مما يؤدي إلى تقلص الخلايا أو تدمير العينات. يمكن تجنب ذلك باستخدام إعداد مضخة تفريغ مناسب أو عن طريق تخطيه تماما ونقع العينات في المحلول المثبت. إذا كان هذا الأخير مفضلا ، يمكن قطع العينات من جميع الجوانب ، وذلك لتسهيل تسلل المثبت إلى الأنسجة.

ما قبل التسلل
سمك جدار الخلية والأنسجة الصلبة هي السمات التشريحية الأكثر تأثيرا في تغلغل الحلول التي تسمح بالتثبيت الأمثل وتسلل العينة. الغرض من sclereids في الأنسجة النباتية هو الدعم والحماية الميكانيكية ، والتي يمكن أن تؤثر على عملية التسلل33. نظرا لأن هذه الأنسجة لها جدران خلوية سميكة للغاية ، يمكن إعاقة تغلغل المحاليل. تؤدي العينات التي تعاني من مشاكل التسلل إلى أقسام شبه رقيقة بها خلايا مكسورة وتمزقات في الراتنج (الشكل 5C ، D). ينتج عن التقسيم الطولي خلايا مشوهة ، مما يتسبب في تحيزات في التحليلات التشريحية وقياس سمات الأوراق مثل حجم الخلية وكثافة الخلية (الشكل 5F-H).

تسلل الراتنج
يعد تقسيم الجودة أمرا حيويا لمراقبة الأنسجة التشريحية ، والتي تتأثر بشكل مباشر بالوسط الذي يتم فيه تضمين العينة. وسائط التضمين الأكثر شيوعا المستخدمة في الأنسجة النباتية هي شمع البارافين والإيبوكسي وراتنجات الأكريليك34,35. يتطلب تضمين الشمع تحضير العينات عن طريق التثبيت الكيميائي ، والتسلل بالشمع السائل ، والتي يتم تقويتها في درجة حرارة الغرفة. ينتج عن هذه القطع عادة أقسام يتراوح سمكها بين 5 و 10 ميكرومتر ، والتي ، كما هو موضح هنا ، يمكن تحقيقها يدويا (الشكل 2) وتتطلب فقط أنسجة طازجة غير ثابتة. في هذه الحالة ، يعد ترتيب الخلايا حول غلاف الحزمة أمرا حيويا للتمييز بين نباتات C3 و C4 ، الأمر الذي يتطلب استخدام وسائط تضمين أكثر قوة وصلابة. تم اختبار راتنجات الايبوكسي (راتنج Spurr36) وراتنج الأكريليك (LR White) من حيث الصلابة وطول العمر وتسلل العينات بالإضافة إلى متانة التقسيم في هذه الدراسة. تم استخدام راتنجات الايبوكسي في تضمين المواد البيولوجية لعقود37. راتنجات الأكريليك جديدة نسبيا وتم أخذها في الاعتبار في البداية لتضمين عينات نباتية نظرا لمرونتها بمرور الوقت لأنها ، على عكس راتنجات الإيبوكسي ، لا يتغير لونها نتيجة التعرض للأشعة فوق البنفسجية وأقل عرضة للانكماش38. تم اختيار راتنج الأكريليك الأبيض LR (الدرجة الصلبة) لتركيبته غير السمية والمستقرة للأشعة فوق البنفسجية. تميل راتنجات الأكريليك إلى أن تكون أقل لزوجة بكثير من راتنجات الإيبوكسي ، مما يسمح بتسلل أسرع للعينة ، وتسمح صلابة المادة بقطع أنظف باستخدام ميكروتوم39. يوضح الشكل 5C ، D نتائج راتنجات الايبوكسي في عينات الأوراق التي تحتوي على كمية كبيرة من الأنسجة الهيكلية ، حيث تكون التمزقات حتمية بسبب نعومة راتنجات الايبوكسي ، مقارنة براتنجات الأكريليك (الشكل 3).

بضع الميكروبات
قد يؤدي التخلص من الراتنج الزائد إلى حدوث تشققات في الراتنج تخترق العينة. لتجنب ذلك ، من الضروري مراعاة كثافة وهشاشة الراتنج المختار للتضمين. يجب أن يتجنب القطع الأعمق في القسم أي قطع أثرية ناتجة عن التشذيب اليدوي أو السكين الخشن. يجب محاذاة العينة بشكل عمودي على حامل العينة والتحقق من صحتها عن طريق زيادة التكبير من خلال العدسة ، وكذلك عرض مقطع ثابت وملطخ. تظهر الخلايا النباتية غير المقطوعة بزاوية قائمة تماما كخلايا مدببة حيث يكون أحد طرفيها أكبر منالطرف الآخر 40.

بعد تلطيخ
تم استخدام التولويدين الأزرق (1 ٪ في محلول مائي) لتلطيخ المقاطع شبه الرقيقة المقطوعة على microtome الفائق. إذا تركت البقعة لتجف على القسم لفترة طويلة جدا ، فإنها تؤدي إلى تلطيخ مفرط ، مما يتسبب في تشبع القسم عند تصويره (الشكل 5 أ). عندما لا يتم ترشيح البقعة جيدا ، فإنها تؤدي إلى تجفيف جزيئات غير مذابة على القسم ، مما يعيق تصور الهياكل التشريحية (الشكل 5 ب). يمكن تجنب هذه المشكلة باستخدام مرشح دقيق عند صنع محلول التولويدين الأزرق وكذلك الحد من تعرض القسم للبقعة. يتم تجفيف العينات على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية قبل تلطيخها للتأكد من أن القسم يلتصق بشريحة المجهر الزجاجي ، ولكن يجب عدم تعريضه لأكثر من 10 ثوان إلى التولويدين الأزرق قبل شطفه وتجفيفه مرة أخرى41.

اعتبارات بشأن القياسات التشريحية
القياسات الموضحة في هذه الورقة هي مجرد مثال على العديد من الصفات التشريحية التي يمكن تقييمها كميا باستخدام أقسام شبه رقيقة ، بما في ذلك جزء من الفضاء الجوي بين الخلايا ، ومتوسط سمك الميزوفيل (بدون أنسجة الأوعية الدموية) ، ومساحة سطح الميزوفيل المعرضة للمساحات الهوائية بين الخلايا لكل وحدة من مساحة الورقة42. ومع ذلك ، في حين أن حجم خلية غلاف الحزمة هو مؤشر مهم للتمييز بين التمثيل الغذائي C3 و C4 ، فإن سمك جدار خلية غمد الحزمة هو سمة مهمة أخرى لا يمكن رؤيتها بناء على الفحص المجهري الضوئي وحده ، لأنه يحدد درجة تسرب خلايا غلاف الحزمة ، أي كمية CO2 المنتشرة مرة أخرى في خلايا الميزوفيل42 ، 43. يقلل التسرب العالي من كفاءة التمثيل الضوئي ، حيث يتم فقد جزء كبير من الطاقة المستخدمة لتثبيت ثاني أكسيد الكربون2 بواسطة كربوكسيلاز PEP44،45،46. لمثل هذه التحليلات الهيكلية الفائقة ، يلزم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني النافذ وتحليل الصور. على الرغم من أنه تم النظر في الفحص المجهري الضوئي فقط للدراسة الحالية ، إلا أن البروتوكول يتضمن العلاج باستخدام رابع أكسيد الأوزميوم ، وهو عامل تباين وتثبيت يعد حجر الزاوية في الفحص المجهري TEM. وبالتالي لا يزال من الممكن استخدام العينات المبلمرة لتحليل TEM كلما دعت الحاجة ، حتى لو لم يتم أخذها في الاعتبار في وقت التحضير.

على الرغم من أن التشخيص التشريحي يمكن أن يكتشف بسهولة الهياكل الشبيهة ب Kranz ، إلا أنه يمكن تشخيص وجود C4 بشكل أكبر عن طريق قياسات تبادل الغازات التي يمكن أن تظهر فسيولوجيا C4 النموذجية ، أي نقطة تعويض CO2 المنخفضة ، وتثبيط O2 المحدود لعملية التمثيل الضوئي وتكوين نظائر الكربون المختلفة2،4،47.

وتجدر الإشارة أيضا إلى أن تشريح كرانز ليس ضروريا لتطور التمثيل الضوئي C4 ، كما يتضح من اكتشاف نباتات C4 أحادية الخلية48،49،50. لذلك ، قد لا يكون التحليل التشريحي وحده كافيا للكشف عن فسيولوجيا C4 في الأصناف الأقل دراسة. يوفر اقتران التوصيف التشريحي بالتحليل الفسيولوجي أدوات قوية للتحقيق في سمات الأوراق وعلاقتها بوظيفة الهيكل في كل من المحاصيل والنباتات البرية.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون ببرنامج الاتحاد الأوروبي لمبادرة أفق 2020 (المشروع GAIN4CROPS ، الجمعية العامة رقم 862087). يتم تمويل مركز التميز AgroCropFuture AgroECOLOGY والمحاصيل الجديدة في المناخات المستقبلية من قبل وزارة التعليم والبحث ، إستونيا. نود أن نشكر البروفيسور إيفلين لويت هارو على توفير بذور T. aestivum و Z. mays ، وبولا بالميت وفايكو فاينولا لمساعدتهم في إعداد المقاطع العرضية للأوراق ، وجواو باولو دي سيلفا سوزا للمساعدة في التحليل. تم الحصول على جميع الصور من وحدة الفحص المجهري التابعة للجامعة الإستونية لعلوم الحياة في إطار مشاريع مختلفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثنائي هيدرات فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na 2< / sub>HPO4< / sub>2H 2< / sub>O)PENTA النقي ، تشيكوسلوفاكيا10028-24-7
فيلم تضمين ، 7.8 مل سميك ، 8 × 12.5 ، (203 × 318 مم)AKLAR ، الولايات المتحدة10501-10
إيثانول ، ABS. 100٪ a.r.Chem-Lab NV ، BECL00.0505.1000خطر: سائل وبخار شديد الاشتعال.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 نظام التصويرThermo Fisher Scientific ، قالب PTFE مدمج مسطح أمريكي
بإطار معدني ، 16 تجاويفPELCO ، الولايات المتحدة10501
قارورة زجاجية 2 ملVWR Life Science ، الولايات المتحدة548-0045
محلول الجلوتارالديهايد 50٪VWR علوم الحياة ، الولايات المتحدة23H2856331خطر: قاتل إذا تم استنشاقه. سام إذا ابتلع. يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين. قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. ارتد قفازات واقية وملابس واقية وحماية للعينين والوجه.
سكين الماس HistoDiatome ، US
LEICA EM UC7Leica Vienna ، AT
LR الراتنج الأبيض الصفالصلب علوم المجهر الإلكتروني ، الولايات المتحدة14383خطر: يسبب تهيج الجلد. يسبب تهيجا شديدا للعين قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي. قد يسبب النعاس أو الدوخة ارتد قفازات واقية وملابس واقية وواقية للعينين والوجه.
شرائح المجهرNormax ، PT5470308A
نيكون Eclipse E600 ونيكون DS0Fi1 5 MPشركة نيكون ، JP
أوزميوم رباعي أكسيد (OsO4< / sub>)Agar Scientific Ltd ، GBR1019خطر: قاتل إذا ابتلع أو ملامسة للجلد أو في حالة استنشاقه. يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين ارتد قفازات واقية مزدوجة وملابس واقية وحماية للعينين والوجه.
أطراف الماصة والماصةThermo Scientific ، FIKJ16047
ثنائي هيدرات فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH2< / sub>PO4 < / sub>.< / sup> 2H2< / sub>O) PENTAالنقي ، تشيكوسلوفاكيا13472-35-0
حقنة 10 ملEcoject ، DE20010
Toluidine blue ، درجة للأغراض العامةFisher Scientific ، 2045836
جيجابايت

المراجع

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92(2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, Ü, Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, Ü, Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478(2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818(2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618(2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592(2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485(2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505(2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14(2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, Ü, Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

C3 C4 ImageJ
تقييم الصفات التركيبية في Triticum aestivum و Zea mays ل C3 و C4 تمايز التمثيل الضوئي باستخدام مقاطع اليد الحرة وشبه الرفيعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.