مقالة منهجية

مقايسة إعادة تجميع لوسيفيراز سبليت لقياس ملامسات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الحية

2.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

أكتوبر 11, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لقد أنشأنا مقايسة إعادة تجميع لوسيفيراز سبليت لمراقبة ملامسات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الحية. باستخدام هذا الاختبار ، نصف بروتوكولا لقياس مستوى هذه الاقتران بين العضيات في الخلايا HEK293T ، كاما ، في حالة المعالجة الكيميائية.

الملخص

تلعب مواقع التلامس بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا دورا مهما في صحة الخلايا والتوازن ، مثل تنظيم Ca2+ والتوازن الدهني ، وديناميكيات الميتوكوندريا ، والتكوين الحيوي للجسيم الذاتي والانقسام المبرمج. الفشل في الحفاظ على اقتران ER الطبيعي والميتوكوندريا متورط في العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري والشلل النصفي التشنجي الوراثي. من الأهمية بمكان استكشاف كيف يمكن أن يؤدي عدم تنظيم ملامسات الميتوكوندريا ER إلى موت الخلايا وما إذا كان إصلاح هذه الاتصالات إلى المستوى الطبيعي يمكن أن يحسن من الظروف التنكسية العصبية. وبالتالي ، فإن المقايسات المحسنة التي تقيس مستوى هذه الاتصالات يمكن أن تساعد في إلقاء الضوء على الآليات المسببة للأمراض لهذه الأمراض. في النهاية ، سيسهل إنشاء فحوصات بسيطة وموثوقة تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. نصف هنا مقايسة سبليت لوسيفيراز لقياس مستوى ملامسات الميتوكوندريا ER في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الاختبار لدراسة الدور الفيزيولوجي المرضي لهذه جهات الاتصال وكذلك لتحديد معدلات الفحص عالي الإنتاجية.

المقدمة

تعتبر التفاعلات بين ER والميتوكوندريا أمرا حيويا للتوازن الخلوي والبقاءعلى قيد الحياة 1،2،3،4. تشير الأدلة السابقة إلى أن أي نوع من الاضطراب أو عدم التنظيم في مواقع الاتصال بالميتوكوندريا ER يمكن أن يساهم في العديد من الأمراض التنكسية العصبية والتمثيل الغذائي والقلب والأوعية الدموية ، بالإضافة إلى السرطان5،6،7،8،9،10. على سبيل المثال ، يمكن أن تؤدي الزيادة غير الطبيعية لامتصاص Ca2+ في الميتوكوندريا إلى موت الخلايا عن طريق فتح المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا ، والتي تظهر بشكل شائع في بعض نماذج مرض الزهايمر5،11. وبالمثل ، يمكن أن يؤدي انخفاض ملامسات الميتوكوندريا ER إلى انخفاض في إنتاج ATP وضعف تناول Ca2+ ، كما هو موضح في نماذج التصلب الجانبي الضموري5،11،12. مع إجراء المزيد من الدراسات في مجال اتصالات الميتوكوندريا ER ، يتم اكتشاف بروتينات وجينات إضافية مرتبطة بالأمراض يمكن أن تؤثر على هذه الاتصالات. على الرغم من المعرفة والأدلة الحالية التي تظهر دور مواقع الاتصال بالميتوكوندريا ER ، لا تزال هناك حاجة إلى الكثير من العمل لتوضيح كيف يمكن أن تؤدي هذه الاتصالات إلى فقدان الوظيفة الخلوية وموت الخلايا في النهاية.

تم تطوير طرق مختلفة لتقييم القرب بين الغشاءين ، والتشكل الهيكلي ، والمسافة بين موقعي التلامس العضية3،4،13. تشمل مناهج مراقبة اقتران الميتوكوندريا ER التصوير القائم على علامة التألق14،15 ، والتصوير المستند إلى مراسل FRET16 ، والتصوير القائم على مسبار التألقالمنفصل 17،18 ، والتي تستخدم الفحص المجهري اللامع والبؤر. يعد الفحص المجهري فائق الدقة والدقة الذرية أيضا أدوات قوية لتصور جهات الاتصال بين العضيات بدقة ، على الرغم من أن استخدامها في تحليل موقع التلامس لا يزال محدودا لأنها تتطلب مجاهر مخصصة للغاية وخبرة فنية19. بالإضافة إلى ذلك ، يشيع استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) ، وتقنيات EM الأخرى مثل التصوير المقطعي الإلكتروني (ET) والفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد ، لأنها توفر تصويرا فوق هيكلي عالي الدقة لمواقع التلامس ، والتي غالبا ما يكون من المستحيل استكشافها باستخدام مناهج تجريبية أخرى20،21،22. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق القائمة على EM هي تقنية منخفضة الإنتاجية للغاية يمكن أن تتأثر أيضا بإجراءات التثبيت الكيميائي. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق قائمة على وضع العلامات على القرب للكشف عن مواقع الاتصال وكذلك لتحديد بروتينات موقع الاتصال الجديدة. على سبيل المثال ، تم استخدام مقايسة ربط القرب (PLA) لتحديد تقارب العضية23،24 ، بينما تم استخدام نسخة منقحة من مقايسة الأسكوربات بيروكسيداز (APEX) في تحديد بروتينات موقع التلامسالجديدة 25،26. من المهم أن ندرك أن كل هذه الطرق الموضحة أعلاه لها نقاط قوة وقيود جوهرية في الكشف عن التلامس بين العضيات. وبالتالي ، فإن الاقتران بين التقنيات المختلفة مطلوب للحصول على تفسير شامل لمواقع التلامس العضية.

في السابق ، أنشأنا مقايسة إعادة تجميع Renilla luciferase 8 (مقايسة Split-Rluc) لمراقبة مستوى ملامسات غشاء الميتوكوندريا ER (الشكل 1 أ) 24،26،27. باختصار ، يتم اقتران كل نصف منقسم من Renilla luciferase مع تسلسل استهداف ER أو الميتوكوندريا. عند نقلها معا ، يتم التعبير عن كل نصف منقسم من الإنزيم إما في ER أو غشاء الميتوكوندريا. عندما يتم وضع ER والميتوكوندريا على مقربة من بعضهما البعض ، يجتمع النصفان المنقسمان معا ويعيدان تكوين الإنزيم بأكمله بنشاط لوسيفيراز. بالنسبة لبناء split-Rluc ، استخدمنا Renilla luciferase 8 (Rluc8) في pBAD / Myc-His27 للقالب الأولي. تم تحديد موقع الانقسام (بين الأحماض الأمينية 91 و 92) بناء على التقارير السابقة27. بالنسبة للنصف الطرفي N من Rluc8 ، تم دمج تسلسل الحمض النووي للأحماض الأمينية 1-91 من Rluc8 في نهاية 3 'من علامة FLAG وتسلسل استهداف الميتوكوندريا AKAP1 للفأر في ناقل pcDNA3.1 TOPO بواسطة PCR27. بالنسبة للنصف الطرفي C الذي يستهدف ER ، تم دمج تسلسلات الحمض النووي التي تشفر الأحماض الأمينية 92-311 في نهاية 5 'من علامة myc وتسلسل توطين الخميرة UBC6 ER. هنا ، قمنا بترقية بنية البلازميد المنقسمة Rluc بحيث يتم التعبير عن نصفين منقسمين من Renilla luciferase في ناقل واحد (pCAG) تحت نفس المحفز ثم يتم تقسيمها لاحقا إلى جزأين مثل T2A ، وهو تسلسل ببتيد 2A ذاتي الشق من فيروس Thosea asigna ، يتم إدخاله بين النصفين المنقسمين (الشكل 1 ب). يتم توفير خريطة الحمض النووي البلازميد وتسلسلاته في الملف التكميلي 1 والشكل التكميلي S1. باستخدام هذا النظام ، قمنا بقياس تأثيرات ثلاث مواد كيميائية (تثبيط GTPases المشاركة في بلمرة الأكتين) على ملامسات ER والميتوكوندريا. هذا الاختبار المنقسم Rluc هو نظام فحص بسيط ولكنه قوي للفحص عالي الإنتاجية لمعدلات التلامس بين العضيات24.

البروتوكول

1. صيانة الخلايا والبذر (اليوم 1)

  1. الحفاظ على خلايا HEK293T في وسط زراعة الخلايا الذي يحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل بقري جنين 10٪ (في أطباق استزراع 100 مم) في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. قبل البدء ، تحقق من التقاء اللوحة من خلال المشاهدة تحت المجهر. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 80-90٪ من التقاء ، استعد لزرع الخلايا في صفيحة مزرعة مكونة من 6 آبار عن طريق إزالة الوسائط وغسلها ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS).
  3. قم بإزالة DPBS من طبق المزرعة وعالج الخلايا ب 1 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA الفينول الأحمر. احتضن لمدة 3 دقائق ، ثم أخرج الطبق من الحاضنة وأضف 9 مل من وسائط المزرعة (DMEM مع 10٪ FBS) لإيقاف تفاعل التربسين. قم بتحريك الماصة ببطء لأعلى ولأسفل لضمان إزاحة أي خلايا لا تزال عالقة في اللوحة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 50 مل.
  4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الوسائط وإعادة تعليق كريات الخلية باستخدام 1 مل من الوسائط الطازجة (DMEM + 10٪ FBS).
  5. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
    1. تأكد من التوزيع المتساوي للخلايا عن طريق تدوير الأنبوب برفق. أخرج على الفور 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. أضف 90 ميكرولتر من الوسائط إلى نفس الأنبوب.
    2. بعد خلط الخلايا والوسائط برفق ، خذ معلق الخلية وقم بتطبيق 10 ميكرولتر على كل غرفة من غرف مقياس الدم عن طريق سحب العينة برفق أسفل الغطاء.
    3. باستخدام هدف 10x ، ركز خطوط الشبكة لمقياس كثافة الدم تحت المجهر. بمجرد التركيز ، احسب عدد الخلايا في مجموعة واحدة من 16 مربعا (4 × 4 مربعات) باستخدام عداد إحصاء اليد. كرر حتى يتم حساب جميع المجموعات الأربع المكونة من 16 مربعا.
    4. احسب العدد الإجمالي للخلايا / مل عن طريق أخذ متوسط عدد الخلايا (من كل مربع زاوية من 16 مربعا) وضرب ذلك في 105.
      ملاحظة: بدلا من استخدام مقياس كثافة الدم لعد الخلايا ، يمكن استخدام عداد الخلايا الآلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  6. بمجرد اكتمال عد الخلايا ، استعد لصفيحة الخلايا في صفيحة مكونة من 6 آبار عند 7.5 × 105 خلايا / كثافة بئر مع 2 مل من الوسائط / البئر. في أنبوب سعة 50 مل ، أضف الحجم اللازم من الخلايا مع 13 مل من الوسائط. قم بتوزيع 2 مل من معلق الخلية المخفف في كل من الآبار ال 6.
    1. قبل الطلاء ، احسب عدد الخلايا اللازمة ل 7.5 × 105 خلايا / بئر باستخدام C1V1 = C2V2 حيث C1 هو عدد الخلايا الأولي (رقم الخلية / مل) ، V1 هو الحجم المطلوب من تعليق الخلية الأولي ، C2 هو كثافة الخلية المستهدفة المطلوبة (رقم الخلية / مل) ، و V2 هو الحجم النهائي اللازم لتلقيح الخلايا.
  7. بعد الاستغناء ، اضغط على اللوحة برفق من جميع الجوانب لنشر الخلايا ثم ضعها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل.

2. تعداء الخلايا بوساطة البولي إيثيلين إيثيلين (PEI) وبذر الخلايا بعد التعدي (اليوم 2)

  1. قم بإزالة اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة واستنشق وسائط الاستزراع الموجودة من كل بئر. أضف 2 مل من الوسائط الطازجة لكل بئر.
  2. قم بنقل الخلايا باستخدام Split-Rluc البلازميد DNA (pCAG-MitoR، luc، N-T2A-R ، lucC، ER-IRES-mCherry) المذاب في المخزن المؤقت TE (الرقم الهيدروجيني 8.0).
    1. لكل بئر ، امزج الحمض النووي (750 نانوغرام) و PEI (نسبة الحمض النووي / PEI = 1: 3) في 200 ميكرولتر من DMEM في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. قم بتدوير الحمض النووي / PEI بسرعة عند المستوى 8 لمدة 2 ثانية تقريبا للتأكد من خلطها جيدا معا لتشكيل معقد. بعد ذلك ، قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي صغير لفترة وجيزة (<3 ثوان).
    2. دع خليط الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ثم أضف الخليط (عن طريق إسقاطه) إلى سطح وسط الاستزراع في الصفيحة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على خلايا. اضغط على الطبق برفق (لتوزيع الخليط بالتساوي) واحتضنه في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 6 ساعات.
  3. أثناء الحضانة ، قم بإعداد صفيحة 96 بئرا مطلية ب Poly-D-Lysine (PDL) عن طريق إضافة 70 ميكرولتر من PDL (50 ميكروغرام / مل في DPBS) إلى كل بئر واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة ساعة واحدة على الأقل. قم بإزالة محلول PDL ثم اغسل كل بئر 2x مع 100 ميكرولتر من DPBS. في نهاية الغسيل الثاني ، تأكد من إزالة جميع DPBS المتبقية.
  4. في 6 ساعات بعد التعداء ، استعد لزرع الخلايا المنقولة في صفيحة 96 بئرا مطلية ب PDL.
    1. أخرج الصفيحة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على خلايا منقولة من الحاضنة ، واسحب الوسائط ، واغسل كل بئر ب 2 مل من DPBS. بعد إزالة DPBS ، أضف 350 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin-EDTA فينول أحمر واحتضنه لمدة 1-2 دقيقة. لإيقاف تفاعل التربسين ، أضف 1.7 مل من الوسائط إلى كل بئر.
    2. بعد نقل الخلايا مع الوسائط إلى أنبوب سعة 50 مل ، قم بتدوير الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي على الطاولة. استنشق الوسائط وأعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من الوسائط الطازجة. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم (كما هو موضح في الخطوة 1.5).
  5. قم بزرع الخلايا في صفيحة 96 بئر مطلية ب PDL بكثافة 4 × 104 خلايا / بئر في 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع. لهذا الغرض ، في أنبوب سعة 50 مل ، أضف الحجم اللازم للخلايا (انظر أدناه للحساب) جنبا إلى جنب مع الحجم المناسب للوسائط (الحجم الإجمالي 12 مل). باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف في كل بئر من الآئرات البالغ عددها 96 بئرا. احتضان الخلايا لمدة 18 ساعة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    1. احسب عدد الخلايا اللازمة ل 4 × 104 خلايا / بئر باستخدام C1V1 = C2V2 حيث C1 هو عدد الخلايا الأولي (رقم الخلية / مل) ، V1 هو الحجم المطلوب من تعليق الخلية الأولي ، C2 هو كثافة الخلية المستهدفة المطلوبة (رقم الخلية / مل) ، و V2 هو الحجم النهائي المطلوب لتلقيح الخلايا.

3. المعالجة الكيميائية ومقايسة لوسيفيراز في الخلايا الحية (اليوم 3)

  1. في أنبوب ميكرو فوج سعة 1.7 مل ، قم بإعداد المحاليل الثلاثة الطازجة من 50 ميكرومتر Rhosin (مخزون 50 ملي مولار في DMSO) ، و 25 ميكرومتر Ehop-016 (مخزون 25 ملي مولار في DMSO) ، و 50 ميكرومتر ZCL278 (مخزون 50 ملي مولار في DMSO) عن طريق تخفيف كل محلول مخزون (50 ملي مولار روزين ، 25 ملي مولار إيهوب -016 ، و 50 مل ZCL278 ؛ كلها في DMSO) 1: 1,000 في الكمية المطلوبة (50 ميكرولتر / بئر × عدد الآبار) من وسائط الاستزراع. إلى كل محلول ، أضف ركيزة الخلايا الحية (مخزون 50 ملي مولار في DMSO) ل Renilla luciferase المخفف 1: 2,000 إلى التركيز النهائي 25 ميكرومتر. لصنع حلول ZCL278 0.5 و 5 و 50 ميكرومتر ، قم بإجراء التخفيفات التسلسلية باستخدام 50 ميكرومتر ZCL278 الأولي في وسائط الاستزراع.
    ملاحظة: إذا كان وقت الحضانة الكيميائي مطلوبا لأقل من 1-1.5 ساعة ، فيمكن احتضان الخلايا مسبقا بركيزة الخلايا الحية (ل Renilla luciferase) لمدة 1-1.5 ساعة قبل معالجتها بكل مادة كيميائية. نضيف المواد الكيميائية وركيزة الخلايا الحية في وقت واحد لتحسين بروتوكول فحص الأدوية عالي الإنتاجية.
  2. قم بإزالة الوسائط من كل بئر من الصفيحة المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على خلايا منقولة وأضف 50 ميكرولتر من خليط الوسائط الكيميائية والركيزة إلى كل بئر.
  3. بعد احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة أو 2 ساعة أو 5 ساعات ، أخرج لوحة الثقافة من الحاضنة ، وقم بتحميلها على قارئ لوحة التلألؤ ، وقم بقياس اللمعان.
    1. قبل البدء ، تأكد من تشغيل قارئ اللوحات. قم بالوصول إلى برنامج قارئ اللوحة الدقيقة وقم بإنشاء ملف جديد بالنقر فوق جلسة جديدة. اضبط درجة حرارة قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية بالنقر فوق الحاضنة ، والتحقق من خيار درجة الحرارة ، والكتابة في 37 درجة مئوية. ضمن تخطيط اللوحة ، اختر الخيار غير معروف وحدد الآبار المراد قياسها بالنقر والسحب.
    2. ضمن البروتوكول، انقر فوق Luminescence واحتفظ بالإعدادات الافتراضية. بمجرد الانتهاء من الإعداد ، قم بتحميل اللوحة مع الغطاء في قارئ اللوحة واختر تشغيل اللوحة في. انقر فوق ابدأ وستظهر نافذة حفظ الملف. احفظ الملف على سطح المكتب عن طريق إعادة تسميته والنقر فوق حفظ.
      ملاحظة: سيستمر إنتاج اللمعان لمدة >24 ساعة بعد إضافة ركيزة الخلية الحية.
  4. بمجرد اكتمال القراءة، قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة ثم انقر فوق تشغيل اللوحة لإعادة القارئ. بمجرد الانتهاء ، ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) حتى القراءة التالية.
  5. عند الانتهاء ، انقل بيانات التلألؤ إلى برنامج رسم بياني لرسم وحدة التلألؤ النسبي (RLU) (المحور y) لكل متغير (على سبيل المثال ، المواد الكيميائية أو التركيزات) (المحور x) وتحليل البيانات.

4. التحقق من صحة اختبار split-Rluc بطرق أخرى.

  1. قم بإجراء فحوصات أخرى مثل مقايسة ربط القرب (PLA) ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، ومراقبة امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من مقايسة Split-Rluc كما هو موضح سابقا24.

النتائج

لقد استخدمنا البروتوكول الموصوف أعلاه لقياس مستوى اتصالات الميتوكوندريا ER عند إضافة ثلاثة مركبات معروفة بتثبيط GTPases المحددة. CDC42 و RHO و RAC هي GTPases التي تعزز بلمرة الأكتين28 عند تنشيطها ويتم تثبيطها بواسطة ZCL278 و Rhosin و Ehop-016 ، على التوالي24. تم التعامل مع HEK293T الخلايا المنقولة باستخدام Split-Rluc باستخدام DMSO (السيطرة) أو ZCL278 (50 ميكرومتر) أو Rhosin (50 ميكرومتر) أو Ehop-016 (25 ميكرومتر) واحتضانها لمدة ساعة واحدة و 2 ساعة و 5 ساعات. باستخدام قارئ اللوحة ، قمنا بقياس نشاط split-Rluc في نقاط زمنية محددة (الشكل 2).

لم تظهر الخلايا المعالجة بالروسين (مثبط RHO GTPase) أي تغييرات كبيرة في نشاط اللوسيفيراز مقارنة بالخلايا المعالجة ب DMSO الضابطة في 1 ساعة و 2 ساعة و 5 ساعات من العلاج (ص > 0.9999 ، ص = 0.6956 ، ص > 0.9999) (الشكل 2). توضح هذه النتائج أن Rhosin لا يؤثر على جهات اتصال الميتوكوندريا ER ، مما يشير إلى عدم وجود مشاركة لنشاط RHO GTPase في تنظيم الاتصالات بين العضيتين.

في المقابل ، أظهر مثبط RAC GTPase Ehop-016 نشاطا أقل بكثير من لوسيفيراز من DMSO في 1 ساعة و 2 ساعة و 5 ساعات من العلاج (ص = 0.0106 ، ص = 0.0009 ، ص = 0.0024) (الشكل 2). تشير هذه البيانات إلى أن نشاط RAC GTPase مطلوب للحفاظ على تفاعل ER والميتوكوندريا الطبيعي في الخلية.

أخيرا ، أظهر مثبط CDC42 ZCL278 التغييرات الأكثر جذرية في نشاط لوسيفيراز (الشكل 2). أظهرت الخلايا المعالجة ب ZCL278 انخفاضا كبيرا في نشاط لوسيفيراز مقارنة ب DMSO الضابط وكان لديها أقل قيم p خلال جميع النقاط الزمنية الثلاث ، مع الحفاظ على p < 0.0001 طوال الوقت. تظهر بياناتنا تثبيطا قويا لاقتران الميتوكوندريا ER عندما يتم حظر نشاط CDC42 GTPase بواسطة ZCL278 ، بما يتفق مع تقريرنا السابق باستخدام مقايسة Split-Rluc الأصلية التي تم إجراؤها في الخلايا التي تم نقلها بشكل مشترك مع متجهين يشفران كل نصف من اللوسيفيراز المنقسم بشكل منفصل24.

بالنظر إلى النتائج المدهشة مع ZCL278 ، خاصة عند مقارنتها بمثبطات GTPase الأخرى ، تم اختبار نشاط ZCL278 بتركيزات مختلفة [0.5 ميكرومتر ، 5 ميكرومتر ، 50 ميكرومتر] ضد عنصر تحكم DMSO. أظهرت أنشطة لوسيفيراز المقاسة في 1 ساعة و 2 ساعة و 5 ساعات بعد العلاج استجابة تعتمد على الجرعة. أدى 0.5 ميكرومتر من ZCL278 إلى أضعف تأثير على نشاط لوسيفيراز ، بينما أظهر 5 ميكرومتر أقوى ، و 50 ميكرومتر أظهر أقوى انخفاض في نشاط الإنزيم المعاد تكوينه (الشكل 3). تظهر نتائجنا معا أن ZCL278 يقلل من تنظيم نشاط تقسيم Rluc بطريقة تعتمد على الجرعة ، ومع تقدم الوقت ، لا تزال التركيزات الأعلى من ZCL278 (مثبط CDC42) تظهر تغييرا كبيرا بالنسبة إلى DMSO الضابط مقارنة بالتركيزات المنخفضة.

كطريقة للتحقق من صحة مقايسة Split-Rluc الخاصة بنا ، يمكن إجراء فحوصات مستقلة راسخة ، مثل مقايسة ربط القرب (PLA) ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) ، ومراقبة امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا (الشكل 4 والبيانات غير معروضة) 24. تم استخدام Isoproterenol ، وهو ناهض مستقبلات الأدرينالية β2 ، وهو أحد المركبات المحددة في شاشتنا لمحفزات الاتصال بالميتوكوندريا ER (الشكل 4 أ) ، لتأكيد أن نشاط اللوسيفيراز للانقسام Rluc عند معالجة الأيزوبروتيرينول قد زاد بسبب اتصالات ER-mitochondria المحسنة كما يتضح من التغيرات في شدة إشارة PLA بالإضافة إلى امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا (الشكل 4B-E).

figure-results-1
الشكل 1: مقايسة إعادة تجميع Split-R luc. (أ) التمثيل التخطيطي لمقايسة Split-RLuc. في حالة عدم وجود اتصالات غشائية بين الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية ، يفشل Mito-R lucN و RlucC-ER في التفاعل وبالتالي لا يوجد نشاط Rluc8. ومع ذلك ، فإن التفاعل بين Mito-R lucN و RlucC-ER ، حيث تتلامس أغشية ER والميتوكوندريا ، ينتج عنه نشاط إنزيمي كامل ، والذي يتم اكتشافه عن طريق تحويل الركيزة إلى لمعان. (ب) خريطة تخطيطية لبناء الحمض النووي المنقسم: Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (ج) رسم تخطيطي لسير العمل لمقايسة تقسيم Rluc في HEK293T الخلايا. الاختصارات: ميتو = الميتوكوندريا. ER = الشبكة الإندوبلازمية. IRES ، موقع دخول الريبوسومات الداخلية. rb_glob باسكال ، إشارة الأدينيل بولي بيتا جلوبين الأرنب ؛ T2A ، تسلسل الببتيد 2A ذاتي الشق من فيروس Thosea asigna. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أنشطة انقسام Rluc المقابلة لمستويات جهات اتصال ER-Mito في الخلايا المعالجة بمثبطات GTPase. (A-C) أنشطة لوسيفيراز المعاد تشكيلها عند (A) 1 ساعة ، (B) 2 ساعة ، أو (C) 5 ساعات بعد DMSO (التحكم) ، Rhosin [50 μM] ، Ehop-016 [25 μM] ، أو ZCL278 [50 ميكرومتر] العلاج (ن = 12 لكل مجموعة). تم تحليل جميع البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة. وتبلغ عن قيمة p على أنها p > 0.05 (ns) ، p ≤ 0.05 (*) ، p ≤ 0.01 (**) ، p ≤ 0.001 (***) ، p ≤ 0.0001 (****). تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط ± الخطأ المعياري في القياس. الاختصارات: ميتو = الميتوكوندريا. ER = الشبكة الإندوبلازمية. RLU = وحدة الضوء النسبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أنشطة تقسيم Rluc التي تقيس مستويات جهات اتصال ER-Mito في الخلايا المعالجة ب ZCL278. (أ-ج) أنشطة لوسيفيراز المعاد تشكيلها عند (أ) 1 ساعة ، (ب) 2 ساعة ، أو (ج) 5 ساعات بعد DMSO (التحكم) أو ZCL278 عند تركيز [0.5 ميكرومتر] أو [5 ميكرومتر] أو [50 ميكرومتر] (ن = 12 لكل مجموعة). تم تحليل جميع البيانات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع مقارنات متعددة. وتبلغ عن قيمة p على أنها p > 0.05 (ns) ، p ≤ 0.05 (*) ، p ≤ 0.01 (**) ، p ≤ 0.001 (***) ، p ≤ 0.0001 (****). تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط ± الخطأ المعياري في القياس. الاختصارات: ميتو = الميتوكوندريا. ER = الشبكة الإندوبلازمية. RLU = وحدة الضوء النسبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحقق من صحة مقايسة split-Rluc. (أ) مثال على القياس الكمي لنشاط انقسام Rluc بعد معالجة خلايا HEK293T ب 11 دواء ، بما في ذلك الأيزوبروتيرينول ، تم تحديده في شاشة مركبة لمحفزات التلامس ER-mitochondria. (ب) مثال على مقايسة ربط القرب في خلايا HeLa التي عولجت ب DMSO أو isoproterenol (1 ميكرومتر). تشير إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى (باللون الأحمر) إلى اتصال وثيق بين ER و Mito. Sec61-GFP (أخضر): لتسمية ER ؛ DAPI (أزرق): نواة. (ج) القياس الكمي لإشارة جيش التحرير الشعبى الصينى في A (ن = 4 تجارب مع 77-97 خلية لكل منها ؛ اختبار مان ويتني). (د) امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا استجابة للهيستامين (100 ميكرومتر). تم رسم تغيير شدة الفلورسنت Mito-R-GECO1 (تم أخذ المتوسط على خلايا HeLa متعددة) كل 2.5 ثانية في الخلايا المعالجة ب DMSO أو الأيزوبروتيرينول. يشير السهم إلى إضافة الهيستامين. (ه) اليسار: أقصى ذروة لامتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا في أ. اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج (ن = 10 ، DMOS ؛ 14 ، إيزوبروتيرينول). على اليمين: معدل امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا (كما في A ؛ 7.5 إلى 12.5 ثانية). اختبار مان ويتني (ن = 12 ، DMSO ؛ 11 ، إيزوبروتيرينول). تم تعديل هذا الشكل من Lim et al.24. الاختصارات: RLU = وحدة الضوء النسبي ؛ جيش التحرير الشعبى الصينى = مقايسة ربط القرب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص التقنيات الحالية لاتصالات ER والميتوكوندريا. قائمة المزايا والقيود لكل طريقة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: ملف مضغوط يحتوي على تسلسل الحمض النووي (تنسيقات PDF و GBK) ل pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1: خريطة pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

لقد استخدمنا مقايسة إعادة تجميع Renilla luciferase 8 (مقايسة Split-Rluc) لتحديد مستوى وصلات ER-mitochondria. في هذه الدراسة ، قمنا بتعديل بناء split-Rlucالأصلي 24 عن طريق إنشاء متجه واحد ، pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry ، وترميز كل مكون من مكونات Split-Rluc (MitoRlucN و RlucCER) وتسلسل الببتيد 2A ذاتي الشق من فيروس Thosea asigna لضمان التعبير عن نفس الكمية من كل نصف مقسم من لوسيفيراز. كركيزة ل Renilla luciferase ، بدلا من coelenterazine ، تم استخدام ركيزة خلية حية معدلة (مشتق محمي من coelenterazine ؛ انظر جدول المواد) للأسباب التالية. أولا ، على عكس coelenterazine الذي يولد تلألؤ ذاتي في بيئة مائية (بشكل خاص أسوأ في المصل) ، فإن هذا المشتق المحمي يولد تلألؤا ذاتيا منخفضا جدا (غالبا ما لا يمكن اكتشافه) في وسط يحتوي على مصل 10٪ ، وبالتالي فإن نسبة الإشارة إلى الخلفية أعلى من تلك الناتجة عن coelenterazine. ثانيا ، بشكل مختلف عن coelenterazine ، حيث يكون اللمعان هو الأقوى بعد فترة وجيزة من إضافة الركيزة ولكنه يبدأ في التضاؤل بسرعة كبيرة ، يصل التلألؤ الناتج عن الركيزة الحية المعدلة إلى أعلى نقطة يمكن تحقيقه بعد حوالي 1.5 ساعة من إضافة الركيزة ويبقى مستمرا لأكثر من 24 ساعة. تسهل هذه التغييرات في حركية التفاعل قياس اللمعان في صفيحة متعددة الآبار ، وهو أمر مفيد جدا للفحص عالي الإنتاجية. علاوة على ذلك ، فإن التلألؤ الناتج عن الركيزة المحمية التي تظل ثابتة على المدى الطويل تسمح بقياس مجموعة واحدة من العينات في نقاط زمنية متعددة ، بدلا من قياس مجموعات متعددة من العينات المستخدمة في نقاط زمنية مختلفة (نقطة واحدة لكل عينة).

باستخدام هذا الإصدار المحدث من بناء split-Rluc ، اختبرنا ما إذا كانت RHO و RAC و CDC42 GTPases تشارك في تكوين اتصال ER-Mito. أضفنا مثبطات GTPase ، Rhosin (مثبط RHO) ، Ehop-016 (مثبط RAC) ، و ZCL278 (مثبط CDC42) ، إلى خلايا HEK293T التي تعبر عن مكونات R lucالمنقسمة. تشير نتائج الفحص التي أجريناها إلى أن ZCL278 هو أقوى مثبط لتكوين ملامسة الميتوكوندريا ER وأن Ehop-016 هو المثبط المهم التالي ، بينما لم يؤثر Rhosin على اتصالاتهم. تشير هذه البيانات إلى أن بلمرة الأكتين بوساطة CDC42 (بالإضافة إلى بلمرة بوساطة RAC بدرجة أقل) مطلوبة للحفاظ على اتصالات الميتوكوندريا ER في الخلية ، في حين أن بلمرة الأكتين بوساطة RHO ربما لا تكون مهمة.

لضمان أقصى قدر من الكفاءة ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يجب مراعاتها لهذا البروتوكول. أولا وقبل كل شيء ، يجب اختبار كمية البناء المنقولة لأن الكثير من الحمض النووي يمكن أن يكون له تأثير سام على الخلايا. ثانيا ، نظرا لأن عدد الخلايا يمكن أن يكون له تأثير كبير على مستويات اللوسيفيراز المقاسة ، فإن الحفاظ على كثافة الخلايا قريبة مما هو مذكور في البروتوكول أمر بالغ الأهمية في ضمان التقاء الخلايا المثالي والمتسق بنسبة 80٪ بحلول وقت الفحص. قد يكون هناك انخفاض في اللمعان إذا وصلت الخلايا إلى التقاء خلال وقت التعرض للمواد الكيميائية ، حيث تنتج الخلايا المتجمعة كمية أقل من البروتين بشكل عام. ثالثا ، لضمان عدم انزلاق الخلايا أثناء إضافة المواد الكيميائية والركيزة ، نستخدم صفيحة 96 بئرا مطلية مسبقا ب Poly-D-Lysine. رابعا ، بالنسبة للمركبات (بما في ذلك الركيزة) المستخدمة في هذا البروتوكول ، من المهم الاحتفاظ بها عند -20 درجة مئوية أو أقل (-70 درجة مئوية) في الحصص وإضافتها إلى الخلايا المذابة على الفور. أخيرا ، نظرا للتقلبات المحتملة في درجات الحرارة التي يمكن أن تؤثر على نشاط اللوسيفيراز ، قد يكون من الأفضل اختيار استخدام الآبار الداخلية للصفيحة وتجاهل الآبار المبطنة للجزء الخارجي من اللوحة.

يوفر اختبار split-Rluc8 طريقة سهلة ولكنها قوية لتحديد جهات اتصال الميتوكوندريا ER ، وهي مثالية للفحص عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، هناك بعض القيود التي يجب ملاحظتها. بالنسبة لفسيولوجيا الخلية ، هناك مشكلة التغيرات في سلوك الخلية بسبب الإفراط المستمر في التعبير عن الحمض النووي البني. حاليا ، نحن نعمل على بناء مع محفز محفز لمكافحة التغيرات المحتملة في فسيولوجيا الخلية بسبب الإفراط في التعبير المستمر. علاوة على ذلك ، عند استخدام هذا الاختبار لغرض الفحص ، تجدر الإشارة إلى أن النتائج الإيجابية الخاطئة يمكن أن تنشأ من أي تأثير غير مباشر للأدوية على أ) مستويات التعبير ، ب) كفاءات استهداف العضيات لشظايا البروتين المذكورة ، أو ج) الأنشطة الأنزيمية للوسيفيرازات المعاد تكوينها. بسبب هذه القيود ، يجب اختبار هذا الاختبار جنبا إلى جنب مع طرق أخرى لمزيد من التحقق من صحة النتائج. يشير الجدول 1 إلى طرق مختلفة لاختبار مواقع الاتصال هذه إلى جانب مزاياها وعيوبها. لقد استفدنا من طرق أخرى ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر فحوصات ربط القرب (PLA) ، التي تكتشف القرب بين البروتينات ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM) ، والذي يسمح بالتصور الواضح لاتصالات العضية ، جنبا إلى جنب مع مقايسة الانقسام Rluc للتحقق من أن التغييرات الناتجة في RLU ترجع بالفعل إلى التغيرات في مواقع التلامس ER-mitochondria (الشكل 4 و Lim et al.24). لقد أظهرنا أيضا وجود علاقة بين التغيير في اتصالات الميتوكوندريا ER والمعلمات الوظيفية مثل نقل الكالسيوم وانشطار الميتوكوندريا (الشكل 4 و Lim et al.24). للتأكد من أن تأثير الأدوية على نشاط split-Rluc لا يرجع إلى زيادة التعبير عن جين split-Rluc ، يمكن إضافة مثبط النسخ أو الترجمة مع الأدوية كما فعلناسابقا 24.

لتطبيق نظام الانقسام Rluc في الخلايا العصبية المتمايزة في الثقافة حيث يكون معدل التعدي منخفضا ، فإن العدوى الفيروسية (مع فيروس العدسي الذي يعبر عن مكونات Split-Rluc) ستكون نهجا بديلا. يمكن توسيع استخدامه لإنشاء نظام فحص حيث يتم تصميم الخلايا (على سبيل المثال ، الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة عن طريق الإنسان) للتعبير بثبات عن كل مكون من مكونات split-Rluc و MitoRluc N و RlucCER ، إما عن طريق العدوى الفيروسية أو عن طريق تحرير الجينات بوساطة CRSPR. ومع ذلك ، بالنسبة لنظام التعبير المستقر ، يجب على المرء أن يدرك أنه يمكن أن يكون هناك ضغط اختيار للخلايا التي تتسامح مع نظام الانقسام Rluc بشكل أفضل ، والذي قد لا يمثل الحالة الفسيولوجية الطبيعية. يمكن أن يؤدي هذا التكيف أو الاختيار إلى تحيز في النتائج التجريبية.

باختصار ، على الرغم من بعض القيود التي تمت مناقشتها أعلاه ، فإن split-Rluc هو اختبار سريع ومباشر وقوي للفحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة أو الجينات التي تنظم الاتصالات بين العضيات في الخلية ، كما هو موضح في دراستنا السابقة لفحص الأدوية24.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور جيفري جولدن (مركز سيدارز سيناي الطبي) على المراجعة النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (NINDS ، R01NS113516).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.7 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق SafeSealسورنسون16070
6 آبار لوحة TC المعالجةالولايات المتحدة الأمريكية العلميةCC7682-7506
10 مل نصائح الماصة OneTipالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1110-3700
10 & L نصائح ماصة OneTipالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1110-3700
20-200 & L نصائح مشطوفة OneTipUSA Scientific1111-1210
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلينFalcon352070
رفوف الأنابيب الدقيقة ذات الزعانف 96جيدا ThermoFisher Scientific8770-11
لوحة 96 بئر TC المعالجة   ؛الولايات المتحدة الأمريكية العلميةCC7682-7596
100 مم × 20 مم TC الطبق المعالج الولاياتالمتحدة الأمريكية العلميةCC7682-3394
1250 & L نصائح OneTipالولايات المتحدة الأمريكية العلمية1112-1720
أجهزة الطرد المركزي 5910   ؛ Ri - جهاز طرد مركزي مبردEppendorf5943000131
ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، لا مائي ، & ge ؛ 99.9٪سيجما ألدريتش276855-100 مل
DMEM ، ارتفاع الجلوكوزThermoFisher Scientific11965092
DPBS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248يذوب في DMSO ؛ تخزين عند -70 درجة ؛ C
EnduRen Live Cell SubstratePromegaE6481تخزين aliquots عند -70 درجة ؛ سي
إيبندورف 2-20 مو ؛ L ماصةEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 & mu ؛ ماصة LEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 & micro ؛ L ماصةEppendorf3123000020
Eppendorf Research بالإضافة إلى 12 قناةEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 & mu ؛ L ماصةEppendorf 3123000055
مصل الأبقار الجنينية ، مناطق مؤهلة ومعتمدة من وزارة الزراعة الأمريكيةThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2 & nbsp ؛ حاضنة ، 184 لتر ، مصقول من الفولاذ المقاوم للصدأThermoFisher Scientific381
عداد إحصاء يدويSigma-AldrichHS6594
HEK 293T خلاياATCCCRL-3216
مقياس الدم - Neubauer Bright Line ، غرفة العد المزدوجLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
مجهرZeissAxiovert 25 CFL
Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1012
رف متعدد الأنابيب لأنابيب 50 مل مخروطية ، 15 مل مخروطية ، وأنابيب طرد مركزي دقيقةBoekel Scientific120008
PEI MAX - إعادة الإرسال الخطي البولي إيثيلينيمين هيدروكلوريد (ميغاواط 40،000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin hydrochlorideBio-Techne Tocris5003تذوب في DMSO ؛ تخزين في -70 درجة ؛ C
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاعThermoFisherScientific VL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365المستوى 8
VWR نظام الشفط الفراغيVWR 75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794يذوب في DMSO ؛ يخزن في -70 درجة ؛ ج

المراجع

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

HEK293T
مقايسة إعادة تجميع لوسيفيراز سبليت لقياس ملامسات الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا في الخلايا الحية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.