مقالة منهجية

عزل مجموعات الريبوسومات تحت الخلوية بناء على بيوتينيل معززة بموقع معين للببتيدات المؤتلفة، مقيدة بالإضاءة،

DOI:

10.3791/66881

⸱

يوليو 24, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية البيوتينيل المعززة بالإضاءة المحددة بالموقع الخاصة ب AviTag (ALIBi) هي طريقة جديدة مفعلة بصريا تم تطويرها لوضع وسم وتنقية تجمعات الخلايا الفرعية للريبوسومات لأغراض التسلسل اللاحق والتحليل البروتيومي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن ترجمة mRNA هي عملية مقسمة للغاية داخل الخلية، وأن انتقال وتوطين mRNA تحت الخلية هو المفتاح لضمان إنتاج البروتينات ذات الوظائف الخاصة بكل قسم في البيئة المثالية وبكميات مناسبة. ومع ذلك، فإن تقنيات عزل الخلايا تحت الخلوية وتوصيف الريبوسومات التي تترجم هذه ال mRNA كانت محدودة حتى الآن، بحيث لا يزال هناك الكثير غير معروف حول كيفية مساهمة تركيب الآليات الانتقالية في تنظيم ترجمة mRNA الموضعية.

هنا، نعرض طريقة AviTag الخاصة ب AviTag Selected Limited Illumin-Enhanced - الإضاءة (ALIBi)، وهي طريقة تجمع بين وسم الحواتم البصرية، وتقنية التحليل البصري المنشط حديثا من نوع البيوتين المنقسم، وتنقية الألفة لتحديد وعزل الريبوسومات المتمركزة في أي قسم خلوي تحت محدد للاهتمام. أولا، يستخدم تحرير كريسبر/كاس9 لدمج ببتيد أفيتاج، وموقع انقسام بروتيز فيروس تبغ (TEV)، وعلامة حواجز FLAG مع بروتين ريبوسومي. يعبر عن ليغاز البيوتين المنقسم، المندمج مع مجال استهداف العضيات، في هذا الخط الخلوي ويكون غير نشط تحت تركيزات البيوتين الطبيعية. عند التنشيط بواسطة البيوتين التكميلي وإضاءة الضوء الأزرق، يقوم بيوتينيل الليغاز بتركيب ريبوسومات Avi Tagged في المنطقة المحيطة مباشرة، مما يسمح بتنقية الألفة للريبوسومات البيوتينيلية والبروتينات والmRNA المرتبطة بها على الخرزات المغطاة بالستربتافيدين. الاستلقاء غير الحساس عبر تقسيم بروتياز TEV ينتج عينات مناسبة لتوصيف البروتينات الريبوسومية الأساسية، والبروتينات المرتبطة بالريبوسوم، والmRNA المرتبطة بالريبوسوم عبر تسلسل الحمض النووي الريبي أو بروتيوميات مطيافية الكتلة.

في هذا البروتوكول، نراجع مبادئ التصميم لدمج AviTag مع بروتين ريبوزومي واستهداف إنزيم ليغاز البيوتين المنقسم إلى العضية المعنية. نظهر تنشيط نظام ALIBi، وتحليل الخلايا، وتنقية الألفة، واستنتاج العينات. وأخيرا، نناقش النتائج النموذجية وحل المشكلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك حاجة مهمة لأدوات يمكنها عزل العينات البيولوجية من أقسام تحت الخلية المحددة لدراسة كيفية تأثير تنظيم وحركة الخلايا تحت الخلوية في العمليات الخلوية. تعد ترجمة mRNA مثالا رئيسيا على مثل هذه العملية: تشير الأدلة المتزايدة إلى أن الترجمة مقسمة بشكل كبير، وبشكل خاص أن العديد من mRNA موضعية في العضيات حيث ستقيم بروتيناتها المشفرة 1,2. ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن التموقع تحت الخلوي للآليات الانتقالية. تبدأ الريبوسومات وجودها في النواة والنواة، حيث يبدأ التجمع من بروتينات الريبوسوم (RPs) والريبوسوم الريبوزومي (rRNAs). ثم يتم تصديرها إلى السيتوبلازم للمراحل النهائية من التجميع، وبعدها تبدأ في ترجمة mRNA 3,4. تشمل المواقع القانونية للترجمة السيتوبلازم والشبكة الإندوبلازمية؛ الأخير هو حيث يتم تصنيع بروتينات الغشاء المتكاملة والبروتينات المخصصة للعضيات المرتبطة بالغشاء أو الإفراز خارج الخلية5. تشمل المواقع الحديثة للترجمة المحلية الميتوكوندريا، البيروكسسوم، والعمليات العصبية 6,7,8,9,10,11,12. ومن المثير للاهتمام أن الأدلة تظهر أيضا على أن ميزات الآلية الانتقالية مثل البروتينات المرتبطة بالريبوسوم، والتعديلات بعد الترجمة، وتعديلات rRNA، والقياس غير القانوني للبروتينات الريبوسومية الأساسية تشارك في آليات تنظيمية تحكم ترجمة mRNA محددة ومعايير مثل دقة الترجمة ومعدل 13,14,15,16,17,18، 19، 20. على سبيل المثال، تم تحديد مئات البروتينات التي تتفاعل مع الريبوسوم وقد تؤدي إلى اختلافات في تركيب الريبوسوم تحت الخلوي13. ومع ذلك، فإن تقنيات عزل تجمعات الريبوسومات تحت الخلوية كانت محدودة حتى الآن؛ لذا، لا يزال الكثير مجهولا حول كيفية مساهمة تركيب الآليات الانتقالية في تنظيم ترجمة mRNA الموضعية. سيسمح ظهور طرق متعددة الاستخدامات لعزل مجموعات الريبوسومات تحت الخلية، خاصة تلك المتوافقة مع أنظمة نماذج الثدييات، باستكشاف هذه الميزات لآلية الترجمة على المستوى تحت الخلوي.

كانت الطرق الأولى لعزل الكسور تحت الخلوية التي تحتوي على الريبوسومات تعتمد على مبادئ التحلل المتسلسل والطرد المركزي21,22. عادة ما تقتصر هذه الطرق على بعض العضيات وغالبا ما تتطلب أوقات معالجة طويلة. طريقة أحدث تعتمد على بيوتين ليغاز بيرا، الذي يقوم تحديدا ببيوتنيل ركيزة ببتيد AviTag 10,23,24. يمكن تحديد موقع BirA جينيا في العضية المهمة في الخلايا التي تم وسم الريبوسومات فيها ب AviTag. ومع ذلك، نظرا لأن BirA نشط عند تركيزات فسيولوجية من البيوتين، فمن الضروري زراعة الخلايا في ظروف استنزاف البيوتين لتجنب التكوين البيوتينيلي غير المحددي للريبوسومات الحاملة ل AviTag10,24. هذا يحد من استخدام بيرآ في أنواع الخلايا الحساسة لاستنزاف البيوتين25. وأخيرا، تم تطوير طرق بيوتينيليشن متعددة تستخدم إنزيمات هندسة مثل BioID وTurboID وAPEX 26,27,28. عند التحفيز، تنتج هذه الإنزيمات وسيطا تفاعليا للبيوتين يقوم بتعديل أي بقايا ليسين ضمن نصف قطر الإنزيم بشكل تساهمي. طرق البيوتينيل المختلطة مفيدة جدا لرسم خرائط البروتينات تحت الخلية، لكنها أقل فائدة في تمييز البروتينات في المنطقة العامة من الريبوسومات المحلية مقارنة بالبروتينات الأقرب إليها.

هنا، نعرض طريقتنا التي طورناها مؤخرا لوضع وسم وعزل تجمعات الريبوسومات تحت الخلية، والتي تسمى ALIBi (ALIBi) الخاصة ب AviTag (ALIBi). تستفيد هذه الطريقة من تقسيم BirA مهندس ملتصق بمفاتيح مغناطيس معززة بصرية (eMag) (الشكل 1A) التي تتحول إلى تغاير تحت إضاءة الضوء الأزرق29؛ وعلامة ببتيدية تتكون من حواتم FLAG، وموقع انقسام بروتياز، وفيروس تبغ (TEV)، وAviTag (FTA) ملتصق ببروتين Rpl31 الريبوزومي (الشكل 1B). يمكن توجيه الإنزيم المنقسم وراثيا إلى عضيات محددة، ويكون غير نشط عند تركيزات فسيولوجية من البيوتين، ويمكن إعادة تشكيله خلال دقائق عند إضاءة الضوء الأزرق وإضافة البيوتين التكميلي (الشكل 1C-E). تنتج التحلل الخلوي اللاحق، وتنقية الألفة، والاستبعاد الإنزيمي غير المتحول عبر تقسيم بروتياز TEV ريبوسومات وجزيئات تنقية مشتركة مثل mRNA والبروتينات المرتبطة بالريبوسومات، وهي مناسبة للطرق التحليلية اللاحقة مثل تسلسل RNA وبروتيوميات مطيافية الكتلة (الشكل 1A). لذلك، تكشف هذه الطريقة ليس فقط عن تركيب الريبوسومات بل أيضا عن ال mRNA التي ترتبط بها الريبوسومات. في مقال حديث يصف التطبيق الأساسي ل ALIBi لتوصيف تجمعات الريبوسومات تحت الخلية، نجحنا في استهداف الإنزيم المنقسم إلى السيتوبلازم، والنواة، والنواة، والشبكة الإندوبلازمية، وغشاء البلازما، والميتوكوندريا (الجدول 1)30. أدى المقارنة الناتجة بين الآليات الانتقالية بين هذه الأقسام تحت الخلوية إلى اكتشافات جديدة وغير متوقعة حول الترجمة في الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا، بالإضافة إلى خيوط محتملة للتحقيق المستقبلي لعوامل تكوين الريبوسوم في النواة والنواة.

يحتوي هذا البروتوكول على عرض تفصيلي للنقل وتنشيط نظام ALIBI، وتحليل الخلايا، وتنقية الألفة، وإزالة العينات. نناقش أيضا كيفية التحقق من نجاح تنقية الألفة عبر ويسترن بلوت ونقدم توصيات لإجراء تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق أو تحليل بروتيومية الكتلة (MS) (انظر الملف التكميلي 1). تم كتابة هذا البروتوكول للتجارب التي تستخدم خلايا جذعية جنينية للفئران (mESCs) تعبر عن Rpl31 الاندماج مع FTA (L31-FTA) بشكل متماثل الزواج من موقع Rpl31 الداخلي؛ هذه السلسلة متاحة من المؤلفين عند الطلب. تم وصف استراتيجية توليد هذا الخط الخلوي في الملف التكميلي 1 وفي الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2. تتوفر البلازميدات التي تشفر الإنزيمات المقسمة الموجهة إلى عدة عضيات على Addgene (أرقام الفهرس #235608 إلى 235643). تم وصف مبادئ التصميم لاستهداف الإنزيمات المنقسمة إلى هذه العضيات في الملف التكميلي 1. يفترض البروتوكول أن كل عينة تنشأ من قطع mESC مزروعة في صفيحة بحجم 10 سم. وجدنا أن مقياس 10 سم ينتج مادة كافية لبروتيوميات مطيافية الكتلة، بينما مقياس 6 آبار كاف لتسلسل البقع الغربية أو RNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا mESC

ملاحظة: قبل تنشيط ALIBi وتحليل الخلية، يجب التعامل مع الخلايا العصبية المتوسطة باستخدام تقنية التعقيم القياسية لزراعة الخلايا. يجب إجراء الطرد المركزي للميكروفونات السليمة على حرارة 200 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. الوسط المسبق يسخن إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء قبل الاستخدام ما لم يذكر خلاف ذلك. يجب تمرير الخلايا العصبية إلى صفيحة زراعة أنسجة جديدة تم تحويلها إلى جيلاتين خلال الليل (انظر الخطوة 1.1).

  1. في اليوم السابق لإذابة L31-FTA، قم بتغطية قاع صفيحة بحجم 10 سم ب 5 مل من الجيلاتين 0.1٪. حضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. اجمع مكونات وسائط mESC (الجدول 2) ومرر عبر مرشح بحجم 0.2 ميكرومتر. يخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. في يوم الذوبان، سخن 5 مل من الوسط لتخفيف الخلايا المذابة و10 مل أليكوت لتلطيفها.
  4. استرجاع مبرد يحتوي على ~5 × 106 L31-FTA mESCs من تخزين النيتروجين السائل. إذابة الزجاجة فورا عن طريق تدوير قاع القارورة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  5. اخلط بلطف 0.5–1 مل من الوسط من أليكوت 5 مل مع محتويات الكريوفيال حسب سعة القارورة، ثم انقل محتويات الكريوفيال إلى أليكوت الوسائط 5 مل.
  6. قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي. استنشق السوبرناتان.
  7. أعد تعليق حبيبة الخلية باستخدام 10 مل من الميديا أليكوت.
  8. استنشق الجيلاتين من صفيحة 10 سم وانقل تعليق الخلية فورا إلى اللوحة. الحضانة عند 37 درجة مئوية.
  9. كل 24 ساعة (باستثناء أيام الوفاة)، استنشق الوسائط القديمة من اللوحة واستبدلها ب 10 مل من الوسائط الجديدة.
  10. عندما تكون المستعمرات متقاربة بنسبة 70٪–80٪ (عادة بعد 48 ساعة من الطبق)، استنشق الوسط القديم وشطفه مرتين ب 10 مل من محلول دولبيكو الملحي المخزن بالفوسفات (DPBS).
  11. بعد استنشاق DPBS، غطى الصفيحة ب 2 مل من 0.05٪ تريبسين (الجدول 2). حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. قم بتحييد التريبسين بإضافة 4 مل من وسط mESC البارد إلى اللوحة. استخدم فورا ماصة مصلية بحجم 5 أو 10 مل لرفع وأسفل 15 مرة في اللوحة لتفكيك المستعمرات إلى تعليق خلية واحدة.
  13. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي. اختياريا، إزالة أليكوت لعد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي.
  14. قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي. استنشق السوبرناتان.
  15. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط جديد. الطبق 5 × 106خلايا (عادة نسبة مرور 1:6) في صفيحة هلامية جديدة بحجم 10 سم وتحتضن عند 37 درجة مئوية. كرر الخطوات 1.9–1.15 حسب الحاجة حتى تكون جاهزا للمضي قدما في النقل.
  16. لصنع مخزونات خلايا مجمدة، قم بتطريب صفيحة من الخلايا المجمدة (كما في الخطوات 1.10–1.14). أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط تجميد (250–500 ميكرولتر لكل 5 × 106 خلايا)، وتحويلها إلى البرودة، وتجميد ببطء في حاوية تجميد الخلية عند -80 درجة مئوية طوال الليل قبل الانتقال إلى تخزين النيتروجين السائل.

2. النقل

ملاحظة: قم بإجراء النقل في يوم تكون فيه أجهزة mESC جاهزة للمرور. قد تبدأ البلازميدات في التعبير في وقت مبكر من 3-5 ساعات بعد النقل. بعد التعبير، نوصي بالتعامل مع الخلايا في الظلام وتقليل التعرض لدرجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية لمنع التنشيط المبكر، حيث أظهرت أبحاث سابقة أن مجالات البصريات المغناطيسية تتلاشى ليس فقط تحت إضاءة الضوء الأزرق بل أيضا عند التعرض للبرودة31. احتفظ بالألواح في حاضنة مخصصة أو احمي رفا في الحاضنة المشتركة من الضوء باستخدام رقائق الألمنيوم. عند التعامل مع الخلايا خارج الحاضنة، قم بإطفاء أو حجب جميع أضواء الغرفة والنوافذ مسبقا، واستخدم مصباح أمامي بالضوء الأحمر للنظر. لا تترك باب الحاضنة مفتوحا لفترة أطول من اللازم. خذ دفعات صغيرة فقط من الألواح من الحاضنة في كل مرة، ووضع الألواح على سطح عازل (أي غطاء صندوق ستايروفوم نظيف) أثناء التعامل لتقليل ملامسة أسطح العمل بدرجة حرارة الغرفة. الوسط الدافئ بالكامل قبل الاستخدام. لا تفحص الألواح تحت مجهر يصدر الضوء.

  1. في اليوم السابق للنقل، قم بعمل جيلاتين على طبق بحجم 10 سم.
  2. في يوم النقل، قم بسحب الجيلاتين من اللوحة وإضافة 7.5 مل من الوسط إلى ما قبل التسخين عند 37 درجة مئوية. وسط مصل مخفف قبل التسخين عند 37 درجة مئوية لإعادة تعليق الخلايا.
  3. تخفيف 18.75 ميكرولتر من مادة التحويل في 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل. انقر برفق لخلط واحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. إذا كان يتم التعبير المشترك عن بلازميدتين يشفران شظايا N وC، أضف 3.75 ميكروغرام من كل بلازميد إلى 250 ميكرولتر من وسط المصل المختزل. إذا كنت تعبر فقط عن بلازميد واحد (أي تحكم سلبي GFP أو تحكم إيجابي بطول كامل من BirA)، أضف 7.5 ميكروغرام من البلازميد الفردي بدلا من ذلك.
  5. أضف خليط البلازميد/الوسط المصلي المنخفض إلى خليط مادة التحويل الداخلي/الوسيط المصلي المخفض، ثم اضغط أو اقلب للخلط. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. وفي هذه الأثناء، قم بالتريبسين وحقن الحبيبات (الخطوات 1.10–1.14). أعد تعليق الحبيبة في وسط مصل منخفض دافئ إلى تركيز 10 × 106 خلايا/مل.
  7. أضف 7.5 × 106 (750 ميكرولتر) الخلايا المعلقة إلى خليط البلازميد/كاشف الترانسفكشن/وسط المصل المخفض. اقلب الأنبوب ليخلط. حضن الأنابيب لمدة 10 دقائق عند RT، مع قلب الأنابيب أحيانا للحفاظ على الخلايا معلقة.
  8. اقلب الأنابيب مرة أخرى لفترة وجيزة وأضف خليط mESC/البلازميد/كاشف النقل/وسط المصل المخفض إلى اللوحة التي تحتوي على وسط دافئ. اهز اللوحة بلطف لتوزيع الخلايا بشكل متساو.
  9. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3–5 ساعات، مما يسمح للخلايا بالالتصاق خلال هذه الفترة.
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، نوصي بمراعاة الاحتياطات السابقة ضد التعرض للضوء ودرجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية.
  10. استنشق الوسائط القديمة بلطف. أضف وسط دافئ جديد، مع رش الأنابيب على جانب الطبق لتجنب تحريك الخلايا. استأنف الحضانة عند 37 درجة مئوية.
  11. إذا تم التفعيل/التحليل بعد 24 ساعة من النقل، انتقل إلى القسم 3. إذا كنت تخطط للتفعيل/التحلل بعد 48 ساعة من التحويل، غير الوسط ~24 ساعة بعد طلاء الخلايا المنقلة.

3. تنشيط ALIBi وتحليل الخلايا

ملاحظة: استمر في التعامل مع الخلايا/العينات في الظلام حتى بداية الاستشعار (الخطوة 5.4). بمجرد تبريد الخلايا على الثلج (الخطوة 3.15)، احتفظ بالعينات باردة واستخدم فقط المواد المبردة حتى بداية عملية الاستنتاج. تأكد من أن الأسطح العملية، والمعدات، والكواشف، والبلاستيك خالية من الحمض النووي الريبي باستخدام العناصر المفتوحة حديثا ومسح أو شطف الأسطح الصلبة بمحلول تعقيم RNAse و70٪ إيثانول. ارتد القفازات عند التعامل مع العينات أو المعدات. بالنسبة للعينات المخصصة لبروتيميكس التصلب المتعدد، يجب أيضا تقليل تلوث الكيراتين من خلال إبقاء مساحة العمل خالية من الغبار؛ غطي الجلد العاري، واربط الشعر الطويل للخلف.

  1. قم بتبريد الطرد المركزي إلى درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. مع إطفاء الأضواء، انقل الألواح المنقولة إلى حاضنة مؤقتة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى لا تتعرض لتقلبات درجة الحرارة في الحاضنة الرئيسية بعد وضع جهاز الإضاءة الناقل بداخلها.
  3. امسح جهاز الإضاءة الزرقاء ب 70٪ إيثانول وقم بتوصيله بالطاقة. ضع جهاز الترانسلمويماتور في الحاضنة الرئيسية وترك ظروف الحاضنة تعيد استقرارها مع الاستمرار في الإعداد.
  4. سخن كمية كبيرة من الوسط ليتم تغذيتها بالبيوتين والسيكلوهكسيميد (CHX) (10 مل من الوسط لكل صفيحة بحجم 10 سم) إلى 37 درجة مئوية. إذا أجريت عينات ضابطة بدون بيوتين مكمل، قم أيضا بتسخين أليكوت منفصل ليتم إعطاؤه فقط من CHX.
    ملاحظة: بعض مكونات المخزن يمكن خلطها في اليوم السابق للاستخدام وتخزينها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية (انظر الجدول 2). لاحظ أن وصفات مختلفة للتحليل ومخزن الغسيل استخدمت في تجارب مخصصة للبروتيوميات الغربية أو MS وتلك المخصصة لتسلسل RNA.
  5. قم بتبريد كمية كبيرة من DPBS ليتم جرعتها ب CHX (20 مل لكل صفيحة 10 سم).
  6. جهز مخزن إزالة RNAse، وغسل الملح، ومخزن التحلل، ومخزن الغسل (انظر الجدول 2). بالنسبة للمخازل ذات المكونات الكثيفة/اللزجة مثل الجلسرول وترايتون X-100، قم بعمل الماصة على المخزن المكتمل لضمان الخلط المتساوي. قم بتبريد الدواسات على الثلج قبل الاستخدام.
    ملاحظة: لخطوات غسل الخرز، قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات في المخزن الحالي في جهاز طرد مركزي جيب لجمع المحتويات في الأسفل. ضع الأنبوب في رف مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة أو حتى تنتقل الخرزات بالكامل. استنشق السوبرناتانت دون لمس حبيبة الخرز. دون أن تجف حبيبة الخرز، أضف المحلول التالي. لإعادة تعليق حبيبة الخرز، إما قم بعمل الماصة بلطف أو لف الأنبوب المغلق بين الأصابع أثناء تثبيته على الرف المغناطيسي، بحيث يتم سحب الخرزات بسرعة في اتجاهات متعددة بواسطة المغناطيس. وأخيرا، قلب الخرزات المعلقة عدة مرات لضمان غسل الجدران الداخلية للأنبوب.
  7. أعد تعليق زجاجة الستريبتافيدين الأصلية عن طريق العزف الخفيف أو التأرجح. انقل 450 ميكرولتر من الخرزات إلى أنبوب منخفض ارتباط البروتين لكل صفيحة بطول 10 سم من الخلايا المتوسطة المحيطة.
  8. باتباع الملاحظة السابقة حول غسل الخرز، تخلص من مخزن التخزين وغسل الخرزات مرتين مع 900 ميكرولتر من مخزن إزالة RNAse.
    ملاحظة: تابع الخطوة التالية دون تأخير؛ قد يؤدي امتد الوقت في مخزن إزالة الحمض النووي الريبي إلى تقليل قدرة التماسك على الخرزات.
  9. اغسل خرزات مرة واحدة مع 900 ميكرولتر من الملح.
  10. استخدم خرز الغسل مرتين مع 900 ميكرولتر من مخزن Wash I. بعد إعادة تعليق الخرزات في الجولة الثانية من التخزين المؤقت للواش I، خزن الخرزات في مخزن Wash I عند 4 درجات مئوية أثناء تنفيذ التفعيل وتحليل الخلية.
  11. أضف البيوتين (تركيز نهائي 50 ميكرومول؛ تخفيف 1:1,000 من مخزون 50 ملليمتر) وCHX (تركيز نهائي 100 ميكروغرام/مل؛ تخفيف 1:1,000 من مخزون 100 ملغ/مل) حسب المناسب للكمية الدافئة من الوسط. حافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  12. أضف CHX (تركيز نهائي 100 ميكروغرام/مل؛ تخفيف 1:1,000 من مخزون 100 ملغ/مل) إلى المجموع البارد ل DPBS واحتفظ به مبردا حتى الاستخدام.
    ملاحظة: الخطوتان التاليتان تصفان تنشيط ALIBi عبر البيوتين الإضافي وإضاءة الضوء الأزرق. مدة التنشيط المثالية طويلة بما يكفي لتوفير كمية كافية من البيوتينيل الريبوسومي للاختبارات اللاحقة، لكنها قصيرة بما يكفي للحفاظ على الدقة المكانية والزمانية. قد يختلف وقت التنشيط المثالي بناء على معايير مثل نوع الخلية، وحجم التجربة، ومستوى تعبير الإنزيمات المنقسمة، ووفرة الريبوسومات بالقرب من العضية المعنية، وحساسية تقنية التحليل. نوصي ب 15 دقيقة كنقطة انطلاق، وهي وقت التفعيل المستخدم في نتائجنا التمثيلية (الشكل 2) وفي عملناالمصاحب 30.
  13. وسائط استنشاق من الصفائح المنقولة. أضف فورا 10 مل من الوسط الدافئ الذي يحتوي على CHX ± البيوتين لكل طبق.
  14. لكي لا تضيء أي ألواح تحكم سلبية، ضعها في حاضنة مظلمة. لكي تضيء اللوحات، ضعها مباشرة فوق جهاز الترانسلميريمنت، شغل جهاز الترانسلميريمنت، واحتضن لمدة 15 دقيقة.
  15. عند اكتمال الإضاءة، اغسل الألواح فورا مرتين ب 10 مل من DPBS بارد + CHX لكل لوحة. ضع الصحون على الثلج بين وبعد الغسلة. بعد سحب الغسيل الثاني، قم بإمالة اللوح واسحب أي DPBS متبقية.
  16. مع الحفاظ على كل لوحة مستوية قدر الإمكان على الثلج، تابع عملية التحلل بإضافة 2 مل من محلول التحلل البارد جدا. حضن الصفيحة على الثلج لمدة 5 دقائق، مع النقر على اللوحة لإزاحة الخلايا 2–3 مرات خلال تلك الفترة.
    ملاحظة: إذا تم الحفاظ على الألواح داكنة تحت ورق الألمنيوم وعلى الجليد، يمكن نقل الصفائح خارج منطقة زراعة الخلايا إلى مكان مظلم آخر خلال هذه الفترة.
  17. قم بإزالة أي خلايا متبقية باستخدام ميكروبايبت لنقل الليسات صعودا وهبوطا على سطح الصفيحة مع تجنب تكون الفقاعات، ثم نقل الليزات إلى أنبوب بروتين منخفض الارتباط المبرد والمسمى بعلامة منخفضة.
    ملاحظة: اختياري: بالنسبة لبعض العضيات التي يصعب تحللها مثل النواة والنواة، قد يساعد التصويب.
  18. في حالة العضيات التي يصعب تحطيمها، قم بسونيكات جميع العينات في التجربة لمدة 45 ثانية عند 4 درجات مئوية (إعداد القدرة 3 واط). إذا كان تصميم الصوتات يتطلب إدخال مسبار في أنبوب عينة مفتوح، انقل الليزات في البداية من اللوح إلى أنبوب أكبر لمنع الفائض أثناء الصوت؛ ثم انقله إلى أنبوب بسعة 2 مل.
  19. حضن الليزات على الثلج لمدة 15 دقيقة.
  20. قم بالطرد المركزي بإزالة الليزات عند 17,000 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة (الليزيات المصفية) إلى أنبوب بروتين مبرد منخفض الارتباط دون الإخلال بحبيبات الحطام الخلوي.
    ملاحظة: إذا كان من المقصود تحليل تسلسل RNA، يمكن الآن جمع أليكوت من الليزيت الموضح كإجمالي نسبة RNA (انظر الملف التكميلي 1، "توصيات لتسلسل RNA" الخطوة 1.1) لمزيد من التفاصيل.
    ملاحظة: إذا كانت كميات الخلايا، وظروف النقل/الزرعة، وظروف التحلل موحدة لجميع العينات، فإننا عادة نفترض أن تركيزات الليزات قابلة للمقارنة بين العينات ونمضي قدما دون قياس تركيز البروتين الكلي. هذا يقلل من الوقت المنقضي بين التنشيط وتنقية الألفة.

4. تنقية الألفة

  1. قم بعمل حبيبات الستربتافيدين المغسولة باستخدام الرف المغناطيسي. استنشق جهاز Wash I Buffer.
  2. نقل 1,200 ميكرولتر من اللايزات المصفى إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المغسولة. استخدم البيبت بلطف لإعادة تعليق الخرز. تخزين بقية الليزات المصفى عند -80 درجة مئوية.
  3. حضن الليسات بالخرزات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة على دوار الأنبوب.
  4. خلال هذه الحضانة، حضر مخزن إخراج TEV (الجدول 2).

5. الشفافية

  1. وباتباع الملاحظات حول غسل الخرزات في القسم 3، قم بإشعال الحبيبات على رف مغناطيسي وانقل المادة الفائقة إلى أنبوب بروتين مبرد منخفض الارتباط. خزن المادة الفائقة عند -80 درجة مئوية.
  2. اغسل حبيبات الغسل مرتين مع 900 ميكرولتر من محلول Wash I.
  3. استخدم خرزات غسل مرة واحدة مع 900 ميكرولتر من محلول Wash II.
    ملاحظة: بعد إتمام هذه الخطوة، لم يعد من الضروري التعامل مع العينات في الظلام.
  4. أضف 450 ميكرولتر من مخزن تنظير TEV إلى الخرزات.
  5. حضن الخرزات في مخزن تنظير TEV لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على دوار الأنبوب. بالنسبة للتجارب الصغيرة التي تستخدم كميات منخفضة من مخزن استخفاض TEV، حضن الأنابيب على هزاز بسرعة 1,000–2,000 دورة في الدقيقة بدلا من ذلك.
  6. اضرب الخرزات على الرف المغناطيسي. انقل اللوات إلى أنبوب منخفض ارتباط البروتين. إذا كان من المقصود تحليل البروتيوميات أو البقعة الغربية، تخزين الأنبوب عند -80 درجة مئوية. إذا كان المقصود تحليل تسلسل RNA، راجع الملف التكميلي 1 "توصيات لتسلسل RNA" الخطوة 1.2 للحصول على تعليمات تخزين ELUATE.
  7. اختياري: لتحديد ما إذا كان تنقية الألفة قد أسفرت عن rRNA/mRNA ملحوظ (مما يشير إلى عزل الريبوسومات)، قم بتحليل الخطوط على مطياف ميكرو حجم باستخدام مخزن استخفاف TEV كفارغ.
    ملاحظة: يجب أن يكون للمقشوفات من الخلايا التي تحتوي على النظام المنشط امتصاص أكبر عند 260 نانومتر مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى الإنزيمات المنقسمة، أو الضوء الأزرق/البيوتين، أو L31-FTA.

6. البقعة الغربية

ملاحظة: حتى يتم تهيئة عينات الليزات والتدفق عبر العينات في مخزن لايملي، نوصي بالاستمرار في تجنب التعرض للضوء. نستخدم جل مسبقا، ومخزن نقل متوفر تجاريا ومخزن تشغيلي، ونظام نقل شبه جاف (انظر جدول المواد). يتم تنفيذ SDS-PAGE وWestern Blot وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لهذه المكونات، ما لم يذكر خلاف ذلك أدناه.

  1. أضف 6x من مخزن لايملي إلى العينات التي تتدفق عبر العينات أو السحب إلى تركيز نهائي من 1x مخزن لايملي. سخن على حرارة 95 درجة مئوية في كتلة حرارة أو دورة حرارية لمدة 10 دقائق. إذا تكونت تكثفات على غطاء أو جدران الأنبوب، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة.
  2. قم بتركيب جل مع حاجز كهربائي في خزان الجل، حسب تعليمات الشركة المصنعة. حمل العينات والسلم.
  3. شغل الجل عند 125 فولت لمدة 45–75 دقيقة حتى تقترب مقدمة الصبغة من أسفل الجل. وفي هذه الأثناء، جهز PBST ومخازن الحجب (الجدول 2).
  4. قم بنقل شبه جاف حسب تعليمات الشركة المصنعة لنظام النقل.
    ملاحظة: لجميع خطوات غسيل/حضانة الغشاء، تأكد من أن الغشاء مغمور بالكامل وضع صينية الغشاء على منظار أو روكر مائل. لصينية بحجم 10 × 15 سم، يتطلب ذلك 25–50 مل من المخزن المؤقت (buffer).
  5. قم بإزالة الغشاء من مجموعة النقل وانتقل فورا إلى الخطوة التالية لضمان عدم جفاف الغشاء.
    ملاحظة: اختياري: البقع الجافة على الغشاء قد تؤدي إلى انسداد غير متساو أو ارتباط المجسات، خاصة مع المجسات التي تحتوي على حضانات قصيرة مثل بيروكسيداز ستربتافيدين-الفجل الحار. لتجنب هذه المشكلة، نعيد ترطيب الأغشية بعد نقلها بميثانول 100٪ لمدة 30 ثانية، ثم نضع في الماء لمدة 5 دقائق. يشبه هذا الإجراء التوصيات العامة لإعادة ترطيب أغشية PVDF التي جفت بعد النقل32,33.
  6. اغسل الغشاء في PBST لمدة 3 × 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. باتباع الشروط المحددة في الجدول 3 لكل مسبار ويسترن بلوت، قم بإجراء الحجب، الغسيل، حضانة المجس، وحضانة الأجسام المضادة الثانوية.
  8. بعد الغسل النهائي في الخطوة 6.7، اخلط مكونات ركيزة ECL حسب تعليمات الشركة المصنعة وغطى الغشاء بالتساوي بها. التقط الصورة باستخدام نظام تصوير هلام كيميائي للتوليخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقطة الغربية (القسم 6 من البروتوكول) هي الطريقة الأكثر سرعة لتقييم نجاح التجربة بشكل أولي. عند فحص الأغشية باستخدام ستربتافيدين-HRP، يجب أن يحتوي الليزات من الخلايا التي توجد فيها جميع مكونات النظام على شريط يتوافق مع L31-FTA البيوتينيلية (الشكل 2A، الخط 20). يجب أن يكون نفس النطاق موجودا، عادة بكثافة أعلى، إذا تم تحويل الخلايا إلى بيرآ كامل الطول كضابط إيجابي (الشكل 2A، المسارات 1–4). يجب أن يكون هذا النطاق أضعف أو غائبا في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم ALIBi عدة مزايا مقارنة بالتقنيات الحالية لدراسة الترجمة تحت الخلوية وله تطبيقات محتملة مستقبلية في بيولوجيا الريبوسوم وما بعدها. يتطلب هذا البروتوكول وقتا مشابها أو أقل مقارنة بالتحليل المتسلسل والطرد المركزي21,22، ويمكن تطبيقه على أي قسم خلوي تحت الخلوي يمكن استهدافها جينيا بتسلسل ببتيدات موضعي. مقارنة ب BirA10,24 النشط بشكل مستمر، لا تتطلب هذه الطريقة زراعة الخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر بارنا على مناقشاتهم المفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
-80 °C storageللزراعة الخلوية
0.1% جيلاتين في الماءMilliporeSigmaES-006-Bللزراعة الخلوية
وحدات فلتر 0.2 µmFisher04-977-158للزراعة الخلوية
0.5% trypsin-EDTA (10X)ThermoFisher15400-054للزراعة الخلوية
1 M MgCl2ThermoFisherAM9010للتحلل والتنقية بالانتحاب
1 M Tris pH 7.5ThermoFisher15567027للتحلل والتنقية بالانتحاب
1 M Tris pH 8ThermoFisherAM9855Gاختياري: لإدخال FTA في موقع بروتين ريبوزومي داخلي
أنابيب طرد مركزي 1.5 و 2 مل، معقمةللتحفير
أنابيب طرد مركزي 1.5 و 2 و 5 مل للبروتينات منخفضة الارتباطEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		للتحلل والتنقية بالانتحاب
صفائح زراعة الأنسجة مقاس 10 سمللزراعة الخلوية
10 M NaOHMilliporeSigma72068-100MLللتحلل والتنقية بالانتحاب
مخفف تشغيل Tris/glycine/SDS مركّز 10xBio-Rad1610772للغربلة المناعية
غرفة زراعة أنسجة 37 °C x 2للزراعة الخلوية. واحدة من هذه تستخدم كمحضنة رئيسية لزراعة الخلايا وإضاءة الخلايا المتحولة. هناك حاجة لمساحة مؤقتة في المحضنة الثانية في يوم تفعيل ALIBi لإيواء الخلايا المتحولة أثناء إعداد جهاز الإضاءة في المحضنة الرئيسية.
حمام مائي 37 °Cللزراعة الخلوية
5 M NaClThermoFisherAM9010للتحلل والتنقية بالانتحاب
50 mM biotinThermoFisherB20656للتحلل والتنقية بالانتحاب
محلول Laemmli 6xFIsher50-196-784للغربلة المناعية
70% إيثانولللتطهير
الأسيتونيتريلFisherA955اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
مجموعة AcTEV proteaseThermoFisher12575015للتحلل والتنقية بالانتحاب
بلازميد C-fragment من ALIBiAddgene#235615, 235636 – 235641مطلوب مقياس Midi-prep للتحفير
بلازميد N-fragment من ALIBiAddgene#235614, 235635, 235642, 235643مطلوب مقياس Midi-prep للتحفير
ورق الألمنيومللتحلل والتنقية بالانتحاب
بيكربونات الأمونيومMilliporeSigma5.3305اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
جسم مضاد anti-FLAGMilliporeSigmaF3165للغربلة المناعية
جسم مضاد anti-GAPDHCell Signaling5174للغربلة المناعية
جسم مضاد ثانوي anti-mouseGE HealthcareNA931Vللغربلة المناعية
جسم مضاد ثانوي anti-rabbitGE HealthcareNA934Vللغربلة المناعية
جسم مضاد anti-Rpl12Abcamab175219للغربلة المناعية
جسم مضاد anti-Rpl31Abcamab103991للغربلة المناعية
جسم مضاد anti-Rpl5ProteinTech15430-1-APللغربلة المناعية
جسم مضاد anti-V5ThermoFisherR960-25للغربلة المناعية
ApyraseNEBM0398Lللتحلل والتنقية بالانتحاب
بيتا-ميركابتو إيثانول (55 ملي مولار)ThermoFisher21985-023للزراعة الخلوية
جهاز إرسال الضوء الأزرقClare Research ChemicalDR46B (صغير) أو DR196 (كبير)للتحلل والتنقية بالانتحاب
البومين مصل الثور (BSA)FisherBP1600-100للغربلة المناعية
نصائح C18 (نصائح OMIX C18)AgilentA57003100اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
حاوية تجميد الخلاياللزراعة الخلوية
طارد مركزي مناسب للأنابيب المخروطية 15 مل و/أو 50 ملللزراعة الخلوية
طارد مركزي لأنابيب الطرد المركزي 1.5-2 ملللتحلل والتنقية بالانتحاب. يجب أن يكون قادرًا على التبريد إلى 4 C وسرعات تصل إلى 17000 g. من الناحية المثالية، يكون موجودًا في غرفة يمكن تعتيمها مؤقتًا أثناء نقل الأنابيب إلى الداخل والخروج.
مجموعة Clarity ECLBio-Rad170-5061للغربلة المناعية
خزان جل CriterionBio-Rad1656001للغربلة المناعية
جل Criterion TGX المصبوغ مسبقًا، 4-20%Bio-Rad5671095للغربلة المناعية. تتوفر أحجام وتخطيطات إضافية للبئر
CycloheximideMilliporeSigmaC7698-5Gللتحلل والتنقية بالانتحاب
DeoxycholateMilliporeSigmaS1827للتحلل والتنقية بالانتحاب
DithiothreitolThermoFisherPIA39255اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
DPBS، بدون كالسيوم، بدون مغنيسيومThermoFisher14190-250للزراعة الخلوية
FBS مؤهل لزراعة الخلايا الجنينيةMilliporeSigmaES-009-Bللزراعة الخلوية
إيثانولGold Shield412828للغربلة المناعية
إيثانولMilliporeSigma459828اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
حمض الفورميكMilliporeSigmaA117اختياري: لتحضير عينات مطيافية الكتلة
محلل حجم الأجزاء ومواد الاستهلاك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 JoVE

مقالات ذات صلة