Method Article

الإنتاج والفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للخلايا الحية متعدد المعلمات (FLIM) للكرويات متعددة الخلايا

DOI:

10.3791/66845

⸱

August 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tissue Engineering and Biomaterials Group, Department of Human Structure and Repair, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 2Ghent Light Microscopy Core, Ghent University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طرق تكوين كروية متعددة الخلايا مختلفة لإجراء الفحص المجهري للخلايا الحية متعدد المعلمات للمتابعة. باستخدام المجهر التصويري مدى الحياة الفلوري (FLIM) ، والتألق الذاتي الخلوي ، والأصباغ الملطخة ، والجسيمات النانوية ، يتم إثبات نهج تحليل استقلاب الخلايا ، ونقص الأكسجة ، وموت الخلايا في السرطان الحي ثلاثي الأبعاد (3D) والأجسام الكروية المشتقة من الخلايا الجذعية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كرويات الورم متعددة الخلايا هي نموذج microaggregate الأنسجة 3D شعبية لإعادة إنتاج البيئة المكروية للورم ، واختبار وتحسين العلاجات الدوائية واستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية والنانوية في سياق 3D. تعد سهولة إنتاجها وحجمها الذي يمكن التنبؤ به ونموها وتدرجات المغذيات والأيض المرصودة مهمة لتلخيص البيئة المكروية للخلايا الشبيهة ب 3D. ومع ذلك ، يمكن أن يؤثر عدم التجانس الكروي وتنوع طرق إنتاجها على التمثيل الغذائي الكلي للخلايا ، والقدرة على البقاء ، والاستجابة الدوائية. هذا يجعل من الصعب اختيار المنهجية الأنسب ، مع الأخذ في الاعتبار المتطلبات في الحجم ، والتباين ، واحتياجات التصنيع الحيوي ، واستخدامها كما هو الحال في نماذج الأنسجة 3D في المختبر في بيولوجيا الخلايا الجذعية والسرطانية. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤثر إنتاج الكرة الأرضية على توافقها مع المجهر الحي الكمي ، مثل التصوير الأيضي البصري ، أو الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة (FLIM) ، أو مراقبة نقص الأكسجة الكروي باستخدام أجهزة الاستشعار النانوية ، أو الجدوى. هنا ، يتم تقديم عدد من بروتوكولات تكوين كروية تقليدية ، مما يسلط الضوء على توافقها مع المجهر الحي واسع المجال ، والبؤري ، وثنائي الفوتون. كما يتم تقديم التصوير التكميلي لخط أنابيب التحليل باستخدام FLIM متعدد التألق الذاتي ، وباستخدام أنواع مختلفة من السرطان وكروية الخلايا الجذعية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل الأجسام الكروية متعددة الخلايا مجموعة من نماذج الأنسجة 3D التي تم الحصول عليها عن طريق التجميع الذاتي للخلايا وإظهار شكل كروي. وهي تستخدم على نطاق واسع لتقليد التفاعل بين الخلايا والخلايا والمصفوفة في المختبر وإعادة إنتاج سياق 3D ضمن العديد من التركيبات المشتقة من السرطان والخلايا الجذعية. يتم استخدام العديد من التقنيات لتقليل ارتباط الخلية وتعزيز التجميع. وتشمل هذه طريقة التعليق والإفلات التي تعتمد على التوتر السطحي1 ؛ طرق صد مرفقات الخلايا مثل ألواح التعلق المنخفضة للغاية والقوالب الدقيقةوالآبار الدقيقة 2,3 ؛ النهج القائم على الموجات الصوتية4 ؛ طرق التجميع المستحثة بالتدفق (قوارير دوارة ، مفاعل حيوي ، وأجهزة الموائع الدقيقة)5 ؛ التكوين بمساعدة الجسيمات المغناطيسية6 واستخدام المصفوفات والسقالات الاصطناعية المعززة للتجميع والقائمة على ECM7،8،9.

في أبحاث السرطان وتطويره والتحقق من صحة العلاجات الدوائية الجديدة ، تعد الكائنات الكروية نموذجا جذابا نظرا لقدرتها على تلخيص التدرجات المحدودة الانتشار المكاني للمغذيات ومنتجات النفايات و O2 ، مما يؤدي غالبا إلى تكوين نواة نخرية ، نموذجية للأورام الصلبة10,11. تتحدى هذه النماذج الأكثر موثوقية وتطورا في المختبر الحاجة إلى الاستخدام المكثف للنماذج الحيوانية (قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء [FDA] 2.012) ، وفقا لمبدأ 3Rs للبحوث الحيوانية (الاستبدال والتقليل والصقل). بالإضافة إلى السرطان ، تجد الأجسام الكروية تطبيقها في أبحاث الخلايا الجذعية. على سبيل المثال ، تتمتع الخلايا الجذعية متعددة القدرات بالقدرة على تكوين أجسام جنينية (EB) ، والتي يمكن استخدامها لتمايز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) نحو أنواع الخلايا المتخصصة التي يصعب الحصول عليها مباشرة من المرضى ، مثل خلايا السلائف العصبية13 أو خلايا المبيض الحبيبية13,14. علاوة على ذلك ، غالبا ما يكون تكوين EB هو الخطوة الأولى في تطوير نماذج عضوية أكثر تعقيدا ، على سبيل المثال ، العصبية15 ، شبكيةالعين 16 ، القلب17 ، الكبد18 ، المعدة19 ، والعضوية المعوية20. يجب مراعاة العوامل بما في ذلك الحجم والتكرار والإنتاجية والتطبيقات النهائية عند اختيار طريقة تكوين كروية مناسبة للتجارب.

يمكن أن يؤدي التعقيد المتزايد لثقافة 3D إلى تباين أعلى مقارنة بثقافة 2D. عوامل مثل تكوين المغذيات21 ، تبخر الوسائط22 ، اللزوجة23 ، التحكم في الأس الهيدروجيني24 ، طريقة تكوين كروية ، وحتى الوقت في الثقافة25,26 يمكن أن يؤدي إلى الحصول على كرويات متفاوتة التشكل والأحجام والجدوى والمقاومة الكيميائية المختلفة27,28. أظهرت الأبحاث الحديثة أن تدرجات الأكسجين الكروية ليست ثابتة دائما وتتأثر بطريقة التكوين وحجم الكرة واللزوجة خارج الخلية ، مما يؤثر على عدم تجانس الكرة29. لتحسين قابلية التكاثر وإمكانية الوصول إلى البيانات على الأجسام الكروية ، تم تطوير قاعدة معارف MISpheroID26 ، وتحديد خط الخلية ، ووسط الثقافة ، وطريقة التكوين ، وحجم الكائنات الكروية باعتبارها الحد الأدنى من المعلومات للحصول على نتيجة قابلة للتكرار. لذلك ، تم إجراء مقارنة مفصلة للعديد من الإنتاجية العالية (SphericalPlate 5D ، والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر ، وقوالب الأنسجة الدقيقة) وطرق التعلق المنخفضة (أي ألواح 96 بئرا المطلية ب Biofloat و Lipidure ، سواء كانت خالية من السقالات أو قائمة على السقالات) (الشكل 1 والجدول 1) ، بما في ذلك حجم البئر (مع إعطاء تقدير للحد الأقصى لحجم الكرة الأرضية) ، والمواد الاستهلاكية المستخدمة ، ووقت التحضير وإمكانية مراقبة الأجسام الكروية دون نقلها إلى أطباق الفحص المجهري. هذا الأخير يتيح دراسات طويلة الأجل ، في حين أن الكرويات المنتجة بطرق عالية الإنتاجية غالبا ما تؤدي إلى تجارب نقطة النهاية. جميع الطرق باستثناء شبكات 5DspheriPlate لا تجلب التألق الذاتي غير المرغوب فيه ، مما يتيح استخدامها المباشر في الفحص المجهري.

figure-introduction-1
الشكل 1: شرح طرق تكوين الكرة الأرضية. طرق عالية الإنتاجية مثل SphericalPlate 5D ، التي دمجت الآبار الدقيقة الحاصلة على براءة اختراع في اللوحة ، بينما تستخدم القوالب الدقيقة المنتجة في المختبر وقوالب MicroTissue طوابع لصنع آبار دقيقة متعددة في الأغاروز (الأزرق). تستخدم الألواح منخفضة التعلق مثل Lipidure (Amsbio) و Biofloat (Sarstedt) طلاءا غير ملتصق يمنع التصاق سطح الخلية ويعزز التجميع الذاتي للخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5D SpheriPlateقوالب دقيقة منتجة ذاتياالأنسجة الدقيقةطرق التعلق المنخفضة
عدد الكرويات / البئر7501589811
قطر البئر90 ميكرومتر400 ميكرومتر800 ميكرومتر1 مم
حجم الثقافة1 مل5 مل1 مل200 ميكرولتر
المواد الاستهلاكية الأخرى/7 مل من 3٪ أغاروز500 ميكرولتر من 2٪ أغاروز/ *
وقت التحضير10 دقائق2 ساعة + 3 أيام تكييف الوسائط0.5 ساعة + 15 دقيقة تكييف الوسائط10-30 دقيقة + 1 ساعة تجفيف
رصدنعملا**نعمنعم
الفلورسنت الذاتينعملالالا
قابلهلانعمنعملا**
كلف€€€€€€€€€€€: طلاء وماتريجيل
€€: لوحة تجارية 96 بئر
* تحتاج بعض خطوط الخلايا إلى إضافة ECM (أي 2٪ -5٪ Matrigel) لتشكيل كرويات مدمجة.
** الطلاء قابل لإعادة الاستخدام حتى ينفد. ومع ذلك ، ستستهلك كل لوحة كمية صغيرة من الوسائط ويمكن أن يتراكم الغبار بمرور الوقت. هناك حاجة إلى تعقيم المرشح بانتظام.

الجدول 1: مقارنة طرق تكوين كروية متعددة29. "المراقبة": القدرة على مراقبة كروية دون الحاجة إلى نقلها إلى طبق الفحص المجهري. €: 0-50€, €€: 50-150€ , €€€: 150-500€ , €€€€: >500€

يتيح الفحص المجهري الفلوري المراقبة المباشرة للجوانب البيولوجية الرئيسية داخل الأجسام الكروية ، بما في ذلك موت الخلايا ، والقدرة على البقاء ، والانتشار ، والتمثيل الغذائي ، واللزوجة ، وحتى الخصائص الميكانيكية30. يوفر الفحص المجهري للتصوير مدى الحياة الفلوري (FLIM) بعدا كميا إضافيا لدراسة تفاعلات مسبار الفلورسنت داخل بيئتها (الدقيقة)31،32،33،34 ، مما يسمح بحل أطياف الانبعاثات المتداخلة وفقا لأعمار الانبعاثات المختلفة35,36 والتحقيق في استقلاب الخلية على أساس التألق الذاتي الخلوي الداخلي. وبالتالي ، يمكن قياس مركبات الفلورسنت الذاتي الخلوية واسعة الانتشار مثل نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد الفوسفات (NAD (P) H) ، أحادي النوكليوتيد الفلافين (FMN) ، فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD) ، البروتوبورفيرين التاسع ، وغيرها يمكن قياسها باستخدام FLIM واحد وفوتونين وتكون بمثابة "مستشعرات" جوهرية لهدم الجلوكوز ، والفسفرة التأكسدية (OxPhos) وتوفر نظرة عامة على حالة الأكسدة والاختزال الخلوية. يوجد NAD (P) H في السيتوبلازم الحر ، أو في أشكال الميتوكوندريا المرتبطة بالبروتين37,38. وبالمثل ، فإن الحالة المؤكسدة ل FAD هي الفلورسنت مع عمر أطول للشكل الحر. عادة ما تتضمن مجهرات NAD (P) H و FAD FLIM المثارة ثنائية الفوتون ، بهدف منع التلف الضوئيللعينة 39. في كثير من الأحيان ، يمكن دمج "التصوير الأيضي البصري" FLIM مع استخدام المجسات القائمة على الصبغة ، وأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا ، والفحص المجهري للتصوير مدى الحياة للفسفور (PLIM) ، والقياسات القائمة على الكثافة النسبية من أجل توفير صورة أكثر اكتمالا لعملية التمثيل الغذائي الكروي أو العضوي ، والأوكسجين ، والانتشار ، وصلاحية الخلية29،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا دمج FLIM مع طريقة نقل طاقة الرنين Förster (FRET) لقياس التباين مدى الحياة للفلوروفور المانح عندما يكون على اتصال وثيق مع المستقبل للتحقيق في ارتباط الدواء بمجاله المستهدف33،40،41.

عادة ما يتم تحليل صور FLIM المكتسبة لحساب العمر بكسل تلو الآخر. حاليا ، هناك ما لا يقل عن 3 استراتيجيات شائعة تستخدم للحصول على عمر مضان: شبه كمي "FLIM'42 السريع"42 (يشار إليه أحيانا باسم "tau sense" 43,44) ، وتركيب منحنى الاضمحلال ، باستخدام تركيب أسي واحد أو اثنين أو ثلاثة ، ونهج "خال من التركيب" مع تحويل الطور وتحليل مخطط الطور. اعتمادا على البائع ، يمكن استخدام البرامج المقدمة (LAS X أو Symphotime أو SPCImage وما إلى ذلك) أو البرامج مفتوحة المصدر (على سبيل المثال ، FLIMfit45 أو FLIMJ46 أو غيرها47) للتعامل مع بيانات FLIM المقاسة. عادة ما تكون البرامج التي يوفرها البائع مفيدة لتحليل البيانات الأولية ، في حين أن الحلول مفتوحة المصدر يمكن أن توفر دراسات أكثر دقة باستخدام ، على سبيل المثال ، مخططات المرحلة والتصور 3D.

على الرغم من فائدة وجاذبية FLIM كطريقة لدراسة الكرات ، يتوفر عدد قليل جدا من البروتوكولات التجريبية ، وهناك نقص عام في المعرفة في اختيار أنسب طريقة تشكيل لتجارب الفحص المجهري الحية متعددة المعلمات الناجحة التي تتضمن FLIM. هنا ، يتم تقديم مقارنة مفصلة لبروتوكولات تكوين كروية شائعة الاستخدام بناء على مورفولوجيتها وصلاحيتها وأكسجينها مع مستشعر نانوي لاستشعار الأكسجين (MMIR1) تم التحقق من صحته مؤخرا وتميزه بالأشعة تحت الحمراء البعيدة والقريبة من الأشعة تحت الحمراء (NIR). يتم تشريب الجسيمات النانوية الكاتيونية بصبغتين مراسلتين ، المرجع O 2-aza-BODIPY غير الحساس (الإثارة 650 نانومتر ، الانبعاث 675 نانومتر) و NIR O2 الحساس للميتالوبورفيرين ، PtTPTBPF (الإثارة 620 نانومتر ، الانبعاث 760 نانومتر). يتيح MMIR1 التحليل في الوقت الفعلي لتدرجات الأكسجين على مجهر مضان تقليدي (باستخدام التحليل النسبي) أو مجهر عمر الفسفرة (PLIM) دون إدخال سمية خلوية والسماح بإشارات مستقرة ومراقبة طويلة الأجل وتعدد الإرسال25,29. اعتمادا على الحاجة إلى تلطيخ الأصباغ أو أجهزة الاستشعار النانوية أو الإنتاجية الكروية أو نوع الخلية ، يمكن اختيار بروتوكول التكوين الأنسب. نظرا لأن دراسات صلاحية الكائنات الكروية والأوكسجين ذات صلة بدراسات السرطان والكرويات المشتقة من الخلايا الجذعية ، فإن البروتوكولات المقدمة تتضمن أيضا أمثلة ونتائج نموذجية متوقعة ل NAD (P) H-FLIM و FAD-FLIM مع هذه النماذج. تستهدف خطوط أنابيب التصوير والتحليل المقدمة منصات الفحص المجهري FLIM الأكثر شيوعا القائمة على عد الفوتون الأحادي المرتبطة بالوقت.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد كرويات متعددة الخلايا

  1. زراعة الخلايا
    ملاحظة: يمكن جمع مزارع الخلايا من مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) أو Lonza أو Sigma-Aldrich أو بائعين آخرين. يوفر ATCC جميع معلومات المناولة المطلوبة ، بما في ذلك وسائط النمو المفضلة ، وإجراءات الاستزراع الفرعي ، ومستوى السلامة الأحيائية ، ومعدل النمو ، وملامح STR. هنا ، يتم استخدام 500 خلية / كروية من خط خلايا سرطان القولون البشري HCT116 في وسائط McCoy's 5A (VWR ، 392-0420) مع 10٪ FBS و 1 mM Sodium Pyruvate. بالنسبة للتجارب طويلة المدى التي تتم مراقبتها يوميا ، يمكن إضافة 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى الوسائط.
    1. تنمو ثقافة الخلايا للوصول إلى التقاء 70٪ -90٪.
    2. شطف الخلايا مع PBS معقمة مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) (5 مل ل 25 سم2 أو 10 مل لكل 75 سم2 قارورة).
    3. أضف 0.05٪ تربسين - 1 مللي مول محلول EDTA (0.5 مل لكل 25 سم² أو 1 مل لكل 75 سم2 قارورة) واحتضانها لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 ، 95٪ رطوبة للوصول إلى انفصال الخلايا.
      ملاحظة: التحكم في انفصال الخلايا تحت مجهر ضوء الإرسال (برايتفيلد). يمكن أن يؤثر التعرض المفرط للخلايا لمحلول الإنزيم المنفصل على صلاحيتها.
    4. تحييد التربسين عن طريق إضافة وسائط زراعة الخلايا الزائدة التي تحتوي على 10٪ FBS (على الأقل 5 مل من الوسائط لكل 1 مل من محلول التفكك).
      ملاحظة: بالنسبة للخلايا المستزرعة على وسائط استزراع منخفضة FBS أو خالية من FBS ، يمكن إجراء تحييد التربسين بإضافة 0.5 مل من FBS بنسبة 100٪ إلى مزرعة الخلايا المعالجة بالتريبسين ، متبوعا بالطرد المركزي لنقل الخلايا إلى وسائط المزرعة الأصلية.
    5. فصل مجاميع الخلايا عن طريق السحب للحصول على تعليق أحادي الخلية في الوسائط.
      ملاحظة: تعمل الماصة باستخدام ماصة مصلية بطرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر في الأعلى على تحسين توليد تعليق أحادي الخلية بشكل كبير في حجم كبير من ثقافة الخلايا المعلقة.
    6. استخدم غرفة العد (مقياس الدم أو البدائل التي يحكمها نيوباور) لحساب عدد الخلايا لكل 1 مل من تعليق الخلية.
    7. تمييع تعليق الخلية للحصول على العدد المطلوب من الخلايا لكل ملليلتر.
    8. أضف محلول مسبار O2 المركز (الجسيمات النانوية) إلى تعليق الخلية بتركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل للتحليل النسبي ل O2.
      ملاحظة: لضمان تعليق خلية متجانسة (مع المسبار) ، أعد التعليق عدة مرات قبل تكوين كروي. إذا لم يكن مسبار O2 مطلوبا ، فتخط هذه الخطوة وتابع تشكيل الأجسام الكروية. يجب تطبيق بروتوكول معدل عند التعامل مع iPSCs. باختصار ، تزرع iPSCs في مستعمرات على ألواح مطلية ب Geltrex ويتم تمريرها باستخدام ReLeSR كما هو موضح في البروتوكول48 المقدم من البائع. في يوم تكوين كروي ، يجب أن تكون المستعمرات كبيرة ومضغوطة وتعرض مراكز متعددة الطبقات ذات حدود مميزة. شطف الخلايا مع PBS معقمة مسخنة. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR) واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 8-10 دقائق. استخدم طرف 1000 ميكرولتر لفصل الخلايا برفق عن البئر والحصول على تعليق أحادي الخلية. انقل معلق الخلية الواحدة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وأضف 4 مل من وسط DMEM-F12 المسخن مسبقا لتحييد GCDR. اغسل البئر ب 1 مل من DMEM-F12 وانقله إلى بقية تعليق الخلية. أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. أعد التعليق في 1 مل من الوسائط المناسبة لمزيد من التجارب. بالنسبة للتجارب الموصوفة في هذه المخطوطة ، تم استخدام مثبط الصخور mTeSR + 10 μM. عد وتخفيف تعليق الخلية للحصول على العدد المطلوب من الخلايا لكل ملليلتر.
  2. طرق تشكيل كروية
    1. 3D طبق بتري قوالب صغيرة
      ملاحظة: تستخدم طريقة الإنتاجية العالية هذه لتوليد عدد كبير من الكرويات (81 كروية) في وقت واحد في مصفوفة micromold 9 × 9 بقطر 800 ميكرومتر وعمق 800 ميكرومتر.
      1. شطف القوالب الصغيرة لصب أطباق بتري 3D في dH2O ووضعها في حاوية قابلة للتعقيم.
      2. قم بقياس 2 جم من مسحوق الأغاروز الكهربائي وضعه في زجاجة زجاجية جافة آمنة للأوتوكلاف سعة 200 مل.
        ملاحظة: تأكد من أن الزجاجة ومسحوق الأغاروز جافان بدون سائل أو رطوبة.
      3. قوالب الأوتوكلاف الصغيرة لصب أطباق وزجاجات بتري 3D مع مسحوق الأغاروز لمدة 30 دقيقة في دورة جافة.
      4. اصنع محلول ملحي 0.9 واط / فولت بإضافة 0.9 جم من كلوريد الصوديوم في 100 مل من الماء عالي النقاء وتعقيمه عن طريق التعقيم.
        ملاحظة: يوصى باستخدام كلوريد الصوديوم من قبل الشركة المصنعة. يزيد من استقرار الأغاروز.
      5. تحضير محلول الأغاروز عن طريق إضافة محلول ملحي معقم إلى مسحوق الأغاروز المعقم. المسمار على الغطاء مثبتة بشكل غير محكم لتجنب تراكم الضغط. حرك الزجاجة لخلط مسحوق الأغاروز.
      6. اسلقي مسحوق الأغاروز وحوبه باستخدام فرن الميكروويف. أوقف الميكروويف بشكل متكرر (~ كل 10 ثوان). حرك الزجاجة وكرر حتى يذوب الأغاروز.
        تنبيه: محلول الأغاروز ساخن ويتطلب معالجة دقيقة. قد يؤدي الاهتزاز مباشرة بعد إجراء الذوبان إلى انفجار المحلول خارج الوعاء. لتجنب الحوادث ، استخدم أوعية كبيرة مملوءة بما يكفي بما لا يزيد عن 50٪ من السعة واستخدم الحماية الشخصية المناسبة (القفازات ، وقفاز الفرن ، وحماية العين ، ومعطف المختبر).
      7. دع محلول الأغاروز المذاب يبرد إلى 60-70 درجة مئوية. باستخدام تقنيات وظروف معقمة ، أغاروز ماصة منصهرة في القالب الصغير (500 ميكرولتر لسلسلة 12 أو 330 ميكرولتر لسلسلة 24).
        ملاحظة: تجنب تكوين الفقاعات أثناء خلط أو سحب الأغاروز. قم بإزالة أي فقاعات صغيرة محاصرة في الميزات الصغيرة للقالب الصغير عن طريق السحب أو التخريد اللطيف قبل أن يصلب الأغاروز.
      8. دع الأغاروز يصلب لمدة 2-3 دقائق. بعد ذلك ، قم بثني القالب الصغير بعناية لإزالة طبق 3D Petri ونقله إلى طبق زراعة الأنسجة 12 جيدا.
        ملاحظة: قد يؤدي الإفراط في ثني القالب الصغير إلى تكوين تشققات داخل قالب الأغاروز.
      9. لموازنة طبق 3D Petri ، أضف 2.5 مل / وسط زراعة خلايا البئر. احتضان لمدة 15 دقيقة أو أكثر. قم بإزالة وسط الاستزراع واستبدله بوسط جديد. كرر مرة أخرى لموازنة طبق 3D Petri مع وسيط ثقافة.
        ملاحظة: يمكن مقاطعة البروتوكول هنا حتى بذر الخلية. للتخزين طويل الأجل (حتى 2 أسابيع عند 4 درجات مئوية) ، استخدم حل PBS بدلا من المتوسط.
      10. قم بإزالة طبق 3D Petri المحيط بوسط الاستزراع (أو PBS) تماما وبدقة قم بإزالة الوسائط داخل طبق 3D Petri عن طريق إمالة لوحة زراعة الأنسجة.
      11. قم بزرع 190 ميكرولتر بعناية من معلق الخلية الذي يحتوي على 40500 خلية قطرة في غرفة بذر الخلايا (انظر الخطوة 1.1).
        ملاحظة: يحدد عدد الآبار الدقيقة في طوابع الأغاروز عدد الكرويات المنتجة لكل طابع. في هذه الحالة ، يحتوي قالب الأغاروز هذا على 81 بئرا صغيرا (81 × 500 خلية / كروية). يسمح تباين تركيز الخلية في التعليق المضاف إلى البئر الكبير بتغيير رقم الخلية لكل كروي ، وبالتالي التحكم في حجم الكروي.
      12. السماح ~ 10 دقيقة للخلايا لتستقر في ميزات 3D Petri dsh. ثم أضف 2 مل من الوسط إلى الخارج من طبق 3D Petri.
      13. ضع لوحة زراعة الأنسجة في حاضنة زراعة الخلايا وتبادل الوسط المحيط بطبق بتري 3D حسب الحاجة.
    2. لوحة مرفقة منخفضة
      ملاحظة: تستخدم هذه الطريقة لتوليد كروي واحد لكل بئر. الألواح المطلية (Lipidure أو Biofloat) متاحة تجاريا (تخطي الخطوات 1.2.2.1-1.2.2.4). بدلا من ذلك ، يمكن شراء الطلاء بشكل منفصل واستخدامه لطلاء الألواح متعددة الآبار غير المعالجة. يوصى بملء الآبار عند حواف 96 بئرا بالماء المعقم أو PBS بسبب التبخر الأسرع في هذه الآبار ، مما يحد من عدد الآبار الكروية إلى 60. في حالة الحاجة إلى عدد أقل من الأجسام الكروية ، املأ الآبار الفارغة المحيطة بالماء أو برنامج تلفزيوني. استخدم نصائح خالية من الغبار للتعامل مع السوائل لتجنب جلب جزيئات صغيرة إلى الآبار ، لأنها تتداخل مع تكوين الكرة الأرضية.
      1. تحضير محلول طلاء 0.5 w/v٪ عن طريق إذابة 0.25 g من مسحوق البوليمر في 50 mL من الإيثانول في وعاء زجاجي. تصفية تعقيم الطلاء.
        ملاحظة: يجب تنفيذ تعقيم المرشح وجميع الخطوات التالية في ظروف معقمة تحت التدفق الصفحي.
      2. أضف 200 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر من صفيحة استزراع قاع U 96.
      3. احتضان لمدة 1 دقيقة وخلع الطلاء الزائد.
        ملاحظة: يمكن استخدام محلول الطلاء عدة مرات. تخزينها في وعاء زجاجي في درجة حرارة الغرفة (RT). لا ينصح باستخدام الحاويات البلاستيكية ، حيث يمكن أن يذوب البلاستيك جزئيا ويصبح جزءا من المحلول. في حالة وجود غبار ، قم بتعقيم المرشح باستخدام مرشحات حقنة بولي إيثر سلفون (PES) أو نايلون 0.22 ميكرومتر أو مرشحات حقنة من النايلون.
      4. دع اللوحة المكونة من 96 بئرا تجف في الهواء لمدة 1 ساعة تقريبا.
        ملاحظة: إذا كانت الخلايا بحاجة إلى مصفوفة خارج الخلية، فانتقل إلى الخطوة 1.2.3. يمكن تخزين الألواح المطلية في RT عند لفها بالألمنيوم لمدة تصل إلى 1 شهر. عند بذر كمية أقل من الخلايا / البئر ، يمكن أن يساعد الطرد المركزي للوحة لمدة 5 دقائق عند 300 جم في سحب الخلايا.
    3. بروتوكول التكوين بمساعدة المصفوفة خارج الخلية
      ملاحظة: بعض خطوط الخلايا لا تنتج ما يكفي من المصفوفة خارج الخلية (ECM) نفسها وتحتاج إلى إضافة ECM مثل Matrigel أو Cultrex أو Geltrex من أجل تكوين كرويات مدمجة49،50،51. بالنسبة لأنواع الخلايا مثل سرطان الثدي MDA-MB-231 ، الحليمة الجلدية البشرية ، خلايا سرطان البروستاتا وغيرها ، من الممكن استخدام الخطوة 1.2.2 مع التعديلات التالية52 ، والتي تتطلب إضافة ECM. يفضل استخدام أطراف خالية من الغبار للتعامل مع السوائل لتجنب تداخل الغبار مع تكوين الكرة الأرضية. يجب تنفيذ الخطوات 1 و 4-7 تحت خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية).
      1. تابع الخطوات 1-2-2-1-1-1-2-2-4 (الألواح منخفضة التعلق) للمعالجة السطحية.
      2. قم بتبريد الطبق المكون من 96 بئرا مسبقا على حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة.
      3. قم بإعداد جهاز الطرد المركزي باستخدام المحول الصحيح للوحة 96 بئرا وقم بتبريده مسبقا لمدة 4 درجات مئوية.
      4. تحضير محلول 5٪ من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) في وسائط زراعة الخلايا المبردة مسبقا (4 درجات مئوية).
        ملاحظة: BMM بسرعة عبر الروابط في RT. عند المناولة ، احتفظ بالأسهم والحلول على الجليد.
      5. قم بإعداد تعليق الخلية (انظر الخطوة 1.1).
      6. أضف 50 ميكرولتر من محلول BMM في كل بئر.
      7. أضف برفق 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر فوق محلول BMM (25000 خلية / بئر).
        ملاحظة: لا تقم بتفجير هذا الحجم في البئر ، وإلا ستنتشر الخلايا على جوانب الآبار ولن تتجمع في القاع. يمكن الحصول على عدد أقل من الخلايا لكل بئر عن طريق ضبط كثافة الخلية وفقا لذلك. لن تشكل جميع الخلايا كرويات في جميع كثافات البذر. يجب إجراء التحسين نوع الخلية والأبعاد المطلوبة. مع الأحجام المقدمة ، يكون التركيز النهائي ل BMM 2.5٪. إذا كانت هناك حاجة إلى تركيز مختلف ، فيجب تحضير محلول المخزون بتركيز أقل / أعلى.
      8. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 بئر لمدة 5 دقائق عند 300 × جم و 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: بدون هذه الخطوة ، لا تتجمع الخلايا بشكل صحيح في قاع البئر ، مما يتسبب في تكوين العديد من الركام الأصغر. يجب تبريد أجهزة الطرد المركزي لتجنب التشابك في هذه المرحلة.
      9. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. تعتبر الركام ناضجة في اليوم 4 بعد البذر.
        ملاحظة: للاطلاع على بروتوكولات إضافية بشأن تكوين الكرة الأرضية، يرجى الرجوع إلى الملف التكميلي 1.

2. الفحص المجهري الحي للكرويات

  1. تحضير كرويات لتحليل التصوير الحي
    ملاحظة: اعتمادا على تصميم التجربة (على سبيل المثال ، المراقبة طويلة الأجل أو تحليل نقطة النهاية ، أو إعداد المجهر ، أو الخصائص الطيفية للتألق المقاس) أو بسبب عدم توافق طريقة إنتاج الكرة مع الفحص المجهري (على سبيل المثال ، سمك العينة ، التألق الذاتي للمادة ، تعويم الأجسام الكروية أثناء التصوير) المراقبة المباشرة للكرويات في اللوحة ، حيث تم إنتاجها ، قد لا يكون ممكنا. يشرح البروتوكول تحضير الأجسام الكروية للتصوير ، وهي مناسبة لمعظم المجاهر ذات المجال العريض والمجاهر متحدة البؤر.
    1. تحضير وسائط التصوير وتسخينها (37 درجة مئوية): DMEM مكمل ب HEPES-Na ، ودرجة الحموضة 7.2 (10 مللي مول) ، وبيروفات الصوديوم (1 مللي مول) ، و L-glutamine (2 mM) ، والجلوكوز (5 mM) ، بدون الفينول الأحمر.
      ملاحظة: يمكن استخدام بيكربونات الصوديوم بمفردها أو بالاشتراك مع HEPES-Na ، إذا تم توفير التحكم في CO2 أثناء التصوير24. بعض أنواع زراعة الخلايا لا يمكن أن تتسامح مع وجود HEPES. اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن تعديل محتوى البيروفات والجلوتامين والجلوكوز.
    2. قم بإعداد أطباق مجهرية معقمة (متوفرة تجاريا أو مصنوعة في المختبر) بأسطح زجاجية مغلفة (للالتصاق كروي قوي) أو غير مطلية (التصاق كروي منخفض) (سمك # 1.5).
      ملاحظة: تعتمد الحاجة ونوع الطلاء على نوع الخلية ، وخصائص التصاق الكائنات الكروية ، ومعدل هجرة الخلايا من واجهة الثقافة 3D إلى 2D. من المهم مراعاة ذلك ، لأن الطلاء يمكن أن يسهل فقدان تنظيم 3D ، وتغيير شكل التدرجات الدقيقة في الأجسام الكروية ، ونتيجة لذلك ، سلوك الخلية. بالنسبة لبعض التجارب (على سبيل المثال ، حلل التصوير الاستجابة لتحفيز الدواء) ، يلزم التصاق كروي قوي بالسطح ، ويفضل طلاء بالجيلاتين أو BMM أو الكولاجين أو الكولاجين / poly-D-lysine أو poly-D-lysine.
    3. اغسل بلطف الأجسام الكروية الملطخة بالمسبار O2 من الآبار الدقيقة للأغاروز ذي الأنماط الدقيقة أو الصفيحة ذات 96 بئرا وانقل الكرويات التي لا تزال عائمة إلى قارورة سعة 2 مل.
      ملاحظة: لضمان جمع جميع الكرات الكروية من طريقة الإنتاجية العالية ، اشطف القالب 1-3 مرات بالحجم الإضافي لوسائط الاستزراع ، مع الجمع بين جميع المعلقات الكروية في قارورة واحدة. بالنسبة للكرويات الموجودة في لوحة منخفضة التعلق ، اجمع الكرات واحدة تلو الأخرى من الآبار الفردية إلى قارورة أو مباشرة إلى طبق الفحص المجهري إذا كان عدد صغير من الأجسام الكروية كافيا للتجربة. عند نقل الأجسام الكروية الكبيرة ، اقطع نهاية طرف الماصة لضمان عدم حدوث ضرر أثناء الماصة.
    4. اترك القارورة في وضع عمودي لمدة تصل إلى 5 دقائق للسماح للكرويات بالاستقرار في قاع القارورة ، لتشكيل حبيبات مرئية.
    5. قم بإزالة الوسائط من الأنبوب ، وترك الأجسام الكروية دون عائق ، وأعد تعليقها برفق في كمية كافية من الثقافة الطازجة.
      ملاحظة: لتسهيل التعامل مع الكرة ، يمكن أيضا نقل الأجسام الكروية إلى وسائط التصوير في هذه المرحلة على دفعات صغيرة ؛ راجع الخطوتين 2.1.7 و2.1.8. يجب معاملة الكائنات الكروية من المجموعات التجريبية المختلفة على قدم المساواة ، حيث يمكن أن يؤثر تكوين الوسائط ووقت التهيئة المسبقة للوسائط على عملية التمثيل الغذائي.
    6. أثناء طفو الأجسام الكروية ، انقل حجما متساويا من التعليق الكروي لكل بئر من طبق الفحص المجهري.
    7. احتضان الكرويات لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لضمان ارتباطها بسطح طبق / بئر الفحص المجهري. للتصوير ، تابع الخطوة 2.1.9. لتلطيخ الأجسام الكروية مع تحقيقات إضافية المضي قدما في الخطوة 2.1.8.
      ملاحظة: معدل هجرة الخلايا من كروي 3D إلى واجهة السطح 2D هو دالة للوقت. لتجنب فقدان تنظيم 3D ، يجب تحسين وقت الحضانة فيما يتعلق بنوع الخلية ونوع طلاء السطح وتصميم التجربة. على سبيل المثال ، يحتاج HCT116 ، اعتمادا على حجم كروي ، إلى ساعتين على الأقل للحصول على مرفق كروي مناسب بالسطح المطلي بالكولاجين IV / poly-D-lysine ، في حين أن مرفق hDPSC والانتقال إلى واجهة 2D سريع للغاية ، مما يؤدي إلى فقدان التنظيم ثلاثي الأبعاد في 1-2 ساعة. لتجنب تصوير "كرويات 2D" بسبب الانتشار المفرط ، يتم استخدام الأسطح الزجاجية غير المطلية مع تقليل وقت الحضانة.
    8. أضف مسبار (مسابار) مضان بتركيزات موصى بها أو محسنة تجريبيا إلى حجم معروف من التعليق الكروي. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية حاضنة CO2 قبل التصوير.
      ملاحظة: بالنسبة للمقايسة الحية / الميتة ، استخدم يوديد البروبيديوم والكالسيين جرين-AM بتركيز نهائي قياسي 1 ميكروغرام / مل. لتجنب التأثير السام لتلطيخ يوديد البروبيديوم على الأجسام الجنينية iPSC ، كان تركيز يوديد البروبيديوم النهائي 0.5 ميكروغرام / مل. يمكن إطالة وقت تحميل المسبار إذا لم يكن انتشار المسبار فعالا بسبب الحجم الكروي الكبير. يجب دائما اعتبار وقت التحميل جزءا من إجمالي وقت الحضانة اللازم لربط الكرة الأرضية بالسطح. إذا كانت هناك حاجة إلى وقت أطول للتعلق الكروي ، فيجب ترتيب إجراء التلوين في نهاية هذه الفترة. كن على علم بأن وقت الحضانة الأطول قد يؤدي إلى فقدان منظمة 3D.
    9. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا أو الوسائط التي تحتوي على مجسات الفلورسنت واستبدلها بالحجم الضروري من وسائط التصوير. لضمان عدم وجود خلفية مضان للوسائط في طريق التصوير الكروي ، كرر خطوة تبادل الوسائط (الغسيل) حتى 5 مرات.
      ملاحظة: لتجنب إزالة الكرة أثناء تبادل الوسائط ، يوصى بنضح الوسائط بعناية باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من حواف أطباق الفحص المجهري وإجراء إضافة الوسائط بجانب الحائط أو بشكل جانبي في طبق الفحص المجهري.
    10. تابع على الفور الخطوة 2.2.1 من بروتوكول التصوير.
      ملاحظة: يمكن أن يؤثر الفاصل الطويل جدا بين التحضير للتصوير واكتساب التصوير الفعلي على استقلاب الخلية (على سبيل المثال ، عن طريق تغيير التركيب المتوسط) ، والجدوى (بعض مجسات الفلورسنت المستخدمة لتحليل نقطة النهاية لها تأثيرات سامة ، والتي يمكن أن تحفز موت الخلايا بعد فترة حضانة طويلة) وكذلك تؤدي إلى فقدان تنظيم 3D. إذا كان يجب مقارنة مجموعات متعددة من الكائنات الكروية أو الظروف التجريبية ، فيجب تطوير التصميم التجريبي وفقا لذلك للحفاظ على توقيت العلاج والتكييف المسبق وإجراءات التصوير متساوية قدر الإمكان بين المجموعات التي تم تحليلها.
  2. الحصول على الصور
    ملاحظة: يصف البروتوكول التصوير متعدد المعلمات للكرويات الحية باستخدام المجهر متحد البؤر Stellaris 8 Falcon (Leica) وبرنامج Leica Application Suite X (LAS X) الإصدار 4.7. ومع ذلك ، لن تكون هناك حاجة إلا إلى تعديلات طفيفة لإجراء مثل هذا التحليل على منصات الفحص المجهري البديلة.
    1. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة قبل 30-60 دقيقة من التصوير. اضبط السرعة اللازمة للتهوية ودرجة الحرارة (35-37 درجة مئوية).
      ملاحظة: إذا كان بالإضافة إلى التحكم في درجة الحرارة ، يجب التحكم في تركيز الغاز (على سبيل المثال ، CO2 أو O2) أثناء التصوير ، فيجب أيضا بدء تشغيل الأجهزة المقابلة مسبقا للوصول إلى الظروف اللازمة قبل التصوير.
    2. قم بتشغيل المجهر والأجهزة المتصلة (مثل ليزر WLL والكمبيوتر ومضخة المياه لهدف الغمر في الماء والكتل الإلكترونية التشغيلية الأخرى). ابدأ تشغيل برنامج التحكم في المجهر (على سبيل المثال ، وضع آلة LAS X أو وضع الماكينة مع التحكم البيئي) المزود بإعداد المجهر الدقيق وقم بتهيئة معايرة المرحلة.
    3. اختر الهدف المطلوب في البرنامج وقم بتطبيق سائل الغمر إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: بالنسبة للفحص المجهري الحي ، يوصى باستخدام أهداف غمر الماء أو الجلسرين التي لها مسافة عمل كافية ("طويلة") ، على سبيل المثال ، HC Fluotar L 25x / 0.95 W مقابل الأشعة تحت الحمراء (مسافة عمل 2.4 مم) ، HC PL Apo 40x / 1.25 GLYC (مسافة عمل 0.35 مم) أو على الأقل NA = 0.4 أو أعلى لأهداف الهواء. يعتمد اختيار التكبير ومسافة العمل على طبيعة وحجم العينة المصورة وإشارات التألق المقاسة (السطوع ، العائد الكمي ، كفاءة التلوين ، انظر على سبيل المثال ، مناقشة الأصباغ والجسيمات النانوية53). تتطلب الأجسام الكبيرة (الأجسام الكروية أو العضوية ، >حجم 500 ميكرومتر) ، أو "المفاعل الحيوي" أو رقائق الموائع الدقيقة أهدافا طويلة لمسافة العمل وتكبيرا أقل ، بينما يتطلب تحليل الخلايا الفردية أو عضيات الخلية تكبيرا عاليا ، وغالبا ما يتحقق ذلك عن طريق التصوير "الفسيفساء".
    4. قم بإعداد طبق الفحص المجهري مع كرويات على المسرح. اضبط التركيز وابحث عن كائن / منطقة اهتمام (ROI).
      ملاحظة: إذا كان يجب العثور على أشياء صغيرة أو فلورية ضعيفة أو ضعيفة التباين أو نادرة وكان العثور على التركيز صعبا ، فمن المستحسن التركيز المسبق على جدران طبق الفحص المجهري و "غربلة" السطح بحثا عن الكائن محل الاهتمام بواسطة السربنتين ، بدءا من أحد أركان البئر.
    5. اختر نافذة فتح المشروع وانقر فوق الرمز المقابل ، إنشاء مشروع جديد. أعط اسما قياسيا (على سبيل المثال ، بدءا من "وصف YY-MM-DD +") إلى ملف مشروع البحث. أثناء التصوير ، سيتم حفظ جميع الصور المنتجة تلقائيا في ملف .lif للمشروع الذي تم إنشاؤه.
    6. افتح نافذة الاستحواذ . اضبط الطول الموجي لإثارة ليزر الضوء الأبيض (WLL) والنطاق المطلوب من كاشفات المسح الهجين أو الرنين (نوع HyD S أو HyD X أو HyD R) بناء على الخصائص الطيفية المعروفة للتألق المقاس (أطياف الإثارة / الامتصاص والانبعاث). اختر أنواع الخط أو الإطار للمسح الضوئي.
      ملاحظة: بالنسبة لمعظم الأصباغ الفلورية المتاحة تجاريا، يمكن العثور على الخصائص الطيفية (أو إضافتها) في حزمة LAS X Dye Assistant. اختر الكاشف ذو نطاق حساسية الأطياف المناسب المتوافق مع الخصائص الطيفية للمسبار ، وفي حالة FLIM ، متوافق مع عد الفوتون (أي HyD X أو HyD R). بالنسبة للتصوير متعدد المعلمات ، اضبط WLL في مواضع إثارة متعددة (على سبيل المثال ، للتصوير المتزامن ل FAD / Flavins وقناتين مضان لمسبار MMIR1 O2 النسبي - مرجعي وحساس ، قد تكون إعدادات الإثارة / الانبعاث 460 نانومتر / 510-590 نانومتر HyD X1 و 614 نانومتر / 631-690 HyD X3 و 724-800 نانومتر HyD R وفقا لذلك في تسلسل مسح تسلسلي واحد أو اثنين). من المهم تعيين الكاشف المناسب لجمع الانبعاثات ، حيث يمكن أن يكون للكاشفات حساسية طيفية مختلفة54.
    7. (اختياري ل FLIM) في نافذة الاستحواذ ، اختر وضع FLIM لإجراء التصوير جنبا إلى جنب مع عد الفوتون (مجموعة الاضمحلال). على الفور ، سيتم فتح "وحدة FLIM إضافية في برنامج LAS X" للتنقل وتحليل بيانات FLIM.
    8. (اختياري ل FLIM) اختر معدل تكرار نبض WLL بناء على متوسط عمر الفلوروفور المتوقع.
      ملاحظة: يجب ضبط تردد نبضة الليزر لجمع الاضمحلال الفلوري الكامل. يمكن القيام بذلك باستخدام ميزة Pulse Picker المثبتة على المجهر. سيؤدي تداخل اضمحلال التألق مع نبضة الليزر إلى تقصير عمر التألق المقدر. يوصى بفترات نبضية أطول من 4-5 مرات من متوسط عمر التألق المتوقع (على سبيل المثال ، 25 نانوثانية / 40 ميجاهرتز لعمر يصل إلى 5 نانوثانية). العديد من أجهزة الليزر النبضية لها معدل تكرار ثابت 80 ميجاهرتز (مثالي فقط لنطاق يصل إلى 2-3 نانوثانية). هذا مهم لاختيار الفلوروفورات الصحيحة للتجربة.
    9. ابدأ معاينة التصوير باستخدام وضع FAST LIVE واضبط التركيز البؤري الدقيق لكائن التصوير على قسم مهم.
      تنبيه: اتبع بدقة قواعد سلامة الليزر. ضع في اعتبارك دائما قواعد سلامة الليزر وانتظر حتى يتوقف التصوير قبل تشغيل ضوء الإرسال أو النظر إلى العدسة أو العينة.
      ملاحظة: في وضع FAST LIVE ، يتم تطبيق مسح ضوئي عالي السرعة يبلغ 600 هرتز (يتوافق مع الحد الأقصى لمعدل الإطارات 4.43/s في حالة استخدام وضع المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه)، ودقة 256 × 256 بكسل تلقائيا على الصورة للحفاظ على التألق في مأمن من التبييض الضوئي. افتح الثقب (على سبيل المثال ، إلى 3-4 AU) و / أو قم بزيادة شدة الليزر إذا كانت إشارة التألق ضعيفة جدا بحيث لا يمكن التركيز على الجسم. تجنب جمع الاضمحلال غير الكامل.
    10. (اختياري ل FLIM) من خلال النظر إلى الرسم البياني لشدة البكسل الذي يظهر أثناء التصوير في نافذة وحدة FLIM (الوضع المباشر ) ، اضبط شدة الليزر / حجم الثقب المناسب والدقة لتحقيق معدل العد ~ 1 حد نبضة الفوتون / الليزر (الخط الأحمر). تجنب الذهاب أعلى بكثير من 1 لاستبعاد خطر تأثير التراكم. إذا لزم الأمر ، اضبط معدل تكرار نبضة WLL للحصول على مجموعة اضمحلال كاملة في نافذة اضمحلال (لتجنب تجميع الاضمحلال غير الكامل ، انظر الخطوة 2.2.8).
      ملاحظة: إذا كان عدد الفوتونات (الشدة) غير كاف لإعادة بناء اضمحلال موثوق به لتحليل التركيب أو سحابة مخطط الطور ، فقم بتطبيق عدة تكرارات مسح (إطارات أو خطوط ، أو قم بإعداد وقت المسح) ، وقم بزيادة كثافة الليزر و / أو التضحية بالدقة (حجم عائد الاستثمار الممسوح ضوئيا). كن على علم بأن تقليل معدل تكرار الليزر يتطلب جمع المزيد من الفوتونات لإعادة بناء الاضمحلال بشكل موثوق ، وقد تكون هناك حاجة إلى تصحيح إضافي لمعلمات التصوير. كن على دراية بالتأثير المحتمل للضوء الشديد والإضاءة المستمرة الطويلة على صلاحية الخلية والتمثيل الغذائي55. يمكن أن يكون التأثير السلبي على الجدوى والتمثيل الغذائي مختلفا في كل حالة على حدة ، اعتمادا على شدة ضوء الإثارة ومدته وطوله الموجي ، بالإضافة إلى طريقة التصوير (على سبيل المثال ، التصوير أحادي الفوتون مقابل التصوير متعدد الفوتونات). اضبط معلمات التصوير وفقا لذلك ، وإذا لزم الأمر ، تحكم في صلاحية / موت الخلية بواسطة Calcein Green-AM أو كثافة يوديد البروبيديوم في التجارب التجريبية56. حيثما أمكن ، ينبغي النظر في مزيد من التحسينات لبروتوكول تلطيخ مسبار التألق للوصول إلى إشارة مضان كافية أثناء الفحص المجهري الحي.
    11. (اختياري لمكدس z 3D) أثناء وجودك في Fast Live ، قم بتعيين الإحداثيات واتجاه المسح الضوئي ونسبها إلى البداية والنهاية في نافذة Z-stack (وضع المسح الضوئي XYZ). اختر حجم الخطوة Z أو عدد الخطوات.
      ملاحظة: بينما يقوم البرنامج تلقائيا بحساب العدد "الأمثل" من الخطوات ، بناء على الدقة المستخدمة ومعلمات المسح الضوئي ، يمكن أن تتطلب إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الحية عادة عددا أقل من الخطوات لتحقيق اكتساب سريع ، على سبيل المثال ، حجم خطوة 1-2 ميكرومتر ، حجم مكدس 50-100 ميكرومتر ، مسح ثنائي الاتجاه ، يتطلب 2-3 دقائق من إجمالي وقت المسح. كن على علم بأن العضيات تحت الخلوية والخلايا ونموذج الخلية 3D يمكن أن تتحرك أيضا أثناء القياسات. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لعمق اختراق الضوء وحدود التشتت ، يمكن عادة تحقيق عمق مسح 50-100 ميكرومتر فقط على FLIM متحد البؤر.
    12. عند تطبيق جميع الإعدادات اللازمة ، ابدأ التصوير.
    13. أعط الصورة اسما مناسبا.
    14. ابحث عن كائن التصوير التالي في وضع ضوء الإرسال وكرر إجراء التصوير باستخدام إعدادات التصوير المحسنة مسبقا (الخطوات 2.2.8-2.2.12).
      ملاحظة: بالنسبة للمقارنة القائمة على الشدة أو تحليل نسبة الشدة (على سبيل المثال ، تحليل الأوكسجين القائم على مسبار MMIR O2 ) ، احتفظ دائما بنفس إعدادات التصوير لجميع الكائنات التي تم تحليلها (التكبير ونوع العدسة الموضوعية ، وشدة الليزر ، وتردد الطاقة والنبضة ، والطول الموجي للإثارة ، ونطاق الكاشفات ، والثقب ، وسرعة المسح ، ووقت مكوث البكسل ودقته). ومع ذلك ، نظرا لأن عمر التألق لا يعتمد على شدة التألق ويتطلب عددا مناسبا من الفوتونات التي سيتم جمعها لحساب موثوق به ، يمكن إعادة ضبط معلمات التصوير FLIM خلال التجربة للحفاظ على أرقام الفوتونات المجمعة قابلة للمقارنة بين العلاجات المختلفة أو الظروف التجريبية. لذلك ، بالنسبة للتحليل متعدد المعلمات حيث يلزم إجراء تحليل قائم على الشدة والتحليل القائم على العمر الفلوري ، يجب تطبيق إعدادات التصوير العالمية المحسنة لجميع الكائنات في المجموعات التجريبية المقارنة. بالنسبة للمقارنة "FLIM فقط" ، من الممكن مقارنة الصور التي تم الحصول عليها بإعدادات تصوير مختلفة قليلا حيث يوفر برنامج LAS X حساب IRF لقياس الصورة الفردية42. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل FLIM المناسب خارج LAS X (على سبيل المثال ، FLIMfit45) ، يجب قياس وظيفة استجابة الجهاز (IRF) لكل حالة تصوير مختلفة ، حيث لا يمكن تصديرها من برنامج التصوير. وبالتالي ، من أجل بساطة التصميم التجريبي وعبء العمل ، يوصى بتطبيق نفس إعدادات التصوير لجميع الصور في مجموعة البيانات. بعد ذلك ، يمكن إجراء قياسات IRF المقابلة باستخدام الفلوروفورات المروية أو الفلورية السريعة مدى الحياة (ضمن نطاق ps) مع خصائص الانبعاث للقناة الطيفية المقاسة57،58،59 ، بواسطة تلألؤ جسيمات الذهبالنانوية 60 أو عن طريق إشارة الجيل التوافقي الثاني للفوتونات المتعددة FLIM61. في برنامج LAS X ، يمكن تحميل معلمات التصوير المحسنة مسبقا لمشروع جديد بالنقر بزر الماوس الأيمن على الملف محل الاهتمام واختيار تطبيق إعدادات الصورة.
    15. عند الانتهاء من جلسة التصوير ، احفظ مشروع التصوير. لإنهاء جلسة التصوير ، قم بإزالة العينة من مرحلة الفحص المجهري وتنظيف الهدف من سائل الغمر (إذا تم استخدامه) وفقا للإجراء القياسي المطبق في مرفق التصوير. أغلق المشروع والبرنامج. قم بإيقاف تشغيل المجهر والليزر وجميع الأجهزة المتصلة.
    16. تابع تحليل بيانات التصوير (الخطوة 2.3).
  3. معالجة الصور NAD (P) H / FAD-FLIM مع وحدة LAS X FLIM وفيجي
    ملاحظة: يصف البروتوكول تحليل عمر مضان للكرويات المصورة لبيانات مجال التردد على أمثلة من NAD (P) H و FAD / Flavins autofluorescence FLIM. أصبح قياس التألق الذاتي NAD (P) H معيارا ذهبيا لتحليل التمثيل الغذائي ، حيث ترتبط مكونات عمر التألق الذاتي NAD (P) H القصيرة والطويلة بتحلل السكر أو الفسفرة التأكسدية (OxPhos) ، على التوالي. يمكن تحليل ذلك من خلال التحول على مخطط طوري على طول المسار الأيضي نحو المعايير المقاسة ل NAD (P) H الحر أو NAD (P) H المرتبط بالبروتين31,62. لتحليل مسار التحول الأيضي ، وكذلك لمقارنة موضع سحب الطور (انظر الملاحظة أدناه الخطوة 2.3.6) على مخطط بين المجموعات التجريبية ، تم تنفيذ تحليل إحداثيات طور مبسط ، بناء على حساب المركز الهندسي (centroid) لسحابة الطور29. يوضح البروتوكول الموصوف حساب إحداثيات النقطه الوسطى في فيجي وقياس المسافة بين نقطتين على مخطط طوري باستخدام الإحداثيات (على سبيل المثال ، المسافة من السنترويد لسحابة الطور الكروية NAD (P) H ذاتية التألق إلى نقطة نظرية "NAD (P) H" الحرة). وبالمثل ، يمكن تحليل FAD وإشارات التألق الذاتي الأخرى. مجموعة بيانات 1 مع .lif (يلزم وجود برنامج LAS X) أو .ptu يتم توفير تنسيقات الملفات لتعلم هذا الإجراء (الملف التكميلي 2, الملف التكميلي 3, الملف التكميلي 4, الملف التكميلي 5, الملف التكميلي 6, الملف التكميلي 7, الملف التكميلي 8, الملف التكميلي 9, و الملف التكميلي 10).
    1. افتح وحدة FLIM في LAS X ، وحدد فتح المشروع ، وقم بتحميل ملف الصورة الكروية (.lif) لتحليل NAD (P) H / FAD للتألق الذاتي.
      ملاحظة: نظرا للأخطاء المحتملة وفقدان البيانات الوسيطة في وحدة FLIM ، استخدم نسخة من ملف الصورة الكروية الأصلي (.lif) لتحليل NAD (P) H / FAD ، مع الحفاظ على الملف الخام دون تغيير.
    2. حدد صورة واحدة وانتقل إلى واجهة تحليل FLIM. انقر فوق Phasor للوصول إلى مخطط phasor وتنشيط وضع تحليل الطور. قم بتطبيق المرشح (الوسيط أو المويج) واضبط العتبة لتقليل الضوضاء وتحسين رؤية البيانات لجميع تحليلات الطور. اختر التوافقيات. لتحليل التحول الأيضي بناء على بيانات NAD (P) H ، تابع الخطوات 2.3.3-2.3.5. للمقارنة العامة لمخططات الطور ، انتقل من الخطوة 2.3.6.
      ملاحظة: قم بتطبيق إعدادات التحليل (نوع المرشح ، والتوافقيات ، والعتبة ، والتجميع ، وعائد الاستثمار على الطور) بالتساوي على جميع الصور في مجموعة بيانات مقارنة.
    3. (اختياري لتحليل NAD (P) H) اختر أي صورة متعلقة بمجموعة البيانات واستخدم خيار مؤشر نسبة الرسم لمكونين لتحديد موقع موضع 0.45 نانوثانية بدقة على دائرة عالمية لمساحة مخطط طور قياسي. سيتم تعيين هذا الموضع لمتوسط عمر مضان لمحلول متجانس نقي من NAD (P) H ، والذي عادة ما يكون قريبا من الاضمحلال الأسيالأحادي 62.
      ملاحظة: Free-NADH و Free-NAD (P) H لهما خصائص طيفية متشابهة وقيم مماثلة لعمر التألق في محلول الماء ، مع مكونين قصيرين العمر ، 0.3 نانوثانية و 0.7 نانوثانية63. وبالتالي ، من أجل بساطة التحليل القائم على الطور وبسبب الاختلاف البسيط بين مكونات العمر ، يتم قبول اضمحلال الفلورة الخاص بهم ليكون أحادي الأس ، مما يسمح بتخصيص سحابة الطور على دائرة عالمية. يمكن أيضا قياس متوسط العمر المرجعي لشكل NAD (P) H الحر ورسمه في فضاء الطور لإجراء تحليل مماثل. تم اختيار العمر المرجعي بناء على الأدبيات62 ؛ لاحظ أنه في مصادر أخرى ، يمكن العثور على قيمة مختلفة قليلا ل NAD (P) H الحر في المحلول (0.4 ns64).
    4. (اختياري لتحليل NAD (P) H) قم بتصدير مخطط الطور مع عمر NAD (P) H المجاني المخصص (انظر الخطوة 2.3.3) بالنقر بزر الماوس الأيمن على قطعة الأرض وتحديد تصدير البيانات. تصدير مخطط phasor كملف بتنسيق .tiff إلى مجلد تخزين معين.
      ملاحظة: حجم البكسل الأصلي لصورة مخطط الطور المصدرة من وحدة LAS X FLIM هو دائما 1024 × 600 بكسل. إذا تم استخدام برنامج آخر لتصدير البيانات والتحليل المسبق ، فتأكد من تصدير جميع صور مخطط الطور بنفس الحجم والدقة.
    5. لتصدير سحابة phasor ذات الصلة بالكرة ، استخدم أداة Draw Cursor في وحدة LAS X FLIM لاختيار عائد الاستثمار الكروي على الصورة. تصدير مخطط المرحلة الذي تم إنشاؤه كما هو موضح في الخطوة 2.3.4.
      ملاحظة: سيتم تعيين إحداثيات g و s المقابلة (على غرار x و y) لمساحة الطور لكل بكسل من عائد الاستثمار المختار ، وفقا لعمرها الافتراضي ، وتحويلها إلى مجموعة بيانات مجال التردد64,65. ستشكل مجموعة وحدات البكسل ذات القيم المتشابهة tf (عمر الطور) و tm (عمر التعديل) نمطا سحابيا (سحابة الطور) على مخطط ، حيث يعكس الترميز اللوني (مع نطاق من الأزرق الغامق إلى الأحمر) وفرة قيم العمر. من خلال موضع السحابة على دائرة عالمية أو داخلها ، يمكن تمييز الاضمحلالات الأحادية أو المتعددة الأسية. تظهر بعض وسائط القياس مضانا قويا (تلقائيا) ، مما يؤدي إلى ظهور سحابة مقابلة على مخطط طوري ، والذي لا يمكن إزالته ببساطة باستخدام عتبة الشدة. سيؤثر هذا النمط على حساب إحداثيات النقطه الوسطى ويجب استبعاده من مخطط الطور المصدر. يسمح العمل مع عائد الاستثمار الكروي باستبعاد وحدات البكسل غير ذات الصلة من تحليل المرحلة الإضافي.
    6. كرر إجراء تصدير مخطط الطور لجميع عائد الاستثمار الكروي في مجموعة بيانات (انظر الخطوتين 2.3.4 و2.3.6). بالإضافة إلى ذلك، تحقق من مجموعة الصور .tiff المصدرة لضمان مجموعة البيانات الكاملة لمزيد من التحليل المقارن والتأكد من أن جميع الصور المصدرة لها نفس حجم البكسل (انظر الملاحظة في الخطوة 2.3.4).
      ملاحظة: في هذه المرحلة من البروتوكول ، يجب أن تتضمن مجموعة الصور phasor مع موقع NAD (P) H المجاني (استنادا إلى الأدبيات أو البيانات التي تم الحصول عليها تجريبيا) وجميع مخططات الطور الكروية ROI (أو أنماط عائد الاستثمار البديلة إذا لزم الأمر للتحليل المحدد). من هذه الخطوة ، سيتم إجراء مزيد من التحليل في فيجي وبعد ذلك في جدول بيانات. باستخدام نافذة أداة التحليل ، قم بتعيين خيار المقياس في FIJI ، وتأكد من معايرة جميع صور رسم الطور بنفس نوع الوحدة ، على سبيل المثال ، بالبكسل فقط. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتعيين طول الوحدة في نافذة Set Scale للوحدة المختارة (على سبيل المثال ، للمقياس المستند إلى البكسل ، ضع 1 في حقل المسافة بالبكسل واضبط وحدة الطول على Pixel). لمزيد من المقارنة ، قم بقياس جميع البيانات المصدرة باستخدام نفس نوع الوحدة.
    7. (اختياري لتحليل NAD (P) H) تحديد موضع نقطة البكسل لمتوسط عمر مضان NAD (P) H حر على صورة مخطط الطور المصدرة المقابلة (انظر الخطوة 2.3.3): افتح صورة الطور باستخدام FIJI ، وقم بتكبير الصورة لتصور بوضوح بدقة بكسل التقاطع بين نصف الدائرة العالمية وخط مؤشر النسبة لمكونين ؛ استخدم أداة عائد الاستثمار المستطيل لتحديد التقاطع.
      ملاحظة: تأكد من أن التحديد المستطيل عبارة عن منطقة صغيرة حول نقطة التقاطع لتحديد إحداثياتها بدقة في الخطوة التالية (الخطوة 2.3.9).
    8. (اختياري لتحليل NAD (P) H) افتح أداة التحليل ، واختر نافذة ضبط القياسات ، وحدد Centroid كمعلمة قياس. انقر فوق قياس في نافذة أداة التحليل لتحديد إحداثيات النقطه الوسطى للنقطة المرجعية المجانية NAD (P) H. تصدير هذه الإحداثيات إلى جدول بيانات.
      ملاحظة: سيتم استخدام إحداثيات FREE-NAD (P) H كنقطة مرجعية لمقارنة المسافات من هذه النقطة إلى موقع سحابة الطور الكروي في مجموعة بيانات (طريقة توصيف التحول الأيضي بين تحلل السكر و OxPhos في تحليل التألق الذاتي NAD (P) H FLIM)
    9. باستخدام فيجي ، افتح صورة سحابة الطور الكروية. افتح أداة نافذة الصورة، اختر ضبط، وحدد عتبة اللون في شريط الأدوات. حدد طريقة العتبة التي تختارها (على سبيل المثال ، Otsu) ، وقم بتعيين قيمة Hue وقيمة السطوع لتضييق المعلمات لاختيار جزء سحابة الطور مع إحداثيات البكسل الأكثر وفرة. انقر فوق تحديد لتحديد منطقة الكتلة.
      ملاحظة: احتفظ بنفس معلمات العتبة لجميع صور مخطط الطور ، والتي يجب تحليلها. بالنسبة لبيانات NAD (P) H-FLIM المقدمة ، تم اختيار طريقة العتبة Otsu مع مجموعة Hue Value 9 وقيمة السطوع 160 وتطبيقها على جميع صور phasor. بدلا من ذلك ، يمكن نسخ المنطقة المحددة إلى ROI Manager (اتبع المسار تحرير > التحديد > إضافة إلى المدير) لإنشاء مكتبة من عائد استثمار المرحلة لمزيد من التحليل.
    10. مع الاحتفاظ بالتحديد ، احسب إحداثيات النقطه الوسطى للمنطقة المحددة باتباع الإجراء الموضح في الخطوة 2.3.9. تصدير هذه الإحداثيات إلى ملف جدول البيانات.
    11. كرر الخطوتين 2.3.9 و2.3.10 لتحديد إحداثيات النقطه الوسطى لجميع صور مرحلة عائد الاستثمار لإنشاء مجموعة بيانات في جدول البيانات.
      ملاحظة: يساعد استخدام مكتبة عائد الاستثمار لمدير عائد الاستثمار على تبسيط تحليل عائد الاستثمار وتنظيمه (راجع الخطوة 2.3.10)
    12. (اختياري لتحليل NAD (P) H) افتح جدول البيانات باستخدام إحداثيات NAD(P)H وعائد الاستثمار الكروي المرجعي المصدر من مجموعات مقارنة مختلفة. احسب المسافة بين كل نقطة مركزية كروية فردية للإشارة إلى موضع NAD (P) H الحر باستخدام الإحداثيات المحددة والمعادلة التالية:
      figure-protocol-1
      حيث ، Xc و Yc هي إحداثيات مركزية ، Xf و Yf هي الإحداثيات المرجعية.
      ملاحظة: تطبيق معلمة centroid لتحديد التحول نحو العمر المرجعي مناسب فقط في حالة وجود جميع centroids من مجموعة بيانات على نفس المسار الخطي نحو النقطة المرجعية. للتحقق من ذلك ، يجب رسم جميع نقاط centroid من مجموعة البيانات مع النقطة المرجعية في نفس مساحة الإحداثيات ، ويجب إجراء محاذاة الاتجاه الخطي. إذا كان معامل R2 لخط الاتجاه الخطي المرسوم عبر جميع النقاط قريبا من 1 (على سبيل المثال ، R2 هو 0.8-0.99) ، يفترض أن يكون تحليل المسافة مناسبا.
    13. تنظيم جميع البيانات وفقا للمقارنة وإجراء التحليل الإحصائي باستخدام أي برنامج مطابق (على سبيل المثال ، Origin ، MatLab). اختيار الاختبار الإحصائي المناسب وفقا لخصائص مجموعة البيانات (التوزيع الطبيعي ، عدد الوحدات الإحصائية ، إلخ).
      ملاحظة: لتحليل NAD (P) H ، قارن قيم المسافة لتوصيف التحول الأيضي اعتمادا على الظروف التجريبية. لمقارنة أي مخططات طور بين المجموعات التجريبية ، قم بإجراء مقارنة إحداثيات سنترويدات سحابة ROI.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اختيار طريقة تكوين كروية مناسبة
يمكن أن تؤثر طريقة تكوين الكرة المختارة بشكل كبير على حجم الكرات وشكلها وكثافة الخلية وصلاحيتها وحساسية الدواء (الشكل 2). في السابق ، تمت مقارنة تأثيرات العديد من الطرق عالية الإنتاجية (SphericalPlate 5D ، والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر ، وقوالب MicroTissue) و "الإنتاجية المتوسطة" منخفضة التعلق (Biofloat وألواح 96 بئرا المطلية بالدهون) على صلاحية الكائنات الكروية والأوكسجين29.

هنا ، تؤدي طرق التكوين المختلفة إلى كرويات بأحجام مختلفة ، حتى مع نفس التركيز الأولي ل 500 خلية / كروية. كانت كرويات HCT116 المتكونة في ألواح بئر 96 منخفضة المرفق أكبر بكثير مقارنة بطرق الإنتاجية العالية بعد 5 أيام من التكوين (الشكل 2 والجدول 2). علاوة على ذلك ، أدت طرق التعلق المنخفضة إلى التطور الواضح لنواة نخرية تم اكتشافها بواسطة تلطيخ يوديد البروبيديوم (أحمر) ، بينما أظهرت الأجسام الكروية المتولدة بطرق أخرى (MicroTissue ، والقوالب المصنوعة في المختبر ، واللوحة الكروية 5D) التوزيع المنتشر للخلايا الميتة عبر الجسم الكروي (الشكل 2 أ). يمكن أن يؤثر هذا الاختلاف في صلاحية الخلية عبر حجم الكرة الأرضية أيضا على انتشار الأكسجين عبر الوسائط ، والذي بدوره يمكن أن يتأثر بالضغط الجزئي O2 ومعدل الاستهلاك ودرجة الحرارة وقابلية الذوبان O2. بالإضافة إلى ذلك ، في طرق الإنتاجية العالية ، يتم استنفاد العناصر الغذائية ، وتتراكم النفايات بشكل أسرع حيث يكون عدد أكبر من الكائنات الكروية ضمن نفس الحجم وبالتالي تتطلب تبادلا أكثر تكرارا للوسائط (الشكل 2 أ).

تم قياس الأوكسجين الكروي الكلي باستخدام مسبار MMIR129 الذي تم توصيفه والتحقق من صحته مؤخرا ، مع بروتوكول مفصل تم الإبلاغ عنه سابقا25. لا يمكن مقارنة الأوكسجين إلا بين طرق الإنتاجية العالية وطريقة التعلق المنخفض بشكل منفصل (الشكل 2 ب) ، حيث تختلف نسبة الإشارة إلى الضوضاء في جميع طرق تكوين كروية مقارنة. أظهرت الصفائح الكروية 5D كروية أكسجة إجمالية أقل مقارنة بالأنسجة الدقيقة (قيمة P = 0.0697) والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر (قيمة P = 0.0005) (الشكل 2C). تزرع الأجسام الكروية المنتجة باستخدام الصفيحة الكروية 5D على مسافة أكبر من سطح واجهة الهواء للوسائط مقارنة بطرق قالب الأغاروز ، مما يتسبب في تسليم O2 أبطأ في الثقافة الثابتة. هذه الفرضية صالحة لأن قيم الأوكسجين بين كل من لوحات التعلق المنخفضة ، بالإضافة إلى ذلك ، بين طريقتي قالب الأغاروز متشابهة إحصائيا (الشكل 2 د).

figure-results-1
الشكل 2: تؤثر طرق تكوين الكرة على التشكل والحجم والصلاحية والأكسجين. (أ) نمت كرويات HCT116 (كثافة البذر الأولية 500 خلية) لمدة 5 أيام قبل تلطيخ 1 ساعة طويلة مع Propidium Iodide (نخر الخلايا ، أحمر ، 1 ميكروغرام / مل) و Calcein Green-AM (خلايا قابلة للحياة ، خضراء ، 1 ميكروغرام / مل). تنتج طرق التكوين منخفضة التعلق كرويات أكبر تحتوي على نواة نخرية (حمراء). شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. (ب) أظهر الأوكسجين في الأوكسجين HCT116 (البذر الأولي ل 500 خلية مع إضافة 20 ميكروغرام / مل MMIR1 أثناء تكوين كروي ، 6 أيام) المنتجة بطرق مختلفة المزيد من الكرويات المؤكسجة مع MicroTissue والقوالب الدقيقة المصنوعة في المختبر من SphericalPlate 5D. (C) الأوكسجين الكروي الكلي المحسوب بواسطة قياسات النسبة. (د) حجم الأجسام الكروية في مربع المنطقة بعد 5 أيام. تظهر النتائج متوسط ± SEM من 6-16 كروية. 5D = لوحة كروية 5D ، MM = طريقة Micromold ، MT = طريقة الأنسجة الدقيقة. القيمة الاحتمالية < 0.001 و **** القيمة P <0.0001 الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طريقة التكوينكمية الكرويات لكل بئرإجمالي كمية الخلايا المزروعة لكل بئرمساحة مربعة (ميكرومتر مربع)
الأنسجة الدقيقة8140500 خلية/190 ميكرولتر112,558 ± 15,702
الآبار الصغيرة المصنوعة في المختبر1859794500 خلية / مل53,460 ± 8,332
لوحة كروية 5D750375000 خلية / مل44,048 ± 7,259
ليبيور1500/200 ميكرولتر257,148 ± 28,132
تعويم حيوي1500/200 ميكرولتر254,475 ± 21365

الجدول 2: تؤدي طرق تكوين كروية مختلفة إلى اختلافات في حجم الكرة ، مقاسة بمربع المساحة.

عند اختيار طريقة تكوين كروية محددة للتجارب ، يجب أن يوضع في الاعتبار أن إضافة الجسيمات النانوية يمكن أن تؤثر على شكل الكروي. عند استخدام الطلاء القائم على الدهون مع الآبار الدقيقة ذات القاع المستدير ، يمكن أن يحدث ترسيب المسبار ، مما يؤدي إلى تكوين "كرويات الأقمار الصناعية" أو كرويات غير دائرية (الشكل 3). تؤدي إضافة مسبار O2 إلى لوحة Biofloat التجارية إلى محيط كروي غير مضغوط ، مما يشير إلى التداخل المحتمل للجسيمات النانوية مع طلاء الصفيحة الدقيقة. يمكن أن تتأثر مورفولوجيا الأجسام الكروية أيضا بالغبار المتصل بأطراف الماصة. يمكن أن تلتصق الخلايا المعلقة بالغبار ، مما يؤثر بالتالي على الشكل. لذلك ، يوصى باستخدام أطراف ماصة قابلة لإعادة التعبئة تم توفيرها بالفعل في رف.

figure-results-2
الشكل 3: صور مجهرية لضوء الإرسال مع أمثلة على تكوين كروي غير مثالي. يمكن أن يتسبب التخزين غير الصحيح للجسيمات النانوية في ترسيب المسبار ، مما يتداخل مع تكوين كروي. أمثلة على تداخل المسبار والغبار. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من الواضح أن طرق تكوين الكرة تؤثر على حجم الكروية ومورفولوجيتها وصلاحيتها ، وتؤدي إلى اختلافات في أكسجينها. طريقة الإنتاجية العالية مع قوالب الأغاروز (على سبيل المثال ، المتاحة تجاريا ، مثل قالب MicroTissue) متوافقة مع معظم التجارب. ينتج عنه شكل أكثر قابلية للتكرار ، ولا يحفز ترسيب الجسيمات النانوية ، ويمكن إعادة استخدامه ، ويمكن أن يكون متوافقا مع الفحص المجهري للمتابعة المباشرة. ومع ذلك ، بالنسبة للكرويات الكبيرة (>800 ميكرومتر) والزراعة طويلة الأجل ، يوصى باستخدام طريقة التعلق المنخفض لأن طرق الإنتاجية العالية تتطلب تبادلا متكررا للوسائط. في مثل هذه الحالة ، يمكن تجنب مشكلة ترسيب الجسيمات النانوية وتأثيرها على تكوين كروي من خلال تلطيخ ما قبل الليل لثقافة أحادية الطبقة 2D قبل تكوين كروي (الشكل 4).

figure-results-3
الشكل 4: خوارزمية مقترحة لاختيار طريقة تكوين كروية للفحص المجهري الفلوري الحي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

  

يكشف تصوير FLIM متعدد المعلمات للكرويات NAD (P) H عبر مجهر FLIM ثنائي الفوتون عن عدم التجانس الأيضي في كرويات HCT116
علامة تألق ذاتي بارزة في التصوير الأيضي الخالي من الملصقات ، يظهر NAD (P) H عمرا أقصر لتحلل السكر وعمرا أطول ل OxPhos ، مما يتيح فك رموز التوزيع المكاني للنشاط الأيضي في نماذج ثلاثية الأبعاد مثل الكرات والكائنات العضوية31. لتحليل توزيع NAD (P) H بشكل ملائم في كرويات HCT116 ، تم استخدام طريقة كمية قائمة على الطور لتحليل NAD (P) H ذاتي التألق ، وكشف عن تحلل السكر والحالات المرتبطة بالفسفرة التأكسدية (OxPhos). في حين أن صور شدة التألق للكرويات HCT116 لم تكشف عن اختلافات كبيرة بين الأجسام الكروية ، كشف التصوير السريع FLIM ل NAD (P) H عن اختلاف واضح داخل المقاطع البصرية الكروية. في صور FLIM السريعة ، تم تمييز الأجسام الكروية ذات المساحة الداخلية التي تعرض عمرا مضانا أقصر بدائرة بيضاء ، مع تحديد ذلك على أنه نواة تحلل للسكر (الشكل 5 أ). وبالتالي ، تم تقسيم الكرويات إلى مجموعتين ، المجموعة الأساسية المحللة للسكر والمجموعة الأساسية غير المحللة للسكر ، بناء على وجود أو عدم وجود نواة تحلل السكر. تم استخدام تحليل الطور القائم على النقطتين الوسطى لتحليل الاختلافات إحصائيا بين مجموعتين متميزتين وقياس المسافة من النقطه الوسطى لمجموعة البكسل إلى نقطة NAD (P) H الحرة. كما هو موضح في الشكل 5 ب ، كان هناك فرق واضح في مجموعة البكسل بين مجموعة تحلل السكر والمجموعة غير المحللة للسكر على مخطط الطور. لقياس المسافة بدقة، تم تحديد نقطة NAD(P)H المجانية على مخطط الطور بدقة باستخدام وحدة FLIM في برنامج LAS X، ثم تم تصديرها إلى برنامج فيجي لتحديد الإحداثيات الدقيقة. بعد ذلك ، وفقا للبروتوكول 2.3 ، تم قياس إحداثيات النقطه الوسطى في مخطط الطور لكل مجموعة باستخدام برنامج FIJI. تم حساب المسافة (D) من النقطه الوسطى إلى نقطة NAD (P) H الحرة ، باستخدام نظرية فيثاغورس ، لتسهيل تحليل ملفات تعريف NAD (P) H للتمييز بين كرويات OxPhos والكروية ذات النواة المحللة للسكريا. تظهر النتائج ، كما هو موضح في مخطط الصندوق ، اختلافات المسافة ذات الدلالة الكبيرة بين كرويات النواة المحللة للسكر والمجموعة الأساسية غير المحللة للسكر (***P-value < 0.001) (الشكل 5C). كانت هذه النتيجة متسقة مع التصوير السريع FLIM ، مما يدل على أن طريقة تحليل الطور هذه مناسبة للتحليل الكمي لتباعد NAD (P) H لمجموعات كروية. علاوة على ذلك ، للتحقق مما إذا كان هذا النهج قابلا للتطبيق لمقارنة المسافة بين المجموعتين الكرويتين ، تم إجراء تحليل الانحدار الخطي للسنترويدات من كلتا المجموعتين ونقطة NAD (P) H الحرة (الشكل 5D). أظهرت النتائج أن النقطات المركزية تتماشى مع NAD (P) H الحر ، مع معامل ارتباط مرتفع (R2 = 0.997) ، مما يؤكد جدوى مقارنة المسافة لاستنتاج فرق NAD (P) H بين المجموعات الكروية.

figure-results-4
الشكل 5: تحليل Phasor للكرويات HCT116 المصنوعة باستخدام ألواح منخفضة التعلق: مقارنة النوى المحللة للسكر وغير المحللة للسكر لتوزيع NAD (P) H عبر FLIM ثنائي الفوتون. معلمات الاستحواذ: كثافة الليزر: 15٪ ، الدقة: 512 × 512 بكسل ، على سبيل المثال 741 نانومتر / إم. 411-491 نانومتر. (أ) تعرض شدة التألق وصور FLIM السريعة توزيع NAD (P) H في كرويات HCT116 ، مما يميز الكرويات ذات النواة المحللة للسكر (يسار) عن تلك التي لا تحتوي على (يمين). عرضت الدائرة البيضاء في صورة FLIM السريعة منطقة عمر أقصر ، تحدد نواة تحلل السكر. كثافة البذر الأولية: 50 خلية (يسار) و 500 (يمين) ، وقت الحضانة: 6 أيام ، شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ب) منهجية قياس المسافة من السنترويد الكروي HCT116 لتحرير نقطة NAD (P) H على مخططات الطور ، باستخدام وحدة LAS X FLIM وبرمجيات فيجي عبر مجموعتين كرويتين متميزتين (D: المسافة). بالنسبة للكرويات HCT116 ، تم استخدام مرشح المويجات وقيمة العتبة 10 لمخطط الطور. (C) مخطط صندوقي يوضح الفرق في المسافة من النقطة المركزية إلى نقطة NAD (P) H الحرة ، ويقارن بين المجموعات الأساسية المحللة للسكر والمجموعات الأساسية غير المحللة للسكر (***P < 0.001). (د) أظهر التركيب الخطي للسنترويدات المخططة للطور من قلب التحلل للسكر ، والمجموعات الأساسية غير المحللة للسكر ، والإحداثيات النظرية NAD (P) H الحرة محاذاة خطية دقيقة مع R2 = 0.997 ، مما يسمح بإجراء مقارنة مباشرة لفرق المسافة بين اللب المحلل للسكر والكرويات الأساسية غير المحللة للسكري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل متعدد الإرسال للتألق الذاتي FAD ونقص الأكسجة في كرويات لب الأسنان البشرية (DPSC)
كرويات الخلايا الجذعية لب الأسنان هي أداة تجريبية جذابة للتصنيع الحيوي للأنسجة المختلفة ، بما في ذلك بانيات العظم25،66،67. ومع ذلك ، نادرا ما يتم دراسة صلاحيتها والتمثيل الغذائي. تعرض هذه الكرات المشتقة من الخلايا الجذعية أحجاما صغيرة إلى حد ما (<200 ميكرومتر) ، وتألق ذاتي أخضر فاتح من FAD / Flavins (يشار إليه لاحقا باسم FAD) (على سبيل المثال 460 نانومتر ، em. 550 نانومتر) ووجود تدرجات نقص الأكسجين "المباشرة" و "المقلوبة"29. يوضح الشكل 6 نتائج التصوير النسبي البؤري المشترك لأكسجة الكرويات (بمساعدة الجسيمات النانوية O2-Sensing MMIR) والتألق الذاتي FLIM ل FAD. لوحظ تدرج الأوكسجين المباشر "الكلاسيكي" في كرويات قطرها 69 مم ، بينما أظهر كروي أكبر (141 ميكرومتر) تدرجا "مقلوبا". تساعد إضافة FAD-FLIM إلى هذه القياسات على التحقق من صحة الاختلافات في التمثيل الغذائي التأكسدي ، كما توضح مخططات FLIM و phasor السريعة: أظهرت الكرات الصغيرة جزءا أكثر بروزا من عمر FAD الأطول ، مما قد يشير إلى نشاط تحلل السكر أعلى في الكرات الأصغر حجما.

figure-results-5
الشكل 6: مثال على التصوير متعدد المعلمات للتألق الذاتي للفلافين (على سبيل المثال 460 نانومتر / م 510-590 نانومتر) والأوكسجين (تحليل نسبة الشدة باستخدام الجسيمات النانوية الحساسة MMIR O2 : على سبيل المثال 614 نانومتر / المرجع em. 631-690 نانومتر / حساس em. 724-800 نانومتر) في كرويات hDPSC ذات أحجام مختلفة (صغيرة: 188 خلية / كروية ، كبيرة: 820 خلية / كروية) ، يتم إنتاجها بواسطة طريقة قوالب الأغاروز الدقيقة عالية الإنتاجية المنتجة ذاتيا (FLIM متحد البؤر). (أ، ب) مثال تمثيلي لنسبة كثافة الأوكسجين والتصوير مدى الحياة للفلافين الذاتي في كرويات hDPSC الكبيرة (A ، "B Sphs") والصغيرة (B ، "S Sphs"). (ج، د) تحليل مقارن لعمر الفلافين-الفلورة الذاتية باستخدام تحليل سحابة مخطط الطور ، بناء على مقارنة المراكز الهندسية لسحابة الطور. (ه) إحداثيات سنترويدات البكسل (المراكز الهندسية) للفلافين الذاتي الفلوري من كروي hDPSC الكبير (B Sphs) والكروي الصغير hDPSC (S Sphs) على مخطط الطور. تم تطبيق رمزين لونيين مختلفين لمناهج تحليل FLIM مختلفة ، حيث يظهر الترميز اللوني باستخدام τ متوسط وقت وصول الفوتون (صور FAST-FLIM) ، بينما يتوافق الترميز اللوني مع τ φ - tau مع تحليل phasor-FLIM لعمر التألق في نفس الكرات الكروية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحليل متعدد الإرسال للتألق الذاتي FAD وموت الخلايا في كرويات iPSC البشرية
غالبا ما تستخدم الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) المستحثة بشريا كخطوة أولى أثناء تحريض التمايز الخاص بالأنسجة وإنتاج المواد العضوية ، على سبيل المثال ، في حالة الثقافة العضوية العصبية. اعتمادا على التعامل معها وبروتوكول التوليد المحدد ، يمكن أن تتأثر بشدة قابلية الصلاحية والتكاثر اللاحق للعضويات. يعد التحقيق غير المدمر للعضويات والأجسام الكروية المحتوية على الخلايا السلفية العصبية أمرا بالغ الأهمية للتقييم الهيكلي والمراقبة والتنبؤ بجودة الأنسجة العصبية النامية والمجمعة أثناء تطورها68,69. يوضح الشكل 7 أ أن FLIM غير المدمر لجزيئات Flavin/FAD ذاتية الفلورسنت يمكن أن يزودنا بمعلومات حول صلاحية الأجسام الكروية iPSC. تم إجراء التصوير بعد 4 أيام من بذر 9000 iPSCs في آبار ألواح التعلق التجارية المنخفضة للغاية (Corning). قبل التصوير ، تم تلطيخ الأجسام الكروية لمدة 1 ساعة ب 0.5 ميكروغرام / مل من البروبيديوم يوديد (PI) لتصور الخلايا الميتة. لم يلاحظ أي نوى نخرية في هذه الكرويات iPSC بكثافة بذر تبلغ 9000 خلية بعد 4 أيام. يمكن تمييز ثلاثة أنماط رئيسية على مخطط الطور المقابل للفلافين / FAD autofluorescence (الشكل 7B اللوحة اليسرى): نمط التألق الذاتي للوسائط (اللون الأرجواني) ، النمط (بمتوسط τ φ - طور تاو ، ~ 2.6 نانوثانية) المقابلة لعدم وجود مناطق PI (ROI1) ونمط (بمتوسط τ φ ~ 3.1 نانوثانية) للمناطق المرتبطة بعلامة موت الخلية - تلطيخ (ROI2). أظهرت مقارنة إضافية لثقافات 2D المعالجة وغير المعالجة ب PI ل iPSCs عدم وجود تأثير ل PI على ظهور أنماط مراحل الفلافين / FAD طويلة العمر (الشكل 7C) ، مما يشير إلى أن هذه الزيادة في عمر الفلافين / FAD يمكن أن تكون علامة مستقلة على قابلية الصلاحية المعرضة للخطر ل iPSCs والخلايا المشتقة منها. في حين أن هذه الملاحظة تتماشى مع التقرير الأخير عن التصوير القائم على الكثافة70 ، لا يمكننا استبعاد وجود كثافة يوديد البروبيديوم تماما مع قناة انبعاث FAD (506-582 نانومتر). هناك حاجة إلى مزيد من التحقيق لإثبات العلاقة بين تغييرات عمر الفلافين / FAD والأحداث المحتملة لموت الخلايا. يوضح التحليل البسيط متعدد المعلمات القائم على الطور لمناطق عائد الاستثمار طريقة أنيقة للفحص السريع وتحليل البيانات.

figure-results-6
الشكل 7: تلطيخ FLIM أحادي البؤر للفلافين ويوديد البروبيديوم في كرويات iPSC لتقييم صلاحية الخلية. (أ) الفلافين الذاتي الفلوري (يسار) والبروبيديوم يوديد - PI (يمين) FLIM لكروي iPSC بعد 4 أيام من بذر 9000 خلية في لوحة ربط منخفضة للغاية (Corning) وتلطيخ PI (0.5 ميكروغرام / مل ، 1 ساعة) قبل التصوير. (ب) تحليل مخطط Phasor للتألق الذاتي للفلافين (يسار) ويوديد البروبيديوم (يمين) الصور الإجمالية وعائد الاستثمار المقابل (ROI1 - الأخضر و ROI2 - الأحمر ، التألق الذاتي للوسائط - أرجواني). تم اختيار عائد الاستثمار بناء على وجود ملصقات يوديد البروبيديوم. (ج) تحليل مخطط FLIM و phasor السريع للفلافينات ذاتية التألق في ثقافة 2D من iPSC المعالجة وغير المعالجة ب PI (0.5 ميكروغرام / مل ، 1 ساعة). لم يتم الكشف عن أي تأثير لتلطيخ PI على مظهر العمر الفلوري الطويل للفلافينات (يتوافق مع نمط الطور داخل دائرة وردية) عند جمع إثارة الفلافين في نطاق من 469-542 نانومتر. لا يتداخل نطاق الكاشف هذا مع طيف الإثارة ل PI (550-720 نانومتر). عندما يتم جمع نطاق إثارة أوسع ل FAD (469-590 نانومتر) يمكن ملاحظة تأثير PI. يتوافق الترميز اللوني للصورة مع متوسط قيم وقت وصول الفوتون (fast-FLIM). كانت معلمات التصوير T = 35 درجة مئوية ، 25X / 0.95 هدف الغمر بالماء (A-B) ، 40X / 1.25 هدف الجلسرين (C). فلافينز: على سبيل المثال 460 نانومتر ، م. 506-582 نانومتر (A-B) ، الثقب 4 AU. PI: على سبيل المثال 535 نانومتر ، em. 584-667 نانومتر ، الثقب 1 AU. القنوات: كثافة وتاو. معدل التكرار 40 ميغاهيرتز لجمع الاضمحلال الكامل للفلافين الذاتي الفلوري. إعدادات تحليل Phasor ؛ التوافقي 1 ، العتبة 1 (أ-ب) ، 47 (ج) ، المرشح المتوسط 17 (أ-ب) ، 11 (ج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: بروتوكولات إضافية حول تكوين كروي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: بيانات FLIM للنواة المحللة للسكر و core.lif غير المحللة للسكري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: بيانات FLIM ل core.ptu حال للسكري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: بيانات FLIM ل core.ptu غير المحللة للجليكوليتيك. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: نواة تحلل السكر سريعة FLIM.tif الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: FLIM.tif سريع النواة غير المحللة للسكر الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 7: point.tif NAD (P) H الخالية من اللب السكري الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 8: plot.tif الطور الأساسي للسكر الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 9: point.tif NAD (P) H الخالية من اللب غير المحللة للسكر الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 10: plot.tif الطور الأساسي غير المحللي للسكر الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الكرات متعددة الخلايا طريقة مفضلة في دراسات البيئات الدقيقة المتخصصة للأورام والخلايا الجذعية ، واكتشاف الأدوية ، وتطوير "لبنات بناء الأنسجة" للتصنيع الحيوي. يمكن أن تحاكي البنية الداخلية غير المتجانسة للكرويات وتدرجات العناصر الغذائية والأوكسجين تلك الموجودة في الأنسجة والأورام في الجسم الحي في بيئة مبسطة نسبيا ويمكن الوصول إليها. مع الحاجة إلى مزيد من الشفافية المنهجية26,28 والتوحيدالقياسي 71 ، من المتوقع أن تساعد هذه البروتوكولات الباحثين على اختيار أفضل طريقة تكوين كروية لتجارب الفحص المجهري للتصوير الكمي الحي مدى الحياة. تستفيد الطرق المقدمة من مستشعرات الجسيمات النانوية تلطيخ الخلايا والتألق الذاتي الخلوي الداخلي ، والتي يمكن دمجها بسهولة مع موت الخلايا الملطخة.

الخطوات الأكثر أهمية هي في بروتوكول تشكيل كروية. وبالتالي ، بالنسبة للطريقة القائمة على الأغاروز عالية الإنتاجية ، من الضروري موازنة قوالب الأغاروز بشكل كاف لوسائط الاستزراع. سيؤدي وقت التوازن غير الكافي إلى تخفيف العناصر الغذائية في PBS المتبقية وجلب عوامل إضافية لعدم تجانس كروي21،26،72،73. يجب أيضا فحص قالب الأغاروز الطازج بصريا بحثا عن وجود فقاعات هواء وشقوق صغيرة وعيوب أخرى.

على الرغم من كفاءته في التصوير ، إلا أن تعليق الجسيمات النانوية يمكن أن يعرض التجميع الذاتي ويتسبب في تكوين كرويات غير منتظمة الشكل في طرق تكوين منخفضة التعلق. يمكن التخفيف من ذلك غالبا عن طريق إضافة المصل إلى وسائط الاستزراع أو عن طريق تلطيخ ثقافة الخلايا أحادية الطبقة مسبقا قبل تكوين كروي. في كثير من الأحيان ، أثناء ضغط الكرة ، يمكن أن تساعد إضافة كمية صغيرة من الجسيمات النانوية (على سبيل المثال ، 10٪ من تركيز التلوين الأولي) أيضا في تلطيخ منطقة تكاثر الأجسام الكروية. أخيرا ، من المهم استخدام أطراف ماصة معقمة "خالية من الغبار" مع جميع طرق التكوين.

يجب دائما مراعاة التأثير المحتمل للإضاءة على صلاحية الخلية أثناء تجارب التصوير. وبالتالي ، من المهم معرفة عوامل الخطر التي تؤثر سلبا على كل تجربة تصوير مباشر. بشكل عام ، يتضمن التلف الضوئي عدة آليات: (1) ارتفاع درجة الحرارة المحلية العالية ، (2) الإجهاد الميكانيكي ، و (3) الإجهاد الكيميائي الضوئي (تفاعل الأكسدة والجذور الحرة)74. اعتمادا على طريقة التصوير (على سبيل المثال ، التصوير أحادي الفوتون مقابل التصوير متعدد الفوتونات ، أوضاع الإضاءة المستمرة مقابل النبضية ، حساسية الكاشفات وقوة مصدر الضوء بأطوال موجية مختلفة إذا كان ضبط الإثارة ممكنا) ، نوع الخلية والأنسجة (على سبيل المثال ، تراكم يعتمد على نوع الأنسجة لأصباغ امتصاص الضوء بكفاءة أو جزيئات التألق الذاتي الأخرى ، 3D مقابل منظمة 2D ، النمو وتكوين وسائط التصوير) ، أصل مسبار الفلورسنت (على سبيل المثال ، خصائص التحسس الضوئي) مزيج مختلف من عوامل الخطر يمكن أن تثير السمية الضوئية أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، حتى لو لم تلاحظ أي زيادة في موت الخلايا بعد الإضاءة ، فإن تأثيرات ما قبل الموت المبكرة المعتمدة على الطاقة الخفيفة على الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي يمكن أن تتداخل مع تحليل التجربة وتفسيرها55.

لاستبعاد التأثير السمي الضوئي على النتائج التجريبية ، يجب على الباحث إجراء مراقبة عامة لصلاحية الخلية والتغيرات في مورفولوجيا الخلية مقارنة بالتحكم السليم أو استخدام مجسات موت الخلايا لتقدير زيادة معدل موت الخلايا بعد الإضاءة. إذا تم إجراء التجارب الأيضية ، فيجب أن يتم تحسين معلمات التصوير وفقا لذلك في التجارب التجريبية لتقدير وتقليل تأثير التصوير على المعلمات الأيضية المقاسة. في حالة المجسات الحساسة للأكسجين ، يمكن تتبع الجرعة الزائدة من الضوء بسهولة عن طريق الزيادة المفاجئة في عمر وشدة فسفور الصبغة الحساسة O2 (التغيرات المقابلة في نسبة الشدة المرجعية إلى الصبغة الحساسة O2) بسبب ما يسمى بتأثير "استهلاك O2 المستحث ضوئيا"53,75. يمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق تحليل المنحنى الحركي لتجارب الفاصل الزمني مع معلمات طاقة ضوئية مختلفة باستخدام ، على سبيل المثال ، البروتوكولالمنشور التالي 25. في "الدفاع" عن إضاءة النبض (على سبيل المثال ، المستخدمة في الفحص المجهري TCSPC-F (P) LIM) ، أظهرت الدراسات الحديثة تأثيرها الضئيل على إنتاج ROS وتبييض ضوئي للمسبار مقارنة بقياسات الإضاءة المستقرة76,77 ، مما يشير إلى ميزة إضافية ل TCSPC-FLIM مقابل نهج التصوير التقليدي القائم على الشدة.

يكمن القيد الرئيسي لطرق تكوين الكروية المقدمة في تطبيقات المراقبة المباشرة وطويلة الأجل. تتطلب قوالب الأغاروز هدفا لمسافة عمل طويلة (أو مجهرا مستقيما إضافيا أو مجهرا ستيريو مضان) بسبب الطبقة السميكة من الأغاروز وقد تتداخل مادة 5D Spheriplate مع القياسات في قنوات الفلورسنت الحمراء (مسبار O2 ). حجم الكروية الناتج عن طرق الإنتاجية العالية محدود بقطر البئر الصغير ويتطلب تبادلا متكررا للوسائط لتجنب استنفاد الوسائط وتحمضها. مع كل هذه القيود ، نوصي بأطباق 3D Petri (MicroTissue) للتجارب التي تتطلب إنتاجية عالية (على سبيل المثال ، لتطبيقات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد) وطرق منخفضة التعلق للدراسات الأساسية "متوسطة الإنتاجية" ، والتي تتطلب أيضا أرقام خلايا أقل.

تعتبر مراقبة الأوكسجين النسبي وتجارب الفحص المجهري التقليدية القائمة على صبغة مضان الخلايا الحية ميسورة التكلفة على المجاهر المقلوبة المتاحة على نطاق واسع إذا كانت مجهزة بكاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) ، والإثارة القائمة على الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، والهدفالمناسب 25. لمزيد من التقسيم البصري المناسب و FLIM ، يوصى باستخدام أنظمة المجهر التجارية متحدة البؤر المتاحة (مثل الموضحة هنا). بينما نصف أيضا طريقة للكشف عن التألق الذاتي NAD (P) H ، والتي تتطلب مجهرا FLIM ثنائي الفوتون أكثر تكلفة ، هناك العديد من الأساليب المختلفة ، المتوافقة والمفيدة لأنظمة FLIM متحدة البؤر ، والمجهزة بشكل مثالي بليزر الضوء الأبيض وكاشفات هجينة أو SPAD. وتشمل هذه تقييم استقلاب الخلايا ، وبروتينات الاستشعار الحيوي FRET-FLIM ، وميكانيكا التصوير والأنسجة ، والتألق الذاتي لأنواع معينة من الخلايا والأنسجة ، والتفاعلات بين المستقبلات والأدوية التي يتم تصورها عبر FLIM-FRET31.

يمكن أن يؤثر برنامج اقتناء وتحليل FLIM المقدم من البائع على نجاح التجربة ، حيث لا يمكن دائما تصدير IRF أو الصور بتنسيق متوافق مع تحليل المصدر المفتوح النهائي. تعد المعالجة اللاحقة جزءا مهما من سير عمل تحليل FLIM ، ولا تزال غير موحدة أو مقبولة عالميا. يتطلب تركيب المنحنى عددا أكبر من الفوتونات وقوة حسابية أكبر مقارنة بنهج الطور. يعد FLIMfit45 (تركيب عالمي وبكسل تلو الآخر) و Flimview78 من بين البرامج المفتوحة المستخدمة لتحليل تركيب المنحنى ، بينما يتم استخدام PAM79 و FLUTE64 و AlliGator80 لتحليل الطور. FLIMJ46 هو مكون إضافي مفيد ل ImageJ يعمل مع كلا النهجين. إجمالا ، تساعد هذه الخيارات في تحسين روتين ما بعد المعالجة وجعله أسرع وأكثر تنوعا وسهولة في الاستخدام.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا شيء للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحظي هذا العمل بدعم من منح صندوق البحوث الخاصة (BOF) المقدم من جامعة غنت (BOF/STA/202009/003; BOF / IOP / 2022/058) ، ومؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO ، I001922N) والاتحاد الأوروبي ، fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No. 101073507.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.05٪ Trypsin-EDTAGibco25300-054متوفر أيضا من Sigma
10 مل ماصات مصليةVWR612-3700تتوفر منتجات مماثلة أيضا من Sarstedt و Corning و VWR وشركات أخرى
12 لوحة لزراعة خلايا البئر ، معقمGreiner bio-one665-180تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning وشركات أخرى.
12 شريحة غرفة البئر ، قابلة للإزالةIbidi81201متوفر أيضا من Grace Bio-Labs و ThermoFisher Scientific وغيرها
من أنابيب الطرد المركزي سعة 15 ملNerbe plus02-502-3001تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning و VWR وشركات أخرى
3D Petri Dish micromoldsMicrotissueZ764000-6EA
6 لوحات ثقافة الخلايا جيدا ،Greiner المعقمة تتوفر منتجات bio-one657160مماثلة أيضا من Sarstedt و Corning و VWR وشركات أخرى
70٪ إيثانولChemLabCL02.0537.5000
BiofloatSarstedt83.3925.400لوحة مطلية ب 96 بئر متوفرة تجاريا لتكوين كروي
Calcein Green-AMTebubioAS-89201تنطبق في التخفيف 1: 1000
برنامج CellSens Dimensionأوليمبوسالإصدار 3
كولاجين من المشيمة البشرية ، النوع الرابعSigmaC5533لتحضير 0.07 مجم / مل كولاجين و 0.03 مجم / مل أطباق مجهرية مطلية ب Poly-D-lysine مجهر
FLIM متحد البؤرLeica MicrosystemsN / AStellaris 8 Falcon مقلوب مع ليزر الضوء الأبيض ، كاشفات HyD X ، غرفة التحكم في المناخ / T (OkoLab) ، 25x / 0.95 W الهدف
D (+) - الجلوكوزMerck8342تحضير محلول مخزون 1 متر ، 1: 100 لتحضير وسيط التصوير (التركيز النهائي 10 ملم)
النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، الفينول الأحمر ، الجلوكوز ، البيروفات والجلوتامين الخاليSigma-AldrichD5030-10X1Lلتحضير وسيط التصوير
مصل الأبقار الجنينية ( FBS)Gibco10270-098متاح أيضا من Sigma. يجب تعطيله بالحرارة قبل الاستخدام.
HEPES (1M)Gibco15630-080التخفيف 1/100 لتحضير وسيط التصوير (التركيز النهائي 10 ملم)
خلايا سرطان القولون البشرية HCT116ATCC
ImageJNIHالإصدار 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X) LeicaMicrosystemsالإصدار 4.6.1.27508
L-glutamineGibco25030متاح أيضا من Sigma. يوضع في التخفيف 1: 100.
Lipidure-CM5206AmsbioAMS.52000034GB1G
McCoy's 5A ، تحتاج إلى إضافة 1 ملي مولار من بيروفات الصوديوم و 10 ملي متر HEPESVWR392-0420وسيط النمو القياسي لخلايا HCT116
طوابع PDMS مطبوعة ثلاثية الأبعاد ذات النمط الدقيقN / AN / Aمقدمة من مركز تكنولوجيا النظم الدقيقة ، البروفيسور الدكتور جان فانفليتيرين ، جامعة غنت
كلوريد الصوديومChemlabCL00.1429.100
غرفة نوباور للتغليف النحويفيشر Scientific15980396
O2 مجسات: MMIR1N / AN /A يمكن العثور على التوصيف الكامل والتحقق من الصحة وبعض التطبيقات على: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110
v1
PBSFisher scientificGibco18912014قم بإذابة قرص PBS في 500 مل من الماء المقطر.
بكتيريا القلم :P إنسلين (10,000 وحدة / مل) / ستربتومايسين (10,000 مو ؛ جم / مل) حل 100xGibco15140-122متاح أيضا من Sigma. يوضع في التخفيف 1: 100.
بولي د-ليسينسيجماP6407-5 ملغلتحضير 0.07 مجم / مل كولاجين و 0.03 مجم / مل أطباق الفحص المجهري المطلية ب بولي دي ليسين
بروبيديوم يوديدسيجما ألدريتش25535-16-4تلطيخ موت الخلايا ، استخدم 1 & micro ؛ جم / مل في 1 ساعة حضانة
PVDF حقنة مرشح 0.22 & منوفولابA35149تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning و VWR وشركات أخرى
بيروفات الصوديوم (100 ملم)Gibco11360-070التخفيف 1/100 لإعداد وسيط التصوير (التركيز النهائي 1 ملم)
SphericalPlate 5D 24-wellKugelmeiersSP5D-24W
معقمPetridish Greiner bio-one633181تتوفر منتجات مماثلة أيضا من Sarstedt و Corning و VWR وغيرها من الشركات
قارورة زراعة الأنسجة (25 سم & sup2 ؛ )VWR734-2311تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning و VWR وغيرها من الشركات
قارورة زراعة الأنسجة (75 سم & sup2;)VWR734-2313تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning و VWR وغيرها من الشركات
U-bottom 96-well plateVWR10062-900تتوفر أيضا منتجات مماثلة من Sarstedt و Corning و Greiner Bio-one وشركات
أخرى Ultrapure AgaroseInvitrogen (Life Technologies)16500-500أنواع أخرى من Agarose مثل نقطة الانصهار المنخفضة Agarose (A-9414 ، Sigma) ، Agarose للاستخدام الروتيني (A-9539 ، Sigma)
المجهر المقلوب الفلوريOlympusN / Aالمجهر المضان المقلوب IX81 ، مع التحكم الآلي في المحور Z ، CoolLED pE4000 (16 قناة ، 365-770 نانومتر) ، كاميرا ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS ، لوحة تسخين الزجاج Okolab ، برنامج CellSens Dimension v.3 والأهداف الجوية 4x / 0.13 UPlanFLN و 40x / 0.6 LUCPlanFLN. (اختياري ، للتصوير عالي الدقة) 60x / 1.0 LUMPLFLN ماء
وسط من واسع المجال

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
  2. Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs. J Vis Exp. (190), e64564(2022).
  3. Griner, L. M., et al. Generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening. J Vis Exp. (139), e57476(2018).
  4. Qian, Y., Wei, X., Chen, K., Xu, M. Three-dimensional acoustic assembly device for mass manufacturing of cell spheroids. J Vis Exp. (200), e66078(2023).
  5. He, H., et al. Dynamic formation of cellular aggregates of chondrocytes and mesenchymal stem cells in spinner flask. Cell Prolif. 52 (4), e12587(2019).
  6. Perez, J. E., Nagle, I., Wilhelm, C. Magnetic molding of tumor spheroids: Emerging model for cancer screening. Biofabrication. 13 (1), 015018(2020).
  7. Kingsley, D. M., et al. Laser-based 3d bioprinting for spatial and size control of tumor spheroids and embryoid bodies. Acta Biomater. 95, 357-370 (2019).
  8. Guillaume, O., et al. Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering. Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).
  9. Danilevicius, P., et al. laser-made 3D microscaffolds for tissue spheroid encagement. Biointerphases. 10 (2), 021011(2015).
  10. Jamieson, L. E., Harrison, D. J., Campbell, C. Chemical analysis of multicellular tumour spheroids. Analyst. 140 (12), 3910-3920 (2015).
  11. Dmitriev, R., Borisov, S., Jenkins, J., Papkovsky, D. Multiparametric imaging of tumor spheroids with ultra-bright and tunable nanoparticle O2 probes. SPIE BiOS. 9328, (2015).
  12. Zushin, P. -J. H., Mukherjee, S., Wu, J. C. FDA Modernization Act 2.0: transitioning beyond animal models with human cells, organoids, and AI/ML-based approaches. J Clin Invest. 133 (21), e175824(2023).
  13. Kim, D. -S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human es and ips cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev Rep. 6 (2), 270-281 (2010).
  14. Hart, D., Gutiérrez, D. R., Biason-Lauber, A. Generation of a human ovarian granulosa cell model from induced pluripotent stem cells. bioRxiv. , 2022(2022).
  15. Chiaradia, I., et al. Tissue morphology influences the temporal program of human brain organoid development. Cell Stem Cell. 30 (10), 1351-1367 (2023).
  16. Wagstaff, E. L., Ten Asbroek, A. L., Ten Brink, J. B., Jansonius, N. M., Bergen, A. A. An alternative approach to produce versatile retinal organoids with accelerated ganglion cell development. Sci Rep. 11 (1), 1101(2021).
  17. Thavandiran, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (49), E4698-E4707 (2013).
  18. Harrison, S. P., et al. Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human pscs. Exp Mol Med. 55 (9), 2005-2024 (2023).
  19. Noguchi, T. -A. K., Kurisaki, A. Formation of stomach tissue by organoid culture using mouse embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 2017, 217-228 (2017).
  20. Takahashi, J., et al. Suspension culture in a rotating bioreactor for efficient generation of human intestinal organoids. Cell Reports Methods. 2 (11), 100337(2022).
  21. Lagziel, S., Gottlieb, E., Shlomi, T. Mind your media. Nat Metab. 2 (12), 1369-1372 (2020).
  22. Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. Reproducibility of uniform spheroid formation in 384-well plates: The effect of medium evaporation. J Biomol Screen. 21 (9), 923-930 (2016).
  23. Bera, K., et al. Extracellular fluid viscosity enhances cell migration and cancer dissemination. Nature. 611 (7935), 365-373 (2022).
  24. Michl, J., Park, K. C., Swietach, P. Evidence-based guidelines for controlling ph in mammalian live-cell culture systems. Commun Biol. 2, 144(2019).
  25. Okkelman, I. A., Vercruysse, C., Kondrashina, A. V., Borisov, S. M., Dmitriev, R. I. Affordable oxygen microscopy-assisted biofabrication of multicellular spheroids. J Vis Exp. (182), e63403(2022).
  26. Peirsman, A., et al. Mispheroid: A knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  27. Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).
  28. Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: Comparison of different protocols. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
  29. Debruyne, A. C., et al. Live microscopy of multicellular spheroids with the multimodal near-infrared nanoparticles reveals differences in oxygenation gradients. ACS Nano. 18 (19), 12168-12186 (2024).
  30. Debruyne, A. C., Okkelman, I. A., Dmitriev, R. I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 144, 55-66 (2023).
  31. Barroso, M., Monaghan, M. G., Niesner, R., Dmitriev, R. I. Probing organoid metabolism using fluorescence lifetime imaging microscopy (flim): The next frontier of drug discovery and disease understanding. Adv Drug Deliv Rev. 201, 115081(2023).
  32. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging-techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  33. Dmitriev, R. I., Intes, X., Barroso, M. M. Luminescence lifetime imaging of three-dimensional biological objects. J Cell Sci. 134 (9), 1-17 (2021).
  34. Sarder, P., Maji, D., Achilefu, S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 26 (6), 963-974 (2015).
  35. Alfonso-Garcia, A., et al. Mesoscopic fluorescence lifetime imaging: Fundamental principles, clinical applications and future directions. J Biophotonics. 14 (6), e202000472(2021).
  36. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  37. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. J Cell Biol. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  38. Heikal, A. A. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 4 (2), 241-263 (2010).
  39. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of nad (p) h and fad. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  40. Verma, A., et al. Fluorescence lifetime imaging for quantification of targeted drug delivery in varying tumor microenvironments. bioRxiv. , 2024(2024).
  41. Smith, J. T., et al. In vivo quantitative fret small animal imaging: Intensity versus lifetime-based fret. Biophys Rep. 3 (2), 100110(2023).
  42. Alvarez, L. A., et al. Application Note: SP8 Falcon: A novel concept in fluorescence lifetime imaging enabling video-rate confocal flim. Nat Methods. , (2019).
  43. Roberti, M. J., et al. TauSense: A fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00364-w.pdf (2020).
  44. Auer, J. M. T., Murphy, L. C., Xiao, D., Li, D. U., Wheeler, A. P. Non-fitting flim-fret facilitates analysis of protein interactions in live zebrafish embryos. J Microsc. 291 (1), 43-56 (2023).
  45. Warren, S. C., et al. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLoS One. 8 (8), e70687(2013).
  46. Gao, D., et al. Flimj: An open-source imagej toolkit for fluorescence lifetime image data analysis. PloS One. 15 (12), e0238327(2020).
  47. Tullis, I. D. C., Ameer-Beg, S. M., Barber, P. R., Rankov, V., Vojnovic, B. Mapping femtosecond pulse front distortion and group velocity dispersion in multiphoton microscopy. Proc. SPIE 6089, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VI. , 60890(2006).
  48. Zhou, Y., et al. One-step derivation of functional mesenchymal stem cells from human pluripotent stem cells. Bio Protoc. 8 (22), e3080(2018).
  49. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  50. Badea, M. A., et al. Influence of matrigel on single-and multiple-spheroid cultures in breast cancer research. SLAS Discov. 24 (5), 563-578 (2019).
  51. Lang, S., Sharrard, R., Stark, M., Villette, J., Maitland, N. Prostate epithelial cell lines form spheroids with evidence of glandular differentiation in three-dimensional matrigel cultures. Br J Cancer. 85 (4), 590-599 (2001).
  52. Barra, J., et al. DMT1-dependent endosome-mitochondria interactions regulate mitochondrial iron translocation and metastatic outgrowth. Oncogene. 43 (9), 650-667 (2024).
  53. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Intracellular probes for imaging oxygen concentration: How good are they. Methods Appl Fluoresc. 3 (3), 034001(2015).
  54. Schweikhard, V., et al. Application Note: The power HyD family of detectors for confocal microscopy. Nat Methods. , https://www.nature.com/articles/d42473-020-00398-0 (2020).
  55. Alam, S. R., Wallrabe, H., Christopher, K. G., Siller, K. H., Periasamy, A. Characterization of mitochondrial dysfunction due to laser damage by 2-photon flim microscopy. Sci Rep. 12 (1), 11938(2022).
  56. Bush, P. G., Wokosin, D. L., Hall, A. C. Two-versus one photon excitation laser scanning microscopy: Critical importance of excitation wavelength. Front Biosci. 12, 2646-2657 (2007).
  57. Liu, M., et al. Instrument response standard in time-resolved fluorescence spectroscopy at visible wavelength: Quenched fluorescein sodium. Appl Spectrosc. 68 (5), 577-583 (2014).
  58. Szabelski, M., et al. Collisional quenching of erythrosine b as a potential reference dye for impulse response function evaluation. Appl Spectrosc. 63 (3), 363-368 (2009).
  59. Chib, R., et al. Standard reference for instrument response function in fluorescence lifetime measurements in visible and near infrared. Meas Sci Technol. 27 (2), 027001(2015).
  60. Talbot, C. B., et al. Application of ultrafast gold luminescence to measuring the instrument response function for multispectral multiphoton fluorescence lifetime imaging. Opt Express. 19 (15), 13848-13861 (2011).
  61. Becker, W. Recording the instrument response function of a multiphoton flim system. Becker & Hickl. , Available from: https://www.becker-hickl.com/literature/application-notes/recording-the-instrument-response-function-of-a-multiphoton-flim-system/ (2007).
  62. Leben, R., Köhler, M., Radbruch, H., Hauser, A. E., Niesner, R. A. Systematic enzyme mapping of cellular metabolism by phasor-analyzed label-free nad (p) h fluorescence lifetime imaging. Int J Mol Sci. 20 (22), 5565(2019).
  63. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using nadh and nadph autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  64. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A python gui for interactive phasor analysis of flim data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  65. Malacrida, L., Ranjit, S., Jameson, D. M., Gratton, E. The phasor plot: A universal circle to advance fluorescence lifetime analysis and interpretation. Annu Rev Biophys. 50, 575-593 (2021).
  66. Okkelman, I., Vandenberghe, W., Dmitriev, R. Role of preconditioning with oxygen and glucose deprivation in promoting differentiation of dental pulp stem cells in 3D culture. Mol Biol Cell. 34 (2), 1212(2022).
  67. Park, J. H., et al. The effect of bmp-mimetic peptide tethering bioinks on the differentiation of dental pulp stem cells (DPSCs) in 3D bioprinted dental constructs. Biofabrication. 12 (3), 035029(2020).
  68. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  69. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  70. Bryanskaya, E. O., et al. High levels of FAD autofluorescence indicate pathology preceding cell death. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1868 (1), 130520(2024).
  71. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21 (1), 152(2021).
  72. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  73. Gstraunthaler, G., Seppi, T., Pfaller, W. Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content on metabolic properties of renal epithelial cell cultures: Are renal cells in tissue culture hypoxic. Cell Physiol Biochem. 9 (3), 150-172 (1999).
  74. Glickman, R. D. Phototoxicity to the retina: Mechanisms of damage. Int J Toxicol. 21 (6), 473-490 (2002).
  75. Golub, A. S., Pittman, R. N. Monitoring Parameters of Oxygen Transport to Cells in the Microcirculation. Quenched-Phosphorescence Detection of Molecular Oxygen: Applications in Life Sciences. , The Royal Society of Chemistry. (2018).
  76. Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging. Biotechniques. 41 (2), 191-197 (2006).
  77. Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of pvp-hypericin: A new strategy using ms pulses of led and the fluorescent dye cfse. J Microsc. 245 (1), 100-108 (2012).
  78. Carrasco Kind, M., et al. flimview: A software framework to handle, visualize and analyze flim data. F1000Research. 9, 574(2020).
  79. Schrimpf, W., Barth, A., Hendrix, J., Lamb, D. C. Pam: A framework for integrated analysis of imaging, single-molecule, and ensemble fluorescence data. Biophys J. 114 (7), 1518-1528 (2018).
  80. Chen, S. -J., Sinsuebphon, N., Barroso, M., Intes, X., Michalet, X. Optical Molecular Probes, Imaging and Drug Delivery. , Optica Publishing Group. (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Lifetime ImagingLive Cell MicroscopyMulticellular SpheroidsSpheroid Production3D Tissue ModelsOptical Metabolic ImagingSpheroid Formation MethodsTumor MicroenvironmentAutofluorescence FLIMCancer Cell Spheroids

Related Articles