مقالة منهجية

تحضير الكريات المجهرية لألجينات الصوديوم المتشابكة مع أيونات معدنية مختلفة باستخدام تقنية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة

DOI:

10.3791/66871

⸱

يونيو 7, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Artificial Organs and Computational Medicine in Zhejiang Province, Institute of Translational Medicine, Zhejiang Shuren University, 2The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول تحضير الكريات المجهرية لألجينات الصوديوم المترابطة مع أيونات المعادن المختلفة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة لتصميم حامل الدواء. كما تم التحقيق في الخصائص المضادة للميكروبات وبطء إطلاق الدواء لهذه الكريات المجهرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكريات المجهرية هي جسيمات بحجم ميكرومتر يمكنها تحميل الأدوية وإطلاقها تدريجيا عن طريق التغليف المادي أو الامتزاز على السطح وداخل البوليمرات. في مجال الطب الحيوي ، تمت دراسة الكريات المجهرية الهيدروجيل على نطاق واسع لتطبيقها كناقلات للأدوية نظرا لقدرتها على تقليل وتيرة تناول الدواء ، وتقليل الآثار الجانبية ، وتحسين امتثال المريض. ألجينات الصوديوم (ALG) هو عديد السكاريد الخطي الذي يحدث بشكل طبيعي مع ثلاثة روابط جليكوسيدية العمود الفقري. توجد مجموعتان مساعدتان من الهيدروكسيل في كل جزء من أجزاء البوليمر، والتي لها خصائص مجموعة هيدروكسيل الكحول. يمكن أن تخضع وحدات ALG الاصطناعية لتفاعلات كيميائية متقاطعة مع أيونات المعادن ، وتشكل بنية شبكة مترابطة من مداخن البوليمر ، وتشكل في النهاية هيدروجيل. يمكن تحضير الكريات المجهرية الهيدروجيل باستخدام عملية بسيطة تتضمن خصائص الربط المتقاطع الأيوني ل ALG. في هذه الدراسة ، قمنا بإعداد الكريات المجهرية الهيدروجيل القائمة على ALG (ALGMS) باستخدام استراتيجية الترسيب الكهربائي للسوائع الدقيقة. كانت الكريات المجهرية الهيدروجيل المحضرة ذات حجم موحد ومشتتة جيدا ، بسبب التحكم الدقيق في تدفق الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة. تم تحضير ALGMS المتصالب مع أيونات معدنية مختلفة باستخدام تقنية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة التي تجمع بين الموائع الدقيقة والمجال الكهربائي العالي ، وتم التحقيق في خصائصه المضادة للميكروبات ، والقدرة على إطلاق الدواء البطيء ، والتوافق الحيوي. هذه التكنولوجيا تبشر بالتطبيق في تطوير وإنتاج الأدوية المتقدمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد أنظمة توصيل الأدوية نقطة ساخنة للأبحاث في مجال هندسة الأنسجة الحيوية ، وتهدف إلى تحسين كفاءة وفعالية توصيل الأدوية وتقليل ردود الفعل السلبية والآثار الجانبية1. من بين هذه الأنظمة ، تعد الكريات المجهرية الهيدروجيل ، التي تتميز بالتوافق الحيوي الجيد ، والخصائص الميكانيكية القابلة للضبط ، واللدونة الوظيفية ، واحدة من أكثر المركبات استخداما لتحميل الأدوية وتسليمها2. يمكن استخدامها لكل من الإطلاق البطيء والمتحكم فيه للأدوية ، وتوفير تأثيرات وقائية جيدة للأدوية ، وتجنب أو تقليل الآثار غير المحددة للأدوية في الأنسجة الأخرى ، واستهداف توصيل الدواء إلى هياكل أنسجة محددة3. لذلك ، أصبحت الكريات المجهرية الهيدروجيل نظاما جديدا وفعالا لتوصيل الأدوية ، مع ظهور الأبحاث في هذا المجال تدريجيا4.

عادة ما يتم تصنيع الكريات المجهرية الهيدروجيل من مواد قابلة للتحلل ، بما في ذلك السكريات والبروتينات والبوليمرات الطبيعية5. من بينها ، ALG هو عديد السكاريد المتوافق حيويا والقابل للتحلل المستخرج من الطحالب البنية البحرية6. تحتوي سلسلته الجزيئية على مجموعات هيدروكسيل وكربوكسيل حرة يمكن أن تتشابك مع معظم الكاتيونات ثنائية التكافؤ أو متعددة التكافؤ لتشكيل بنية هيدروجيل غير قابلة للذوبان في الماء مع شبكة ثلاثية الأبعاد5. يمكن تحويل الكريات المجهرية الهيدروجيل التي تشكلها ALG إلى إلكتروليتات سالبة الشحنة في المحاليل المحايدة والقلوية. يؤدي هذا التنافر بين الشحنات السالبة إلى تضخم الكريات المجهرية ، مما يسمح بإطلاق المكون النشط أو الدواء المغلف. وقد أدت هذه الخصائص إلى اعتبار الكريات المجهرية ALG كناقلات أدوية واعدة تستخدم على نطاق واسع لتحميل الأدوية والإطلاقالخاضع للرقابة 7.

توجد طرق مختلفة لإعداد الكريات المجهرية هيدروجيل. عادة ما تتضمن طرق تحضير ALGMS التقليدية طريقة sol-gel أو طريقة emulsion-sol. تتضمن هذه الطرق خطوات مثل الترسيب والترسيب المشترك وتفاعلات الهلام للحصول على الكرات المجهرية المستهدفة8. في السنوات الأخيرة ، مع التطوير المستمر لتكنولوجيا الموائع الدقيقة ، أصبحت طريقة الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة تدريجيا طريقة تحضير مجهرية فعالة ودقيقة9. تستخدم هذه الطريقة تقنية الموائع الدقيقة للرش الكهربائي لمحلول بوليمر من خلال فوهة دقيقة لتشكيل قطرات وكرات مجهرية بحجم ميكرومتر أثناء عملية المعالجة أو الربط المتقاطع اللاحقة10. بالمقارنة مع الطريقة التقليدية ، يوفر الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة تحكما دقيقا في حجم جسيمات الكرة المجهرية ومورفولوجيتها عن طريق ضبط المعلمات مثل معدل تدفق المحلول والجهد وحجم الفوهة الدقيقة11. كما أنه يتيح التحضير المستمر عالي السرعة للكرات المجهرية ، مما يحسن كفاءة التحضير ويحافظ على ظروف رد فعل معتدلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إعداد ALGMS لامتلاك وظائف مختلفة ، مثل الأدوية الخاضعة للرقابة والمحفزات المحملة ، مما يتيح تطبيقها بسهولة في مختلف المجالات.

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد الكريات المجهرية ALG باستخدام طريقة الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة. تتضمن العملية تمرير محلول ALG من خلال جهاز الموائع الدقيقة وتعريضه للرش الكهربائي. تم جمع القطرات الناتجة في المحلول الذي يحتوي على أيونات معدنية مختلفة (Ca2+ و Cu2+ و Zn2+ و Fe3+) لبدء تفاعل الارتباط المتقاطع. يعمل هذا التفاعل على تحسين استقرار الكرات المجهرية والالتصاق بها ويمنحها وظائف مختلفة. هذه الطريقة سهلة التنفيذ ، وتظهر الكرات المجهرية المركبة توحيدا جيدا في الحجم في مورفولوجيتها. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بالتحقيق في خصائصها المضادة للميكروبات ، وبطء قدرتها على إطلاق الدواء ، والتوافق الحيوي. سيكون هذا البروتوكول مفيدا لمزيد من تطوير الأدوية وإنتاجها.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على الدم المستخدم في التجارب من إناث الفئران BALB / c من فئة SPF التي تزن 20-25 جم وحوالي 7 أسابيع من العمر. وافقت لجنة أخلاقيات التجارب على في كلية تشجيانغ شورين على جميع إجراءات رعاية والتجريبية.

1. إعداد الحل

  1. يزن ALG ويذوب في ماء عالي النقاء عن طريق التقليب في حمام مائي على حرارة 50 درجة مئوية للحصول على محلول ALG 2٪.
  2. تحضير جزء الكتلة بشكل منفصل مع 5 ٪ (أو تركيز الكتلة المولية هو 0.3 M) من CaCl2 و FeCl3 و ZnSO4 و CuSO4 في الماء عالي النقاء. صب كل حل على حدة في طبق تجميع.

2. جهاز الرش الكهربائي ميكروفلويديك

  1. خذ أنبوبا شعريا زجاجيا وضعه فوق لهب موقد اللحام لتليينه ، ثم قم بتمديده إلى أقطار مختلفة (50 ميكرومتر -500 ميكرومتر). اقطع الأجزاء الدقيقة بقاطع زجاجي وقم بتلميع منفذ الطرف برفق باستخدام ورق صنفرة عالي الجودة من كربيد السيليكون. بعد التنظيف ، قم بتوصيل الطرف السميك للأنبوب الشعري بأنبوب طويل والطرف الآخر من الأنبوب بإبرة توزيع ومحقنة سعة 5 مل (الشكل التكميلي 1).
    ملاحظة: يصعب إدخال الحواف الحادة لقطع الأنبوب الزجاجي في الخرطوم ؛ وبالتالي ، يجب تقريب الفاصل عند حافة اللهب.
  2. قم بتوصيل المحقنة بمضخة حقنة الموائع الدقيقة والأنبوب الشعري في أحد طرفيه بالحامل. قم بتوصيل المشبك الأحمر عالي الجهد لمصدر الطاقة عالي الجهد بإبرة الاستغناء عن المحقنة وضع المشبك الفضي في سائل التجميع. ينشئ هذا التكوين جهاز رش كهربائي بسيط للسوائع الدقيقة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: ضع الأنبوب الشعري عموديا على الطاولة.

3. إعداد الكرات المجهرية ALG

  1. ضع أطباق المجموعة المنفصلة التي تحتوي على أيونات معدنية مختلفة مباشرة تحت الأنبوب الشعري. قم بتشغيل مضخة حقنة الموائع الدقيقة وحدد Fast Forward لتجهيز الأنبوب باستخدام ALG ، ثم اضبط معدل التدفق المناسب (2 مل / ساعة).
  2. قم بتشغيل مفتاح الطاقة عالي الجهد وأدر المقبض لضبط الجهد المناسب (5-7 كيلو فولت).
  3. أضف محلول 20 مل إلى كل طبق من أطباق بتري 90 مم لجمع الكريات المجهرية ALG لتشكيل ALGMS مترابطة مع أيونات معدنية مختلفة (الشكل 1B).
  4. تشكل ALG كريات مجهرية تحت تأثير المجال الكهربائي والجاذبية في محاليل مختلفة لجمع الأيونات في غضون ثوان قليلة. قم بنضح الكريات المجهرية باستخدام ماصة معقمة ونقلها إلى أنابيب طرد مركزي فردية سعة 1.5 مل للحصول على الكريات المجهرية Zn2+ و Ca2+ و Cu2+ و Fe3+ -ALG hydrogel (الشكل 1C). قم بتسمية أنابيب Zn-ALGMS و Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Fe-ALGMS.
    ملاحظة: يمكن الحصول على كريات مجهرية بأقطار مختلفة عن طريق ضبط المعلمات مثل الجهد وقطر الطرف ومعدل التدفق وتركيز المحلول.
  5. خذ كمية صغيرة من الكرات المجهرية المعدة ، وقم بتفريقها بالتساوي قدر الإمكان في برنامج تلفزيوني ، وضعها تحت المجهر للتصور.
  6. تم اختيار 10 حقول مراقبة عشوائيا في نفس الدفعة من الكرات المجهرية ، واستيراد الصور المراد قياسها في برنامج ImageJ ، وتحويل الصور إلى وضع التدرج الرمادي المناسب ، واستخدام تقنية تجزئة العتبة لتحديد مساحة الجسيمات المستهدفة بدقة وبدء وظيفة تحليل الجسيمات حتى يتمكن ImageJ من تحديد وقياس الجسيمات المستهدفة. احصل على بيانات عن الكرات المجهرية ثم قم باستيراد البيانات إلى برنامج Origin للتحليل وتعيين حجم الجسيمات.

