مقالة منهجية

عزل الخلايا المناعية عن دماغ الفأر والجمجمة

DOI:

10.3791/66861

⸱

يوليو 26, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program (MBPP), Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقيق في الاستجابة المناعية لاضطرابات الدماغ ، يتمثل أحد الأساليب الشائعة في تحليل التغيرات في الخلايا المناعية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين بسيطين وفعالين لعزل الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران ونخاع عظم الجمجمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الاستجابة المناعية التي تسببها اضطرابات الدماغ (على سبيل المثال ، نقص تروية الدماغ والتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي) لا تحدث فقط في الدماغ ، ولكن أيضا في الجمجمة. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية نحو تحليل التغيرات في مجموعات الخلايا المناعية في كل من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة بعد تلف الدماغ (مثل السكتة الدماغية) في الحصول على أعداد كافية من الخلايا المناعية عالية الجودة للتحليلات النهائية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين محسنين لعزل الخلايا المناعية من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. تنعكس مزايا كلا البروتوكولين في بساطتهما وسرعتهما وفعاليتهما في إنتاج كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة. قد تكون هذه الخلايا مناسبة لمجموعة من التطبيقات النهائية ، مثل فرز الخلايا وقياس التدفق الخلوي والتحليل النسخي. لإثبات فعالية البروتوكولات ، تم إجراء تجارب التنميط المناعي على أدمغة السكتة الدماغية ونخاع عظم الجمجمة الطبيعي في الدماغ باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ، وتتماشى النتائج مع نتائج الدراسات المنشورة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدماغ ، المحور المركزي للجهاز العصبي ، محمي بواسطة الجمجمة. تحت الجمجمة توجد ثلاث طبقات من النسيج الضام تعرف باسم السحايا - الأم الجافية ، الأم العنكبوتية ، والأم الحنان. يدور السائل الدماغي الشوكي (CSF) في الفضاء تحت العنكبوتية بين الأم العنكبوتية والأم الحنون ، مما يخفف من الدماغ ويزيل النفايات أيضا عبر الجهاز اللمفاوي 1,2. توفر هذه البنية الفريدة معا بيئة آمنة وداعمة تحافظ على استقرار الدماغ وتحميه من الإصابة المحتملة.

لطالما اعتبر الدماغ متميزا في المناعة. ومع ذلك ، فقد تم التخلي عن هذه الفكرة جزئيا حيث تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه بالإضافة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الحمة ، فإن حدود الدماغ ، بما في ذلك الضفيرة المشيمية والسحايا ، تستضيف مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية3. تلعب هذه الخلايا أدوارا مهمة في الحفاظ على الاتزان الداخلي، ومراقبة صحة الدماغ، وبدء الاستجابة المناعية لإصابة الدماغ. والجدير بالذكر أن النتائج الأخيرة تشير إلى أن الجمجمة متورطة في مناعة السحايا ، وقد تساهم في الاستجابة المناعية في الدماغ بعد الإصابة. في عام 2018 ، قام Herisson et al. باكتشاف أساسي للقنوات الوعائية المباشرة التي تربط نخاع عظم الجمجمة بالسحايا ، وبالتالي إنشاء طريق تشريحي لهجرة الكريات البيض 4,5. في وقت لاحق ، أظهر Cugurra et al. أن العديد من الخلايا النخاعية (على سبيل المثال ، الوحيدات والعدلات) والخلايا البائية في السحايا لا تنشأ من الدم6. باستخدام تقنيات مثل زرع رفرف عظم كالفاريا وأنظمة التشعيع الانتقائية ، قدم المؤلفون أدلة دامغة على أن نخاع عظم الجمجمة يعمل كمصدر محلي للخلايا النخاعية في السحايا وكذلك حمة الجهاز العصبي المركزي بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي6. علاوة على ذلك ، اقترحت دراسة أخرى أن الخلايا البائية السحائية يتم توفيرها باستمرار بواسطة نخاع عظم الجمجمة7. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد بنية جديدة ، تسمى خروج الكفة العنكبوتية (ACE) ، كبوابة مباشرة بين الأم الجافية والدماغ لتهريب الخلايا المناعية8.

هذه النتائج المثيرة لها آثار مهمة على أصل تسلل الخلايا المناعية إلى الدماغ المصاب (على سبيل المثال ، بعد السكتة الدماغية). أشارت مجموعة كبيرة من الأدلة إلى أنه بعد السكتة الدماغية ، تتسلل العديد من الخلايا المناعية إلى الدماغ ، مما يساهم في كل من تلف الدماغ الحاد والتعافي المزمن للدماغ. الفكرة التقليدية هي أن هذه الخلايا تدور كريات الدم البيضاء في الدم التي تتسلل إلى الدماغ ، والتي يتم تسهيلها إلى حد كبير عن طريق تلف حاجز الدم في الدماغ الناجم عن السكتة الدماغية. ومع ذلك ، فقد تم الطعن في هذه الفكرة. في إحدى الدراسات ، تم تصنيف الخلايا المناعية في الجمجمة وساق الفئران بشكل مختلف ، وفي 6 ساعات بعد السكتة الدماغية ، تم العثور على انخفاض أكبر بكثير في العدلات والوحيدات في الجمجمة مقابل. كانت الساق والمزيد من العدلات المشتقة من الجمجمة موجودة في الدماغ الإقفاري. تشير هذه البيانات إلى أنه في مرحلة السكتة الدماغية الحادة ، تنشأ العدلات في الدماغ الإقفاري بشكل أساسي من نخاع عظم الجمجمة4. ومن المثير للاهتمام أن CSF قد يوجه هذه الهجرة. في الواقع ، أظهر تقريران حديثان أن السائل الدماغي الشوكي يمكنه نقل إشارات الإشارات مباشرة من الدماغ إلى نخاع عظم الجمجمة عبر قنوات الجمجمة ، وتوجيه هجرة الخلايا وتكون الدم في نخاع عظم الجمجمة بعد إصابة الجهاز العصبي المركزي 9,10.

في ضوء هذه النتائج الأخيرة ، أصبح من المهم تحليل التغيرات في الخلايا المناعية في كل من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة ، عند دراسة الاستجابة المناعية لاضطرابات الدماغ. في مثل هذه التحقيقات ، هناك حاجة إلى أعداد كافية من الخلايا المناعية عالية الجودة للتحليلات النهائية مثل فرز الخلايا وتحليل قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). هنا ، الهدف العام هو تقديم إجراءين محسنين لإعداد معلقات أحادية الخلية من أنسجة المخ ونخاع عظم الجمجمة. من المهم ملاحظة أن الجلفاريا (العظم الجبهي والعظم القذالي والعظام الجدارية) للجمجمة تستخدم عادة لاستخراج نخاع العظم ، ويشار إلى نخاع العظم هذا على وجه التحديد باسم نخاع عظم الجمجمة طوال هذه الدراسة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام في معهد ديوك (IACUC). تم استخدام ذكور C57Bl / 6 الفئران (3-4 أشهر ؛ 22-28 جم) في الدراسة الحالية. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تعليق خلية واحدة من دماغ الفأر

ملاحظة: يوضح الشكل 1 نظرة عامة على بروتوكول عزل خلايا الدماغ.

  1. تخدير الفأر وتنبيبه وتأمينه ، كما هو موضح سابقا11.
  2. قم بعمل شق في الجزء العلوي من البطن عبر الجلد وطبقات العضلات الأساسية ، وقم بقص الحجاب الحاجز والأضلاع بعناية لإنشاء فتحة في التجويف الصدري.
  3. املأ حقنة سعة 30 مل ببرنامج تلفزيوني بارد وأرفقها بإبرة التروية الحادة عبر أنبوب سيليكون. أدخل إبرة التروية بعناية في البطين الأيسر.
  4. قم بإجراء شق صغير في الأذين الأيمن للسماح بتصريف الدم ثم قم بتهويةالماوس 12 بمعدل تدفق ~ 10 مل / دقيقة لمدة 3-4 دقائق.
    ملاحظة: لتحسين إزالة الدم في الدماغ ، يمكن النظر في زيادة حجم محلول التروية وإضافة الهيبارين.
  5. قطع رأس الفأر وإجراء شق في خط الوسط من خلال الجلد في الجزء العلوي من الرأس لفضح الجمجمة.
  6. اكشط بعناية أي نسيج ضام يغطي الجمجمة باستخدام ملقط حاد.
  7. استخدم مقص تشريح حاد لقطع خيوط الجمجمة بعناية على طول خط الوسط وعلى كلا الجانبين ، مما يؤدي إلى إنشاء رفرف.
  8. ارفع رفرف الجمجمة برفق لكشف الدماغ ، واستخدم ملقط غير حاد لإزالة الدماغ بعناية من تجويف الجمجمة.
  9. اغمر الدماغ في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد وأزل أي أنسجة سحائية متبقية.
    ملاحظة: للحفاظ على صلاحية الخلية بشكل أفضل ، يوصى بتنفيذ جميع الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.
  10. ضع الدماغ في خالط Dounce زجاجي مبرد مسبقا سعة 15 مل يحتوي على 20 مل (دماغ كامل) أو 12 مل (نصف دماغ) من المخزن المؤقت HBSS القديم الجليدي.
  11. استخدم مدقة Dounce السائبة لفصل أنسجة المخ بلطف وببطء بحوالي 100-120 ضربة على الجليد.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للحصول على كمية كبيرة من خلايا الدماغ السليمة. تستغرق هذه الخطوة حوالي 10 دقائق. أوقف التجانس عندما لا تظهر قطع كبيرة من أنسجة المخ في التعليق. عند هذه النقطة ، يمكن للمدقة أن تتحرك بسهولة دون أي قوة.
  12. قم بتصفية تعليق أنسجة المخ الناتج من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  13. شطف أنبوب Dounce مع 5 مل HBSS ، والمضي قدما في الترشيح لتحقيق أقصى قدر من جمع الخلايا.
  14. جهاز طرد مركزي تعليق الأنسجة المفلترة عند 550 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 30٪.
    ملاحظة: لصنع 15 مل من محلول تدرج الكثافة متساوي التوتر بنسبة 30٪ ، امزج 4.5 مل من وسط تدرج كثافة المخزون بنسبة 100٪ ، و 1.5 مل من 10× PBS ، و 9 مل من ddH2O.
  16. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وأضف 9 مل (دماغ كامل) أو 6 مل (نصف دماغ) من محلول تدرج الكثافة بنسبة 30٪.
  17. اقلب الأنبوب برفق لضمان الخلط الشامل.
  18. قم على الفور بطرد الأنبوب عند 845 × جم مع ضبط التسارع والفرامل على المستوى 3 ، لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  19. قم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي دون اهتزاز ، وقم بشفط طبقة المايلين العلوية بعناية باستخدام طرف سعة 1 مل متصل بالفراغ.
    ملاحظة: من المهم للغاية عدم إزعاج هذه الطبقة. أي مايلين متبقي يمكن أن يؤثر سلبا على صحة الخلايا ويضر بالتحليلات النهائية.
  20. نضح المادة الطافية ، وترك 1-2 مل خلفها ، وأعد تعليق حبيبات الخلية بحد أدنى 10 مل من HBSS البارد.
  21. جهاز طرد مركزي عند 550 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  22. اغسل مرة أخرى بحد أدنى 7 مل من HBSS البارد.
  23. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام 100-200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت FACS لقياس التدفق الخلوي المستخدم في هذه الدراسة على 0.5٪ BSA و 2 mM EDTA في 1× PBS. يوصى باستخدام لوحة قاع V ذات 96 بئرا لتلطيخ الخلايا لتقليل فقد الخلايا أثناء خطوات الغسيل.
  24. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام بروتوكول قياسي تم إنشاؤه في المختبرات الفردية13.
    1. باختصار ، امزج 80 ميكرولتر من معلق الخلية مع 20 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة في صفيحة قاع V ذات 96 بئرا واحتضانها لمدة 25 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. اغسل ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ثم أعد تعليق الخلايا ب 100 ميكرولتر من HBSS بالإضافة إلى كاشف تلطيخ صلاحية الخلية.
    3. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، يغسل بمحلول FACS ويعاد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول FACS لتحليل قياس التدفق الخلوي.

2. إعداد نخاع العظم تعليق خلية واحدة من الفأر كالفاريا

ملاحظة: يوضح الشكل 2 نظرة عامة على إجراء عزل نخاع عظم الجمجمة.

  1. قم بلف الماوس كما هو موضح في الخطوة 1.4.
  2. قطع رأس الفأر وإجراء شق الجلد في خط الوسط على فروة الرأس لفضح الجمجمة.
  3. قطع من خلال الجمجمة ، بدءا من الثقبة ماغنوم والمضي قدما على طول الجوانب الجانبية للكالفاريا باستخدام مقص حاد. ثم ارفع وأزل كالفاريا.
    ملاحظة: يمكن حصاد الدماغ من نفس الفأر ومعالجته باستخدام الخطوة 1 ، مما يتيح تحليل الخلايا المناعية من كل من الدماغ ونخاع عظم الجمجمة.
  4. تقشر بعناية الأم الجافية من الجمجمة تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط حادة.
    ملاحظة: من الأسهل البدء من حواف العظم القذالي ، والانفصال ببطء ، والتقدم بثبات نحو المنطقة الأمامية ، والعمل إلى الداخل.
  5. ضع الكالفاريا في الطبق على الثلج واستخدم ماصة 1 مل لشطف كالفاريا ، مما يضمن إزالة بقايا الدم من سطحه.
  6. انقل الكالفاريا إلى طبق جديد مع برنامج تلفزيوني طازج وبارد يكفي لغمر كالفاريا.
  7. استخدم مقصا معقما لتقطيع الكالفاريا إلى شظايا 3 مم × 3 مم تقريبا في برنامج تلفزيوني بارد.
    ملاحظة: قد تؤثر طرق الاقتصاص على كفاءة استخراج نخاع العظم الكالفاريا. يوصى باستخدام نفس طريقة الاقتصاص لتقليل التباين. من المهم أيضا قطع الغرز. يوضح الشكل 2 ب نهجا واحدا.
  8. قم بعمل ثقب في قاع أنبوب طرد مركزي صغير سعة 500 ميكرولتر باستخدام إبرة 18 جرام.
  9. أدخل هذا الأنبوب في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد.
  10. انقل شظايا كالفاريا إلى أنبوب 500 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب أن تكون شظايا العظام معبأة بشكل فضفاض لزيادة كفاءة الاستخراج.
  11. أجهزة طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من استعادة الخلايا ، استخدم إبرة 18 جم لتقليب شظايا الكالفاريا برفق ، وكرر هذه الخطوة 1-2 مرات أكثر.
  12. إعادة تعليق خلايا نخاع العظم كالفاريا المجمعة في 500 ميكرولتر من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
  13. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من برنامج تلفزيوني بارد.
  14. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  15. اغسل مرة أخرى مع 5 مل من برنامج تلفزيوني بارد.
  16. أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن مؤقت مناسب. بالنسبة لقياس التدفق الخلوي ، نستخدم عادة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  17. لتحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بإجراء عد الخلايا واستخدم ما يقرب من 1 × 106 خلايا لتلطيخ الأجسام المضادة.
    ملاحظة: تأكد من تضمين خطوة كتلة Fc قبل تلطيخ الأجسام المضادة13.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحضير الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفأر ، ينتج البروتوكول عموما خلايا ذات قابلية عالية للحياة (84.1٪ ± 2.3٪ [متوسط ± SD]). ما يقرب من 70 ٪ -80 ٪ من هذه الخلايا هي CD45 إيجابية. في دماغ الفأر الطبيعي ، تكون جميع خلايا CD45 + تقريبا عبارة عن خلايا دبقية صغيرة (CD45LowCD11b +) ، كما هو متوقع. تم استخدام هذا البروتوكول في المختبر لتطبيقات مختلفة ، بما في ذلك تحليل التدفق الخلوي ، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، وتحليل scRNA-seq. على سبيل المثال ، تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي في نموذج السكتة الدماغية (الشكل 3). تعرضت الفئران لنموذج السكتة الدماغية العابرة ، انسداد الشريان الدماغي الأوسط لمدة 30 دقيقة (MCAO) 14. في اليوم 3 بعد السكتة الدماغية ، تم تحضير الخلايا من أدمغة الفئران وملطخة بعلامات سطح الخلايا المناعية الشائعة. استراتيجية البوابات موضحة في الشكل 3 أ. تمشيا مع الأبحاث السابقة13,15 ، لوحظت زيادة ملحوظة في خلايا CD45العالية في نصف الكرة المماثل (الشكل 3B ، C) ، مما يشير إلى تسلل الخلية المناعية إلى الدماغ.

بالنسبة لبروتوكول نخاع عظم الجمجمة ، تم تحقيق عائد كبير من خلايا نخاع عظم الجمجمة (حوالي 2 × 106 خلايا) باستمرار مع قابلية ممتازة (93.8٪ ± 1.8٪ [متوسط ± SD]). كما هو متوقع ، فإن معظم هذه الخلايا إيجابية CD45. لتوضيح فائدة هذا البروتوكول ، أجريت دراسة مقارنة لتوصيف تكوين الخلايا المناعية في كل من عظم الفخذ ونخاع عظم الجمجمة للفئران الساذجة (الشكل 4). كما هو موضح في المخططات التمثيلية ، كان تكوين الخلايا المناعية مشابها بين عظم الفخذ ونخاع عظم الجمجمة (الشكل 4 أ ، ب). ومن المثير للاهتمام ، أن تواتر العدلات يبدو أعلى في عظم الفخذ منه في عظم الجمجمة (الشكل 4C). ومع ذلك ، فإن هذه النتيجة تتطلب مزيدا من التحقق من الصحة ، حيث كان حجم العينة صغيرا لهذه الدراسة التجريبية.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول عزل خلايا الدماغ. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: بروتوكول عزل خلايا نخاع عظم الجمجمة. أ: نظرة عامة على الإجراء. ب: النمط الموصى به لقطع الجمجمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل السريان الخلوي التمثيلي للخلايا المناعية في دماغ السكتة الدماغية. أ: مثال على استراتيجية البوابات. تصور المخططات مجموعات الخلايا المناعية التالية: الخلايا الدبقية الصغيرة (CD45LowCD11b +) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (CD45HighNK1.1+) ، والعدلات (CD45High Ly6G +) ، والخلايا التائية (CD45HighCD11b-CD3+) ، والخلايا البائية (CD45HighCD11b-CD19+). يمثل هذا المثال تحليلا للخلايا المناعية للدماغ في نصف الكرة المماثل في اليوم 3 بعد السكتة الدماغية. (ب، ج) تسلل الخلايا المناعية إلى دماغ السكتة الدماغية. تعرضت الفئران الذكور الشابة لانسداد الشريان الدماغي الأوسط العابر (MCAO). في اليوم 3 ، تم جمع الأدمغة وتقسيمها إلى نصفي الكرة الأيسر (المقابل) والأيمن (المماثل). تم تحضير خلايا الدماغ وفقا للبروتوكول الموصوف ثم خضعت لتحليل قياس التدفق الخلوي. توضح المؤامرات التمثيلية زيادة تسلل الخلايا المناعية إلى نصف الكرة المماثل (CD45High cells; ب). البيانات الكمية موضحة في الرسوم البيانية الشريطية (C). تم حساب أرقام الخلايا بناء على عدد الخلايا وحجمها المسجل في بيانات قياس التدفق الخلوي. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. * p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل السريان الخلوي التمثيلي لخلايا نخاع عظم الجمجمة. للمقارنة ، تم تضمين تحليل خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ. تصور المخططات مجموعات الخلايا المناعية التالية: الخلايا القاتلة الطبيعية (CD45 + NK1.1 +) ، العدلات (CD45 + CD11b + Ly6G +) ، الخلايا التائية (CD45 + CD11b-CD3 +) ، والخلايا البائية (CD45 + CD11b-CD19+). أ: مخططات تمثيلية لنخاع عظم الفخذ. ب: قطع أرض تمثيلية لنخاع عظم الجمجمة. ج: مقارنة تركيب الخلايا المناعية بين عظم الفخذ ونخاع عظم الجمجمة. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SEM. * p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم تقديم بروتوكولين بسيطين لكنهما فعالان لعزل الخلايا المناعية عن الدماغ ونخاع عظم الجمجمة. يمكن أن تنتج هذه البروتوكولات بشكل موثوق كمية كبيرة من الخلايا المناعية القابلة للحياة التي قد تكون مناسبة لتطبيقات المصب المتنوعة ، ولا سيما لقياس التدفق الخلوي.

لدراسة الالتهاب العصبي في اضطرابات الدماغ المختلفة ، تم إنشاء العديد من البروتوكولات لتحضير الخلايا المناعية من الدماغ واستخدامها في مختبرات مختلفة15،16،17. تتضمن الأساليب الشائعة تفكك الخلايا القائم على الإنزيم متبوعا بفصل التدرج. عادة ، في هذه البروتوكولات ، يتم فرم أنسجة المخ ثم حضنها في محلول هضم إنزيمي يحتوي على كل من كولاجيناز و DNase لمدة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هز لطيف. بعد الهضم ، تخضع الخلايا لمزيد من التفكك باستخدام طريقة ميكانيكية مثل السحب أو التجانس Dounce. بعد المرور عبر مصفاة الخلية (على سبيل المثال ، مصفاة 70 ميكرومتر) ، تخضع الخلايا بعد ذلك للطرد المركزي المتدرج (غالبا محلول تدرج الكثافة 30٪ / 70٪) لإزالة المايلين وخلايا الدم الحمراء والحطام وإثراء الكريات البيض. ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج حضانة إنزيمية طويلة عند 37 درجة مئوية قد تغير بشكل كبير النسخ والبروتين للخلايا المناعية في الدماغ. في الواقع ، اقترح تحقيق منهجي أن النهج الأنزيمي يقدم تغييرات عميقة في النسخ والنمط البروتيني لخلايا دماغية معينة18. هذا يمكن أن يؤدي إلى القطع الأثرية في التحليلات النسخية اللاحقة مثل scRNA-seq. في المقابل ، يستخدم البروتوكول المذكور هنا نهج التفكك الميكانيكي في درجات الحرارة الباردة طوال الإجراء ، وبالتالي قمع التمثيل الغذائي الخلوي. وهذا يضمن الحفاظ بشكل أفضل على حالة النسخ والبروتينات ، مما يقلل من القطع الأثرية المحتملة. أثناء تطوير البروتوكول ، لاحظنا أن استخدام خالط Dounce كبير لتجانس أنسجة المخ أمر بالغ الأهمية لتحقيق عدد أعلى من الخلايا مع انخفاض موت الخلايا. من المحتمل أنه أثناء تجانس Dounce ، يكون الوجود الهائل للمصفوفات خارج الخلية ، وحطام الخلايا ، والمكونات السيتوبلازمية ساما للخلايا. يساعد استخدام كمية زائدة من المخزن المؤقت على تخفيف هذه المواد السامة ، وبالتالي يخفف من آثارها الضارة ، مما يؤدي إلى تحسين صلاحية الخلية. أكدت بيانات قياس التدفق الخلوي معدل صلاحية تقريبي بنسبة 85٪ للخلايا المناعية المحضرة بهذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، من الجدير بالذكر أن الطرد المركزي بمحلول تدرج الكثافة بنسبة 30٪ فقط يثري بشكل فعال الخلايا المناعية في الدماغ ويزيل المايلين. هذا يمكن أن يقلل أيضا من تكلفة إعداد الخلية.

لا تزال الدراسات التي أجريت على الخلايا المناعية في نخاع عظم الجمجمة محدودة. تتضمن الطريقة المستخدمة عادة لعزل الخلايا من كالفيوم جمجمة الفأر قطع الجمجمة إلى قطع صغيرة ثم سحق القطع ميكانيكيا باستخدام مدقة6. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام الطرد المركزي القصير. تم تكييف هذه الطريقة من بروتوكول منشور لإعداد نخاع العظم من عظم الفخذ والقصبة19. بالنسبة لهذه العظام الطويلة ، يحتاج المرء فقط إلى قطع أحد طرفي العظم لجمع نخاع العظم عن طريق الطرد المركزي. بالنسبة للجمجمة ، يتم تعديل هذه الخطوة عن طريق تقطيعها إلى عدة قطع صغيرة لفتح تجويف النخاع. يوصى باستخدام نمط ثابت لقطع الجمجمة من أجل الحصول على عدد الخلايا القابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، لتحقيق أقصى قدر من استعادة خلايا نخاع العظام ، يمكن أن تخضع قطع الجمجمة ل 2-3 جولات من الطرد المركزي مع الخلط بين كل طرد مركزي.

كلا البروتوكولين لهما قيود. أولا ، قد لا يؤدي استخدام الطرد المركزي بمحلول التدرج بنسبة 30٪ إلى إزالة خلايا الدم الحمراء المتبقية في الدماغ بشكل فعال ، والتي قد تحدث بسبب التروية غير المكتملة. علاوة على ذلك ، إذا تم تعديل بنية المايلين في ظل ظروف معينة ، فقد لا يكون محلول تدرج الكثافة بنسبة 30٪ تركيزا مثاليا لإزالتها. في هذه الحالة ، يجب إنشاء تركيز عمل آخر لمحلول تدرج الكثافة. ثانيا ، على الرغم من أن تحليل قياس التدفق الخلوي يشير إلى قابلية الخلايا المناعية للخلايا المناعية في الدماغ باستخدام البروتوكول الموصوف ، إلا أنه لا يزال بحاجة إلى تقييم لتطبيقات أخرى ، مثل التحليل النسخي الذي يمكن فيه استخدام الأكتينومايسين D. ثالثا ، يتم استخدام كالفاريا لإعداد نخاع عظم الجمجمة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن الخلايا المناعية موجودة في أجزاء أخرى كثيرة من الجمجمة. أخيرا ، تحتوي السحايا ، وخاصة الأم الجافية ، على خلايا مناعية متنوعة وتلعب أدوارا في توازن الدماغ والخلل الوظيفي20. للتحليل المناعي للسحايا ، يمكن اعتماد بروتوكول منشور في مكان آخر17،21،22،23.

باختصار ، تم وصف بروتوكولين قويين لعزل الخلايا المناعية من كل من دماغ الفأر والجمجمة. من المتوقع أن تكون هذه البروتوكولات مفيدة للحصول على كمية كبيرة من الخلايا عالية الجودة ، ومناسبة لمختلف التطبيقات النهائية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر كاثي غيج على مساهمتها التحريرية الممتازة. تم إنشاء الأشكال التوضيحية باستخدام BioRender.com. تم دعم هذه الدراسة بأموال من قسم التخدير (المركز الطبي بجامعة ديوك) ومنح المعاهد الوطنية للصحة NS099590 و HL157354 و NS127163.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-068
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide NeedleBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339653
96-well V-bottom microplate SARSTEDT82.1583
AURORA  flow cytometerCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 dilution
CD19-BV785BioLegend1155431:500 dilution
CD19-FITCBioLegend1155061:500 dilution
CD3-APCBioLegend1003121:500 dilution
CD3-PEBioLegend1002061:500 dilution
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 dilution
CD45-BV421Biolegend1031331:500 dilution
Cell Strainer 70 umAvantor732-2758
Dressing Forceps V. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 dilution
ForcepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificN71671:500 dilution
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 dilution
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 dilution
Percoll (density gradient medium)Cytiva17089101
Phosphate buffer saline (10x)Gibco70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)BioLegend420302
ScissorsSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL SizeDWK Life Sciences357544

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
  2. Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
  7. Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
  8. Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
  12. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
  13. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
  14. Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
  16. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  17. Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
  18. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
  20. Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
  21. Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
  22. Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
  23. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة