يصف هذا البروتوكول منهجيات إنشاء نموذج بسيط وفعال لزرع الجنين في المختبر لتقييم الجزيئات ذات الصلة التي تؤثر على عملية زرع الجنين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
زرع الجنين هو الخطوة الأولى في تأسيس حمل ناجح. يعد النموذج المختبري لزرع الأجنة أمرا بالغ الأهمية للبحث البيولوجي الأساسي وتطوير الأدوية والفحص. تقدم هذه الورقة نموذجا بسيطا وسريعا وعالي الكفاءة في المختبر لزرع الجنين. في هذا البروتوكول ، نقدم أولا اكتساب الكيسة الأريمية للفأر وتحضير خلايا سرطان بطانة الرحم الغدي البشري (إيشيكاوا) للزرع ، تليها طريقة الزراعة المشتركة لأجنة الفئران وخلايا إيشيكاوا. أخيرا ، أجرينا دراسة لتقييم تأثير التركيزات المتفاوتة من 17-β-استراديول (E2) والبروجسترون (P4) على معدلات التصاق الجنين بناء على هذا النموذج. كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن التركيزات العالية من E2 قللت بشكل كبير من التصاق الجنين ، في حين أن إضافة البروجسترون يمكن أن يعيد معدل الالتصاق. يوفر هذا النموذج منصة بسيطة وسريعة لتقييم وفحص الجزيئات المشاركة في عملية الالتصاق ، مثل السيتوكينات والأدوية وعوامل النسخ التي تتحكم في الزرع وتقبل بطانة الرحم.
المقدمة
زرع الجنين ، الخطوة الأولى للحمل الناجح ، أمر بالغ الأهمية لفهم أساسه البيولوجي ومواجهة تحديات العقم. ومع ذلك ، فإن القيود الأخلاقية تفرض قيودا كبيرة في جمع عينات الأجنة السريرية البشرية ، مما يعيق البحث في التفاعلات المعقدة بين الأجنة البشرية وبطانة الرحم أثناء الحمل المبكر1. إن الفهم العميق لهذه الآليات المعقدة أمر حيوي للنهوض بالبحوث البيولوجية الأساسية واكتشاف الأدوية والصحة الإنجابية.
استخدمت النماذج السابقة في المختبر نماذج الالتصاق حيث تمت زراعة الخلايا الظهارية البطانية البشرية أحادية الطبقة (RL95-2) 2 مع بدائل جنينية ، مثل خلايا BeWo أو JAr أو Jeg-3 3المشيمية . ومع ذلك ، فإن اختيار حجم الكرويات ، الذي يتراوح بين 70-100 ميكرومتر ، كان أمرا بالغ الأهمية لأن مجاميع الخلايا الأكبر أو الأصغر يمكن أن تضر بدقة التجربة. والجدير بالذكر أن 25٪ فقط من الأجسام الكروية في كل مستحضر استوفت معيار الحجمالمناسب 4 ، وكانت هناك اختلافات كبيرة مقارنة بالظروف الفسيولوجية للأكياس الأريمية.
علاوة على ذلك ، توفر أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) لبطانة الرحم والكيسة الأريمية بيئة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية5 ، ولكنها تتطلب خبرة تقنية عالية ، وبطء نمو الخلايا ، وارتفاع تكاليف الموارد والصيانة ، وصعوبة في التوحيد القياسي ، وانخفاض قابلية التكاثر6.
في هذا البروتوكول ، نقدم نموذجا فعالا من حيث التكلفة وسريعا في المختبر لزرع الجنين يمكن تطويره واستخدامه في معظم المختبرات. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير منصة موثوقة وقابلة للتكرار لدراسة التفاعلات بين الأجنة وبطانة الرحم في بيئة خاضعة للرقابة. من خلال محاكاة الأحداث الرئيسية لزرع الأجنة في المختبر ، يهدف هذا النموذج إلى سد الفجوة بين النماذج الحيوانية والإعدادات السريرية ، مما يتيح إجراء أبحاث أكثر دقة واستهدافا.
بالمقارنة مع البدائل الجنينية ، يوفر استخدام الكيسات الأريمية للفأر تمثيلا أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لعملية زرع الجنين في الجسم الحي7. بالإضافة إلى ذلك ، يمتلك خط خلايا إيشيكاوا ، المشتق من سرطان بطانة الرحم الغدي البشري ، خصائص مختلطة من الظهارة الغدية وظهارة تجويف الرحم1 ، مما يمكنه من التعبير عن الإنزيمات والبروتينات الهيكلية ومستقبلات الستيرويد الوظيفية المشابهة لتلك الموجودة في بطانة الرحم الطبيعية ، وبالتالي توفير ركيزة ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لزرع الجنين. تتيح بساطة وسرعة نظام الثقافة المشتركة إجراء فحص عالي الإنتاجية واختبار الأدوية8،9،10. من خلال توفير منصة قوية وقابلة للتكرار ، توفر هذه الطريقة فرصة لتعزيز فهمنا لزرع الأجنة وتأثيرها على صحة الإنسان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء مناولة الفئران والدراسات التجريبية بموجب البروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة التابعة لمعهد شنغهاي للتقنيات الطبية الحيوية والصيدلانية. ضمان إجراءات السلامة: احرص دائما على ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع المواد الكيميائية أو المواد البيولوجية.
1. اقتناء أجنة الفئران
ملاحظة: يصف هذا القسم عملية الحصول على أجنة الفئران. تم الحفاظ على إناث الفئران البالغة (6-8 أسابيع ، الهجين C57BL / 6 و DBA / 2) في ظل الظروف البيئية القياسية من 12 ساعة خفيفة و 12 ساعة مظلمة عند 20-25 درجة مئوية ورطوبة 40-60٪ مع توفير الطعام والماء حسب الحاجة.
- حقن إناث الفئران داخل الصفاق مع 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG) ثم حقنها ب 10 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) بفاصل 42-48 ساعة.
- تزاوج كل أنثى فأر مع ذكر من نفس العمر وتحقق من وجود سدادة مهبلية في صباح اليوم التالي.
ملاحظة: السدادة المهبلية عبارة عن كتلة صفراء فاتحة من التحميلة تتشكل بعد تصلب السائل المنوي عند فتحة المهبل. - القتل الرحيم للفئران الإناث مع المقابس المهبلية عن طريق استنشاق CO2 .
- فتح البطن وتحديد موقع الأعضاء التناسلية الأنثوية. تمتد قناة البيض والمبيض ومنصات الدهون مع ملقط. قطع قناة البيض والمبيض بالمقص. ثم قطع قناة البيض والرحم (الشكل 1).
- نقل قناة البيض التي تم الحصول عليها إلى طبق بتري 35 ملم مملوءة مسبقا مع M2 المتوسطة.
ملاحظة: يجب تسخين وسط M2 في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة. - ثقب الأمبولة المتضخمة لقناة البيض بإبرة 25 جم لتحرير أو قرصة مجمع الركام والزيجوت (الشكل 2).
- استخدم الملقط لنقل مركب الركام والزيجوت إلى محلول M2 يحتوي على 0.5 مجم / مل هيالورونيداز واحتضانه لعدة دقائق حتى تتفكك الخلايا الركامية (الشكل 3).
- اجمع الزيجوت باستخدام ماصة نقل البويضات واغسلها في وسط M2 يحتوي على 4 مجم / مل BSA لإزالة الهيالورونيداز المتبقي والخلايا الركامية والشوائب.
2. في الثقافة المختبرية لجنين الفأر
ملاحظة: يفصل هذا القسم عملية زراعة أجنة الفئران في المختبر من الزيجوتات إلى الكيسات الأريمية. يجب تحضير قطرات صغيرة لثقافة KSOM قبل 24 ساعة لضمان درجة الحرارة وتوازن الغاز.
- تحضير 12 قطرة صغيرة من وسط KSOM ، كل منها بحجم 20 ميكرولتر ، في الجزء السفلي من طبق بتري 35 مم. قم بتغطية القطرات الدقيقة ب 3-5 مل من الزيت المعدني (الشكل 4) ، وضع أطباق بتري في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للتوازن.
- انقل أجنة الفأر من وسط M2 إلى وسط KSOM باستخدام ماصة نقل للغسيل الشامل.
ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة مجهرا مجسما بمرحلة تسخين 37 درجة مئوية. تقليل مدة التعامل مع الأجنة خارج الحاضنة. - ضع الأجنة المغسولة في قطرات KSOM الدقيقة المحضرة واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 أيام.
ملاحظة: لضمان التغذية الكافية ، قم بزراعة 5-10 أجنة لكل 20 ميكروقطرة ميكرولتر. - حدد الكيسات الأريمية المفيدة وفقا لحجمها (100-130 ميكرومتر) ، وكتلة الخلية الداخلية (تتكون كتلة الخلية الداخلية من العديد من الخلايا المضغوطة جميعها) ، وعدد خلايا الأرومة الغاذية (الأدمة الغاذية المكونة من العديد من الخلايا المتماسكة والمعبأة معا) ، ودرجة التوسع (تحتل البلاستوكول 80-100٪ من الجنين).
3. تحضير خلايا بطانة الرحم
- داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط 1 مل من الجيلاتين بنسبة 2٪ باستخدام ماصة ووزعها في طبق استزراع مكون من 12 بئرا. قم بتدوير اللوحة برفق لضمان تغطية كاملة للقاع بالجيلاتين. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بشفط الجيلاتين الزائد واترك قاع اللوحة يجف تماما.
- بعد اكتمال عملية الطلاء ، قم بزراعة خلايا سرطان بطانة الرحم الغدي البشري (إيشيكاوا) مع DMEM / F12 (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 2 mM L-glutamine ، 100 μg / mL streptomycin ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين ، وزرعها في ألواح 12 بئر مغلفة بالجيلاتين (2 × 105خلايا / بئر) ، واحتضانها لمدة 24 ساعة.
4. تعلق الجنين
- ضع برفق 5-15 كيسا أريميا طازجا في كل بئر من الصفيحة المكونة من 12 بئرا والتي تحتوي على خلايا إيشيكاوا المحضرة في الخطوة السابقة للزراعة المشتركة (الشكل 5).
- بعد 48 ساعة من الحضانة ، راقب الأجنة تحت المجهر لتقييم حالة تعلقها. لمراقبة تعلق الجنين ، حرك اللوحة بسرعة ثلاث مرات. ستظهر الأجنة غير المرتبطة حركة عائمة أو متدحرجة على سطح خلايا إيشيكاوا.
- حساب معدل زرع الجنين باستخدام المعادلة (1) ؛ استخدم معدل التصاق الجنين لتمثيل تأثير الزرع.
معدل زرع الأجنة = (الأجنة المرفقة / إجمالي عدد الأجنة المزروعة) × 100٪ (1)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في عملية تقنيات الإنجاب المساعدة ، يعد فرط تحفيز المبيض الخاضع للرقابة (COH) خطوة حاسمة ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات هرمون الاستروجين بشكل كبير لدى المرضى بأكثر من 10-20 مرة مقارنة بالدورات الطبيعية11. بالنظر إلى هذا السياق ، سألنا عما إذا كانت تركيزات هرمون الاستروجين العالية في الدم تؤثر على زرع الجنين أثناء نقل الأجنة الطازجة. بناء على نموذج زرع الجنين هذا ، درسنا تأثيرات التركيزات المختلفة ل E2 و P4 على معدلات زرع الجنين12. بعد علاج الجوع ، تم تحضين خلايا إي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توفر بساطة وسرعة النموذج المختبري المقترح لزرع الجنين مزايا ملحوظة لفحص الأدوية في المراحل المبكرة والتطبيقات البحثية الأخرى. البروتوكول المباشر ، إلى جانب الطبيعة عالية الإنتاجية لخطوط خلايا إيشيكاوا ، يجعله مرشحا مثاليا للشاشات واسعة النطاق ، لا سيما في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية. وجد Liang13 أن ضربة قاضية TAGLN2 قللت من قدرة غزو خلايا الأرومة الغاذية. أظهر Green14 أن عامل النمو الشبيه بالأنسولين قد حسن كفاءة التصاق الكيسة الأريمية للفأر بناء على نظام خلاي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح المالية أو غيرها للإعلان عنه.
شكر وتقدير
تم دعم دراساتنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82171603) ، ومؤسسة لجنة الصحة البلدية في شنغهاي (202140341) ، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (23JC1403803) ، وبرنامج تعزيز الابتكار التابع ل NHC و Shanghai Key Labs ، SIBPT (RC2023-02).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 17-&-estradiol | SIGMA | 3301 | أقوى هرمون الاستروجين للثدييات |
| BD Falcon | BD | 353001 | أطباق بتري البكتريولوجية 35 × 10 مم نمط ث / غطاء محكم ، بوليسترين عذراء من الدرجة الكريستالية ، |
| خزانة السلامة الحيوية | ESCO | Class  BSC | عمليات معقمة ، وصنع أطباق الاستزراع ، والكواشف ، وما إلى |
| CO2< / sub> حاضنة | Thermo | 8000DH | ثقافة زراعة الأجنة |
| Corning | 3506 | زراعة الخلايا | |
| DMEM / F12 | Gibco | 1133032 | DMEM / F12 (1x) ، سائل 1: 1 ، يحتوي على L-glutamine و 15 ملي مولار HEPES عازلة |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | مصل 10099141 | الأبقار الجنينية ، مؤهل ، أستراليا المنشأ |
| الجيلاتين | SIGMA | G9391 | النوع B ، مسحوق ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | كاشف التعقيم ، الحقن داخل الصفاق ، 50 وحدة دولية / مل |
| Hyaluronidase ؛ | SIGMA | V900833 | الصف كاشف ، مسحوق ؛ |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x) ، مسحوق ، بدون فينول أحمر ، 5 × 10 مل |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | L-glutamine-200 mM (100x) ، سائل |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 متوسط (1x) ، سائل ، مع |
| زيت معدني أحمر الفينول ؛ | SIGMA | M8410 | مناسبة للاستخدام كطبقة غطاء للتحكم في التبخر والتلوث المتبادل في تطبيقات البيولوجيا الجزيئية المختلفة |
| البنسلين الستربتومايسين ، سائل | جيبكو | 15140122 | 10,000 وحدة بنسلين (قاعدة) و 10,000 وحدة ستربتومايسين (قاعدة) ، باستخدام البنسلين G (ملح الصوديوم) وكبريتات الستربتومايسين في محلول ملحي 0.85٪ |
| PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | كاشف التعقيم ، الحقن داخل الصفاق ، 50 وحدة دولية / مل |
| البروجسترون | SIGMA | 5341 | هرمون الستيرويد الذي يفرزه الجسم الأصفر خلال النصف الأخير من الدورة الشهرية |
| بيروفات الصوديوم | جيبكو | 11360070 | يضاف بيروفات الصوديوم بشكل شائع إلى وسائط زراعة الخلايا كمصدر للكربون بالإضافة إلى الجلوكوز |
| المجهر المجسم | أوليمبوس | SZX7 | استرجاع الأجنة ومراقبة نمو الجنين |
المراجع
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