4. اختبار أداء مضادات الميكروبات

  1. تحضير معلقات 5 مل من المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) والإشريكية القولونية (E. coli) مع عكارة بكتيرية أولية تبلغ 0.2 mcF باستخدام وسط Luria-Bertani السائل (LB).
  2. أضف 10 مل من كل محلول بكتيري إلى 4 أنابيب طرد مركزي معقمة فردية سعة 15 مل. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من Zn-ALGMS و Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Fe-ALGMS ALG إلى كل أنبوب وضعها في شاكر بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة. أضف كمية متساوية من المياه المالحة إلى المجموعة الضابطة.
  3. تمييع كل محلول بكتيري إلى 105 مرات بالماء المعقم. استخدم حبة زجاجية معقمة لنشر 200 ميكرولتر من المحلول البكتيري على وسط صلب LB.
  4. انشر المحلول بسرعة وبشكل متساو على لوحة الطلاء ، وتجنب ذهابا وإيابا في نفس المنطقة. ثم ضع الألواح في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. مراقبة مستعمرات المجموعات المختلفة.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات المعقمة بالقرب من مصباح الكحول. تعقيم أوعية الاستزراع الميكروبي وأواني التلقيح ووسائط الاستزراع.

5. اختبار إطلاق الدواء

  1. لتقييم قدرة إطلاق الدواء للكرات المجهرية المختلفة ، استخدم ألبومين مصل الأبقار (BSA) كدواء نموذجي محمل. أضف 500 ميكرولتر من كل كرة مجهرية (Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Zn-ALGMS و Fe-ALGMS) إلى 1 مجم / مل معلق BSA لمدة 24 ساعة.
  2. بالنسبة لمقايسة إطلاق الدواء ، أضف كل عينة مشبعة إلى 5.0 M من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4) ، متبوعا بالتحريك لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر عند 80 دورة في الدقيقة.
  3. استخدم 100 ميكرولتر من المحلول واستبدل الوسط بآخر جديد عند 1 و 3 و 6 و 12 و 24 و 36 و 48 ساعة.
  4. حدد تركيزات البروتين الطافية في أوقات محددة باستخدام مجموعة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس الدواء الذي تم إطلاقه كميا بواسطة علامة الإنزيم للحصول على الامتصاص المقابل وتحويل القيمة المقاسة إلى تركيز الدواء الفعلي وفقا للمنحنى القياسي. احسب معدل إطلاق الدواء باستخدام الصيغة التالية:
    النسبة المئوية لإطلاق الدواء = (تركيز الدواء الذي تم إطلاقه في نقطة زمنية محددة / تركيز الدواء الأولي) × 100٪
  5. على فترات منتظمة ، قم بإزالة حجم متساو من PBS من كل بئر واستبدله بحجم متساو من الوسط الجديد.

6. اختبار انحلال الدم

  1. ضع Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Zn-ALGMS و Fe-ALGMS المحضرة في PBS واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لصياغة محلول الحضانة.
  2. الحصول على الدم الكامل من الفئران السليمة BALB / c عن طريق الفصد العيني ، التي تم جمعها في أنابيب مضادة للتخثر تحتوي على سترات الصوديوم. دوامة وأجهزة طرد مركزي عند 1509 × جم لمدة 15 دقيقة للحصول على خلايا الدم الحمراء.
  3. اغسل خلايا الدم الحمراء 2x-3x باستخدام برنامج تلفزيوني وقم بإعداد محلول خلايا الدم الحمراء بنسبة 10٪ باستخدام برنامج تلفزيوني.
  4. تحضير ALGMS المختلفة: خذ 500 ميكرولتر من كل كرة مجهرية للمجموعة التجريبية ، و 1 مل ماء فائق النقاء (ddH2O) لمجموعة التحكم الإيجابية ، و 1 مل من محلول PBS لمجموعة التحكم السلبية واخلط كل منها مع 20 ميكرولتر من محلول خلايا الدم.
  5. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1509 × جم ، 15 دقيقة. اترك المادة الطافية جانبا وصور خلايا الدم الحمراء في كل مجموعة بعد انحلال الدم.
  6. خذ معدل انحلال الدم لمجموعة التحكم الإيجابية على أنه 100٪ ومجموعة التحكم السلبية على أنه 0٪. قم بقياس قيم امتصاص المواد الطافية في كل مجموعة واحسب معدل انحلال الدم باستخدام الصيغة:
    انحلال الدم (٪) = (قيم امتصاص المواد الطافية لكل مجموعة-
    قيم امتصاص الماء المقطر وحده) / (قيم الامتصاص لمجموعة التحكم الإيجابية - قيم امتصاص الماء المقطر وحده) × 100

7. اختبار التوافق الحيوي الخلوي

  1. اغسل ALGMS 2x المختلفة باستخدام برنامج تلفزيوني وضعها في طبق بتري سعة 5 مل لمدة 15 دقيقة وتخلص من المادة الطافية.
  2. أضف بشكل منفصل ALGMS مختلفة عند 0.2 مل في وسط استزراع كامل (DMEM) يحتوي على 10٪ FBS ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، وقم بتصفية المحلول للحصول على المادة المرتشحة.
  3. قم بزراعة خلايا NIH3T3 إلى ما يقرب من 70٪ من كثافة الخلايا في 24 لوحة بئر ، وعالج خلايا NIH3T3 بمحلول ترشيح الكريات المجهرية ، واستمر في الزراعة بوسط كامل لمدة 24 ساعة أخرى.
  4. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني.
  5. تقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة Calcein-AM / PI. خذ 2.5 ميكرولتر من محلول Calcein-AM (4 mM) و 12.5 μL من محلول PI (2 mM) وأضفهما إلى 5 مل من 1x PBS واخلطهما جيدا للحصول على محلول عملي مع 2 ميكرومتر Calcein-AM و 5 μM PI.
  6. أضف محلول العمل إلى ألواح زراعة الخلايا المصنفة مسبقا عند 500 ميكرولتر لكل بئر ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية تحت حماية الضوء لمدة 15 دقيقة ، وراقبها وصورها تحت مجهر مضان مقلوب. قم بإعداد ثلاث نسخ متماثلة لكل مجموعة.
  7. احسب صلاحية الخلية وفقا للصيغة التالية:
    صلاحية الخلية (٪) = عدد الخلايا القابلة للحياة / (عدد الخلايا القابلة للحياة + عدد الخلايا الميتة)

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف ALGMS المتصالب مع أيونات المعادن المختلفة
يظهر الشكل 2 التشكل البصري ل Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Zn-ALGMS و Fe-ALGMS ، مما يدل على كروية جيدة ، وسطح أملس ، وتوزيع موحد لحجم الجسيمات (الشكل التكميلي 2) وتشتت أحادي ممتاز. كما أجرينا التوصيف المجهري باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وتحليل التحليل الطيفي المشتت للطاقة (EDS). كما هو موضح في الشكل 3 ، كانت الكرات المجهرية كروية بشكل عام مع استدارة محددة جيدا. تم توزيع سطح Zn-ALGMS بشكل غير متساو ، وظهر أكثر خشونة مع العديد من التجاعيد. أجرينا التحليل الطيفي المشتت للطاقة لتحديد توزيع محتوى أيونات المعادن المشاركة في تفاعل الربط المتقاطع في الهلام. والجدير بالذكر أنه يمكن تعديل حجم الكرة المجهرية عن طريق تغيير المعلمات مثل مسافة التجميع وتركيز الهلام وجهد المجال الكهربائي12. في البروتوكول المحدد ، من خلال ضبط معلمات جهاز الموائع الدقيقة وتركيز السائل ، يمكن الحصول بسهولة على جزيئات بأحجام مختلفة وفقا لمتطلبات محددة.

تقييم خصائص مضادات الميكروبات
قمنا بتقييم القدرة المضادة للميكروبات للكرات المجهرية المختلفة باستخدام طريقة الصفيحة ، كما هو موضح في الشكل 4. أظهرت الكريات المجهرية المختلفة نشاطا مضادا للبكتيريا ضد الإشريكية القولونية والمكورات العنقودية الذهبية ، حيث أظهر Cu-ALGMS و Zn-ALGMS أقوى الخصائص المضادة للبكتيريا. يمكن أن تعزى هذه الفعالية المتزايدة إلى النشاط المضاد للميكروبات للمعادن ، أي النحاس (Cu) والزنك (Zn)13. أظهر Sukhodub et al. أن Fe3+ و Zn2+ و Ca2+ و Cu2+ أظهرت تأثيرات تآزرية مضادة للبكتيريا مع الشيتوزان ، في حين أن العينات التي لا تحتوي على الشيتوزان لم تظهر مثل هذا النشاط ، مما يؤكد صحة التأثير التآزري المضاد للبكتيريا للمجمعات المكونة14. تتوافق النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الدراسة ، حيث تتفوق Cu-ALGMS و Zn-ALGMS على الكريات المجهرية الهيدروجيل الأخرى في علاج الأمراض المعدية البكتيرية.

تقييم خصائص الافراج عن المخدرات
كشف تقييم إطلاق الدواء من مختلف الكريات المجهرية لهيدروجيل الجينات القائمة على المعادن باستخدام BSA كدواء نموذجي عن اختلافات في ملامح إطلاقها. (الشكل التكميلي 3). أظهرت الأيونات قدرة بطيئة على إطلاق الدواء بشكل أفضل من تلك الموجودة في المواد الأخرى. كان معدل إطلاق الدواء من Fe2+ أسرع نسبيا من معدل الأيونات الثلاثة الأخرى ، في حين أن معدل إطلاق الدواء من Ca2+ و Zn2+ كان أبطأ نسبيا. تسلط هذه النتائج الضوء على الاختلافات في تأثيرات الأيونات المختلفة على إطلاق الدواء. نفترض أن Fe2+ ربما يتفاعل مع الدواء أو يرتبط بطريقة تسهل إطلاقه ، في حين أن Ca2+ و Zn2+ يرتبطان بالدواء بشكل أكثر إحكاما ، أو هناك عوامل أخرى تحد من معدل الإطلاق. قد يكون هذا الإطلاق المستمر للدواء من الكريات المجهرية الهيدروجيل مرتبطا بقوة الربط المتقاطع بين المعدن وعديد السكاريد الجيني. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يكون الاختلاف في قدرة الامتزاز للمعادن المختلفة مقارنة بقدرة BSA قد ساهم في الاختلافات التي لوحظت في قدرات تثبيط المخدرات.

تقييم التوافق الحيوي
التوافق الحيوي الجيد هو شرط أساسي لناقلات توصيل الأدوية في التطبيقات السريرية. لذلك ، قمنا بتقييم التوافق الدموي للكرات المجهرية باستخدام اختبار انحلال الدم في المختبر . استخدمنا الماء النقي كعنصر تحكم إيجابي وحل PBS كعنصر تحكم سلبي. تظهر النتائج التجريبية في الشكل التكميلي 4 ، مما يكشف أن خلايا الدم الحمراء في المعلق ظلت سليمة عند ملامستها للكريات المجهرية المختلفة ، مما يشير إلى الحد الأدنى من انحلال الدم بواسطة الكريات المجهرية. أظهرت نتائج التوافق الحيوي الخلوي أن الكرات المجهرية لم تؤثر على النشاط الخلوي (الشكل التكميلي 5). أشارت هذه النتائج إلى أن الكريات المجهرية تتمتع بتوافق جيد مع خلايا الدم.

figure-results-1
الشكل 1: تحضير الكريات المجهرية لهيدروجيل الجينات. (أ) تركيب تكنولوجيا الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة. (ب) الصورة في الوقت الحقيقي لعملية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة. (ج) الكرات المجهرية المحضرة Ca2+ و Cu2+ و Zn2+ و Fe3+ ألجينات هيدروجيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: صورة مجهرية لهيدروجيل الجينات المجهرية. صورة مجهرية ل (أ) Ca-ALGMS ، (ب) Cu-ALGMS ، (ج) Zn-ALGMS ، و (د) Fe-ALGMS في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: الفحص المجهري الإلكتروني الماسح والتحليل الطيفي المشتت للطاقة. تظهر الصور توصيف (A) Ca-ALGMS و (B) Cu-ALGMS و (C) Zn-ALGMS و (D) Fe-ALGMS مع i و II لمسح بيانات الفحص المجهري و iii-v لبيانات التحليل الطيفي. تظهر الصور من iii-v تعيين EDS ، حيث يختار EDS وجها على سطح العينة لمسحه ضوئيا للحصول على معلومات توزيع العناصر على المنطقة بأكملها. يستخدم وضع مسح الخريطة في تطبيقات التحليل التركيبي وتحليل منطقة الطور وتوزيع حجم الجسيمات للمواد ، حيث يتم تمثيل كل عنصر بلون مختلف ، كما هو موضح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. خصائص مضادات الميكروبات من المجهرية. (أ) تم اختبار الخواص المضادة للميكروبات للمجموعات باستخدام طريقة اللطاخة البكتيرية. (ب، ج) القياس الكمي لنتائج عدد لوحات اللطاخة البكتيرية لكل مجموعة. تظهر عينات التحكم مستعمرات نمت على وسط LB دون أي إضافة. تم حساب المستعمرات النسبية للبكتيريا الأخرى عن طريق أخذ عدد استنساخ المجموعة الضابطة على أنه 100٪ واستخدامه كخط أساس. شريط الخطأ: الانحراف المعياري ، n = 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: أنبوب زجاجي موصل بالمحقنة من خلال أنبوب مطاطي طويل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: حجم الجسيمات. (أ) Zn-ALGMS ، (B) Ca-ALGMS ، (C) Cu-ALGMS ، (D) Fe-ALGMS. تم استخدام تركيز مولي بنسبة 5٪ لجميع العينات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: إطلاق المخدرات. منحنى إطلاق الدواء ل Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Zn-ALGMS و Fe-ALGMS في PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). شريط الخطأ: الانحراف المعياري ، n = 3 الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: مقايسة انحلال الدم ل Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Zn-ALGMS و Fe-ALGMS. الكمبيوتر الشخصي (التحكم الإيجابي): ddH2O ؛ NC (التحكم السلبي): برنامج تلفزيوني. شريط الخطأ: الانحراف المعياري ، n = 3. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: السمية الخلوية للكرات المجهرية المترابطة مع أيونات مختلفة. تم إجراء تقييم التوافق الحيوي ل Zn-ALGMS و Ca-ALGMS و Cu-ALGMS و Fe-ALGMS. تم استخدام Calcein-AM / PI لإجراء الاختبار ، وبالنسبة للنتائج هنا ، تم اختيار 5 مجالات عرض عشوائيا. تم استخدام ImageJ لتحليل نسبة خلايا الدم الحمراء إلى الخلايا الميتة للحصول على قابلية بقاء الخلية النسبية. 1.PC ، التحكم الإيجابي ، 2.NC ، التحكم السلبي ، 3. Zn-ALGMS ، 4. Ca-ALGMS ، 5. Cu-ALGMS ، 6. Fe-ALGMS ، شريط الخطأ: الانحراف المعياري ، n = 3. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة لإعداد ALGMS على أساس تقنية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة. الطريقة سهلة التشغيل وتنتج عددا كبيرا من الكرات المجهرية ذات الاستدارة الموحدة والقطر الذي يمكن التحكم فيه. يوفر هذا النهج الراحة للباحثين ويمكن أن يعزز البحث وتطبيق الكريات المجهرية الهيدروجيلية. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال الربط المتقاطع مع أيونات المعادن المختلفة ، تم تحسين الاستقرار والنشاط الحيوي ل ALGMS. في التجارب المضادة للميكروبات ، أظهر Cu-ALGMS و Zn-ALGMS تأثيرات مثبطة بكتيرية كبيرة.

الكريات المجهرية الهيدروجيل هي هياكل مجهرية مرنة ذات مرونة ممتازة ، مما يتيح توصيل الدواء بشكل فعال من خلال اختيار مواد محددة وتصميم هيكلي. الجينات ، عديد السكاريد الطبيعي الذي يصنع المواد الهلامية في ظل ظروف معتدلة متوافق حيويا وقابل للتحلل البيولوجي وغير سام. تستخدم الكريات المجهرية لألجينات الصوديوم على نطاق ميكرون على نطاق واسع في الكيمياء الحيوية والطب الحيوي ، بما في ذلك البحوث الصيدلانية وتوصيل الأدوية وهندسة الأنسجة. تتمثل الميزة الرئيسية للكريات المجهرية لألجينات الصوديوم في تطبيقات توصيل الأدوية في قدرتها على الإطلاق المستدام للدواء ، مما يضمن الحفاظ على تركيزات عالية من المكون الصيدلاني النشط على مدى فترةممتدة 14. كشفت تجاربنا المستمرة لإطلاق الأدوية أن ALGMS ذات الروابط المتقاطعة الأيونية المختلفة لديها القدرة على الحفاظ على إطلاق الدواء ويمكن استخدامها في تطبيقات توصيل الدواء.

تشمل طرق التصنيع الشائعة للكرات المجهرية الهيدروجيل استحلاب الدفعات ، والاتصال الميكانيكي ، والطباعة الحجرية ، ومستحلب الموائع الدقيقة ، والرش الكهربائي8،15. تكمن مزايا استحلاب الدفعات وطرق التكسير الميكانيكي في بساطة طريقة التصنيع وكفاءة الإخراج العالية. ومع ذلك ، من الصعب التحكم في شكل الكريات المجهرية المائية الفردية باستخدام هذه الطرق. يتضمن التصوير الحجري الضوئي تركيز الضوء على لوحة قناع أو قالب لعلاج الربط المتقاطع وتشكيل كريات مجهرية هيدروجيلية. ومع ذلك ، فإن كفاءة إنتاج هذه الطريقة تتأثر بسهولة بلوحة القناع ومصدر الضوء والعفن. علاوة على ذلك ، يمكن لطريقة مستحلب الموائع الدقيقة التحكم بشكل أفضل في عملية صب الكريات المجهرية الهيدروجيل وإنتاج كريات هيدروجيل مجهرية بأشكال محددة ؛ ومع ذلك ، فإن كفاءتها الإنتاجية منخفضة16. بالمقارنة مع هذه الطرق ، يمكن لطريقة الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة إنتاج كريات مجهرية هيدروجيل ذات حجم موحد وشكل منتظم وحجم جسيم قابل للتعديل17. الخطوة الرئيسية في هذا البروتوكول هي إعداد المجهرية. قد يختلف حجم وشكل الكرات المجهرية اعتمادا على تسطيح الأنبوب الزجاجي وقيمة الجهد ومعدل التدفق18. هناك أيضا بعض القيود في استخدام تقنية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة لإعداد الكريات المجهرية ، مثل ميل القنوات الدقيقة إلى الانسداد والعائد المحدود ، والتوافق المحدود للمواد وصعوبة توسيع نطاق العملية ، وصعوبة التحكم في العملية ومراقبتها. هذا يحد من تطبيقها على نطاق واسع إلى حد ما19.

باختصار ، تقنية الرش الكهربائي للسوائع الدقيقة هي طريقة تحضير مجهرية ناضجة ، توفر ميزة التوليف بخطوة واحدة. من خلال تحسين معلمات حجم قناة التدفق والتحكم في تركيز المواد ومعدل التدفق ، يمكن بسهولة الحصول على الكريات المجهرية من مختلف الأشكال والأحجام. والجدير بالذكر أن العملية تنطوي فقط على المرحلة المائية ولا توجد مواد خافضة للتوتر السطحي إضافية ، مما يجعلها صديقة للبيئة وسهلة التشغيل ، وتجنب الحاجة إلى عمليات الغسيل المعقدة. توفر هذه الطريقة استراتيجية لإنتاج الكريات المجهرية من مواد هيدروجيل مماثلة لعملية هلام الجينات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لن يتم الكشف عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال مشروع بحثي بجامعة تشجيانغ شورين (2023R053 و 2023KJ237).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
120 شبكة الشاشةSolarbio ، الصينYA0946
موقد الكحولSolarbio ، الصينYA2320
BALB / c الفئرانWukong التكنولوجيا الحيوية ، كاشف
Meilunbio ، الصينMA0082
مصل الأبقار ألبومينLablead ، الصين9048-46-8
CaCl2 & نب سب. مسحوقعلاء الدين ، الصين10043-52-4
Calcein-AM / PIBiosharp ، الصينBL130A
أنابيب الطرد المركزيCorning ، أمريكا430290
CuSO4   مسحوقJnxinyuehuagong ، الصين7758-99-8
DMEMGibicol ، الصينC11995500BT
FeCl3 & nbsp مسحوقعلاء الدين ، الصين7705-08-0
مصل الأبقار الجنينHAKATA ، الصينHN-FBS
أنابيب زجاجيةSartorius ، ألمانياCC0028
الفحص المجهري الخفيفEvidencescientific ، اليابانBX53 (LED)
مضخة حقنة الموائعالدقيقة Longerpump ، إنجلتراLSP01-3A
NIH3T3HyGyte ، الصينTCM-C752
طبق بتريThermofisher ، أمريكا150464
الفوسفات عازلة محلول ملحيThermofisher ، أمريكا3002
مجهر إلكتروني ماسحThermofisher ، أمريكاAxia ChemiSEM
مسحوق ألجينات الصوديوم   ؛Bjbalb ، الصينY13095
ZnSO4 مسحوقJnxinyuehuagong ، الصين7733-02-0
فحص حمض Bicinchoninic الصيني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
  2. Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
  3. Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
  4. Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
  5. Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
  6. El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
  7. Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
  8. Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
  9. Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
  10. Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
  11. Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
  12. Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
  13. Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
  14. Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
  15. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
  16. Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  17. Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
  18. Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
  19. Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة