مقالة منهجية

تطوير العلاجات التوافقية لإصابة الحبل الشوكي باستخدام توصيل الخلايا الجذعية

DOI:

10.3791/66872

⸱

يونيو 7, 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تم تطوير الهلاميات المائية المركبة المضادة للأعصاب ووصفها والتي يمكن استخدامها للتحقيق والاستفادة من السلوك المؤيد للتجدد للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لإصلاح إصابات الحبل الشوكي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤدي إصابة الحبل الشوكي الرضحية (SCI) إلى حدوث عجز حسي حركي دائم أسفل موقع الإصابة. إنه يؤثر على ما يقرب من ربع مليون شخص في الولايات المتحدة ، ويمثل مصدر قلق لا يقاس للصحة العامة. تم إجراء البحوث لتوفير العلاج الفعال. ومع ذلك ، لا يزال اصابات النخاع الشوكي تعتبر غير قابلة للشفاء بسبب الطبيعة المعقدة لموقع الإصابة. يتم التحقيق في مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات ، بما في ذلك توصيل الأدوية وزرع الخلايا والمواد الحيوية القابلة للحقن ، لكن استراتيجية واحدة وحدها تحد من فعاليتها في التجديد. على هذا النحو ، اكتسبت العلاجات التوافقية مؤخرا اهتماما يمكن أن تستهدف السمات متعددة الأوجه للإصابة. لقد ثبت أن المصفوفات خارج الخلية (ECM) قد تزيد من فعالية زرع الخلايا من أجل اصابات النخاع الشوكي. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد التي تتكون من الحبال الشوكية منزوعة الخلايا (dSCs) والأعصاب الوركي (dSNs) بنسب مختلفة وتميزها. أكد التحليل النسيجي ل dSCs و dSNs إزالة المكونات الخلوية والنووية ، وتم الاحتفاظ ببنى الأنسجة الأصلية بعد إزالة الخلايا. بعد ذلك ، تم إنشاء الهلاميات المائية المركبة بنسب حجمية مختلفة وإخضاعها لتحليلات حركية هلام التعكر ، والخصائص الميكانيكية ، وقابلية الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hASC) المضمنة. لم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في الخصائص الميكانيكية بين النسب المختلفة للهلاميات المائية ومصفوفات الحبل الشوكي منزوعة الخلايا. ظلت ASCs البشرية المضمنة في المواد الهلامية قابلة للحياة طوال ثقافة 14 يوما. توفر هذه الدراسة وسيلة لتوليد الهلاميات المائية الاندماجية المصممة بالأنسجة والتي تقدم ECM الخاصة بالأعصاب والخلايا الجذعية الوسيطة المؤيدة للتجديد. يمكن أن توفر هذه المنصة رؤى جديدة حول استراتيجيات التجدد العصبي بعد اصابات النخاع الشوكي مع التحقيقات المستقبلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعاني ما يقرب من 296,000 شخص من اصابات النخاع الشوكي المؤلمة ، وكل عام هناك حوالي 18,000 حالة جديدة من اصابات النخاع الشوكي تحدث في الولايات المتحدة الأمريكية.1. عادة ما يحدث اصابات النخاع الشوكي المؤلمة بسبب السقوط والجروح الناجمة عن طلقات نارية وحوادث المركبات والأنشطة الرياضية وغالبا ما يسبب فقدانا دائما للوظيفة الحسية الحركية أسفل موقع الإصابة. تتراوح النفقات المقدرة مدى الحياة لعلاج اصابات النخاع الشوكي بين مليون إلى خمسة ملايين دولار لكل فرد مع انخفاض كبير في متوسط العمرالمتوقع 1. ومع ذلك ، لا يزال اصابات النخاع الشوكي غير مفهومة جيدا وغير قابلة للشفاء إلى حد كبير ، ويرجع ذلك أساسا إلى العواقب الفيزيولوجية المرضية المعقدة بعد الإصابة2. تم التحقيق في استراتيجيات مختلفة ، بما في ذلك زرع الخلايا والسقالات القائمة على المواد الحيوية. في حين أن زرع الخلايا والمواد الحيوية قد أظهر إمكاناته ، فإن الطبيعة متعددة الأوجه لمرض اصابات النخاع الشوكي تشير إلى أن الأساليب التوافقية قد تكون أكثر فائدة3. نتيجة لذلك ، تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات التوافقية وأظهرت فعالية علاجية أفضل من المكونات الفردية. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتوفير مواد حيوية جديدة لتوصيل الخلايا والأدوية3.

أحد الأساليب الواعدة لتصنيع الهلاميات المائية الطبيعية هو إزالة الخلايا الأنسجة. تستخدم عملية إزالة الخلايا طرقا أيونية وغير أيونية وفيزيائية وتوافقية لإزالة جميع أو معظم المواد الخلوية والنووية مع الحفاظ على مكونات ECM. عن طريق إزالة جميع أو معظم المكونات الخلوية ، تكون الهلاميات المائية المشتقة من ECM أقل تفاعلا مناعيا للمضيف بعد الزرع / الحقن4. هناك العديد من المعلمات التي يجب قياسها من أجل تقييم جودة الأنسجة منزوعة الخلايا: إزالة المحتويات الخلوية / النووية ، والخصائص الميكانيكية ، والحفاظ على ECM. تم وضع المعايير التالية لتجنب الاستجابات المناعية الضارة: 1) أقل من 50 نانوغرام من الحمض النووي المزدوج الشريطة (dsDNA) لكل مجم من الوزن الجاف ECM ، 2) أقل من 200 نقطة أساس طول جزء الحمض النووي ، و 3) تقريبا أو معدومة مادة نووية مرئية ملطخة ب 4'6-diamidino-2-phenuylindole (DAPI) 5. يمكن قياس الخواص الميكانيكية عن طريق اختبارات الشد والضغط و / أو الريولوجيا ، ويجب أن تكون مشابهة للأنسجةالأصلية 6. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم الحفاظ على البروتين عن طريق البروتينات أو المقايسات الكمية التي تركز على المكونات الرئيسية للأنسجة منزوعة الخلايا ، على سبيل المثال ، اللامينين ، الجليكوزامينوجليكان (GAG) ، وكبريتات شوندروتن بروتيوغليكان (CSPG) للحبل الشوكي7،8. يمكن إعادة الخلايا الهلامية المائية المشتقة من ECM التي تم التحقق منها بأنواع مختلفة من الخلايا للمساعدة في العلاج القائم على الخلايا9.

تمت دراسة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، مثل خلايا شوان ، وخلايا التغليف الشمي ، والخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام (MSCs) ، والخلايا الجذعية / السلفية العصبية ، لإصلاح اصابات النخاعالشوكي 10،11،12. ومع ذلك ، فإن الاستخدام السريري لهذه الخلايا محدود بسبب المخاوف الأخلاقية ، والتكامل المتناثر مع الخلايا / الأنسجة المجاورة ، ونقص مصادر الأنسجة للحصول على عائد مرتفع ، وعدم القدرة على التجديد الذاتي ، و / أو القدرة التكاثريةالمحدودة 13،14،15. على عكس هذه الأنواع من الخلايا ، تعتبر الخلايا الجذعية الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hASCs) مرشحا جذابا لأنه يمكن عزلها بسهولة بطريقة طفيفة التوغل باستخدام الخلايا الدهنية ، ويمكن الحصول على عدد كبير من الخلايا16. بالإضافة إلى ذلك ، تتمتع hASCs بالقدرة على إفراز عوامل النمو والسيتوكينات التي لديها القدرة على الحماية العصبية ، وعلم الأوعية الدموية ، والتئام الجروح ، وتجديد الأنسجة ، وتثبيط المناعة17،18،19،20،21.

كما تم وصفه ، تم إجراء دراسات متعددة22،23،24 ، وتم تعلم الكثير منها ، لكن الخصائص غير المتجانسة لمرض اصابات النخاع الشوكي حدت من فعاليتها في تعزيز التعافي الوظيفي. على هذا النحو ، تم اقتراح مناهج اندماجية لزيادة فعالية علاج اصابات النخاع الشوكي. في هذه الدراسة ، تم تطوير الهلاميات المائية المركبة من خلال الجمع بين الحبال الشوكية منزوعة الخلايا والأعصاب الوركي لثقافة hASC ثلاثية الأبعاد (3D). تم تأكيد إزالة الخلايا الناجحة من خلال التحليلات النسيجية والحمض النووي ، وتم تمييز نسب مختلفة من الهلاميات المائية المركبة للأعصاب من خلال حركية الهلام الهلامي واختبارات الضغط. تم التحقيق في جدوى hASCs في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب لإثبات أنه يمكن استخدام هذا الهيدروجيل كمنصة لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على أنسجة الخنازير تجاريا ، لذلك لم تكن موافقة لجنة أخلاقيات مطلوبة.

1. نزع خلايا الحبل الشوكي الخنازير (الوقت المقدر: 5 أيام)

ملاحظة: قم بإجراء إزالة الخلايا باستخدام البروتوكولات المحددة مسبقا مع التعديلات25،26. يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة سلامة حيوية معقمة في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب تصفية جميع المحاليل معقمة باستخدام مرشح أعلى الزجاجة (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) في زجاجات معقمة يمكن إجراء الإجراءات التي سيتم تنفيذها عند 37 درجة مئوية داخل حاضنة أو فرن نظيف مضبوطة على 37 درجة مئوية.

  1. تحضير حلول إزالة الخلايا
    ملاحظة: يتم حساب جميع الحلول بسعة 1 لتر. قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط الحجم النهائي المطلوب وفقا لاحتياجاتهم التجريبية.
    1. خفف 500 مل من 0.05٪ تريبسين / حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) مع 500 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لصنع 0.025٪ تريبسين / EDTA.
    2. خفف 300 مل من 10٪ Triton X-100 مع 700 مل من PBS لصنع 3٪ Triton X-100. امزج 0.56 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.31 جم من NaH2PO4H2O ، و 10.85 جم منHNa 2O4P·7H2O في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل 100 ملي مولار Na / 50 ملي مولار فوس.
    3. امزج 32.4 جم من السكروز في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل 1 متر من السكروز. امزج 40 جم من ديوكسي كولات الصوديوم (SD) في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لعمل محلول SD بنسبة 4٪. خفف 6.7 مل من حمض البيراسيتيك 15٪ مع 993.3 مل من الإيثانول 4٪.
  2. تحضير الحبل الشوكي الخنازير
    ملاحظة: تم شحن الحبال الشوكية مجمدة دون أي محلول وحفظها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    1. قم بإذابة الحبل الشوكي عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة 18-24 ساعة قبل إزالة الخلايا. استخدم مقصا معقما لإزالة الأم الجافية بعناية.
    2. قطع الحبل الشوكي إلى قطع صغيرة (طولها حوالي 1 سم). ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل أو ثلاث قطع كحد أقصى في أنبوب سعة 50 مل.
  3. نزع خلايا الحبل الشوكي
    ملاحظة: بعد كل خطوة ، يتم سكب محاليل إزالة الخلايا يدويا في دورق كبير للتخلص منه. يمكن استخدام مصفاة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة للتعقيم للمساعدة في التخلص من محاليل إزالة الخلايا دون فقدان الأنسجة اللازمة لكل خطوة. تم تحريك الحبل الشوكي عند 83 دورة في الدقيقة ما لم ينص على خلاف ذلك.
    1. اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 18-24 ساعة عند 4 درجات مئوية و 60 دورة في الدقيقة.
    2. اشطف الحبل الشوكي بنسبة 0.025٪ تريبسين / EDTA لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و 40 دورة في الدقيقة. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 15 دقيقة ، 2x.
    3. اشطف الحبل الشوكي ب 3٪ Triton X-100 لمدة ساعتين. اشطف الحبل الشوكي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة، 2 مرة.
    4. اشطف الحبل الشوكي ب 1 م من السكروز لمدة ساعة. ثم اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة.
    5. اشطف الحبل الشوكي بنسبة 4٪ SD لمدة ساعتين. بعد ذلك ، اشطف الحبل الشوكي بمحلول 100 ملي Na / 50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة ، 2x.
    6. شطف الحبل الشوكي مع 0.1٪ حمض بيراسيتيك في 4٪ الإيثانول لمدة 4 ساعات. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 1 ساعة.
    7. اشطف الحبل الشوكي بالماء منزوع الأيونات لمدة 1 ساعة ، 2x. ثم اشطف الحبل الشوكي باستخدام PBS لمدة 1 ساعة.
    8. قم بتجميد الحبل الشوكي بالتجميد عند 0.01 ملي بار و -56 درجة مئوية لمدة 3 أيام واحفظه جافا حتى الاستخدام.

2. نزع خلايا العصب الوركي الخنازير (الوقت المقدر: 5 أيام)

ملاحظة: قم بإجراء إزالة الخلايا باستخدام بروتوكول27 تم إنشاؤه مسبقا. يجب أن تتم جميع الإجراءات في خزانة سلامة حيوية معقمة في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. يجب تصفية جميع المحاليل معقمة باستخدام مرشح أعلى الزجاجة (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) في زجاجات معقمة يمكن إجراء الإجراءات التي يجب تنفيذها عند 37 درجة مئوية داخل حاضنة أو فرن نظيف مضبوطة على 37 درجة مئوية.

  1. تحضير حلول إزالة الخلايا
    ملاحظة: يتم حساب جميع الحلول بسعة 1 لتر. قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط الحجم النهائي المطلوب وفقا لاحتياجاتهم التجريبية.
    1. قم بإعداد 50 ملي مولار من Na / 10 mM phos buffer عن طريق خلط 1.86 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.262 جم من d NaH2PO4H2O ، و 2.17 جم منHNa 2O4P·7H2O في 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
    2. قم بإعداد محلول 125 ملي مولار سلفوبيتين -10 (SB-10) عن طريق خلط 38.4 جم من SB-10 في 1 لتر من 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس.
    3. تحضير محلول 3٪ SD / 0.6 ملي مولار سلفوبيتين -16 (SB-16) عن طريق خلط 30 جم من SD و 0.24 جم من SB-16 في 1 لتر من 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار من الفوس.
  2. تحضير العصب الوركي الخنازير
    ملاحظة: تم شحن الأعصاب الوركي المجمدة باستخدام PBS وحفظها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    1. قم بإذابة العصب الوركي عند 4 درجات مئوية في الثلاجة قبل 18-24 ساعة من إزالة الخلايا.
    2. قطع العصب الوركي إلى قطع صغيرة (طولها حوالي 1 سم). ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل أو ثلاث قطع كحد أقصى في أنبوب سعة 50 مل.
  3. نزع الخلايا من العصب الوركي
    ملاحظة: بعد كل خطوة ، يتم سكب محاليل إزالة الخلايا يدويا في دورق كبير للتخلص منه ، ويمكن استخدام مصفاة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ قابلة للتعقيم للمساعدة في التخلص من محاليل إزالة الخلايا دون فقدان الأنسجة اللازمة لكل خطوة. تم تحريك العصب الوركي عند 15 دورة في الدقيقة ما لم ينص على خلاف ذلك.
    1. اشطف العصب الوركي بالماء منزوع الأيونات لمدة 7 ساعات. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي ب 125 ملي مولار سلفوبيتين -10 (SB-10) في 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس عازلة لمدة 18 ساعة.
    2. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي باستخدام 3٪ SD / 0.6 mM sulfobetaine -16 (SB-16) في 50 ملي مولار Na / 10 ملي مولار فوس عازلة لمدة ساعتين.
    3. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na / 50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة ، 3x. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي ب 125 ملي مولار SB-10 في 50 ملي مولار Na / 10 ملي فوس عازلة لمدة 7 ساعات.
    4. اشطف العصب الوركي بمحلول 100 ملي مولار Na/50 ملي فوس لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، اشطف العصب الوركي باستخدام 3٪ SD / 0.6 mM SB-16 في 50 ملي مولار Na / 10 ملي فوس عازلة لمدة 1.5 ساعة.
    5. اشطف العصب الوركي بمحلول 50 ملي مولار Na/10 ملي فوس لمدة 15 دقيقة، 3 أضعاف. ثم اشطف العصب الوركي ب 75 وحدة / مل من ديوكسي ريبونوكلاز (DNase) لمدة 3 ساعات دون تحريض.
    6. اشطف العصب الوركي بمحلول 50 ملي مولار Na/10 ملي فوس لمدة ساعة واحدة، 3 أضعاف. ثم اشطف العصب الوركي ب 0.2 وحدة / مل من شوندروتيناز ABC لمدة 16 ساعة دون تحريض عند 37 درجة مئوية.
    7. اشطف العصب الوركي باستخدام PBS لمدة 3 ساعات ، 3x. قم بتجميد العصب الوركي بالتجميد عند 0.01 ملي بار و -56 درجة مئوية لمدة 3 أيام واحفظه جافا حتى الاستخدام.

3. هضم الأنسجة منزوعة الخلايا وتصنيع الهلاميات المائية المركبة (الوقت المقدر: 4 أيام)

  1. قم بتقطيع أو طحن الأنسجة منزوعة الخلايا إلى مسحوق باستخدام المقص أو الخالط. عقم الأدوات لتقطيع أو طحن المناديل باستخدام الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. طريقة أكسيد الإيثيلين قابلة للتطبيق أيضا.
  2. هضم الأنسجة بشكل منفصل في محلول حمض الهيدروكلوريك 0.01 نيوتن (HCl) الذي يحتوي على 1 مجم / مل بيبسين بتركيز 15 مجم / مل. الأوزان المقدرة للحبل الشوكي منزوع الخلايا والعصب الوركي هي 50-100 مجم و 100-150 مجم لكل قطعة ، على التوالي.
  3. ضع الشريط المغناطيسي وحرك عند 500 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية لمدة 4 أيام على الأقل لتوليد محاليل بريجل.
  4. امزج العصب الوركي والحبل الشوكي النخاعي بالنسب الحجمية التالية: 2: 1 و 1: 1 و 1: 2. اضبط الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و HCl وقم بتخفيفه إلى التركيز المطلوب باستخدام وسائط M199 و 1x PBS. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: أضف هيدروكسيد الصوديوم 1 ميكرولتر في المرة الواحدة. يمكن استخدام وسائط M199 كمؤشر للأس الهيدروجيني لأنها تتحول إلى اللون الوردي الفاتح عندما يكون الرقم الهيدروجيني 7.4 ، ولكن يجب استخدام شرائط الأس الهيدروجيني لتأكيد مستوى الأس الهيدروجيني.

4. التحقق من إزالة الخلايا

  1. تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E ؛ الوقت المقدر: 8 أيام)
    ملاحظة: بعد كل خطوة شطف ، يتم سكب المحاليل يدويا في دورق كبير للتخلص منه.
    1. إصلاح الحبل الشوكي الطازج ومنزوعة الخلايا والعصب الوركي في 3.7٪ الفورمالديهايد عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة. ضع قطعة واحدة في أنبوب سعة 15 مل.
    2. إزالة الفورمالديهايد ووضع الأنسجة في 10٪ سكروز لمدة يوم واحد. قم بإزالة 10٪ من السكروز وضع المناديل في 30٪ سكروز لمدة 6 أيام.
    3. املأ مادة التبريد ذات الحجم المناسب بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT) في منتصف الطريق. ضع الأنسجة منزوعة الخلايا, قم بتغطيتها مع OCT, والسماح لها بامتصاص OCT لمدة 1 يوم.
    4. بعد يوم واحد ، قم بتجميد الأنسجة طوال الليل عند -80 درجة مئوية. قم بتقطيع الأنسجة بالتبريد بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد.
    5. اشطفها ب 1x PBS لمدة 5 دقائق ، 2x. ثم اشطفها بماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
    6. وصمة عار بمحلول الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة. اشطفها بماء الصنبور لمدة 1 دقيقة ، 3 مرات.
    7. وصمة عار بمحلول اليوزين لمدة 1 دقيقة. اشطفه بنسبة 95٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، 2x و 100٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، 3x.
    8. اشطفها بالزيلين لمدة دقيقة واحدة ، 2 دقيقة ، ثم 1 دقيقة. دع الشرائح تجف لمدة 5 دقائق.
    9. استخدم قطعة قطن لتقطير 3-4 قطرات من محلول ثنائي بوتيل فثاليت البوليسترين زيلين (DPX) على الشرائح. ضع أغطية فوق الشرائح المغطاة ب DPX. دع الشرائح تجف طوال الليل.
  2. تحليل الحمض النووي (الوقت المقدر: 1 ساعة)
    1. وزن الأنسجة منزوعة الخلايا والمجففة. عزل الحمض النووي وتحديده باستخدام المجموعات المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. توصيف الهلاميات المائية المركبة

  1. اختبار تعكر التبلور (الوقت المقدر: 1 ساعة)
    1. ضع 100 ميكرولتر من محاليل بريجل في كل بئر من صفيحة 96 بئرا على الثلج. اقرأ الامتصاص عند 405 نانومتر كل دقيقتين لمدة 45 دقيقة باستخدام قارئ لوحة.
    2. احسب الامتصاص الطبيعي باستخدام المعادلة التالية:
      (الامتصاص -الامتصاص الأولي) / (الحد الأقصى للامتصاص -الامتصاص الأولي)
    3. احسب ميل المنحنى والوقت اللازم لتحقيق 50٪ و 95٪ هلام ، ر1/2 و ر95 ، على التوالي.
  2. اختبار الضغط (الوقت المقدر: 1 دقيقة لكل هيدروجيل)
    1. تصنيع هيدروجيل مركب بتركيز 12 مجم / مل بقطر 8 مم وارتفاع 2 مم.
    2. استخدم مقياس الريومتر لضغط العينات بحمل 250 نيوتن بين الألواح المتوازية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بمعدل إجهاد 10٪ من ارتفاع العينة / دقيقة. سيوفر البرنامج الذي يوفر قراءات مقياس الريومتر منحنى الإجهاد والإجهاد من خلال تطبيق القوة وقياس الإجهاد حتى تنكسر الهلاميات المائية.
    3. احسب معامل يونغ من ميل المنطقة الخطية لمنحنيات الإجهاد والإجهاد.

6. ثقافة ثلاثية الأبعاد ل ASCs البشرية في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب

  1. إعداد منصة ثلاثية الأبعاد (3D) (الوقت التقريبي: 3 ساعات)
    1. رقاقة السيليكون المحفورة مع مقاومة الضوء SU-8 لتوليد أنماط دائرية بعمق 200 ميكرومتر وقطر 4 مم.
    2. امزج قاعدة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) وعامل المعالجة بنسبة 10: 1. يسكب المزيج على رقاقة السيليكون ويترك لمدة 20 دقيقة لإزالة جميع الفقاعات التي تنشأ من خلط قاعدة PDMS وعامل المعالجة.
    3. ضعه في الفرن ومعالجته لمدة ساعتين عند 70 درجة مئوية. قم بفك قالب ورقة PDMS المعالجة وقم بإخراجها باستخدام لكمة خزعة بقطر 8 مم لصنع آبار صغيرة PDMS.
    4. ضع الآبار الصغيرة في صفيحة سعة 96 بئرا وضع لوحة البئر في منظف بلازما الهواء لتعقيم الآبار الصغيرة PDMS.
    5. قم بتشغيل الآبار الصغيرة PDMS مع 1٪ بولي إيثيلين (PEI) و 0.1٪ جلوتارالديهايد (GA) لمدة 10 دقائق و 20 دقيقة على التوالي. اغسل الآبار الصغيرة بالماء المقطر ، 2x.
  2. تحضير hASCs (الوقت المقدر: 7 أيام)
    1. خلايا ممر الثقافة ل 2-5 ممرات في وسائط نمو hASCs (الوسائط القاعدية hASCs المكملة بمصل الأبقار الجنينية (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (Pen-Strep)) حتى التقاء. تمرير وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
  3. الهلاميات المائية المركبة للأعصاب المحملة ب ASC (الوقت المقدر: 2 ساعة)
    1. امزج العصب الوركي والحبل الشوكي بنسبة حجمية 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 ، وقم بإعداد هيدروجيل للحبل الشوكي فقط دون خلط أي بريجل للعصب الوركي.
    2. أضف وسائط M199 واضبط درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1 N و NaOH و HCl. أعد تعليق hASCs مع وسائط النمو في البرجل بكثافة 1 × 106 خلايا / مل.
      ملاحظة: يجب أن تكون كمية M199 وتعليق الخلية 10٪ من بريجل.
    3. خفف البرجل إلى 12 مجم / مل باستخدام 1x PBS. ضع البرجل على الآبار الصغيرة واحتضنه لمدة 30 دقيقة. استزراع الهلاميات المائية المحملة ب ASC في وسائط نمو hASCs.
  4. اختبار بقاء الخلية (الوقت المقدر: 4 ساعات في اليوم)
    1. قم بإعداد حلول اختبار الجدوى باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. شفط الوسائط في الأيام 1 و 4 و 7 و 14. أضف الكاشف إلى الآبار واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. اقرأ التألق عند الإثارة / الانبعاث 560/590 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. احسب النسبة المئوية للفرق باستخدام المعادلة التالية:
      [(عينة مضان -فلورة فارغة) /مضان فارغ] × 100

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحضير الأنسجة منزوعة الخلايا باستخدام بروتوكولات تم وضعها مسبقا مع تعديلات طفيفة26،27. بعد إزالة الخلايا ، والتجميد ، والهضم ، تم تصنيع الهلاميات المائية العصبية المركبة بنسب SN: SC = 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 ، والمواد الهلامية المائية للحبل الشوكي فقط (الشكل 1). تم تأكيد إزالة المكونات النووية من خلال تلطيخ H & E (الشكل 2 أ). لتقييم إزالة الخلايا كميا ، تم قياس الحمض النووي المتبقي داخل ECM. كان محتوى dsDNA في الأم الجافية الطازجة 132.6 ± 21.3 نانوغرام dsDNA / mg من الأنسجة الجافة ، في حين احتوت حمة الحبل الشوكي الطازجة ومنزوعة الخلايا على 22.6 ± 8.3 نانوغرام dsDNA / mg من الأنسجة الجافة و 23.74 ± 6.69 نانوغرام dsDNA / mg الأنسجة الجافة ، على التوالي (الشكل 2 ب). وأشارت إلى أنه كان من المقرر إزالة الأم الجافية قبل إزالة الخلايا. كانت كمية dsDNA للعصب الوركي الطازج ومنزوعة الخلايا 222.5 ± 42.65 و 0.63 نانوغرام dsDNA / mg من الأنسجة الجافة ، على التوالي (الشكل 2 ج).

تم تقييم حركية التبلور للهلاميات المائية العصبية المركبة لتحديد سرعة الهلام (S) والأوقات للوصول إلى 50٪ و 95٪ من التعكر النهائي (ر1/2 و ر95). أظهرت حركية التبلور شكلا سينيا لجميع مجموعات الهيدروجيل (الشكل 3 أ). لم تكن سرعة التبلور (S) في جميع مجموعات الهيدروجيل مختلفة بشكل كبير عن بعضها البعض. كان الوقت المطلوب للوصول إلى نصف العكارة النهائية ، ر1/2 ، هو 11.32 ± 0.57 دقيقة ، و 13.33 ± 0.6 دقيقة ، و 15.7 ± 0.92 دقيقة ، و 17.23 ± 1.13 دقيقة ل SN: SC = 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 ، والحبل الشوكي فقط ، على التوالي. كان الوقت المطلوب للوصول إلى 95٪ من التعكر النهائي ، t95 ، هو 13.8 ± 0.83 دقيقة ، و 15.53 ± 0.83 دقيقة ، و 18.38 ± 0.79 دقيقة ، و 19.62 ± 1.27 ل SN: SC = 2: 1 ، 1: 1 ، 1: 2 والحبل الشوكي فقط ، على التوالي. تشير هذه النتائج إلى أن الهلاميات المائية التي تحتوي على محتوى أكثر من العصب الوركي تصل إلى الحالة المستقرة بشكل أسرع ، وقد تعزز ECM للعصب الوركي تجميع الهيدروجيل. أظهرت نتيجة اختبار الضغط اتجاها مفاده أن الهلاميات المائية التي تحتوي على محتوى أكبر من الحبل الشوكي توفر صلابة متزايدة. ومع ذلك ، لم يكن مختلفا بشكل كبير عبر جميع النسب المختلفة للهلاميات المائية المركبة (الشكل 3 ب).

أخيرا ، لتحديد جدوى الخلية ل hASCs في جميع مجموعات الهيدروجيل ، تم إعداد الثقافات ثلاثية الأبعاد باستخدام الآبار الصغيرة PDMS الدقيقة ، كما هو موضح في الشكل 4. طوال فترة الثقافة التي استمرت 14 يوما ، تم قياس جدوى ASC باستخدام مقايسة التمثيل الغذائي اللونية والفلورية المستندة إلى وسائط زراعة الخلايا المتاحة تجاريا ، حيث تم حساب الاختلافات المئوية عن القراءات في أربع نقاط زمنية مختلفة: اليوم 1 ، اليوم 4 ، اليوم 7 ، واليوم 14 (الشكل 5). زادت قيمة النسبة المئوية للفرق مع زيادة النقاط الزمنية ، وكانت قيمة الهيدروجيل للحبل الشوكي فقط أقل من بقية المجموعات في الأيام 1 و 4 و 14. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن جدوى hASC زادت على طول فترة الثقافة بسبب تكاثر الخلايا وزيادة نشاط التمثيل الغذائي للخلية.

figure-results-1
الشكل 1: تصنيع الهلاميات المائية العصبية المركبة. تم إزالة الخلايا من الحبال الشوكية الخنازير والأعصاب الوركي ، وتجميدها ، وهضمها للحصول على محاليل بريجل. تم خلط محاليل العصب الوركي والحبل الشوكي بنسبة 2: 1 و 1: 1 و 1: 2 ، كما تم تحضير بريجل للحبل الشوكي فقط. تم تحضين جميع محاليل بريجل عند 37 درجة مئوية لتوليد الهلاميات المائية العصبية المركبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التحقق من إزالة الخلايا. (أ) تلطيخ H & E للحبال الشوكية الخنازير الطازجة ومنزوعة الخلايا والأعصاب الوركي. تشير الأسهم إلى وجود خلايا في الأنسجة. أشرطة المقياس = 1 مم للصور ذات الرؤية الواسعة و 500 ميكرومتر للصور ذات التكبير (200 ميكرومتر فقط لصور العصب الوركي منزوعة الخلايا). (ب) تحليل الحمض النووي للأم الجافية الطازجة ، والحمة ، والحبل الشوكي منزوع الخلايا (ن = 10 و 16 و 6 على التوالي). (ج) تحليل الحمض النووي للأعصاب الوركي الطازجة ومنزوعة الخلايا (ن = 8 و 3 ، على التوالي). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق ل (B) واختبار t ل (C). الاختصارات: ns = غير مهم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: توصيفات الهلاميات المائية العصبية المركبة. (أ) الامتصاص الطبيعي للهلاميات المائية العصبية المركبة (ن = 5). (ب) معامل يونغ للحبل الشوكي منزوع الخلايا والهيدروجيل المركب للأعصاب (ن = 4 للحبل الشوكي منزوع الخلايا و 3 لكل مجموعة هيدروجيل مركبة ، على التوالي). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق. الاختصارات: ns = غير مهم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: صورة تخطيطية للثقافة ثلاثية الأبعاد. (أ) تم تصنيع الآبار الصغيرة PDMS على رقاقة سيليكون مطلية ب SU-8. تم تثقيب كل بئر صغير باستخدام لكمة خزعة 8 مم. (ب) الحبل الشوكي منزوع الخلايا والعصب الوركي بنسب مختلفة ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، وإعادة تعليقه باستخدام hASCs ، ووضع البرجل على ميكروويل ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: مقايسة بقاء الخلية. النسبة المئوية للفرق في hASCs المزروعة في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب في الأيام 1 و 4 و 7 و 14 (ن = 3). تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. تم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey اللاحق. * ص<0.05؛ ** p<0.01; ص <0.005 ؛ ص <0.001 ؛ NS: ليس مهما. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتقد على نطاق واسع أن الفيزيولوجيا المرضية لمرض اصابات النخاع الشوكي معقدة ومتعددة الأوجه. على الرغم من أن العلاجات الفردية مثل زرع الخلايا وتوصيل الأدوية والمواد الحيوية قد قدمت رؤى قيمة حول اصابات النخاع الشوكي ، إلا أن الطبيعة المعقدة لاصابات النخاع الشوكي قد تحد من فعاليتها الفردية28،29،30،31. لذلك ، زادت الجهود المبذولة لتطوير علاجات اندماجية فعالة. قد تعمل الهلاميات المائية العصبية المركبة الموصوفة في هذه الدراسة كوسيلة توصيل فعالة للخلايا أو الأدوية. فيما يتعلق بالخلايا ، تعد ASCs واحدة من المرشحين الواعدة لزرع الخلايا. تفرز ASCs عوامل معدلة للمناعة مثل إنترلوكين -10 (IL-10) وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) بالإضافة إلى عوامل التغذية العصبية مثل عامل نمو الأعصاب (NGF) ، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) ، وعامل التغذية العصبية المشتق من الدبقي (GDNF) ، والتغذية العصبية -3 (NT-3) التي تؤدي إلى زيادة نمو العقد الجذرية الظهرية في المختبر واستعادة الوظيفة في الجسم الحي17،19،32،33 ، 34. عززت ASCs التي يتم تسليمها في محاليل مائية الانتعاش الوظيفي بعد اصابات النخاع الشوكي في الفئران والبشر. ومع ذلك ، لوحظت تحديات التوسط في الهجرة والتمايز والبقاء والتمايز بين ASCs35،36،37. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تقارير متضاربة حول الإمكانات السرطانية للسرطانات السرطانية المزروعة. بينما أشارت بعض الدراسات إلى أن ASCs قد تساهم في انتشار ورم خبيث لأنواع مختلفة من السرطان ، فقد أظهرت دراسات أخرى أيضا إمكانات مضادة للأورام38،39،40،41وبالتالي ، يجب التحقيق في ملف تعريف السلامة طويل المدى ل ASCs في الهلاميات المائية المركبة للأعصاب في المستقبل. هنا ، تمت دراسة الحبال الشوكية منزوعة الخلايا والأعصاب الوركي بشكل منفصل لإصلاح اصابات النخاع الشوكي.

تم حقن الحبل الشوكي منزوع الخلايا في نموذج الفئران من اصابات النخاع الشوكي وحفز النمو المحوري في الآفة وارتفاع الانتعاش الوظيفي. ومع ذلك ، بسبب التدهور السريع ، تم تشكيل كيس ، وتضاءل الشفاء بعد 4-8 أسابيع من العلاج4 ، 42. تم حقن هيدروجيل العصب الوركي منزوع الخلايا في فئران اصابات النخاع الشوكي وعزز التجديد العصبي ، لكن فعالية الهيدروجيل كانت محدودة بسبب التدهور السريع24. لذلك ، اكتسبت الأساليب التوافقية باستخدام الأنسجة منزوعة الخلايا الانتباه مؤخرا. تم الإبلاغ عن أن الهلاميات المائية للحبل الشوكي منزوعة الخلايا عززت تكاثر الخلايا الجذعية العصبية / الخلايا السلفية والهجرة والتمايز إلى خلايا عصبية4. كما أنه سهل نمو العصبات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الأرومي العصبي N1E-115 ، مما يشير إلى أن الهلاميات المائية للحبل الشوكي منزوعة الخلايا قد تكون سقالة جذابة لتعزيز التجديد المحوري26. تمت دراسة الأعصاب الوركي منزوعة الخلايا باستخدام تغليف شوان وأظهرت إمكانات كطعم عصبي بعد SCI43. مجتمعة ، من المتوقع أن يؤدي مزيج من الحبل الشوكي منزوع الخلايا والأعصاب الوركي إلى تعزيز كل من التجديد المحوري واستعادة الأنسجة. لا تشمل الدراسة الحالية أيضا تقييم الآثار العلاجية للهلاميات المائية العصبية المحملة ب ASC. لذلك ، من الضروري تقييم الإمكانات التجديدية ، مثل التأثيرات المؤيدة للأوعية الدموية والتغذية العصبية ، للمنصة عبر الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الهلاميات المائية المركبة للأعصاب بسهولة لتغليف أنواع الخلايا الأخرى ، مثل خلايا شوان والخلايا الجذعية الشمية والخلايا الجذعية العصبية ، لتحسين الفعالية العلاجية لزرع الخلايا. سيكون من المثير للاهتمام التحقيق في سلامة وفعالية أنواع الخلايا المختلفة داخل هيدروجيل العصب المركب في مراحل مختلفة من اصابات النخاع الشوكي.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في إنشاء الهلاميات المائية المركبة في تحضير كمية كافية من الأنسجة ، وخاصة الحبال الشوكية. إنتاجية الحبل الشوكي منزوعة الخلايا منخفضة بشكل ملحوظ ، كما هو مذكور في البروتوكول (50-100 مجم قطعة من الحبل الشوكي و 100-150 مجم قطعة العصب الوركي) ؛ وبالتالي ، لا ينصح بحصاد أو الحصول على الحبل الشوكي من الصغيرة مثل الفئران والجرذان. يقترح على الأقل متوسطة الحجم ، مثل الأرانب ، الحصول على كمية كبيرة من مصفوفات الحبل الشوكي. أيضا ، من المهم التحقق من الرقم الهيدروجيني عند هضم الأنسجة منزوعة الخلايا لأن إضافة الأنسجة يمكن أن تحول درجة الحموضة إلى ما وراء نطاق تنشيط البيبسين المطلوب ، والذي يبلغ حوالي 1.5-2. أوقات التحريض لإزالة الخلايا من الحبل الشوكي أطول من الطريقة المحددةسابقا 26 لأن سرعة التحريض أبطأ في البروتوكول الحالي. يوفر الدوار المستخدم في هذا البروتوكول ما يصل إلى 83 دورة في الدقيقة ، بينما تم استخدام 200 دورة في الدقيقة كحد أقصى في الطرق المحددة مسبقا. لذلك ، تمت زيادة أوقات التحريك مرتين لغسل جميع الحطام الخلوي جيدا. لضمان أن جميع حلول إزالة الخلايا يمكن أن تخترق الأنسجة وتغسل جميع المحتويات الخلوية والنووية ، يجب تحسين أوقات التحريك والسرعة باستخدام الأنسجة أو تحليل الحمض النووي من جانب المستخدم. يقترح أن تكون النسبة بين الأنسجة ومحلول إزالة الخلايا 1:15 كحد أدنى [وزن / حجم]. تم هضم / تحريك الأنسجة منزوعة الخلايا في البروتوكول26 الذي تم إنشاؤه مسبقا في درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، تم هضمها بشريط مغناطيسي على لوحة تحريك عند 4 درجات مئوية و 500 دورة في الدقيقة لمدة 4 أيام. يمكن لمحرك لوحة التحريك أن يولد الحرارة ويدخلها إلى محلول بريجل. لذلك ، يوصى بالهضم في درجات حرارة منخفضة أو استخدام لوحة تحريك يمكن التحكم في درجة حرارتها.

كما هو مذكور في تحليل الحمض النووي (الشكل 2 ب) ، من الأهمية بمكان إزالة الأم الجافية للحبل الشوكي لأنه يمكن العثور على كمية كبيرة من الحمض النووي داخل الأم الجافية. الأم الدورانية ، على عكس حمة الحبل الشوكي ، تتكون من أنسجة ليفية. لذلك ، يجب استخدام طرق مختلفة لإزالة الخلايا كما هو موثقسابقا 44،45. تم استخدام تلطيخ H& E وتحليل الحمض النووي للأنسجة منزوعة الخلايا للتحقق من فعالية عملية إزالة الخلايا. يجب استيفاء المعايير التالية لتحقيق أهداف إزالة الخلايا بنجاح: 1. أقل من 50 نانوغرام dsDNA / mg ECM الوزن الجاف ، 2. أقل من 200 نقطة أساس طول جزء الحمض النووي ، 3. نقص المواد النووية في أقسام الأنسجة أو H &E 5. أظهر التحليل النوعي لتلوين H & E بعد إزالة الخلايا نقصا في تلطيخ النوى ، مما يشير إلى الإزالة الناجحة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، تم الاحتفاظ بمكونات ECM ، مثل الكولاجين وبروتينات المصفوفة الأخرى ، وتم تقليل شدة التلوين بعد إزالة الخلايا ، مما يعكس إزالة المادة الخلوية. بعد إزالة الخلايا ، كانت محتويات الحمض النووي 0.63 نانوغرام في العصب الوركي و 23.74 ± 6.69 نانوغرام في الحبل الشوكي لكل مجم من الوزن الجاف ECM ، وهو أقل من العتبة المقبولة للتطبيق في الجسم الحي .

يجب تصميم القياسات الريولوجية للهلاميات المائية المركبة بعناية ، حيث لا يمكن استخدام مقاييس الريومتر ذات قوة الضغط العالية أو أجهزة اختبار الشد لتحليل الخواص الميكانيكية للمواد اللينة مثل الهلاميات المائية المركبة العصبية التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة. سيتم تمزيق / تمزيق العينات عندما يتم إمساكها بجهاز اختبار الشد ، ولن يوفر الضغط بقوة عالية بيانات حساسة بما يكفي لتحليلها. في هذه الدراسة ، تم استخدام مقياس متغير بقوة ضغط تبلغ 250 نيوتن ، وينصح بالعثور على جهاز بقوة مماثلة أو مناسبة لأغراض المستخدمين. كبديل ، قد تساعد القياسات الريولوجية المختلفة ، مثل قياس القص التذبذبي ، في تحديد وحدات التخزين والخسارة. تعتبر الخصائص الميكانيكية المنخفضة بعد إزالة الخلايا قيدا في هذه الدراسة. على الرغم من أن معامل يونغ لجميع مجموعات الهيدروجيل مشابه لمعامل الحبل الشوكي منزوع الخلايا ، إلا أنه يختلف اختلافا كبيرا عن الحبل الشوكي الجديد (البيانات غير معروضة). أظهرت الخلايا الجذعية العصبية و MSCs المزروعة على مواد ناعمة نسبيا زيادة في التمايز العصبي وتعبير التوبولين β-III ، على التوالي46،47. ومع ذلك ، من الممكن تعزيز أو ربط المواد منزوعة الخلايا بمواد أخرى مثل الجينات والبولي (جلايكول الإيثيلين) والجينيبين والجلوتارالديهايد48،49،50،51. سيكون التحسين ضروريا للتأكد من أن هذه الاستراتيجيات لتعزيز الخصائص الميكانيكية للهلاميات المائية لا تؤثر على السلوك الخلوي أو قابلية البقاء.

يمكن ملاحظة التباين من دفعة إلى دفعة في الهلاميات المائية العصبية المركبة ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات في عمر وجنسها ووزنها وأنواعها. قد يساعد الاستخدام الخاضع للرقابة والمتسق لنفس النوع من في التخفيف من التقلبات. يمكن أن يساعد تجميع عينات الأنسجة من مختلفة أيضا في تقليل التباين بين الدفعات52. أحد التحديات المحتملة لترجمة هذه الدراسة إلى التطبيقات السريرية هو قابلية التوسع. سيؤدي انخفاض العائد لإزالة خلايا الحبل الشوكي إلى إعاقة إنتاج كمية كبيرة من الأنسجة منزوعة الخلايا. ستحتاج إلى تطوير / تحسين طرق جديدة لتوليد المزيد من الأنسجة ، أو يمكن إزالة الخلايا من الأم الجافية معا لزيادة المحصول بعد إزالة الخلايا. التحدي المحتمل الآخر هو التصريح التنظيمي. في الولايات المتحدة ، إدارة الغذاء والدواء الأمريكية مسؤولة عن الموافقة التنظيمية للعلاجات القائمة على الخلايا53. وافقت الهيئة التنظيمية لجمهورية كوريا على دخول CARTISTEM إلى السوق ، وهو منتج قائم على MSC يتكون من الخلايا الجذعية الجذعية الخيفية المشتقة من دم الحبل السري و 4٪ من هيدروجيل الهيالورونات لعلاج عيوب غضروفالركبة 54. قد تساعد مثل هذه الحالات السابقة في تبسيط عملية المراجعة التنظيمية من خلال توفير بيانات السلامة والكفاءة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي شيء يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة PhRMA والمعاهد الوطنية للصحة من خلال رقم الجائزة P20GM139768 و R15NS121884 الممنوحة ل YS. نود أن نشكر الدكتور كارتيك بالاتشاندران والدكتور راج راو في قسم الهندسة الطبية الحيوية بجامعة أركنساس على السماح لنا باستخدام معداتهم. أيضا ، نود أن نشكر الدكتور جين وو كيم والسيد باتريك كوتشوارا من قسم الهندسة البيولوجية والزراعية بجامعة أركنساس على توفير التدريب على مقياس الريومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-(Decyldimethylammonio)ملح البروبان سلفونات الداخليسيغما-ألدرتشD4266يستخدم أثناء تفكيك الخلايا العصبي الوركي، SB-10
3-(N,N-ثنائي ميثيل بالميتيلامونيو) بروبان سلفوناتسيغما-ألدرتشH6883يستخدم أثناء تفكيك الخلايا العصب الوركي، SB-16
كاشف ألامار بلوفيشر ساينتيفكDAL1100تم استخدامه خلال اختبار Viabiiltiation خلية AlamaBlue
كوندروتيناز ABCسيغما-ألدرتشC3667يستخدم أثناء إزالة الخلايا العصبية الوركية
كريوستاتلايكاCM1860
ديوكسيريبونوكلازسيغما-ألدرتشD4263يستخدم أثناء إزالة الخلايا العصبية الوركية
هيبتاهيدرات فوسفات ثنائي الصوديومVWRBDH9296مادة كيميائية لفوس 100 ملليمولار/50 ملليمولار فوس و50 ملليمولار ناثر/10 ملليمولار فوس
DNeasy Blood & مجموعة المناديلتشياغن69506يستخدم أثناء تحليل الحمض النووي
تركيب DPX لعلم الأنسجة، وسيط تركيب الشرائحسيغما-ألدرتش6522استخدم خلال H&. التلوين الإلكتروني
إيوسينسيغما-ألدرتشHT110216استخدم خلال H&. التلوين الإلكتروني
ايثانولVWR89125-172
فورمالدهيدسيغما-ألدرتش252549استخدم خلال H&. التلوين الإلكتروني
جلوتارالديهايد (جورجيا)سيغما-ألدرتشG6257يستخدم أثناء عملية السطح في PDMS
وسائط النمو hASCلونزاPT-4505تستخدم لزراعة hASCs، التي تحتوي على مصل الأبقار الجنيني والبنيسيلين/الستربتوميسين
الهيماتوكسيلينVWR26041-06استخدم خلال H&. التلوين الإلكتروني
الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشريةلونزاPT-5006
حمض الهيدروكلوريك (HCl)سيغما-ألدرتش320331يستخدم لهضم الأنسجة التي تم إزالة السليولارا وضبط محاليل الجل الجاهزة
وسائط M199سيغما-ألدرتشM0650يستخدم لتخفيف الجل البريجل إلى التركيز المرغوب
مركب القطع الأمثل للتمباتورTissue-Tek4583
بيبسينسيغما-ألدرتش7000 بيزويستخدم لهضم الأنسجة المنعزلة إلى الخلايا
حمض البيراسيتيكزقاق المختبرPAA1001يستخدم أثناء إزالة الخلايا الحبل الشوكي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)VWR97062-948
قارئ الألواحبيوتيك إنسترومنتسسينرجي إم إكس
بولي إيثيلينامين (جزيرة الأمير إدوار)سيغما-ألدرتش181978يستخدم أثناء عملية السطح في PDMS
العصب الوركي الخنزيريTissue Source LLCخنازير حية، بدون معلومات محددة ولا تفاصيل تتبع
الحبل الشوكي الخنزيريTissue Source LLCخنازير حية، بدون معلومات محددة ولا تفاصيل تتبع
نظام كوانتي فلور dsDNAبروميغاE2670يستخدم لتحليل محتويات الحمض النووي
الريومترشركة تي إيه إنسترومنتسDHR 2
الدوار المتقطعغلاس-كو099A RD4512يستخدم أثناء إزالة الخلايا الحبل الشوكي
كلوريد الصوديوم (NaCl)VWRBDH9286مادة كيميائية لفوس 100 ملليمولار/50 ملليمولار فوس و50 ملليمولار ناثر/10 ملليمولار فوس
دي أوكسي كولات الصوديومسيغما-ألدرتشD6750
مونوهيدرات ثنائي هيدروجين الصوديومVWRBDH9298مادة كيميائية لفوس 100 ملليمولار/50 ملليمولار فوس و50 ملليمولار ناثر/10 ملليمولار فوس
محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيغما-ألدرتش415443يستخدم لتعديل محاليل بريجل
SU-8كاياكو مواد متقدمةSU8-100يستخدم لتغطية رقاقة السيليكون
سكروزسيغما-ألدرتشS8501يستخدم أثناء إزالة الخلايا الحبل الشوكي
مجموعة سيلغارد 184 سيليكون إيلاستومرداو1317318مادة بولي ديميثيل كسيلوكسان (PDMS) الأساسية وعامل المعالجة
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشX100يستخدم أثناء إزالة الخلايا الحبل الشوكي
تريبسين-إيدتا (0.05٪)، فينول أحمرثيرمو فيشر25300062يستخدم أثناء عمل hASC وأثناء إزالة الخلايا الحبل الشوكي
دوار المسدس الأنبوبيثيرمو فيشر88881001يستخدم أثناء إزالة الخلايا العصبية الوركية
زيلينVWRMK866816استخدم خلال H&. التلوين الإلكتروني

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة