مقالة منهجية

تلخيص الإصابة علاجية المنشأ: تقنية الاستئصال الكهربائي لنمذجة تضيق مجرى البول في الفئران

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

أكتوبر 11, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، نقدم نموذجا جديدا وفعالا ومستقرا للفئران لتضيق مجرى البول الذي تم إنشاؤه من خلال الاستئصال الكهربائي لمجرى البول في الفئران ، والذي يحاكي بشكل فعال الإصابة علاجية المنشأ التي لوحظت في البيئات السريرية.

الملخص

تضيق مجرى البول (الولايات المتحدة) هو حالة سريرية شائعة في جراحة المسالك البولية ، وتتميز بارتفاع معدل الانتشار والمراضة في جميع الأعمار. تفشل العلاجات الحالية للحالات الأميركية، مثل توسيع مجرى البول واستئصال الإحليل الداخلي، في حل الحالة بشكل كامل وترتبط بمعدلات عالية من التكرار والمضاعفات.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن التسبب في الولايات المتحدة غير مفهوم جيدا. لاستكشاف التسبب في الولايات المتحدة وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة ، من الأهمية بمكان إنشاء نموذج موحد للفئران يعكس بدقة المظاهر السريرية. توضح هذه الدراسة طريقة مباشرة وقابلة للتكرار لحث الولايات المتحدة في الفئران باستخدام سكين كهربائي عالي التردد. تتضمن الطريقة عمل شق طولي باستخدام السكين الكهربائي الذي تم ضبطه على وضع القطع المختلط أحادي القطب عند 4 واط ، مما يتسبب في تلف كبير في مجرى البول. يظهر التحليل النسيجي المرضي سماكة الظهارة البولية ، والتسلل الالتهابي ، وألياف الكولاجين غير المنظمة. يكرر هذا النموذج بشكل فعال الإصابة علاجية المنشأ من خلال الاستئصال الكهربائي في مجرى البول الفئران. باختصار ، نجحت هذه الدراسة في إنشاء نموذج فئران جديد وفعال ومستقر للولايات المتحدة يحاكي عن كثب السيناريو السريري ، مما يوفر أداة قيمة لمزيد من البحث في الآليات والعلاجات الجديدة للولايات المتحدة.

المقدمة

يعد تضيق مجرى البول (الولايات المتحدة) من بين أقدم حالات المسالك البولية ولا يزال منتشرا على نطاق واسع. تشير البيانات الحديثة إلى أن هناك ما بين 229 و 627 حالة من الولايات المتحدة لكل 100,000 ذكر1. يعاني أولئك الذين يعانون من الولايات المتحدة من مجموعة من الأعراض بما في ذلك أعراض المسالك البوليةالسفلية 2 ، والألم3 ، والضعف الجنسي4. تتوفر العديد من العلاجات الطبية ، مثل بضع الإحليل ورأب الإحليل والتوسع5. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه العلاجات معقدة بسبب مشاكل مثل النزيف والعدوى وسلس البول ، مما يساهم في عبء المرض ويظهر معدلات متفاوتة من التكرار6،7. وبالتالي ، يظل تحديد الأساليب العلاجية الأكثر فعالية يمثل تحديا حاسما لإشراك الباحثين والأطباء.

تتميز الولايات المتحدة عموما بأنها تضيق في مجرى البول الأمامي الناجم عن التليف وتسطيخ الغشاء المخاطي لمجرى البول والأنسجة الإسفنجيةالمحيطة 8. على الرغم من انتشاره ، فإن الأسباب والآليات الكامنة وراء الولايات المتحدة غير مفهومة جيدا ، وهناك نقص في النماذج الحيوانية المناسبة للدراسة المتعمقة. تعد الإصابة علاجية المنشأ ، الناتجة عن الجراحة عبر الإحليل ، السبب الرئيسي حاليا للولايات المتحدة ، حيث تمثل 41٪ من الحالات9. لذلك ، يجب أن يكرر النموذج الحيواني المثالي للأبحاث الأمريكية الإصابات السريرية الشائعة بدقة ، ويظهر أوجه تشابه جينومية وبروتينية وثيقة مع البشر ، ويظهر الكفاءة والاستقرار. مثل هذا النموذج من شأنه أن يسهل إلى حد كبير إجراء تحقيقات أعمق في التسبب في الولايات المتحدة وتطوير علاجات أكثر فعالية.

للتحقيق في العملية المسببة للأمراض وآلية الأنواع السريرية الشائعة ، تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة باستخدام كبيرة مثل الأرانب10،1112 والخنازير13،14 باستخدام تقنيات مثل التخثير الكهربائي والاستئصالالكهربائي 15 وحقن البيوميسين16. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه هذه النماذج تحديات بسبب قيود حجم العينة والاختلافات الجينية من البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراعاة فعالية تكلفة استخدام الكبيرة. على الرغم من التكاليف المرتفعة المرتبطة بالرعاية اليومية ، فإن الكبيرة تنطوي أيضا على مخاطر كبيرة للعدوى ، مما يستلزم رعاية مكثفة بعد الجراحة ونفقات كبيرة. من الموثق جيدا أن القوارض تشترك في الخصائص الفسيولوجية والمرضية مع البشر في العديد من أجهزة الأعضاء. أظهرت دراسة حديثة التماثل بين خلايا المسالك البولية للحيوانات القوارض والبشر17. علاوة على ذلك ، فإن تكاليف شراء الفئران وإسكانها ورعايتها بعد الجراحة أقل بكثير من تكاليف الكبيرة18. وبالتالي ، يعتبر نموذج الفئران للولايات المتحدة مناسبا. ومع ذلك ، لم يتم وصف تطوير مثل هذه النماذج في الفئران بشكل كاف.

استخدمت الدراسات السابقة أدوات جراحية مثل الشفرات أو الإبر لحث الولايات المتحدة في نماذج الفئران19. ارتبط هذا النهج بمخاطر مثل إتلاف الأوعية الدموية حول الإحليل ، مما يؤدي إلى نزيف حاد. يمكن أن تؤدي الطبيعة الذاتية لهذه الإجراءات الجراحية أيضا إلى تباين في مدى الإصابة الميكانيكية ، وتفتقر إلى المعايير الكمية للنمذجة ، مما قد يؤثر على تقييم نتائج إصلاح مجرى البول في الدراسات العلاجية اللاحقة.

بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، هناك حاجة واضحة لتطوير نموذج فئران أمريكي إضافي. لإنشاء نموذج أمريكي فعال وفعال من حيث التكلفة ومستقر في الفئران ، استخدمنا آلة سكين كهربائية عالية التردد في بحثنا. سيسهل هذا النموذج إجراء مزيد من التحقيقات في آليات الولايات المتحدة وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة قبل الشروع في التجارب السريرية.

البروتوكول

في هذا التحقيق ، تم توظيف عشرين فأرا من ذكور Sprague-Dawley يبلغ من العمر 6 أشهر ، يزن كل منها 400-500 جرام. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في المستشفى الخامس التابع لجامعة صن يات سين (رقم الموافقة: 00349). تم إيواء في منشأة ذات درجة حرارة وظروف إضاءة خاضعة للرقابة. السمة الأساسية لتضيق مجرى البول هي تطور التندب داخل مجرى البول. بناء على الجدول الزمني المحدد لتكوين الندبة ، والذي يحدث عادة في غضون 4 أسابيع من الإصابة ، حددنا وجود نسيج ندبي ملحوظ في مجرى البول عند علامة 4 أسابيع بعد الجراحة كنقطة نهاية تجريبية.

1. تحضير الأدوات الجراحية

  1. تحضير المواد الجراحية التالية: قسطرة مطلية بالتفلون (0.6 × 1 مم) ، خيوط قابلة للامتصاص (6-0) ، مقص خياطة ، ملقط الأنسجة ، كماشة إبرة ، ملقط ناعم ، وحدة الجراحة الكهربائية عالية التردد (الشكل 1) ، بما في ذلك لوحة السكين الكهربائي عالي التردد ، وسكين الجراحة الكهربائية عالي التردد ، والقضيب الموصل الشرجي (انظر جدول المواد).
  2. نظف منطقة الجراحة بمناديل كحولية تحتوي على 75٪ إيثانول.
  3. التحضير لاستخدام سكين كهربائي عالي التردد في وضع القطع الكهربائي أحادي القطب.
    1. قم بتوصيل السكين الكهربائي عالي التردد بمصدر الطاقة الرئيسي المؤرض 220 فولت باستخدام سلك طاقة.
    2. أدخل مقبض السكين المعقم الذي يتم التحكم فيه يدويا والقضيب الموصل في مآخذهما (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: تأكد من توصيل جميع كابلات الطاقة بإحكام للحفاظ على سلامة الجراحة.

2. تحضير

  1. اسحب البنتوباربيتال الصوديوم (60 مجم / كجم) في حقنة.
  2. قم بتأمين الجرذ عن طريق الإمساك بذيله باليد المهيمنة وإمساك جلد أذنيه ورقبته باليد غير المهيمنة للتأكد من تثبيته بإحكام.
  3. كشف أسفل بطن الفئران وتطهير المنطقة باستخدام كرات قطنية مبللة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
  4. أدخل إبرة المحقنة حوالي 1-2 مم بجانب خط الوسط البطني في أسفل البطن ، وتوجيهها إلى تجويف البطن بزاوية 45 درجة.
    ملاحظة: ستشعر بفقدان المقاومة عندما تخترق الإبرة الصفاق.
  5. اسحب مكبس المحقنة برفق للتأكد من عدم وجود دم أو سوائل في المحقنة.
  6. حقن بنتوباربيتال الصوديوم ببطء. اسحب الإبرة ، واستكمل الحقن ، وقم بتطهير الموقع مرة أخرى بكرات قطنية مبللة بنسبة 75٪ من الإيثانول.
  7. راقب إيقاع تنفس الفئران واضغط على مخلبه الخلفي للتحقق من ردود الفعل.
    ملاحظة: تأكد من أن تنفس الفئران ثابت وأنه لا يظهر أي ردود أفعال قبل الشروع في الجراحة.
  8. اعصر مرهم الإريثروميسين واغمس قطعة قطن في المرهم. ضع المرهم بقطعة قطن على قرنية كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
  9. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلاقة أسفل البطن والعجان بعد تأكيد التخدير.
  10. امسح الشعر المتساقط من المنطقة المحلوقة بمنديل مبلل بالمحلول الملحي.
  11. قم بتطهير المنطقة عن طريق مسحها مرتين بإسفنجة شاش مبللة باليودوفور لتقليل تهيج الجلد.
  12. ضع الجرذ المخدر بعمق على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية في وضع ضعيف. تأكد من العقم أثناء العمليات الجراحية من خلال ارتداء القفازات الطبية.

3. إجراء قسطرة مجرى البول والإصابة

  1. أدخل القضيب الموصل في فتحة الشرج للفأر لإنشاء دائرة حلقة مغلقة فعالة لآلة السكين الكهربائية عالية التردد (الشكل 2 أ).
  2. قم بقسطرة مجرى البول للفأر للمساعدة في تحديد الوضع وتقديم الدعم أثناء خطوات ما بعد المعالجة للجراحة.
    1. قم بتليين القسطرة البولية بزيت البارافين.
    2. كشف القضيب عن طريق الضغط على الجلد المحيط به لإخراجه من البطن.
    3. تطهير قضيب الفئران بإسفنجة شاش مبللة باليودوفور.
    4. افتح فتحة مجرى البول برفق باستخدام ملقط ناعم وأدخل القسطرة المشحمة في مجرى البول.
    5. أدخل القسطرة المطلية بالتفلون بعناية في مجرى البول مع إيقاع تقلص مجرى البول. تجنب أي إدخال قوي (الشكل 2 ب).
    6. إذا تمت مواجهة مقاومة ، اسحب القضيب برفق باتجاه الجانب البطني لضبط زاوية الانحناء للقضيب واستمر في دفع القسطرة إلى المثانة حتى يتدفق البول للخارج (الشكل 2 ج).
    7. تأكد من نجاح القسطرة عن طريق التأكد من أن القضيب يشكل زاوية تقريبية تبلغ 45 درجة مع البطن (الشكل 2 د).
  3. قم بتشغيل آلة السكين الكهربائية عالية التردد ، وانقر فوق أزرار لوحة السكين عالية التردد لتحديد وضع القطع المختلط أحادي القطب ، واضبط الطاقة على 4 واط للخطوات التالية للاستئصال الكهربائي للقضيب طبقة تلو الأخرى.
  4. قم بمحاذاة الشق مع القسطرة. اضغط على الزر الأصفر الموجود على مقبض السكين الجراحي الكهربائي وقم بعمل شق على طول خط تعليم القسطرة من جلد القضيب إلى الطبقة الخارجية من مجرى البول باستخدام السكين الكهربائي حتى يتعرض مجرى البول (الشكل 3 أ ، ب).
    ملاحظة: تأكد من الضغط على الزر الأصفر للاستئصال الكهربائي ، وليس الزر الأزرق للتخثير الكهربائي.
  5. استمر في عمل شق طولي بطول 0.5 سم في مجرى البول بالسكين الكهربائي ، مع ضمان قطر عرضي يبلغ 0.1 سم ، حتى تظهر القسطرة (الشكل 3 ج).
  6. خياطة الجرح وطبقة الجلد السطحية بطبقة باستخدام خيوط قابلة للامتصاص (6-0) إما بغرز مستمرة أو متقطعة (الشكل 3D ، E).
  7. قم بإزالة قسطرة مجرى البول وأعد وضع القضيب (الشكل 3F).
  8. قم بإيقاف تشغيل السكين الكهربائي عالي التردد وإزالة القضيب الموصل من فتحة الشرج للفئران.
  9. نظف المواد الجراحية بمناديل الكحول (75٪ إيثانول).

4. رعاية ما بعد الجراحة

  1. ضع الجرذ على وسادة دافئة (37 درجة مئوية) وراقب تعافيه من التخدير عن كثب. انتبه جيدا للحالة الجسدية للفئران ، بما في ذلك إيقاع التنفس ودرجة حرارة الجسم ومستوى الوعي.
    ملاحظة: لا تعيد الجرذ إلى قفصه حتى يتم ملاحظة الشفاء التام.
  2. ضع الفئران في قفص نظيف واملأ زجاجة الماء بالماء المليء بالمورفين (0.4 مجم / كجم) للتحكم اليومي في الألم بعد الشفاء.
  3. يجب إعطاء الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (مثل كاربروفين، 0.5 ملغم/كغ، الحقن تحت الجلد) للشفاء التام للفئران من آلام ما بعد الجراحة.

5. التقييم النسيجي

  1. بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، قم بتحفيز منعكس التبول عن طريق رفع ذيول الفئران. ضع الجرذ في صندوق القتل الرحيم ، وافتح صمام أنبوب نقل ثاني أكسيد الكربون2 ، وقتل الفئران بشكل إنساني بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون2.
  2. أغلق الصمام بعد التأكد من أن الجرذ بلا حراك ولا يتنفس وملاحظة أن التلميذ متسع. استمر في مراقبة الحالة الجسدية للفأر لمدة دقيقتين للتأكد من نجاح القتل الرحيم.
  3. أخرج الجرذ من صندوق القتل الرحيم.
  4. نظف المنطقة الجراحية والمواد الجراحية بمناديل مبللة بالإيثانول بنسبة 75٪.
  5. قم بتشريح البطن لمراقبة حالة ملء المثانة وحصاد مجرى البول بالكامل.
  6. بعد حصاد مجرى البول ، ضع الجرذ في كيس مانع للتسرب وقم بتخزينه في ثلاجة 4 درجات مئوية للمعالجة من قبل فنيي المختبرات.
  7. تقييم الولايات المتحدة من الناحية الشكلية لعلم الأمراض الجسيم ، مع التركيز على لون ونعومة الأنسجة.
  8. تلطيخ أنسجة مجرى البول بالهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) لتصور بنية الجرح وطبقة الخلايا البولية.
    1. اغمس الشرائح في الزيلين لإزالة البارافين (2 × 5 دقائق).
    2. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بالترتيب (100٪ 1 × 3 دقائق ، 95٪ 1 × 3 دقائق ، 85٪ 1 × 3 دقائق ، 75٪ 1 × 3 دقائق).
    3. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 دقيقة).
    4. تلطخ الشرائح بالهيماتوكسيلين (10 دقائق).
    5. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (5 دقائق).
    6. ميز العينات بمحلول التمايز (40 ثانية).
    7. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 × 3 دقائق).
    8. تلطخ الشرائح باليوزين (2 دقيقة).
    9. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بترتيب (100٪ 1 × 3 ثوان ، 95٪ 1 × 3 ثوان ، 85٪ 1 × 3 ثوان ، 75٪ 1 × 3 ثوان)
    10. اغمس الشرائح في 100٪ من الإيثانول (1 دقيقة) وقم بشفافية الشرائح بالزيلين (2 × 1 دقيقة).
    11. أضف بلسم محايد وأغلقه بالغطاء.
  9. ضع صبغة ماسون ثلاثية الألوان على أنسجة مجرى البول لإبراز بنية ألياف الكولاجين.
    1. اغمس الشرائح في الزيلين لإزالة البارافين (2 × 5 دقائق).
    2. أعد ترطيب الشرائح في الإيثانول بالترتيب (100٪ 1 × 3 دقائق ، 95٪ 1 × 3 دقائق ، 85٪ 1 × 3 دقائق ، 75٪ 1 × 3 دقائق).
    3. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 دقيقة).
    4. تلطخ الشرائح في محلول الهيماتوكسيلين الحديدي من Weigert (5 دقائق).
    5. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (5 دقائق).
    6. تلطخ الشرائح في Biebrich Scarlet-Acid Fucshin (5 دقائق).
    7. اغسل الشرائح بالماء منزوع الأيونات (2 × 3 دقائق).
    8. تلطخ الشرائح بمحلول حمض الفوسفوروموليبديك (5 دقائق).
    9. ضع الشرائح في محلول الأنيلين الأزرق (5 دقائق). تجاهل الحل.
    10. اشطف الشرائح ، وجففها من خلال الكحول ، وقم بإزالتها في الزيلين.
    11. أضف بلسم محايد وأغلقه بالغطاء.
  10. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام جسم مضاد TGF-β لتقييم طبقة الخلايا البولية.
    1. أضف المخزن المؤقت المناسب لاسترجاع المستضد إلى قدر الضغط. ضع قدر الضغط على لوح التسخين وقم بتشغيله بكامل طاقته.
    2. بمجرد الغليان ، انقل الشرائح من ماء الصنبور إلى قدر الضغط. قم بتشغيل الماء البارد فوق الطباخ وقم بتسخين الشرائح لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإيقاف تشغيل قدر الضغط وإزالة الشرائح. قم بتبريد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. اغسل الشرائح بمحلول PBS.
    5. ضع علامة على هوامش العينات بقلم مانع السائل.
    6. اغمس الشرائح في PBS بالإضافة إلى 0.3٪ Triton X-100 لمدة 30 دقيقة.
    7. اغسل الشرائح في PBS بتحريك لطيف (2 × 5 دقائق).
    8. ضعي مصل الماعز بنسبة 10٪ في PBS في درجة حرارة الغرفة (60 دقيقة).
    9. المخزن المؤقت لحجب الشفط واحتضانه بالجسم المضاد الأساسي عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    10. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3 × 5 دقائق).
    11. احتضان الجسم المضاد الثانوي المسمى بالفلوروكروم المخفف في المخزن المؤقت لتخفيف الأجسام المضادة.
    12. اغسل الشرائح باستخدام 1x PBS (3 × 3 دقائق).
    13. قم بتركيب الشرائح وإغلاقها.
  11. امسح الشرائح الملطخة رقميا باستخدام هدف 40x في ماسح ضوئي للشرائح.
  12. قم بتحليل الصور وقياس سمك اليوثريثيليوم باستخدام البرنامج المشار إليه (جدول المواد).
    1. افتح البرنامج.
    2. انقر فوق Local Computer لتحديد صور الشرائح الملونة.
    3. انقر فوق قياس المسافة لقياس سمك الظهارة البولية.
    4. سجل البيانات عن سمك الظهارة البولية.

النتائج

نجح البروتوكول الموضح في هذه الدراسة في إنشاء تضيق مستقر في مجرى البول في الفئران وأظهر قابلية عالية للتكاثر. كان متوسط مدة العمليات 20 دقيقة ، ولم تنشأ أي مشاكل فنية أثناء الإجراءات. تم حصاد عينات مجرى البول بنجاح بعد 4 أسابيع من العملية.

في المجموعة التجريبية ، أظهرت مثانات الفئران علامات فرط الانتفاخ ، على عكس المجموعة الضابطة حيث كانت المثانات فارغة (الشكل 4). تشير هذه الملاحظات إلى ضعف كبير في وظيفة إفراغ الفئران بعد النمذجة التجريبية.

بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، تطورت مواقع الجرح إلى نسيج ندبي أبيض شمعي بارز من سطح مجرى البول (الشكل 5 ب) ، بينما ظهرت أقسام مجرى البول في المجموعة الضابطة ناعمة وحمراء شاحبة (الشكل 5 أ)).

كشف الفحص النسيجي مع تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) لقسم مجرى البول عن سماكة كبيرة في البوليثيليوم وتراكم الخلايا الليمفاوية. بالإضافة إلى ذلك ، حدد تلطيخ ماسون منطقة حمراء واضحة من الأنسجة الظهارية لمجرى البول مفرط التنسج والميتابلاست ، مصحوبة بألياف الكولاجين المضطربة (انظر الشكل التكميلي S1 للحصول على صور مفصلة لتلوين ماسون) ، مما يشير إلى وجود تشوهات في بنية العضلات الملساء وألياف الكولاجين (الشكل 6).

أظهر تحليل التألق المناعي لعمليات القطع بالتبريد زيادة TGF-β في أنسجة مجرى البول بعد الجراحة (الشكل 7) ، مما يشير إلى أن تكوين بنية مجرى البول يرتبط بالتعبير المرتفع عن TGF-β.

figure-results-1
الشكل 1: الأدوات الرئيسية المستخدمة لإنشاء نموذج الولايات المتحدة. (أ) قسطرة مغلفة بالتفلون (0.6 × 1 مم)؛ (ب) خيوط قابلة للامتصاص (6-0) ، ملقط الأنسجة ، كماشة تثبيت الإبرة ، ملقط ناعم (من اليسار إلى اليمين) ؛ (ج) قلم جراحي كهربائي عالي التردد وقضيب موصل شرجي ؛ (د) لوحة السكين الكهربائي عالي التردد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الاستعدادات للجراحة. (أ) حلق النصف السفلي من بطن الفئران وقم بتوصيل القضيب الموصل الشرجي. (ب-د) توضيح موضع قسطرة مجرى البول داخل مجرى البول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: عملية الاستئصال الكهربائي. (أ) يبين إنشاء شق طولي على جلد القضيب بقياس 0.8 سم؛ (ب) تعرض مجرى البول. (ج) يفصل المقطع الكهربائي من خلال جميع طبقات جدار مجرى البول حتى تظهر القسطرة داخل مجرى البول. (د ، ه) يصور إزالة قسطرة مجرى البول وإعادة وضع القضيب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: حالة ملء المثانة في الفئران في ظل الظروف التشريحية. (أ) يتميز بمثانة فارغة من الفئران في المجموعة الضابطة. (ب) يظهر مثانة ممتلئة من الفئران في المجموعة التجريبية. المثانات داخل المخطط الأحمر المتقطع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: النتائج العيانية لعينات مجرى البول المقطوعة. (أ) أنسجة مجرى البول الطبيعية. (ب) النسيج الندبي في مجرى البول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: نتائج الأنسجة لعينات مجرى البول. (أ) أنسجة مجرى البول من المجموعة الضابطة الملطخة ب H & E (التكبير الأصلي ، 100x). (ب) تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لكتلة مجرى البول عند التكبير الأصلي 100x. (ج) التضخم وبيانات قياس سماكة الظهارة البولية الطبيعية ، والتي تبلغ 85.9 ميكرومتر. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (D) يظهر تلطيخ H & E لأنسجة مجرى البول من المجموعة التجريبية عند التكبير الأصلي 100x. (ه) يصور تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان لأنسجة مجرى البول من المجموعة التجريبية ، أيضا عند التكبير الأصلي 100x. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (F) تضخم ندبة مجرى البول وبيانات قياس الظهارة البولية السميكة -231.2 ميكرومتر. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: نتائج الكيمياء المناعية على عينات مجرى البول المستعصية. يسلط وضع العلامات على الأجسام المضادة TGF-β الضوء على خلايا الظهارة البولية. ينبعث مضان أخضر عند ارتباط الجسم المضاد بالخلايا. (أ-ج) إظهار شدة إشارة أقل في خلايا الظهارة البولية للمجموعة الضابطة مقارنة ب (D-F) شدة إشارة أعلى في خلايا الظهارة البولية للمجموعة التجريبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي S1: الصورة الكاملة لتلوين ماسون لعينات مجرى البول. (أ) تلطيخ الكتلة للمجموعة الضابطة؛ (ب) تلطيخ ماسون للمجموعة التجريبية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تشكل الولايات المتحدة عبئا كبيرا في مجال الرعاية الصحية له تأثير اقتصادي كبير ، مما يؤثر سلبا على كل من الصحة النفسيةوالجسدية 20. لا تزال هناك حاجة لعلاج لا يعالجنا تماما فحسب ، بل يمنع تكراره بشكل فعال.

في هذه الدراسة ، استخدمنا نموذج الفئران لتطوير طريقة مباشرة وقابلة للتكرار لتقليد إصابة مجرى البول لدى المرضى ، والتي تبعتها إصابة مجرى البول الناجمة عن جراحة عبر الإحليل. تفضل الفئران كنماذج حيوانية لأنها فعالة من حيث التكلفة وسهلة التعامل معها وتوفر قابلية التكرار وتوفر بيانات موثوقة. يتميز نموذج الفئران المستخدم في هذه الدراسة بالعديد من المزايا مقارنة بالنماذج الأخرى: فهو شائع الاستخدام في تحليلات omics المختلفة ويسهل إدارته. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التشابه في التعبير الجيني للخلايا الظهارية في المسالك البولية بين القوارض والبشر يجعل نموذج الفئران الأمريكي مناسبا بشكل خاص للتحقيقات الأعمق21.

كما يتضح من الشكل 7 ، تم التعبير عن TGF-β في الدائرة الكاملة لمجرى البول في كل من المجموعات الضابطة والتجريبية ، وكان التعبير عن TGF-β في المجموعة التجريبية أعلى بشكل ملحوظ من المجموعة الضابطة. وقد وثق العمل السابق أن خلايا اليوثريثيليوم المقيمة تخضع فعليا لتحول ظاهري إلى الخلايا الليفية العضلية بعد الإصابة ، والتي تكون العملية مدفوعة بشكل أساسي ب TGF-β ، والتي تمارس تأثيرات كبيرة على تكوين الندبة من خلال تنظيم إنتاج ECM (المصفوفة خارج الخلية) ، والتعديل المناعي ، وتكاثر الخلايا ، والهجرة والتمايز22،23. تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن الإفراط في التعبير عن TGF-β قد يعزز تكوين ندبة مجرى البول ، وأن إفراز TGF-β لا يقتصر على الخلايا المقيمة في سطح الجرح ولكنه يتطلب مشاركة مجرى البول بأكمله.

يمثل القطر الصغير وانحناء مجرى البول الذكور تحديات في اكتشاف التغيرات في ديناميكا البول بعد النمذجة. هناك ندرة في الأبحاث حول طرق تقييم وظيفة المسالك البولية في ذكور الفئران. في هذه الدراسة ، استخدمنا طرقا غير مباشرة لمراقبة التغيرات في وظيفة المسالك البولية من خلال تقييم حالة ملء المثانة بعد 4 أسابيع من الجراحة. عند تحفيز منعكس التبول ، أظهرت ملاحظة بطن الفئران المقطوع تشريح أن المجموعة التجريبية أظهرت امتلاء مستمر للمثانة ، مما يدل على ضعف كبير في وظيفة الإفراغ بعد النمذجة. تتوافق هذه النتائج مع الأعراض السريرية لصعوبة التبول التي يعاني منها المرضى الذين يعانون من تضيق مجرىالبول 24. ومع ذلك ، فإن تطوير طرق لإجراء دراسات فسيولوجية حول المعلمات البولية في ذكور الفئران ، مثل تكرار الإفراغ ، ومتوسط حجم التفريغ ، وكفاءة الإفراغ ، لا يزال يمثل تحديا.

يؤثر اختيار الأوضاع وإعدادات الطاقة للسكاكين الكهربائية عالية التردد بشكل حاسم على مدى الإصابة في العمليات الجراحية. تقدم هذه الدراسة تقنية جراحية تضمن مستوى مناسبا من الإصابة ، ودرجة كافية من السكين الكهربائي عالي التردد وهو 4 واط لتطوير نموذج أمريكي في الفئران. تتضمن الطريقة الأكثر شيوعا في نماذج الفئران الأمريكية عمل شقوق بإبرة أو مشرط25. ومع ذلك ، فإن استخدام المشرط يميل إلى زيادة احتمالية حدوث نزيف مستمر بسبب السطح الأملس والقطر الصغير لمجرى البول للفئران ، مما قد يؤدي إلى إتلاف الأوعية الدموية المحيطة عن غير قصد.

يوفر السكين عالي التردد ميزة كبيرة من خلال توفير إرقاء متزامن من خلال تطبيق تيار كهربائي مستقر وقابل للتعديل على الأنسجة ، مما يعزز استقرار الإجراء وراحته. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح إمكانية التحكم في إعداد الطاقة بإجراء تقييم قابل للقياس الكمي للضرر الناجم عنه.

من شأن البروتوكول التجريبي المثالي أن ينتج باستمرار جروح مجرى البول ذات حجم وعمق موحدين. في هذه الدراسة ، تم اختيار وضع القطع المختلط أحادي القطب للحث على تلف مجرى البول. على عكس وضع التخثير الكهربائي ، الذي يتسبب في المقام الأول في تطاير المكونات السائلة ، والتجفيف ، وتخثر الأنسجة ، وإغلاق الأوعية الدموية دون تمزق الأنسجة مما يؤدي إلى حرق الأنسجة والالتصاق السريع - يتيح وضع القطع شقوقا دقيقة طبقة تلو الأخرى في أنسجة القضيب. في حين أن التخثير الكهربائي شائع الاستخدام في نماذج الأرانب الأمريكية ويتطلب خطوات إضافية مثل فصل القضيب عن الراديوم وعمل شقوق بأدوات جراحية أخرى26 ، مما يزيد من مخاطر الصدمات والمضاعفات الحيوانية ، فإن وضع القطع المختلط أحادي القطب يسمح بشقوق مباشرة في القلفة لكشف مجرى البول. تعزز هذه الطريقة الكفاءة التشغيلية وتقلل من الصدمات التي تلحق بحيوانات التجارب.

لم يتم تحديد إعداد الطاقة في الدراسة السابقة بالتفصيل ، لأنه يعتمد عادة على وزن التجربة ومنطقة التلامس بين السكين الإلكتروني والأنسجة. في هذه الدراسة ، كانت الموضوعات التجريبية من فئران SD البالغة من العمر 6 أشهر يتراوح وزنها بين 400 غرام و 500 جرام. في هذه الظروف ، تم تحديد إعداد الطاقة الأمثل ليكون بين 4-7 واط ، مما سمح بالتحكم الدقيق في حجم وعمق الشق. نوصي بأن يبدأ المشغلون بإعداد طاقة أقل عند استخدام السكين عالي التردد لأول مرة لتطوير نموذج الفئران الأمريكي ، والتعديل حسب الحاجة للعثور على القيمة الأنسب لظروف مختلفة.

علاوة على ذلك ، تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في قسطرة مجرى البول للفئران قبل الجراحة. يتم تأكيد القسطرة الناجحة عندما يتم وضع القسطرة بشكل صحيح في المثانة. على الرغم من أن القسطرة تعمل كسقالة مؤقتة ، إلا أنها يجب أن تحافظ على موضع مجرى البول وتساعد في تحديد موقع الجراحة. يبلغ قطر مجرى البول لدى ذكر الفئران قطرا صغيرا نسبيا ، وهناك مسافة محدودة بين القلفة وأنسجة القضيب ، مما يجعل من السهل إدخال القسطرة عن طريق الخطأ في الفتحة الخاطئة ، مما قد يؤدي إلى تعقيد الإجراءات اللاحقة. يتم التحقق من الوضع الصحيح للقسطرة عندما يتدفق البول للخارج ، مما يشير إلى أنه داخل المثانة بشكل آمن. بالإضافة إلى ذلك ، يجب وضع القضيب القسطرة بزاوية 45 درجة لتعزيز الاستقرار داخل مجرى البول وتسهيل العملية الجراحية.

في الختام ، توضح هذه الدراسة طريقة جديدة وفعالة للغاية وفعالة من حيث التكلفة لإنشاء نموذج أمريكي في الفئران. تتميز هذه الطريقة ببساطتها ومعدل نجاحها العالي واستقرارها ، مما يوفر أداة قيمة للتحقيق في مجموعة واسعة من العلاجات المبتكرة لتضيق مجرى البول.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (رقم 2019A1515012116 ورقم 2022A1515012559).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خيوط قابلة للامتصاص (6-0)وسادة تشغيل حيوانية KR2230814
مقدمة من مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للتصوير الطبيالحيوي NA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
كاربروفينسيجما ألدريتشMFCD00079028
CoraLite488 الماعز المترافق المضاد للأرانب IgG (H + L)ProteintechSA00013-2
H& E Stain KitAbcamab150669
  وحدة الجراحة الكهربائية عالية الترددشركة Beijing Taktvoll Technology CompanyES-100v
طقم تلطيخ ماسونMerckHT15
كماشة إبرةRWD Life ScienceS15001-11
زيت البارافينNANA
ملقط ناعمRWD Life ScienceF13019-12
البنتوباربيتالالصوديوممختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للتصوير الطبي الحيويNA
Sprague & ndash ؛ مركز مختبر داولي الفئرانقوانغدونغالطبي GDMLAC-035
مقص خياطةRWD Life ScienceS15001-11
قسطرة مطلية بالتفلون (0.6 مم × 1 مم)شركة المواد الجديدة DGZFNA
TGF Beta 1 الأجسام المضادة متعددة النسيلةProteintech21898-1-AP
مقص المناديلRWD Life ScienceS13029-14
شركة KERONG

المراجع

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة